KR20220009367A - 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막, 세포배양용 담체 및 세포배양용 용기 - Google Patents

세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막, 세포배양용 담체 및 세포배양용 용기 Download PDF

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유우헤이 아라이
노부히코 이누이
마유미 유카와
다이고 고바야시
유우타 나카무라
겐타 다카쿠라
사토시 하네다
료마 이시이
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세키스이가가쿠 고교가부시키가이샤
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Abstract

세포의 파종 후의 정착성이 우수하고, 세포의 증식률을 높일 수 있는, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막을 제공한다. 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막이며, 세포배양용 스캐폴드 재료는, 합성 수지를 포함하고, 수지막이, 적어도 제1 상 및 제2 상을 포함하는, 상분리 구조를 갖고, 제1 상 및 제2 상 중 한쪽 상의 표면 전체에 대한 표면적의 비가, 0.01 이상, 0.95 이하인, 수지막.

Description

세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막, 세포배양용 담체 및 세포배양용 용기
본 발명은, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 수지막을 구비하는 세포배양용 담체 및 세포배양용 용기에도 관한 것이다.
근년, 세포 의약이나 줄기세포를 사용한 차세대 의료가 주목을 모으고 있다. 그 중에서도, 재생 의료 인간 배아줄기세포(hESC)나, 인간 인공 다능성 줄기세포(hiPSC) 등의 인간 다능성 줄기세포(hPSC), 혹은 그것들로부터 유도되는 분화 세포는, 창약이나 재생 의료로의 응용이 기대되고 있다. 이러한 응용을 행하기 위해서는, 다능성 줄기세포나, 분화 세포를 안전하게, 또한 재현성 좋게 배양하고, 증식시키는 것이 필요해진다.
특히, 재생 의료의 산업 이용상에 있어서는, 줄기세포를 다량으로 다룰 필요가 있는 점에서, 천연 고분자 재료나 합성 고분자 재료, 혹은 피더 세포를 사용하여 다능성 줄기세포의 증식을 지지하는 것이 필요해진다. 그 때문에, 천연 고분자 재료나 합성 고분자 재료 등의 스캐폴드 재료를 사용한 배양 방법에 대하여 여러가지 검토되고 있다.
예를 들어, 하기의 특허문헌 1에는, 폴리비닐아세탈 화합물을 포함하는 성형물 또는 해당 폴리비닐아세탈 화합물과 수용성 다당류를 포함하는 성형물을 포함하고, 해당 폴리비닐아세탈 화합물의 아세탈화도가 20 내지 60몰％인 세포배양용 담체가 개시되어 있다.
하기의 특허문헌 2에는, 제1 섬유 폴리머 스캐폴드재를 포함하는 조성물이며, 제1 섬유 폴리머 스캐폴드재의 섬유가 정렬되어 있는, 조성물이 개시되어 있다. 상기 제1 섬유 폴리머 스캐폴드재를 구성하는 섬유는, 폴리글리콜산이나 폴리락트산 등의 지방족 폴리에스테르에 의해 구성되는 것이 기재되어 있다.
또한, 하기의 특허문헌 3에는, 다능성 줄기세포의 미분화성을 유지하기 위한 세포배양 방법이며, 폴리로탁산 블록 공중합체로 피복된 표면을 갖는 배양기 상에서 해당 다능성 줄기세포를 배양하는 공정을 포함하는 방법이 개시되어 있다.
일본 특허 공개 제2006-314285호 공보 일본 특허 공표 제2009-524507호 공보 일본 특허 공개 제2017-23008호 공보
그런데, 스캐폴드 재료로서 천연 고분자 재료를 사용한 경우, 파종 후의 세포의 정착성을 높일 수 있다. 특히, 천연 고분자 재료로서 라미닌, 비트로넥틴 등의 접착 단백질이나 마우스 육종 유래의 마트리겔을 사용하면, 파종 후의 세포의 정착성이 매우 높은 것이 알려져 있다. 한편, 천연 고분자 재료는, 고가이거나, 천연 유래 물질이기 때문에 로트 간의 변동이 크거나, 동물 유래의 성분에 의한 안전상의 우려가 있거나 한다.
이에 비해, 합성 수지를 사용한 스캐폴드 재료는, 천연 고분자 재료를 사용한 스캐폴드 재료와 비교하여, 조작성이 좋고, 저렴하고, 로트 간의 변동이 작고, 또한 안전성이 우수하다. 그러나, 특허문헌 1 내지 3과 같은 합성 수지를 사용한 스캐폴드 재료에서는, 친수성이 높은 합성 수지가 사용되고 있기 때문에 합성 수지가 과도하게 팽윤하거나 한다. 또한, 합성 수지는, 천연 고분자 재료에 비하여, 세포와의 친화성이 낮은 점에서, 배양 중에 세포괴가 박리해 버리는 경우가 있다. 이렇게 합성 수지를 사용한 스캐폴드 재료는, 세포의 파종 후의 정착성이 낮고, 세포가 충분히 증식하지 않는 경우가 있다.
본 발명의 목적은, 세포의 파종 후의 정착성이 우수하고, 세포의 증식률을 높일 수 있는, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막, 세포배양용 담체 및 세포배양용 용기를 제공하는 데 있다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막은, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료가 합성 수지를 포함하고, 상기 수지막이, 적어도 제1 상 및 제2 상을 포함하는, 상분리 구조를 갖고, 상기 제1 상 및 제2 상 중 한쪽 상의 표면 전체에 대한 표면적의 비가, 0.01 이상, 0.95 이하이다.
본 발명에 따른 수지막의 어느 특정한 국면에서는, 상기 제2 상의 면적에 대한 주위 길이의 비(주위 길이/면적)가, 0.001(1/nm) 이상, 0.40(1/nm) 이하이다.
본 발명에 따른 수지막의 다른 특정한 국면에서는, 상기 상분리 구조가, 해도 구조이고, 상기 제1 상이 바다부이고, 상기 제2 상이 섬부이다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 섬부인 상기 제2 상의 개수가, 1개/㎛2 이상, 5000개/㎛2 이하이다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 상분리 구조가, 상기 합성 수지의 분자 내에 있어서의 상분리 구조에 의해 구성되어 있다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 표면 자유 에너지의 분산항 성분이 25.0mJ/㎡ 이상, 50.0mJ/㎡ 이하, 또한 극성항 성분이 1.0mJ/㎡ 이상, 20.0mJ/㎡ 이하이다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 합성 수지가, 양이온성 관능기를 갖고, 상기 합성 수지의 구조 단위 중에 포함되는 상기 양이온성 관능기의 함유량이, 0.2몰％ 이상, 50몰％ 이하이다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 제2 상이, 펩티드부를 갖는다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 펩티드부가, 세포 접착성의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 수팽윤 배율이 50％ 이하이다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 100℃에서의 저장 탄성률이, 1.0×104Pa 이상, 1.0×108Pa 이하이고, 25℃에서의 저장 탄성률과 100℃에서의 저장 탄성률의 비((25℃에서의 저장 탄성률)/(100℃에서의 저장 탄성률))가, 1.0×101 이상, 1.0×105 이하이다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 동물 유래의 원료를 실질적으로 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 합성 수지가 비닐 중합체를 포함한다.
본 발명에 따른 수지막의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 합성 수지가, 적어도 폴리비닐알코올 유도체 또는 폴리(메트)아크릴산에스테르를 포함한다.
본 발명에 따른 세포배양용 담체는, 담체와, 본 발명에 따라서 구성되는 수지막을 구비하고, 상기 담체의 표면 상에, 상기 수지막이 배치되어 있다.
본 발명에 따른 세포배양용 용기는, 용기 본체와, 본 발명에 따라서 구성되는 수지막을 구비하고, 상기 용기 본체의 표면 상에, 상기 수지막이 배치되어 있다.
본 발명에 따르면, 세포의 파종 후의 정착성이 우수하고, 세포의 증식률을 높일 수 있는, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막, 세포배양용 담체 및 세포배양용 용기를 제공할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시 형태에 따른 세포배양용 용기를 도시하는 모식적 정면 단면도이다.
도 2는, 실시예 3에서 얻어진 수지막의 원자간력 현미경 사진이다.
도 3은, 실시예 14에서 얻어진 수지막의 원자간력 현미경 사진이다.
이하, 도면을 참조하면서, 본 발명의 구체적인 실시 형태를 설명함으로써, 본 발명을 분명하게 한다.
본 발명은, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막에 관한 것이다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 합성 수지를 포함한다. 본 발명의 수지막은, 적어도 제1 상 및 제2 상을 포함하는, 상분리 구조를 갖는다. 본 발명의 수지막에서는, 제1 상 및 제2 상 중 한쪽 상의 표면 전체에 대한 표면적의 비가, 0.01 이상, 0.95 이하이다.
본 발명의 수지막은, 상기의 구성을 구비하므로, 세포의 파종 후의 정착성이 우수하고, 세포의 증식률을 높일 수 있다.
종래의 천연 고분자 재료를 사용한 세포배양용 스캐폴드 재료는, 파종 후의 세포의 정착성을 높일 수 있기는 하지만, 고가이거나, 천연 유래 물질이기 때문에 로트 간의 변동이 크거나, 동물 유래의 성분에 의한 안전상의 우려가 있거나 한다. 한편으로, 합성 수지를 사용한 종래의 스캐폴드 재료에서는, 합성 수지가 과도하게 팽윤하거나, 세포와의 친화성이 낮거나 하므로, 배양 중에 세포괴가 박리해 버리는 경우가 있다. 따라서, 합성 수지를 사용한 종래의 스캐폴드 재료는, 세포의 파종 후의 정착성이 낮고, 세포가 충분히 증식하지 않는 경우가 있다.
본 발명자들은, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막의 상분리 구조에 착안하여, 제1 상 및 제2 상 중 한쪽 상의 표면 전체에 대한 표면적의 비가 상기 특정한 범위가 되는 것과 같은 상분리 구조로 함으로써, 세포와의 친화성을 높이고, 그것에 의하여 파종 후의 접착성을 높일 수 있고, 나아가서는 세포의 증식률을 높일 수 있는 것을 발견하였다. 이 이유에 대해서는 분명치는 않지만, 이러한 상분리 구조를 갖는 경우, 에너지 분배가 원활하게 진행하는 것이나, 친화성이나 강도가 다른 제1 상 및 제2 상의 존재 위치나 존재 비율을 조정할 수 있기 때문에, 세포의 종류에 관계없이 친화성을 높여, 세포 혹은 세포 표면 단백질의 집적 및 흡착 효과를 실현할 수 있는 것으로 생각된다.
따라서, 본 발명의 수지막에 의하면, 파종 후의 세포와의 접착성을 높일 수 있고, 세포의 증식률을 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서는, 상기와 같이 합성 수지를 사용할 수 있으므로, 천연 고분자 재료를 사용한 스캐폴드 재료와 비교하여, 조작성이 좋고, 저렴하고, 로트 간의 변동이 작고, 또한 안전성이 우수하다.
또한, 본 발명에 있어서는, 상기 합성 수지로서, 펩티드부를 갖는 합성 수지를 사용해도 된다. 펩티드부를 갖는 합성 수지의 상세에 대해서는, 후술한다.
본 발명에 있어서, 제1 상 및 제2 상 중 한쪽 상의 표면 전체에 대한 표면적의 비(표면적 분율)는, 0.01 이상, 바람직하게는 0.10 이상, 0.95 이하, 보다 바람직하게는 0.90 이하이다. 표면적 분율이 상기 범위 내에 있는 경우, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상분리 구조로서는, 예를 들어 해도 구조, 실린더 구조, 자이로이드 구조, 또는 라멜라 구조 등의 마이크로 상분리 구조를 들 수 있다. 해도 구조에서는, 예를 들어 제1 상을 바다부로 하고, 제2 상을 섬부로 할 수 있다. 실린더 구조, 자이로이드 구조, 또는 라멜라 구조에서는, 예를 들어 표면적이 가장 큰 상을 제1 상으로 하고, 표면적이 2번째로 큰 상을 제2 상으로 할 수 있다. 이들 중에서도, 상분리 구조로서는 해도 구조가 바람직하다. 이와 같이, 연속상과, 불연속상을 가짐으로써, 세포와의 친화성을 높이고, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 그것에 의하여 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
상기 상분리 구조가 해도 구조인 경우, 제2 상의 표면 전체에 대한 표면적 분율은, 0.01 이상, 바람직하게는 0.1 이상, 보다 바람직하게는 0.2 이상이고, 또한, 0.95 이하, 바람직하게는 0.9 이하, 보다 바람직하게는 0.8 이하이다. 표면적 분율이 상기 범위 내에 있는 경우, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
제2 상의 면적에 대한 주위 길이의 비(주위 길이/면적)는, 바람직하게는 0.001(1/nm) 이상, 보다 바람직하게는 0.0015(1/nm) 이상, 더욱 바람직하게는 0.008(1/nm) 이상이다. 제2 상의 면적에 대한 주위 길이의 비(주위 길이/면적)는, 바람직하게는 0.40(1/nm) 이하, 보다 바람직하게는 0.20(1/nm) 이하, 더욱 바람직하게는 0.08(1/nm) 이하, 특히 바람직하게는 0.013(1/nm) 이하이다. 비(주위 길이/면적)가 상기 범위 내에 있는 경우, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
합성 수지가 펩티드부를 갖지 않는 경우에, 제2 상의 면적에 대한 주위 길이의 비(주위 길이/면적)는, 바람직하게는 0.001(1/nm) 이상, 보다 바람직하게는 0.0015(1/nm) 이상, 바람직하게는 0.08(1/nm) 이하, 보다 바람직하게는 0.013(1/nm) 이하이다. 비(주위 길이/면적)가 상기 범위 내에 있는 경우, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
합성 수지가 펩티드부를 갖는 경우에, 제2 상의 면적에 대한 주위 길이의 비(주위 길이/면적)는, 바람직하게는 0.008(1/nm) 이상, 보다 바람직하게는 0.013(1/nm) 이상, 바람직하게는 0.40(1/nm) 이하, 보다 바람직하게는 0.20(1/nm) 이하, 더욱 바람직하게는 0.10(1/nm) 이하이다. 비(주위 길이/면적)가 상기 범위 내에 있는 경우, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
섬부인 제2 상의 개수는, 바람직하게는 1개/㎛2 이상, 보다 바람직하게는 2개/㎛2 이상, 더욱 바람직하게는 10개/㎛2 이상, 바람직하게는 5000개/㎛2 이하, 보다 바람직하게는 1000개/㎛2 이하, 더욱 바람직하게는 500개 이하/㎛2, 특히 바람직하게는 300개/㎛2 이하이다. 이 경우, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
섬부인 제2 상의 직경 평균은, 바람직하게는 20nm 이상, 보다 바람직하게는 30nm 이상, 더욱 바람직하게는 50nm 이상, 특히 바람직하게는 80nm 이상, 바람직하게는 3.5㎛ 이하, 보다 바람직하게는 3.0㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 1.5㎛ 이하이다. 제2 상의 직경 평균이 상기 범위 내에 있는 경우, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
합성 수지가 펩티드부를 갖지 않는 경우에, 섬부인 제2 상의 직경 평균은, 바람직하게는 50nm 이상, 보다 바람직하게는 100nm 이상, 더욱 바람직하게는 120nm 이상, 특히 바람직하게는 200nm 이상, 바람직하게는 1㎛ 이하, 보다 바람직하게는 300nm 이하, 더욱 바람직하게는 250nm 이하이다. 제2 상의 직경 평균이 상기 범위 내에 있는 경우, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
합성 수지가 펩티드부를 갖는 경우에, 섬부인 제2 상의 직경 평균은, 바람직하게는 10nm 이상, 보다 바람직하게는 20nm 이상, 더욱 바람직하게는 40nm 이상, 바람직하게는 1㎛ 이하, 보다 바람직하게는 300nm 이하, 더욱 바람직하게는 100nm 이하이다. 제2 상의 직경 평균이 상기 범위 내에 있는 경우, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
또한, 상분리 구조의 유무나, 상기와 같은 상분리 구조를 나타내는 파라미터는, 예를 들어 원자간력 현미경(AFM)이나, 투과형 전자 현미경(TEM), 주사형 전자 현미경(SEM) 등에 의해 확인할 수 있다.
구체적으로, 제1 상 및 제2 상 중 한쪽 상의 표면 전체에 대한 표면적의 비(표면적 분율), 제2 상의 주위 길이와 면적과의 비(주위 길이/면적), 섬부인 제2 상의 개수, 및 그 평균 직경 사이즈는, 전술한 현미경 관찰 화상으로부터 예를 들어 ImageJ 등의 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 구할 수 있다.
제1 상 및 제2 상 중 한쪽 상의 표면 전체에 대한 표면적의 비(표면적 분율)는, 관찰 영역(30㎛×30㎛) 내에 있어서, 제1 상 및 제2 상 중 한쪽 상이 차지하는 표면적을, 관찰 영역의 면적으로 제산함으로써 구해진다.
제2 상의 면적에 대한 주위 길이의 비(주위 길이/면적)는, 관찰 영역(30㎛×30㎛) 내에 있어서, 제2 상의 주위 길이의 합계를, 제2 상의 면적의 합계로 제산함으로써 구해진다.
상분리 구조가 해도 구조인 경우, 섬부인 제2 상의 개수는, 관찰 영역(30㎛×30㎛) 내에 있어서의 제2 상의 개수를, 관찰 영역의 면적으로 제산함으로써 구해진다. 또한, 섬부인 제2 상의 평균 직경은, 동 면적의 원 평균 직경으로서 구해진다.
또한, 상기와 같은 상분리 구조는, 예를 들어 다른 적어도 2종류의 폴리머를 블렌드하거나, 공중합하거나, 그라프트 공중합하거나, 펩티드부를 갖는 합성 수지를 사용하거나 함으로써, 합성 수지의 분자 간 또는 분자 내에 상분리 구조를 형성함으로써 얻을 수 있다. 그 중에서도, 세포의 접착성을 보다 한층 높일 수 있는 관점에서, 상기 상분리 구조가 분자 내의 상분리 구조에 의해 형성되어 있는 것이 바람직하다. 즉, 상기 합성 수지는, 다른 적어도 2종류의 폴리머의 공중합체이거나 또는 펩티드부를 갖는 합성 수지인 것이 바람직하고, 그라프트 공중합체이거나 또는 펩티드부를 갖는 합성 수지인 것이 보다 바람직하다.
상기와 같은 상분리 구조는, 용해도 파라미터(SP값)가 0.1 이상, 바람직하게는 0.5 이상, 보다 바람직하게는 1 이상으로 다른 2종류 이상의 폴리머(모노머)를 공중합함으로써 얻는 것이 바람직하다. 이 경우, 해도 구조를 보다 한층 용이하게 형성할 수 있다.
SP값은, 용매-용질 간에 작용하는 분자간력을 나타내는 척도이고, 물질 간의 친화성의 척도이다. SP값은, Hidebrand의 정칙 용액의 이론에 기초하여 구할 수 있다. 또한, SP값은, 문헌 정보로부터 얻을 수 있는 것 이외에, Hansen이나 Hoy의 계산 방법, Fedors의 추산법 등에 의해 얻을 수 있다. 본 명세서에서는, Fedors의 식 δ2=ΣE/ΣV(δ는 SP값, E는 증발 에너지, V는 몰 체적을 의미한다.)에 의해 산출되는 계산값을 의미한다. 또한, SP값의 단위는(cal/㎤)0.5이다. Fedors의 방법에 대해서는, 일본 접착 협회지, 1986년 22권 566페이지에 기재되어 있다.
또한, 표면적 분율 등의 상분리 구조를 나타내는 상분리 파라미터는, 예를 들어 2종류의 폴리머의 배합 비율이나 폴리머의 구조를 제어하거나, 펩티드부의 함유율을 제어하거나 함으로써 조정할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서는, 제1 상 및 제2 상과는 다른 다른 상이 존재하고 있어도 된다. 다른 상은, 1개의 상이어도 되고, 복수의 상이어도 된다. 이러한 상은, 예를 들어 SP값이 다른 또 다른 폴리머(모노머)를 그라프트 등의 공중합을 함으로써 얻을 수 있다. 이 경우에는, 수지막의 표면을 차지하는 면적이 큰 2개의 상을 상기 제1 상 및 상기 제2 상으로 한다.
합성 수지가 펩티드부를 갖지 않는 경우에, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막에 있어서의 표면 자유 에너지의 분산항 성분은, 바람직하게는 25.0mJ/㎡ 이상, 50.0mJ/㎡ 이하이다. 이 경우, 세포배양용 스캐폴드 재료의 친수성을 적절하게 조정할 수 있고, 상분리 구조와의 상승 효과에 의해, 파종 후의 세포와의 계면 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다. 상기 분산항 성분은, 보다 바람직하게는 30.0mJ/㎡ 이상, 더욱 바람직하게는 35.0mJ/㎡ 이상, 보다 바람직하게는 47.0mJ/㎡ 이하, 더욱 바람직하게는 45.5mJ/㎡ 이하이다.
합성 수지가 펩티드부를 갖지 않는 경우에, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막에 있어서의 표면 자유 에너지의 극성항 성분은, 바람직하게는 1.0mJ/㎡ 이상, 20.0mJ/㎡ 이하이다. 이 경우, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높여, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다. 상기 극성항 성분은, 보다 바람직하게는 2.0mJ/㎡ 이상, 더욱 바람직하게는 3.0mJ/㎡ 이상, 보다 바람직하게는 10.0mJ/㎡ 이하, 더욱 바람직하게는 5.0mJ/㎡ 이하이다.
또한, 표면 자유 에너지의 분산항 성분 γd 및 극성항 성분인 쌍극자 성분 γp는, Kaelble-Uy의 이론식을 사용하여 산출된다. Kaelble-Uy의 이론식은, 하기 식 (1)로 나타내는 바와 같이, 토탈 표면 자유 에너지 γ가, 분산항 성분 γd와 쌍극자 성분 γp와의 합이 된다는 가정에 기초하는 이론식이다.
Figure pct00001
또한, Kaelble-Uy의 이론식에서는, 액체의 표면 자유 에너지를 γl(mJ/㎡)로 하고, 고체의 표면 자유 에너지를 γs(mJ/㎡)로 하고, 접촉각을 θ(°)로 하면, 하기 식 (2)가 성립한다.
Figure pct00002
따라서, 액체의 표면 자유 에너지 γl이 기지인 액체를 2종류 사용하여, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막에 대한 각각의 접촉각 θ를 측정하고, γs d 및 γs p의 연립방정식을 풀음으로써, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막의 표면 자유 에너지의 분산항 성분 γd 및 쌍극자 성분 γp를 구할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서는, 상기 표면 자유 에너지 γl이 기지인 2종류의 상기 액체로서, 순수 및 디요오도메탄이 사용되고 있다.
접촉각 θ는, 접촉각계(예를 들어, 교와 가이멘 가가꾸사제 「DMo-701」)를 사용하여, 이하와 같이 하여 측정된다.
세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막의 표면에, 순수 또는 디요오도메탄을 1μL 적하한다. 적하하고 나서 30초 후의 순수와, 수지막과의 이루는 각도를, 순수에 대한 접촉각 θ로 한다. 또한, 마찬가지로, 적하하고 나서 30초 후의 디요오도메탄과, 수지막과의 이루는 각도를, 디요오도메탄에 대한 접촉각 θ로 한다.
합성 수지에 있어서의 소수성 관능기의 함유율을 높게 하거나, 환상 구조를 갖는 관능기의 함유율을 높게 하거나, 부틸기의 함유율을 적게 하거나 함으로써, 상기 표면 자유에너지의 분산항 성분 γd를 작게 할 수 있다. 또한, 합성 수지에 있어서의 친수성 관능기의 함유율을 높게 하거나, 부틸기의 함유율을 높게 하거나 함으로써, 상기 표면 자유 에너지의 쌍극자 성분 γp를 작게 할 수 있다.
본 발명의 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막에 있어서는, 100℃에서의 저장 탄성률이, 바람직하게는 0.6×104Pa 이상, 보다 바람직하게는 0.8×104Pa 이상, 더욱 바람직하게는 1.0×104Pa 이상, 바람직하게는 1.0×108Pa 이하, 보다 바람직하게는 0.8×108Pa 이하, 더욱 바람직하게는 1.0×107Pa 이하이다.
특히, 본 발명의 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막은, 25℃에서의 저장 탄성률과 100℃에서의 저장 탄성률과의 비((25℃에서의 저장 탄성률)/(100℃에서의 저장 탄성률))가, 바람직하게는 1.0×101 이상, 보다 바람직하게는 5.0×101 이상, 더욱 바람직하게는 8.0×102 이상, 바람직하게는 1.0×105 이하, 보다 바람직하게는 0.75×105 이하, 더욱 바람직하게는 0.5×105 이하이다. 저장 탄성률을 상기 범위 내로 함으로써, 파종 후의 세포의 정착성을 보다 한층 높일 수 있다.
또한, 25℃ 및 100℃의 저장 탄성률은, 예를 들어 동적 점탄성 측정 장치(아이티 케이소쿠 세이교사제, DVA-200)에 의해 인장 조건 하, 주파수 10Hz, -150℃로부터 150℃의 온도 범위를 승온 속도 5℃/분으로 측정한다. 얻어진 인장 저장 탄성률의 그래프로부터 25℃ 및 100℃에서의 저장 탄성률을 구하고, 25℃ 저장 탄성률/100℃ 저장 탄성률을 산출한다. 길이 50mm, 폭 5 내지 20mm, 두께 0.1 내지 1.0mm의 측정 샘플을 사용하여, 10Hz, 변형 0.1％, 온도 -150℃ 내지 150℃ 및 승온 속도 5℃/min의 조건에서 행한다.
상기 25℃ 및 100℃의 저장 탄성률은, 예를 들어 상기 합성 수지에 있어서의 가교도를 높이는 것, 상기 합성 수지를 연신하는 것 등에 의해, 높일 수 있다. 또한, 상기 25℃ 및 100℃의 저장 탄성률은, 상기 합성 수지에 있어서 수 평균 분자량을 낮추는 것, 유리 전이 온도를 낮추는 것 등에 의해, 낮게 할 수 있다.
본 발명의 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막은, 수팽윤 배율이, 바람직하게는 50％ 이하, 보다 바람직하게는 40％ 이하이다. 이 경우, 파종 후의 세포의 정착성을 보다 한층 높일 수 있다. 또한, 수팽윤 배율의 하한값은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 0.5％로 할 수 있다. 수팽윤 배율은, 이하와 같이 하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 길이 50mm, 폭 10mm, 두께 0.05mm 내지 0.15mm의 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막(측정 샘플)을 25℃의 물에 24시간 침지한다. 침지 전과 후의 샘플 무게를 측정하고, 수팽윤 배율=(침지 후의 샘플 중량-침지 전의 샘플 중량)/(침지 전의 샘플 중량)×100(％)을 산출한다.
상기 수팽윤 배율은, 예를 들어 상기 합성 수지의 소수성 관능기를 증가시키는 것, 수 평균 분자량을 낮추는 것 등에 의해, 작게 할 수 있다.
(합성 수지)
세포배양용 스캐폴드 재료는, 합성 수지(이하, 합성 수지 X라고 기재하는 경우가 있다)를 포함한다. 합성 수지 X의 주쇄는, 탄소쇄인 것이 바람직하다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「구조 단위」란, 합성 수지를 구성하는 모노머의 반복 단위를 말한다. 또한, 합성 수지가 그라프트쇄를 갖는 경우에는, 그 그라프트쇄를 구성하는 모노머의 반복 단위를 포함한다.
합성 수지 X가 펩티드부를 갖지 않는 경우에, 합성 수지 X는, 양이온성 관능기를 갖는 것이 바람직하다. 합성 수지 X가 펩티드부를 갖는 경우에, 펩티드부를 갖는 합성 수지 X는, 해당 펩티드부 이외의 구조 부분에 있어서, 양이온성 관능기를 갖고 있어도 되고, 갖고 있지 않아도 된다. 양이온성 관능기로서는, 아미노기, 이미노기, 아미드기 등의 구조를 갖는 치환기를 들 수 있다. 예를 들어, 특별히 한정되지 않지만, 히드록시아미노기, 우레아기, 구아니딘, 비구아니드 등의 공액 아민계 관능기, 피페라진, 피페리딘, 피롤리딘, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄, 헥사메틸렌테트라아민, 모르폴린, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 피롤, 아자트로피리덴, 피리돈, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 벤조트리아졸, 피라졸, 옥사졸, 이미다졸린, 트리아졸, 티아졸, 티아진, 테트라졸, 인돌, 이소인돌, 푸린, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 신놀린, 프테리딘, 카르바졸, 아크리딘, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실, 멜라민 등의 헤테로환 아미노계 관능기, 포르피린, 클로린, 콜린 등의 환상 피롤계 관능기 및 그들의 유도체 등을 들 수 있다. 이들의 양이온성 관능기는, 1종을 단독으로 사용해도 되고, 복수종을 병용해도 된다.
본 발명에 있어서, 합성 수지 X의 구조 단위 중에 포함되는 양이온성 관능기의 함유량은, 바람직하게는 0.2몰％ 이상, 바람직하게는 2몰％ 이상, 보다 바람직하게는 3몰％ 이상, 50몰％ 이하, 바람직하게는 10몰％ 이하, 보다 바람직하게는 7몰％ 이하이다. 이러한 범위 내에서 양이온성 관능기를 함유하는 합성 수지 X를 사용함으로써, 파종 후의 세포의 정착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다. 또한, 양이온성 관능기의 함유량은, 예를 들어 1H-NMR(핵자기 공명 스펙트럼)에 의해 측정할 수 있다.
(비닐 중합체)
합성 수지 X는, 비닐 중합체를 포함하는 것이 바람직하고, 비닐 중합체인 것이 보다 바람직하다. 또한, 비닐 중합체란, 비닐기 또는 비닐리덴기를 갖는 화합물의 중합체이다. 상기 합성 수지 X가 비닐 중합체인 경우, 수중에 있어서의 세포배양용 스캐폴드 재료의 팽윤을 보다 억제하기 쉽게 할 수 있다. 비닐 중합체로서는, 예를 들어 폴리비닐알코올 유도체, 폴리(메트)아크릴산에스테르, 폴리비닐피롤리돈, 폴리스티렌, 에틸렌·아세트산비닐 공중합체 등을 들 수 있다. 또한, 비닐 중합체로서는, 세포와의 접착성을 보다 높이기 쉬운 관점에서, 폴리비닐알코올 유도체 또는 폴리(메트)아크릴산에스테르인 것이 바람직하다.
(폴리비닐아세탈 골격을 갖는 합성 수지 X)
세포배양용 스캐폴드 재료는, 폴리비닐아세탈 골격을 갖는 합성 수지 X를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 폴리비닐아세탈 골격을 갖는 합성 수지 X는, 폴리비닐아세탈 수지의 구조 단위와 비닐 화합물 및/또는 비닐리덴 화합물과의 공중합체인 것이 바람직하다. 비닐 화합물은, 비닐기(H2C=CH-)를 갖는 화합물이다. 비닐리덴 화합물은, 비닐리덴기(H2C=CR-)를 갖는 화합물이다. 비닐 화합물 또는 비닐리덴 화합물은, 그 중합체인 비닐 중합체여도 된다. 또한, 이하의 설명에서는, 폴리비닐아세탈 수지에 공중합되는 비닐 화합물, 비닐리덴 화합물 및 비닐 중합체를 총칭하여 「비닐 화합물 A」라고 하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 공중합체는, 폴리비닐아세탈 수지와 비닐 화합물 A와의 블록 공중합체여도 되고, 폴리비닐아세탈 수지에 비닐 화합물 A가 그라프트한 그라프트 공중합체여도 된다. 상기 공중합체는, 그라프트 공중합체인 것이 바람직하다. 이 경우, 상분리 구조를 보다 한층 용이하게 형성할 수 있다.
상기 비닐 화합물 및 비닐리덴 화합물로서는, 에틸렌, 알릴아민, 비닐피롤리돈, 무수 말레산, 말레이미드, 이타콘산, (메트)아크릴산, 비닐아민 및 (메트)아크릴산에스테르 등을 들 수 있다. 이들의 비닐 화합물은, 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다. 따라서, 이들의 비닐 화합물이 공중합한 비닐 중합체여도 된다.
상기 공중합체에 있어서는, 폴리비닐아세탈 수지와, 비닐 화합물 A와의 SP값의 차가 0.5 이상인 것이 바람직하다. 이 경우, 상분리 구조를 보다 한층 용이하게 형성할 수 있다. 폴리비닐아세탈 수지와, 비닐 화합물 A와의 SP값의 차는, 보다 바람직하게는 1.0 이상이다. 또한, SP값의 차의 상한값은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 10.0으로 할 수 있다.
상기 공중합체는, 제1 상이 폴리비닐아세탈 수지이고, 제2 상이 비닐 화합물 A인 것이 바람직하다. 상기 공중합체의 폴리비닐아세탈 수지 부분에 의해 제1 상이 형성되어 있고, 비닐 화합물 A 부분에 의해 제2 상이 형성되어 있는 것이 바람직하다. 이 경우, 폴리비닐아세탈 수지의 제1 상이 바다부이고, 비닐 화합물 A의 제2 상이 섬부인 것이 바람직하다. 다만, 비닐 화합물 A의 제1 상이 바다부이고, 폴리비닐아세탈 수지의 제2 상이 섬부여도 된다.
공중합체 중에 있어서의, 비닐 화합물 A의 함유 분율(몰/몰)은, 바람직하게는 0.015 이상, 보다 바람직하게는 0.3 이상, 바람직하게는 0.95 이하, 보다 바람직하게는 0.90 이하, 더욱 바람직하게는 0.70 이하이다. 상기 함유 분율이 상기 하한 이상에 있는 경우, 상분리 구조를 보다 한층 용이하게 형성할 수 있다. 상기 함유 분율이 상기 상한 이하에 있는 경우, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
<폴리비닐아세탈 수지>
이하, 폴리비닐아세탈 수지(공중합체의 폴리비닐아세탈 수지 부분)에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
폴리비닐아세탈 수지는, 측쇄에 아세탈기와, 아세틸기와, 수산기를 갖는다.
폴리비닐아세탈 수지의 합성 방법은, 폴리비닐알코올을 알데히드에 의해 아세탈화하는 공정을 적어도 구비한다.
폴리비닐아세탈 수지를 얻기 위한 폴리비닐알코올의 아세탈화에 사용되는 알데히드는, 특별히 한정되지 않는다. 알데히드로서는, 예를 들어 탄소수가 1 내지 10의 알데히드를 들 수 있다. 알데히드는, 쇄상 지방족기, 환상 지방족기 또는 방향족기를 갖고 있어도 된다. 알데히드는, 쇄상 알데히드여도 되고, 환상 알데히드여도 된다.
상기 알데히드로서는, 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부틸알데히드, 펜탄알, 헥산알, 헵탄알, 옥탄알, 노난알, 데칸알, 아크롤레인, 벤즈알데히드, 신남알데히드, 페릴알데히드, 포르밀피리딘, 포르밀이미다졸, 포르밀피롤, 포르밀피페리딘, 포르밀트리아졸, 포르밀테트라졸, 포르밀인돌, 포르밀이소인돌, 포르밀푸린, 포르밀벤즈이미다졸, 포르밀벤조트리아졸, 포르밀퀴놀린, 포르밀이소퀴놀린, 포르밀퀴녹살린, 포르밀신놀린, 포르밀프테리딘, 포르밀푸란, 포르밀옥솔란, 포르밀옥산, 포르밀티오펜, 포르밀티올란, 포르밀티안, 포르밀아데닌, 포르밀구아닌, 포르밀시토신, 포르밀티민, 또는 포르밀우라실 등을 들 수 있다. 이들의 알데히드는, 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다.
알데히드는, 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부틸알데히드, 또는 펜탄알인 것이 바람직하고, 부틸알데히드인 것이 보다 바람직하다. 따라서, 폴리비닐아세탈 골격은, 폴리비닐부티랄 골격인 것이 바람직하다. 폴리비닐아세탈 수지는, 폴리비닐부티랄 수지인 것이 바람직하다.
세포의 접착성을 보다 한층 높이는 관점에서는, 폴리비닐아세탈 수지는, 브뢴스테드 염기성기 또는 브뢴스테드 산성기를 갖는 것이 바람직하고, 브뢴스테드 염기성기를 갖는 것이 보다 바람직하다. 즉, 폴리비닐아세탈 수지의 일부가 브뢴스테드 염기성기 또는 브뢴스테드 산성기에 의해 변성되어 있는 것이 바람직하고, 폴리비닐아세탈 수지의 일부가 브뢴스테드 염기성기로 변성되어 있는 것이 보다 바람직하다.
브뢴스테드 염기성기는, 수소 이온 H+를 다른 물질로부터 수취할 수 있는 관능기의 총칭이다. 브뢴스테드 염기성기로서는, 이민 구조를 갖는 치환기, 이미드 구조를 갖는 치환기, 아민 구조를 갖는 치환기, 또는 아미드 구조를 갖는 치환기 등의 아민계 염기성기를 들 수 있다. 브뢴스테드 염기성기는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 히드록시아미노기, 우레아기, 구아니딘, 비구아니드 등의 공액 아민계 관능기, 피페라진, 피페리딘, 피롤리딘, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄, 헥사메틸렌테트라아민, 모르폴린, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 피롤, 아자트로피리덴, 피리돈, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 벤조트리아졸, 피라졸, 옥사졸, 이미다졸린, 트리아졸, 티아졸, 티아진, 테트라졸, 인돌, 이소인돌, 푸린, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 신놀린, 프테리딘, 카르바졸, 아크리딘, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실, 멜라민 등의 헤테로환 아미노계 관능기, 포르피린, 클로린, 콜린 등의 환상 피롤계 관능기, 또는 그들의 유도체 등을 들 수 있다.
브뢴스테드 산성기로서는, 카르복실기, 술폰산기, 말레산기, 술핀산기, 술펜산기, 인산기, 포스폰산기, 또는 이들의 염 등을 들 수 있다. 브뢴스테드 산성기는, 카르복실기인 것이 바람직하다.
폴리비닐아세탈 수지는, 이민 구조를 갖는 구조 단위, 이미드 구조를 갖는 구조 단위, 아민 구조를 갖는 구조 단위, 또는 아미드 구조를 갖는 구조 단위를 갖는 것이 바람직하다. 이 경우, 이들의 구조 단위 중 1종만을 갖고 있어도 되고, 2종 이상을 갖고 있어도 된다.
폴리비닐아세탈 수지는, 이민 구조를 갖는 구조 단위를 갖고 있어도 된다. 이민 구조란, C=N 결합을 갖는 구조를 말한다. 특히, 폴리비닐아세탈 수지는, 이민 구조를 측쇄에 갖는 것이 바람직하다.
폴리비닐아세탈 수지는, 이미드 구조를 갖는 구조 단위를 갖고 있어도 된다. 이미드 구조를 갖는 구조 단위는, 이미노기(=NH)를 갖는 구조 단위인 것이 바람직하다.
폴리비닐아세탈 수지는, 이미노기를 측쇄에 갖는 것이 바람직하다. 이 경우, 이미노기는, 폴리비닐아세탈 수지의 주쇄를 구성하는 탄소 원자에 직접 결합하고 있어도 되고, 알킬렌기 등의 연결기를 통해 주쇄에 결합하고 있어도 된다.
폴리비닐아세탈 수지는, 아민 구조를 갖는 구조 단위를 갖고 있어도 된다. 상기 아민 구조에 있어서의 아민기는, 제1급 아민기여도 되고, 제2급 아민기여도 되고, 제3급 아민기여도 되고, 제4급 아민기여도 된다.
아민 구조를 갖는 구조 단위는, 아미드 구조를 갖는 구조 단위여도 된다. 상기 아미드 구조란, -C(=O)-NH-를 갖는 구조를 말한다.
폴리비닐아세탈 수지는, 아민 구조 또는 아미드 구조를 측쇄에 갖는 것이 바람직하다. 이 경우, 아민 구조 또는 아미드 구조는, 폴리비닐아세탈 수지의 주쇄를 구성하는 탄소 원자에 직접 결합하고 있어도 되고, 알킬렌기 등의 연결기를 통해 주쇄에 결합하고 있어도 된다.
또한, 이민 구조를 갖는 구조 단위의 함유율, 이미드 구조를 갖는 구조 단위의 함유율, 아민 구조를 갖는 구조 단위의 함유율, 아미드 구조를 갖는 구조 단위의 함유율은, 1H-NMR(핵자기 공명 스펙트럼)에 의해 측정할 수 있다.
<비닐 화합물 A>
이하, 비닐 화합물 A에 대하여 의해 상세하게 설명한다.
비닐 화합물 A는, (메트)아크릴산에스테르 또는 폴리(메트)아크릴산에스테르 수지인 것이 바람직하다. 특히, 합성 수지 X가, 폴리비닐아세탈 수지에, (메트)아크릴산에스테르 또는 그의 중합체인 폴리(메트)아크릴산에스테르 수지가 그라프트 공중합한 공중합체인 것이 바람직하다.
폴리(메트)아크릴산에스테르 수지는, (메트)아크릴산에스테르의 중합에 의해, 혹은 (메트)아크릴산에스테르와, 상기 다른 모노머와의 중합에 의해 얻어진다.
(메트)아크릴산에스테르로서는, (메트)아크릴산알킬에스테르, (메트)아크릴산 환상 알킬에스테르, (메트)아크릴산아릴에스테르, (메트)아크릴아미드류, (메트)아크릴산폴리에틸렌글리콜류, (메트)아크릴산포스포릴콜린 등을 들 수 있다.
(메트)아크릴산알킬에스테르로서는, 메틸(메트)아크릴레이트, 에틸(메트)아크릴레이트, n-프로필(메트)아크릴레이트, 이소프로필(메트)아크릴레이트, n-부틸(메트)아크릴레이트, 이소부틸(메트)아크릴레이트, t-부틸(메트)아크릴레이트, n-옥틸(메트)아크릴레이트, 이소옥틸(메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실(메트)아크릴레이트, 노닐(메트)아크릴레이트, 이소노닐(메트)아크릴레이트, 데실(메트)아크릴레이트, 이소데실(메트)아크릴레이트, 라우릴(메트)아크릴레이트, 또는 스테아릴(메트)아크릴레이트, 이소테트라데실(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
또한, (메트)아크릴산알킬에스테르는, 탄소수 1 내지 3의 알콕시기 및 테트라히드로푸르푸릴기 등의 치환기로 치환되어 있어도 된다. 이러한 (메트)아크릴산알킬에스테르의 예로서는, 메톡시에틸아크릴레이트, 테트라히드로푸르푸릴아크릴레이트 등을 들 수 있다.
(메트)아크릴산 환상 알킬에스테르로서는, 시클로헥실(메트)아크릴레이트, 또는 이소보르닐(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
(메트)아크릴산아릴에스테르로서는, 페닐(메트)아크릴레이트, 또는 벤질(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
(메트)아크릴아미드류로서는, (메트)아크릴아미드, N-이소프로필(메트)아크릴아미드, N-tert-부틸(메트)아크릴아미드, N,N'-디메틸(메트)아크릴아미드, (3-(메트)아크릴아미드프로필)트리메틸암모늄 클로라이드, 4-(메트)아크릴로일모르폴린, 3-(메트)아크릴로일-2-옥사졸리디논, N-[3-(디메틸아미노)프로필](메트)아크릴아미드, N-(2-히드록시에틸)(메트)아크릴아미드, N-메틸올(메트)아크릴아미드, 또는 6-(메트)아크릴아미드헥산산 등을 들 수 있다.
(메트)아크릴산폴리에틸렌글리콜류로서는, 예를 들어 메톡시-폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 에톡시-폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 히드록시-폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 메톡시-디에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 에톡시-디에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 히드록시-디에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 메톡시-트리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 에톡시-트리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 또는 히드록시-트리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
(메트)아크릴산포스포릴콜린으로서는, 2-(메트)아크릴로일옥시에틸포스폴린콜린 등을 들 수 있다.
(메트)아크릴산에스테르와 공중합되는 다른 모노머로서는, 비닐 화합물이 적합하게 사용된다. 비닐 화합물로서는, 에틸렌, 알릴아민, 비닐피롤리돈, 비닐이미다졸, 무수 말레산, 말레이미드, 이타콘산, (메트)아크릴산, 비닐아민, 또는 (메트)아크릴산에스테르 등을 들 수 있다. 비닐 화합물은, 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「(메트)아크릴」이란, 「아크릴」 또는 「메타크릴」을 의미하고, 「(메트)아크릴레이트」란, 「아크릴레이트」 또는 「메타크릴레이트」를 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서, 합성 수지 X는, 본 발명의 상분리 구조를 형성 가능한 한에 있어서, 폴리(메트)아크릴산에스테르 골격을 갖는 수지와 다른 비닐 화합물과의 공중합체여도 된다.
이 경우의 다른 비닐 화합물은, 에틸렌, 알릴아민, 비닐피롤리돈, 무수 말레산, 말레이미드, 이타콘산, (메트)아크릴산, 비닐아민, 또는 SP값이 다른 다른(메트)아크릴산에스테르 등을 사용할 수 있다.
(펩티드부를 갖는 합성 수지 X)
세포배양용 스캐폴드 재료는, 펩티드부를 갖는 합성 수지 X를 포함하는 것이 바람직하다. 펩티드부를 갖는 합성 수지 X는, 합성 수지 X와, 링커와, 펩티드를 반응시켜서 얻을 수 있다. 펩티드부를 갖는 합성 수지 X는, 폴리비닐아세탈 수지부와, 링커부와, 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지인 것이 바람직하고, 폴리비닐부티랄 수지부와, 링커부와, 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐부티랄 수지인 것이 보다 바람직하다. 펩티드부를 갖는 합성 수지 X는, 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다.
상기 펩티드부는, 3개 이상의 아미노산에 의해 구성되는 것이 바람직하고, 4개 이상의 아미노산에 의해 구성되는 것이 보다 바람직하고, 5개 이상의 아미노산에 의해 구성되는 것이 더욱 바람직하고, 10개 이하의 아미노산에 의해 구성되는 것이 바람직하고, 6개 이하의 아미노산에 의해 구성되는 것이 보다 바람직하다. 상기 펩티드부를 구성하는 아미노산의 개수가 상기 하한 이상 및 상기 상한 이하이면, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
상기 펩티드부는, 세포 접착성의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 세포 접착성의 아미노산 서열이란, 파지 디스플레이법, 세파로즈 비즈법, 또는 플레이트 코팅법에 의해 세포 접착 활성이 확인되고 있는 아미노산 서열을 말한다. 상기 파지 디스플레이법으로서는, 예를 들어 「The Journal of Cell Biology, Volume 130, Number 5, September 1995 1189-1196」에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 상기 세파로즈 비즈법으로서는, 예를 들어 「단백질 핵산 효소 Vol.45 No.15(2000) 2477」에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 상기 플레이트 코팅법으로서는, 예를 들어 「단백질 핵산 효소 Vol.45 No.15(2000) 2477」에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
상기 세포 접착성의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 RGD 서열(Arg-Gly-Asp), YIGSR 서열(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR 서열(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), HAV 서열(His-Ala-Val), ADT 서열(Ala-Asp-Thr), QAV 서열(Gln-Ala-Val), LDV 서열(Leu-Asp-Val), IDS 서열(Ile-Asp-Ser), REDV 서열(Arg-Glu-Asp-Val), IDAPS 서열(Ile-Asp-Ala-Pro-Ser), KQAGDV 서열(Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val) 및 TDE 서열(Thr-Asp-Glu) 등을 들 수 있다. 또한, 상기 세포 접착성의 아미노산 서열로서는, 「병태 생리, 제9권 제7호, 527 내지 535 페이지, 1990년」 및 「오사카부립 모자 의료 센터 잡지, 제8권 제1호, 58 내지 66 페이지, 1992년」에 기재되어 있는 서열 등도 들 수 있다. 상기 펩티드부는, 상기 세포 접착성의 아미노산 서열을 1종만 갖고 있어도 되고, 2종 이상을 가져도 된다.
상기 세포 접착성의 아미노산 서열은, 상술한 세포 접착성의 아미노산 서열 중 적어도 어느 하나를 갖는 것이 바람직하고, RGD 서열, YIGSR 서열, 또는 PDSGR 서열을 적어도 갖는 것이 보다 바람직하고, 하기 식 (1)로 표시되는 RGD 서열을 적어도 갖는 것이 더욱 바람직하다. 이 경우에는, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높여, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다.
Arg-Gly-Asp-X ···식 (1)
상기 식 (1) 중, X는, Gly, Ala, Val, Ser, Thr, Phe, Met, Pro 또는 Asn을 나타낸다.
상기 펩티드부는, 직쇄상이어도 되고, 환상 펩티드 골격을 갖고 있어도 된다. 상기 환상 펩티드 골격이란, 복수개의 아미노산에 의해 구성된 환상 골격이다. 본 발명의 효과를 한층 효과적으로 발휘시키는 관점에서는, 상기 환상 펩티드 골격은, 4개 이상의 아미노산에 의해 구성되는 것이 바람직하고, 5개 이상의 아미노산에 의해 구성되는 것이 바람직하고, 10개 이하의 아미노산에 의해 구성되는 것이 바람직하다.
펩티드부를 갖는 합성 수지 X에 있어서, 상기 펩티드부의 함유율은, 바람직하게는 0.1몰％ 이상, 보다 바람직하게는 1몰％ 이상, 더욱 바람직하게는 5몰％ 이상, 특히 바람직하게는 10몰％ 이상이다. 펩티드부를 갖는 합성 수지 X에 있어서, 상기 펩티드부의 함유율은, 바람직하게는 60몰％ 이하, 보다 바람직하게는 50몰％ 이하, 더욱 바람직하게는 35몰％ 이하, 특히 바람직하게는 25몰％ 이하이다. 상기 펩티드부의 함유율이 상기 하한 이상이면, 상분리 구조를 보다 한층 용이하게 형성 할 수 있다. 상기 펩티드부의 함유율이 상기 하한 이상이면, 파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높일 수 있고, 세포의 증식률을 보다 한층 높일 수 있다. 또한, 상기 펩티드부의 함유율이 상기 상한 이하이면, 제조 비용을 억제할 수 있다. 또한, 상기 펩티드부의 함유율(몰％)은, 펩티드부를 갖는 합성 수지 X를 구성하는 각 구조 단위의 물질량의 총합에 대한 상기 펩티드부의 물질량이다.
상기 펩티드부의 함유율은, FT-IR 또는 LC-MS에 의해 측정할 수 있다.
파종 후의 세포와의 접착성을 보다 한층 높이는 관점 및 세포의 증식률을 보다 한층 높이는 관점에서, 펩티드부를 갖는 합성 수지 X에서는, 제2 상이 펩티드부를 갖는 것이 바람직하고, 해당 펩티드부가 상기 세포 접착성의 아미노산 서열을 갖는 것이 보다 바람직하다. 펩티드부를 갖는 합성 수지 X의 펩티드부 부분에 의해 제2 상이 형성되어 있는 것이 바람직하다. 이 경우, 펩티드부를 갖는 제2 상이 섬부인 것이 바람직하다. 다만, 제1 상이 펩티드부를 갖고 있어도 되고, 펩티드부를 갖는 제2 상이 바다부여도 된다.
펩티드부를 갖는 합성 수지 X에 있어서, 합성 수지 X 부분과 펩티드부와는, 링커를 통해 결합하고 있는 것이 바람직하다. 즉, 펩티드부를 갖는 합성 수지 X는, 펩티드부와 링커부를 갖는 합성 수지 X인 것이 바람직하다. 상기 링커는, 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다.
상기 링커는, 상기 펩티드의 카르복실기 또는 아미노기와 축합 가능한 관능기를 갖는 화합물인 것이 바람직하다. 상기 펩티드의 카르복실기 또는 아미노기와 축합 가능한 관능기로서는, 카르복실기, 티올기 및 아미노기 등을 들 수 있다. 펩티드와 양호하게 반응시키는 관점에서는, 상기 링커는, 카르복실기를 갖는 화합물인 것이 바람직하다. 상기 링커로서, 상술한 비닐 화합물 A를 사용할 수도 있다.
상기 카르복실기를 갖는 링커로서는, (메트)아크릴산 및 카르복실기 함유 아크릴아미드 등을 들 수 있다. 상기 카르복실기를 갖는 링커로서 중합성 불포화기를 갖는 카르복실산(카르복실산 모노머)을 사용함으로써, 링커와 합성 수지 X를 반응시킬 때, 그라프트 중합에 의해 해당 카르복실산 모노머를 중합시킬 수 있기 때문에, 펩티드와 반응시킬 수 있는 카르복실기의 개수를 증가시킬 수 있다.
[세포배양용 스캐폴드 재료]
세포배양용 스캐폴드 재료는, 상기 합성 수지 X를 포함한다. 본 발명의 효과를 효과적으로 발휘시키는 관점 및 생산성을 높이는 관점에서는, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료 100중량％ 중, 상기 합성 수지 X의 함유량은, 바람직하게는 90중량％ 이상, 보다 바람직하게는 95중량％ 이상, 더욱 바람직하게는 97.5중량％ 이상, 특히 바람직하게는 99중량％ 이상, 가장 바람직하게는 100중량％(전량)이다. 따라서, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 상기 합성 수지 X인 것이 가장 바람직하다. 상기 합성 수지 X의 함유량이 상기 하한 이상이면, 본 발명의 효과를 보다 한층 효과적으로 발휘시킬 수 있다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 상기 합성 수지 X 이외의 성분을 포함하고 있어도 된다. 상기 합성 수지 X 이외의 성분으로서는, 폴리올레핀 수지, 폴리에테르 수지, 폴리비닐알코올 수지, 폴리에스테르, 에폭시 수지, 폴리아미드 수지, 폴리이미드 수지, 폴리우레탄 수지, 폴리카르보네이트 수지, 다당류, 셀룰로오스, 폴리펩티드, 합성 펩티드 등을 들 수 있다.
본 발명의 효과를 효과적으로 발휘시키는 관점에서, 상기 합성 수지 X 이외의 성분의 함유량은 적을수록 좋다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료 100중량％ 중, 해당 성분의 함유량은, 바람직하게는 10중량％ 이하, 보다 바람직하게는 5중량％ 이하, 더욱 바람직하게는 2.5중량％ 이하, 특히 바람직하게는 1중량％ 이하, 가장 바람직하게는 0중량％(미함유)이다. 따라서, 세포배양용 스캐폴드 재료는, 합성 수지 X 이외의 성분을 포함하지 않는 것이 가장 바람직하다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 동물 유래의 원료를 실질적으로 포함하지 않는 것이 바람직하다. 동물 유래의 원료를 포함하지 않음으로써, 안전성이 높고, 또한, 제조 시에 품질의 변동이 적은 세포배양용 스캐폴드 재료를 제공할 수 있다. 또한, 「동물 유래의 원료를 실질적으로 포함하지 않는다」란, 세포배양용 스캐폴드 재료 중에 있어서의 동물 유래의 원료가, 3중량％ 이하인 것을 의미한다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 세포배양용 스캐폴드 재료 중에 있어서의 동물 유래의 원료가, 1중량％ 이하인 것이 바람직하고, 0중량％인 것이 보다 바람직하다. 즉, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 동물 유래의 원료를 전혀 포함하지 않는 것이 보다 바람직하다.
(세포배양용 스캐폴드 재료를 사용한 세포배양)
상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 세포를 배양하기 위하여 사용된다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 세포를 배양할 때의 해당 세포의 스캐폴드으로서 사용된다. 따라서, 본 발명의 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막은, 세포를 배양하기 위하여 사용되고, 또한, 세포를 배양할 때의 해당 세포의 스캐폴드으로서 사용된다.
상기 세포로서는, 인간, 마우스, 래트, 돼지, 소 및 원숭이 등의 동물 세포를 들 수 있다. 또한, 상기 세포로서는, 체세포 등을 들 수 있고, 예를 들어 줄기세포, 전구세포 및 성숙 세포 등을 들 수 있다. 상기 체세포는, 암세포여도 된다.
상기 성숙 세포로서는, 신경세포, 심근세포, 망막세포 및 간세포 등을 들 수 있다.
상기 줄기세포로서는, 간엽계 줄기세포(MSC), iPS 세포, ES 세포, Muse 세포, 배성 암세포, 배성 생식 줄기세포 및 mGS 세포 등을 들 수 있다.
(세포배양용 스캐폴드 재료의 형상)
본 발명의 수지막은, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된다. 상기 수지막은, 세포배양용 스캐폴드 재료를 사용하여 형성된다. 상기 수지막은, 막상의 세포배양용 스캐폴드 재료인 것이 바람직하다. 상기 수지막은, 세포배양용 스캐폴드 재료의 막상물인 것이 바람직하다.
본 명세서에서는, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료를 포함하는, 입자, 섬유, 다공체, 또는 필름도 제공한다. 이 경우, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료의 형상은 특별히 한정되지 않고, 입자여도, 섬유여도, 다공체여도, 필름이어도 된다. 또한, 상기 입자, 섬유, 다공체, 또는 필름은, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료 이외의 구성 요소를 포함하고 있어도 된다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료를 포함하는 필름은, 세포를 평면 배양(이차원 배양)하기 위하여 사용되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료를 포함하는, 입자, 섬유, 또는 다공체는, 세포를 삼차원 배양하기 위하여 사용되는 것이 바람직하다.
(세포배양용 담체)
본 발명은, 담체의 표면 상에 상기 수지막이 배치되어 있는, 세포배양용 담체에도 관한 것이다. 본 발명의 세포배양용 담체는, 예를 들어 담체의 표면 상에 상기 수지막을 코팅 등에 의해 배치함으로써 얻을 수 있다. 상기 담체의 형상은, 입자, 섬유, 다공체, 또는 필름이어도 된다. 즉, 본 발명의 세포배양용 담체는, 입자, 섬유, 다공체, 또는 필름의 형상이어도 된다. 또한, 본 발명의 세포배양용 담체는, 상기 담체 및 상기 수지막 이외의 구성 요소를 포함하고 있어도 된다.
(세포배양용 용기)
본 발명은 세포의 배양 영역의 적어도 일부에 상기 수지막을 구비하는, 세포배양용 용기에도 관한 것이다. 도 1은, 본 발명의 일 실시 형태에 따른 세포배양용 용기를 모식적으로 도시하는 단면도이다.
세포배양용 용기(1)는, 용기 본체(2)와, 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막(3)을 구비한다. 용기 본체(2)의 표면(2a) 상에 수지막(3)이 배치되어 있다. 용기 본체(2)의 저면 상에 수지막(3)이 배치되어 있다. 세포배양용 용기(1)에 액체 배지를 첨가하고, 또한, 세포를 수지막(3)의 표면에 파종함으로써, 세포를 평면 배양할 수 있다.
또한, 용기 본체는, 제1 용기 본체와, 해당 제1 용기 본체의 저면 상에 커버 유리 등의 제2 용기 본체를 구비하고 있어도 된다. 제1 용기 본체와 제2 용기 본체는 분리 가능하여도 된다. 이 경우, 제2 용기 본체의 표면 상에, 해당 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막이 배치되어 있어도 된다.
상기 용기 본체로서, 종래 공지된 용기 본체(용기)를 사용할 수 있다. 상기 용기 본체의 형상 및 크기는 특별히 한정되지 않는다.
상기 용기 본체로서는, 1개 또는 복수개의 웰(구멍)을 구비하는 세포배양용 플레이트 및 세포배양용 플라스크 등을 들 수 있다. 상기 플레이트의 웰 수는 특별히 한정되지 않는다. 해당 웰 수로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 2, 4, 6, 12, 24, 48, 96, 384 등을 들 수 있다. 상기 웰의 형상으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 진원, 타원, 삼각형, 정사각형, 직사각형, 오각형 등을 들 수 있다. 상기 웰 저면의 형상으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 평평한 바닥, 둥근 바닥, 요철 등을 들 수 있다.
상기 용기 본체의 재질은 특별히 한정되지 않지만, 수지, 금속 및 무기 재료를 들 수 있다. 상기 수지로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 폴리이소프렌, 시클로올레핀 폴리머, 폴리이미드, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, (메트)아크릴 수지, 에폭시 수지, 실리콘 등을 들 수 있다. 상기 금속으로서는, 스테인리스, 구리, 철, 니켈, 알루미늄, 티타늄, 금, 은, 백금 등을 들 수 있다. 상기 무기 재료로서는, 산화규소(유리), 산화알루미늄, 산화티타늄, 산화지르코늄, 산화철, 질화규소 등을 들 수 있다.
실시예
이어서, 본 발명의 구체적인 실시예 및 비교예를 들음으로써 본 발명을 분명하게 한다. 또한, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
세포배양용 스캐폴드 재료의 원료로서, 이하의 합성 수지를 합성하였다.
(실시예 1)
교반 장치를 구비한 반응기에, 이온 교환수 2700mL, 평균 중합도 1700, 비누화도 98몰％의 폴리비닐알코올을 300중량부 투입하고, 교반하면서 가열 용해하고, 용액을 얻었다. 얻어진 용액에, 촉매로서, 염산 농도가 0.2중량％로 되도록 35중량％ 염산을 첨가하였다. 이어서, 온도를 15℃로 조정하고, 교반하면서 n-부틸알데히드 22중량부를 첨가하였다. 이어서, n-부틸알데히드 148중량부를 첨가하고, 백색 입자상의 폴리비닐부티랄 수지를 석출시켰다. 석출하고 나서 15분 후에, 염산 농도가 1.8중량％로 되도록 35중량％ 염산을 첨가한 후, 50℃로 가열하고, 50℃에서 2시간 유지하였다. 이어서, 용액을 냉각하고, 중화한 후, 수세하고, 건조시킴으로써, 폴리비닐아세탈 수지로서의 폴리비닐부티랄 수지(PVB, SP값: 9.9)를 얻었다. 얻어진 폴리비닐부티랄 수지 90중량부를, 1중량％의 용액으로 되도록 테트라히드로푸란에 용해시켜, 개시제로서 이르가큐어 184를 5중량부, N-비닐피롤리돈(SP값: 11.7) 2중량부 및 n-라우릴메타크릴레이트(SP값: 8.2) 8중량부를 첨가하고, 그라프트 중합을 행함으로써, 합성 수지를 얻었다. 얻어진 합성 수지는, 아세탈화도(부티랄화도) 69몰％, 수산기량 27.5몰％, 아세틸화도 2.0몰％, 비닐피롤리돈기의 함유율 0.3몰％, n-라우릴메타크릴레이트부의 함유율 1.2몰％였다.
(실시예 2 내지 11 및 비교예 1)
폴리비닐부티랄 수지, N-비닐피롤리돈 및 n-라우릴메타크릴레이트의 중량 비율을 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여 합성 수지를 얻었다. 실시예 2 내지 11 및 비교예 1에서 얻어진 합성 수지의 아세탈화도(부티랄화도), 수산기량, 아세틸화도, 비닐피롤리돈기의 함유율, n-라우릴메타크릴레이트부의 함유율을 표 1, 표 2 및 표 4에 나타내었다.
(실시예 12)
교반 장치를 구비한 반응기에, 이온 교환수 2700mL, 평균 중합도 1700, 비누화도 99몰％의 폴리비닐알코올을 300중량부 투입하고, 교반하면서 가열 용해하고, 용액을 얻었다. 얻어진 용액에, 촉매로서, 염산 농도가 0.2중량％로 되도록 35중량％ 염산을 첨가하였다. 이어서, 온도를 15℃로 조정하고, 교반하면서 n-부틸알데히드 22중량부를 첨가하였다. 이어서, n-부틸알데히드 148중량부를 첨가하고, 백색 입자상의 폴리비닐아세탈 수지(폴리비닐부티랄 수지)를 석출시켰다. 석출하고 나서 15분 후에, 염산 농도가 1.8중량％가 되도록 35중량％ 염산을 첨가한 후, 50℃로 가열하고, 50℃에서 2시간 유지하였다. 이어서, 용액을 냉각하고, 중화한 후, 폴리비닐부티랄 수지를 수세하고, 건조시켜서, 폴리비닐아세탈 수지(폴리비닐부티랄 수지, 평균 중합도 1700, 아세탈화도(부티랄화도) 70몰％, 수산기량 27몰％, 아세틸화도 3몰％)를 얻었다.
링커의 도입:
얻어진 폴리비닐아세탈 수지 99중량부와, 아크릴산(링커) 1중량부를 THF 300중량부에 용해하고, 광 라디칼 중합 개시제의 존재 하에서, 자외선 조사 하에서 20분간 반응시켜, 폴리비닐아세탈 수지와 아크릴산을 그라프트 공중합시킴으로써, 링커를 도입하였다. 링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지 1중량부를 부탄올 19중량부에 용해시켰다. 얻어진 용액 150μL를, 에어 더스터로 제진한 φ22mm의 커버 유리(마쓰나미사제 「22원 No.1」)의 표면 상에 토출하고, 스핀 코터를 사용하여 2000rpm, 20초 회전시킨 후, 60℃에서 60분간 가열하여, 표면이 평활한 수지막을 얻었다.
펩티드부의 형성:
Gly-Arg-Gly-Asp-Ser의 아미노산 서열을 갖는 직쇄상의 펩티드(아미노산 잔기수 5개, 표에서는 GRGDS라고 기재)를 준비하였다. 이 펩티드 10중량부와, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(축합제) 1중량부를, 칼슘 및 마그네슘의 양쪽을 포함하지 않는 인산 완충 생리 식염수에 해당 펩티드의 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하고, 펩티드 함유액을 제작하였다. 이 펩티드 함유액 1중량부를, 스핀 코팅한 수지막(링커를 형성한 폴리비닐아세탈 수지)에 첨가하고, 반응시켜서, 링커의 카르복실기와, 펩티드의 Gly의 아미노기를 탈수 축합하였다. 이와 같이 하여, 폴리비닐아세탈 수지부와, 링커부와, 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
얻어진 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지는, 아세탈화도(부티랄화도) 69몰％, 수산기량 27몰％, 아세틸화도 3몰％, 카르복실기의 함유율 0.1몰％, 펩티드부의 함유율 1.0몰％였다.
(실시예 13)
링커의 도입에 있어서, 85중량부의 폴리비닐아세탈 수지와 15중량부의 아크릴산(링커)을 사용한 것, 펩티드의 형성에 있어서, 펩티드의 첨가량을 15중량부로 변경한 것 이외에는, 실시예 12와 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
(실시예 14)
링커의 도입에 있어서, 70중량부의 폴리비닐아세탈 수지와 30중량부의 아크릴산(링커)을 사용한 것, 펩티드의 형성에 있어서, 펩티드의 첨가량을 30중량부로 변경한 것 이외에는, 실시예 12와 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
(실시예 15)
링커의 도입에 있어서, 67중량부의 폴리비닐아세탈 수지와33중량부의 아크릴산(링커)을 사용한 것, 펩티드의 형성에 있어서, 펩티드의 첨가량을 33중량부로 변경한 것 이외에는, 실시예 12와 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
(실시예 16)
링커의 도입에 있어서, 63중량부의 폴리비닐아세탈 수지와 37중량부의 아크릴산(링커)을 사용한 것, 펩티드의 형성에 있어서, 펩티드의 첨가량을 37중량부로 변경한 것 이외에는, 실시예 12와 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
(실시예 17)
링커의 도입에 있어서, 30중량부의 폴리비닐아세탈 수지와 70중량부의 아크릴산(링커)을 사용한 것, 펩티드의 형성에 있어서, 펩티드의 첨가량을 70중량부로 변경한 것 이외에는, 실시예 12와 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
(비교예 2)
합성 수지로서, 폴리스티렌 수지를 그대로 사용하였다.
(비교예 3)
교반 장치를 구비한 반응기에, 이온 교환수 2700mL, 평균 중합도 1700, 비누화도 98몰％의 폴리비닐알코올을 300중량부 투입하고, 교반하면서 가열 용해하고, 용액을 얻었다. 얻어진 용액에, 촉매로서, 염산 농도가 0.2중량％로 되도록 35중량％ 염산을 첨가하였다. 이어서, 온도를 15℃로 조정하고, 교반하면서 n-부틸알데히드 22중량부를 첨가하였다. 이어서, n-부틸알데히드 148중량부를 첨가하고, 백색 입자상의 폴리비닐부티랄 수지를 석출시켰다. 석출하고 나서 15분 후에, 염산 농도가 1.8중량％로 되도록 35중량％ 염산을 첨가한 후, 50℃로 가열하고, 50℃에서 2시간 유지하였다. 이어서, 용액을 냉각하고, 중화한 후, 수세하고, 건조시킴으로써 폴리비닐부티랄 수지(SP값: 9.9)를 얻었다. 즉, 비닐 화합물이 공중합하고 있지 않은 폴리비닐부티랄 수지(합성 수지)를 얻었다.
(비교예 4)
N-비닐피롤리돈 17중량부 및 n-라우릴메타크릴레이트 83중량부를 혼합하고, (메트)아크릴 모노머 용액을 얻었다. 얻어진 (메트)아크릴 모노머 용액에 이르가큐어 184(BASF사제) 1중량부를 용해시켜, PET 필름 상에 도포하였다. 도포물을 25℃에서 아이 그래픽스사제, UV 컨베이어 장치 「ECS301G1」을 사용하여, 365nm의 파장의 광을 적산 광량 2000mJ/㎠로 조사함으로써 폴리(메트)아크릴산에스테르 수지 용액을 얻었다. 얻어진 폴리(메트)아크릴산에스테르 수지 용액을 80℃, 3시간 진공 건조시킴으로써 폴리(메트)아크릴산에스테르 수지로서의 합성 수지를 얻었다.
(참고예 A)
천연물 유래의 스캐폴드재의 제작:
인산 버퍼(PBS) 중에 5μg/ml로 조정한 비트로넥틴(코닝사제) 용액을 φ35mm 디쉬에 1ml 첨가하였다. 거기에 φ22mm의 커버 유리(마쓰나미사제 「22원 No.1」)를 침지시켜, 37℃에서 1시간 양생함으로써 비트로넥틴이 표면에 평활하게 흡착된 천연물 유래의 스캐폴드재(표 중에서는 VTN이라고 기재)를 얻었다.
세포배양용 용기의 제작:
비트로넥틴과 커버 유리와의 적층체를, φ22mm의 폴리스티렌 디쉬에 배치함으로써 세포배양용 용기를 얻었다. 또한, 비트로넥틴은 건조하면 변성되고, 접착 성능이 크게 저하되어 버리기 때문에, 세포배양용 용기의 제작 후 바로 PBS 용액으로 침지하였다.
[평가]
(아세탈화도 및 양이온성기 변성도)
실시예 및 비교예에서 얻어진 합성 수지의 아세탈화도 및 양이온성기 변성도는, 합성 수지를 DMSO-d6(디메틸술폭시드)에 용해한 후, 1H-NMR(핵자기 공명 스펙트럼)에 의해 측정하였다.
(저장 탄성률)
각 스캐폴드 재료의 25℃ 및 100℃의 저장 탄성률은, 동적 점탄성 측정 장치(아이티 케이소쿠 세이교사제, DVA-200)에 의해 인장 조건 하, 주파수 10Hz, -150℃로부터 150℃의 온도 범위를 승온 속도 5℃/분으로 측정하였다. 얻어진 인장 저장 탄성률의 그래프로부터 25℃ 및 100℃에서의 저장 탄성률을 구하고, 25℃ 저장 탄성률/100℃ 저장 탄성률을 산출하였다. 길이 50mm, 폭 5 내지 20mm, 두께 0.1 내지 1.0mm의 측정 샘플을 사용하여, 10Hz, 변형 0.1％, 온도 -150℃ 내지 150℃ 및 승온 속도 5℃/min의 조건에서 행하였다.
(수팽윤 배율)
길이 50mm, 폭 10mm, 두께 0.05mm 내지 0.15mm의 각 스캐폴드 재료를 포함하는 수지막(측정 샘플)을, 25℃의 물에 24시간 침지하였다. 침지 전과 후의 샘플 무게를 측정하고, 수팽윤 배율=(침지 후의 샘플 중량-침지 전의 샘플 중량)/(침지 전의 샘플 중량)×100(％)을 산출하였다.
(세포배양용 용기의 제작)
실시예 1 내지 11 및 비교예 1 내지 4에서는, 얻어진 합성 수지 1g을 부탄올 19g에 용해시킴으로써, 수지 용액을 얻었다. 얻어진 수지 용액 150μL를 φ22mm의 커버 유리(마쓰나미사제, 22원 No.1을 에어 더스터로 제진하여 사용) 상에 토출하고, 스핀 코터를 사용하여 2000rpm, 20초 회전시켜서 평활한 수지막을 얻었다. 얻어진 상기 수지막을 커버 26 유리마다 φ22mm의 폴리스티렌 디쉬에 배치함으로써 세포배양용 용기를 얻었다. 실시예 12 내지 17에서는, 얻어진 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지와 커버 유리와의 적층체를, φ22mm의 폴리스티렌 디쉬에 배치함으로써 세포배양용 용기를 얻었다.
(표면 자유 에너지)
세포배양용 용기의 조제의 란에서 얻어진 수지막의 표면 자유 에너지에 대하여 접촉각계(교와 가이멘 가가꾸사제, DMo-701)를 사용하여 측정하였다. 수지막 상에 순수 1μL를 적하하고, 30초 후의 액적상을 촬영함으로써 순수의 접촉각을 얻었다. 또한, 상기 수지막 상에 디요오도메탄 1μL를 적하하고, 30초 후의 액적상을 촬영함으로써 디요오도메탄의 접촉각을 얻었다. 얻어진 접촉각으로부터, Kaelble-Uy의 이론식을 사용하여 표면 자유 에너지의 분산항 성분 γd(dSFE) 및 극성항 성분인 쌍극자 성분 γp(pSFE)를 산출하였다.
(상분리 파라미터)
세포배양용 용기의 조제의 란에서 얻어진 수지막을 원자간력 현미경(AFM, 브루커사제, 제품 번호 「Dimension XR」)에 의해 관찰하였다. 캔틸레버는 SCAN ASYST AIR을 사용하였다. 그 결과, 도 2에 도시한 바와 같이, 실시예 3의 수지막에서는, 제1 상으로서의 폴리비닐부티랄 수지부가 바다부를 형성하고, 제2 상으로서의 (메트)아크릴산에스테르 및 비닐 화합물을 갖는 수지부(N-비닐피롤리돈 및 n-라우릴메타크릴레이트의 공중합체부)가 섬부를 형성하는 해도 구조가 관찰되었다. 마찬가지로, 실시예 1 내지 2, 4 내지 11에 있어서도, 제1 상으로서의 폴리비닐부티랄 수지부가 바다부를 형성하고, 제2 상으로서의 (메트)아크릴산에스테르 및 비닐 화합물을 갖는 수지부(N-비닐피롤리돈 및 n-라우릴메타크릴레이트의 공중합체부)가 섬부를 형성하는 해도 구조가 관찰되었다. 또한, 실시예 12 내지 17에 있어서도, 제1 상으로서의 폴리비닐부티랄 수지부가 바다부를 형성하고, 제2 상으로서의 펩티드부가 섬부를 형성하는 해도 구조가 관찰되었다. 한편, 비교예 1 내지 4에서는, 상분리 구조가 관찰되지 않았다.
또한, 원자간력 현미경에 의해 얻어진 화상으로부터 화상 해석 소프트웨어(ImageJ)를 사용하여, 상술한 방법에 의해 제2 상의 표면 전체에 대한 표면적의 비(상분리 구조의 표면적 분율), 제2 상의 주위 길이와 면적과의 비(주위 길이/면적), 섬부인 제2 상의 개수(섬 개수) 및 섬부의 직경의 평균(평균 섬 사이즈)을 구하였다.
(세포 증식률)
얻어진 세포배양용 용기에 인산 완충 생리 식염수 1mL를 첨가하여 37℃의 인큐베이터 내에서 1시간 정치 후, 배양 용기 내의 인산 완충 생리 식염수를 제거하였다. 35mm 디쉬에 콘플루언트 상태가 된 h-iPS 세포 253G1의 콜로니를 첨가하고, 다음으로 1mL의 0.5mM 에틸렌디아민/인산 완충 용액을 첨가하고, 실온에서 2분 정치하였다. 그 후, 에틸렌디아민/인산 완충 용액을 제거하고, 1mL의 TeSRE8 배지에서 피펫팅에 의해 50 내지 200㎛로 부서진 세포괴(0.5×105cells)를 배양 용기에 파종하였다. 배지 TeSR E8(STEM CELL사제) 1.7mL 및 ROCK-인히비터(Y27632) 10μM의 존재 하에서, 37℃ 및 CO2 농도 5％의 인큐베이터 내에서 배양을 행하였다. 24시간마다 배지를 1mL 제거하고, 새로운 TeSR E8을 1mL 가함으로써 배지 교환을 행하였다. 5일 후에 있어서의 정착 세포괴를, TryPLE Express 박리액 1.0mL를 사용하여 박리하고, 셀 카운터(Nucleocounter NC-3000, Chemometec사제)를 사용하여 세포수를 카운트하였다.
하기 식을 사용하여 참고예 A에 대한 세포 증식률을 구하였다.
참고예 A에 대한 세포 증식률(％)=(실시예·비교예에 있어서의 세포수)/(참고예 A에 있어서의 세포수)×100
세포 증식률에 대해서, 이하의 기준에 따라서 평가하였다.
[평가 기준]
AAA…참고예 A에 대한 세포 증식률이, 70％ 이상
AA…참고예 A에 대한 세포 증식률이, 60％ 이상, 70％ 미만
A…참고예 A에 대한 세포 증식률이, 50％ 이상, 60％ 미만
B…참고예 A에 대한 세포 증식률이, 40％ 이상, 50％ 미만
C…참고예 A에 대한 세포 증식률이, 30％ 이상, 40％ 미만
D…참고예 A에 대한 세포 증식률이, 30％ 미만
결과를 하기의 표 1 내지 4에 나타내었다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
1: 세포배양용 용기
2: 용기 본체
2a: 표면
3: 수지막
SEQUENCE LISTING <110> SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. <120> Resin film made of cell culture scaffold material, cell culture carrier and cell culture vessel <130> F2893PCT <150> JP 2019-092083 <151> 2019-05-15 <150> JP 2019-119079 <151> 2019-06-26 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 1 Arg Gly Asp Gly 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 2 Arg Gly Asp Ala 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 3 Arg Gly Asp Val 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 4 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 5 Arg Gly Asp Thr 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 6 Arg Gly Asp Phe 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 7 Arg Gly Asp Met 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 8 Arg Gly Asp Pro 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 9 Arg Gly Asp Asn 1 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 10 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 11 Pro Asp Ser Gly Arg 1 5 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 12 Arg Glu Asp Val 1 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 13 Ile Asp Ala Pro Ser 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 14 Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 15 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5

Claims (16)

  1. 세포배양용 스캐폴드 재료에 의해 형성된 수지막이며,
    상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 합성 수지를 포함하고,
    상기 수지막이, 적어도 제1 상 및 제2 상을 포함하는, 상분리 구조를 갖고,
    상기 제1 상 및 제2 상 중 한쪽 상의 표면 전체에 대한 표면적의 비가, 0.01 이상, 0.95 이하인, 수지막.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 상의 면적에 대한 주위 길이의 비(주위 길이/면적)가, 0.001(1/nm) 이상, 0.40(1/nm) 이하인, 수지막.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 상분리 구조가, 해도 구조이고,
    상기 제1 상이 바다부이고, 상기 제2 상이 섬부인, 수지막.
  4. 제3항에 있어서, 상기 섬부인 상기 제2 상의 개수가, 1개/㎛2 이상, 5000개/㎛2 이하인, 수지막.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상분리 구조가, 상기 합성 수지의 분자 내에 있어서의 상분리 구조에 의해 구성되어 있는, 수지막.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 자유 에너지의 분산항 성분이 25.0mJ/㎡ 이상, 50.0mJ/㎡ 이하, 또한 극성항 성분이 1.0mJ/㎡ 이상, 20.0mJ/㎡ 이하인, 수지막.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 수지가, 양이온성 관능기를 갖고,
    상기 합성 수지의 구조 단위 중에 포함되는 상기 양이온성 관능기의 함유량이, 0.2몰％ 이상, 50몰％ 이하인, 수지막.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 상이, 펩티드부를 갖는, 수지막.
  9. 제8항에 있어서, 상기 펩티드부가, 세포 접착성의 아미노산 서열을 갖는, 수지막.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 수팽윤 배율이 50％ 이하인, 수지막.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 100℃에서의 저장 탄성률이, 1.0×104Pa 이상, 1.0×108Pa 이하이고,
    25℃에서의 저장 탄성률과 100℃에서의 저장 탄성률의 비((25℃에서의 저장 탄성률)/(100℃에서의 저장 탄성률))가, 1.0×101 이상, 1.0×105 이하인, 수지막.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 동물 유래의 원료를 실질적으로 포함하지 않는, 수지막.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 수지가 비닐 중합체를 포함하는, 수지막.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 합성 수지가, 적어도 폴리비닐알코올 유도체 또는 폴리(메트)아크릴산에스테르를 포함하는, 수지막.
  15. 담체와,
    제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 수지막을 구비하고,
    상기 담체의 표면 상에, 상기 수지막이 배치되어 있는, 세포배양용 담체.
  16. 용기 본체와,
    제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 수지막을 구비하고,
    상기 용기 본체의 표면 상에, 상기 수지막이 배치되어 있는, 세포배양용 용기.
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