KR20220009366A - 세포배양용 스캐폴드 재료 및 세포배양용 용기 - Google Patents

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KR20220009366A
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겐타 다카쿠라
마유미 유카와
다이고 고바야시
료마 이시이
히로키 이구치
유우헤이 아라이
사토시 하네다
노부히코 이누이
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세키스이가가쿠 고교가부시키가이샤
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Abstract

위족의 신전성이 우수하고, 또한 세포의 증식성이 우수한 세포배양용 스캐폴드 재료를 제공한다. 본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 폴리비닐알코올 유도체부와, 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체를 포함하고, 수산기가가, 1100mgKOH/g 이하이다.

Description

세포배양용 스캐폴드 재료 및 세포배양용 용기
본 발명은, 세포를 배양하기 위하여 사용되는 세포배양용 스캐폴드 재료에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료를 사용한 세포배양용 용기에 관한 것이다.
학술 분야, 창약 분야 및 재생 의료 분야 등의 연구 개발에 있어서, 인간, 마우스, 래트, 돼지, 소 및 원숭이 등의 동물 세포가 사용되고 있다. 동물 세포를 배양하기 위하여 사용되는 스캐폴드 재료로서, 라미닌 및 비트로넥틴 등의 접착 단백질, 그리고 마우스 육종 유래의 마트리겔 등의 천연 고분자 재료가 사용되고 있다. 천연 고분자 재료를 스캐폴드 재료로서 사용함으로써 라미닌이나 비트로넥틴 등이 갖는 세포 접착성의 아미노산 서열(Arg-Gly-Asp 등)을 갖는 도메인과, 세포 표면의 인테그린이 결합하고, 세포가 스캐폴드 재료에 양호하게 접착하고, 또한 세포가 양호하게 증식한다.
또한, 하기의 특허문헌 1에는, 반복 구조와 RGD 서열 등의 세포 접착 서열을 포함하는 단백질이 개시되어 있다. 이 단백질은, 상기 반복 구조로서, 특정한 Ala 리치 부위와 특정한 Ala 비리치 부위가 연결된 구조를 갖는다. 또한, 특허문헌 1에는, 이 단백질을 포함하는 재료를 세포 스캐폴드 재료로서 사용할 수 있는 것이 기재되어 있다.
또한, 하기의 특허문헌 2 내지 5에 나타내는 바와 같이 합성 수지를 사용한 스캐폴드 재료도 알려져 있다.
하기의 특허문헌 2에는, 폴리비닐아세탈 화합물을 포함하는 성형물 또는 해당 폴리비닐아세탈 화합물과 수용성 다당류를 포함하는 성형물을 포함하고, 해당 폴리비닐아세탈 화합물의 아세탈화도가 20 내지 60몰％인 세포배양용 담체가 개시되어 있다.
또한, 하기의 특허문헌 3에는, 제1 섬유 폴리머 스캐폴드재를 포함하고, 해당 제1 섬유 폴리머 스캐폴드재의 섬유가 정렬되어 있는, 조성물(스캐폴드 재료)이 개시되어 있다. 이 섬유 폴리머의 재료로서, 지방족 폴리에스테르 등이 사용되고 있다.
또한, 하기의 특허문헌 4에는, 다능성 줄기세포의 미분화성을 유지하기 위한 세포배양 방법이며, 폴리로탁산 블록 공중합체로 피복된 표면을 갖는 배양기 상에서 해당 다능성 줄기세포를 배양하는 공정을 포함하는 방법이 개시되어 있다.
또한, 하기의 특허문헌 5에는, 표면을 갖는 기판과, 상기 기판의 상기 표면에 마련된 친수성 공중합체층과, 상기 친수성 공중합체층의 표면에 각각에 결합되는 복수의 펩티드쇄를 구비하는 세포배양용 제품이 개시되어 있다. 상기 친수성 공중합체층은, 복수의 폴리비닐알코올 단위, 복수의 폴리비닐알코올 유도체 단위 및 복수의 카르복실산기 함유 단위에 의해 공중합된 층이다.
일본 특허 공개 제2018-064542호 공보 일본 특허 공개 제2006-314285호 공보 WO2007/090102A1 일본 특허 공개 제2017-023008호 공보 일본 특허 공개 제2015-070832호 공보
스캐폴드 재료로서 천연 고분자 재료를 사용함으로써, 파종 후의 세포가 양호하게 증식하고, 또한, 위족이 양호하게 신전한다. 그러나, 천연 고분자 재료는, 고가이거나, 천연 유래 물질이기 때문에 로트 간의 변동이 크거나, 동물 유래의 성분에 의한 안전상의 우려가 있거나 한다. 또한, 스캐폴드 재료로서, 특허문헌 1에 기재와 같은 RGD 서열 등의 세포 접착 서열을 갖는 폴리펩티드를 사용한 경우에도, 세포 접착 서열 이외의 아미노산 서열에 의해, 세포의 접착성이나 세포의 증식성에 변동이 발생하는 경우가 있다.
한편, 특허문헌 2 내지 5에 기재와 같은 합성 수지를 사용한 스캐폴드 재료는, 천연 고분자 재료를 사용한 스캐폴드 재료와 비교하여, 저렴하고, 로트 간의 변동이 작고, 또한 안전성이 우수하다. 그러나, 특허문헌 2 내지 4에 기재와 같은 종래의 합성 수지를 사용한 스캐폴드 재료에서는, 세포의 증식성이 낮다는 문제가 있다. 또한, 종래의 합성 수지를 사용한 스캐폴드 재료에서는, 위족이 충분히 신전하지 않는다. 또한, 특허문헌 5에 기재된 스캐폴드 재료에서는, 세포의 증식성을 어느 정도 높일 수 있기는 하지만, 친수성이 높기 때문에, 액체 배지에 의해 스캐폴드 재료가 침지하거나, 팽윤하거나 해서, 세포의 증식성이 저하되는 경우가 있다.
본 발명의 목적은, 위족의 신전성이 우수하고, 또한 세포의 증식성이 우수한 세포배양용 스캐폴드 재료를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료를 사용한 세포배양용 용기를 제공하는 것도 목적으로 한다.
본 발명의 넓은 국면에 의하면, 폴리비닐알코올 유도체부와 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체를 포함하고, 수산기가가, 1100mgKOH/g 이하인, 세포배양용 스캐폴드 재료가 제공된다.
본 발명의 넓은 국면에 의하면, 폴리비닐알코올 유도체부와 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체를 포함하고, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 수산기가가, 1100mgKOH/g 이하인, 세포배양용 스캐폴드 재료가 제공된다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료가 있는 특정한 국면에서는, 상기 펩티드부가, 세포 접착성의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료의 다른 특정한 국면에서는, 상기 세포 접착성의 아미노산 서열이, RGD 서열, YIGSR 서열, 또는 PDSGR 서열을 적어도 갖는다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 세포 접착성의 아미노산 서열이, 하기 식 (1)로 표시되는 RGD 서열을 적어도 갖는다.
Arg-Gly-Asp-X ···식 (1)
상기 식 (1) 중, X는, Gly, Ala, Val, Ser, Thr, Phe, Met, Pro 또는 Asn을 나타낸다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 펩티드부가, 3개 이상 10개 이하의 아미노산에 의해 구성된다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 폴리비닐알코올 유도체부와 상기 펩티드부가, 링커부를 통해 결합하고 있다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료의 또 다른 특정한 국면에서는, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체가, 폴리비닐아세탈 수지부와 상기 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지이다.
본 발명의 넓은 국면에 의하면, 용기 본체와, 상술한 세포배양용 스캐폴드 재료를 구비하고, 상기 용기 본체의 표면 상에, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료가 배치되어 있는, 세포배양용 용기가 제공된다.
본 발명에 따르면, 위족의 신전성이 우수하고, 또한 세포의 증식성이 우수한, 세포배양용 스캐폴드 재료 및 세포배양용 용기를 제공할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시 형태에 따른 세포배양용 용기를 모식적으로 도시하는 단면도이다.
도 2의 (a) 및 (b)는, 해도 구조의 유무 모습을 도시하는 화상이다.
도 3의 (a), (b) 및 (c)는, SF와 세포의 평면 형상과의 관계를 도시하는 도면이다.
이하, 본 발명의 상세를 설명한다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 폴리비닐알코올 유도체부와 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체를 포함한다. 본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료에서는, 해당 세포배양용 스캐폴드 재료의 수산기가가 1100mgKOH/g 이하이거나, 또는, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 수산기가가 1100mgKOH/g 이하이다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료에서는, 상기의 구성이 구비되어 있으므로, 위족의 신전성이 우수하고, 또한 세포의 증식성이 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 세포의 접착성이 우수하다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료에서는, 마트리겔 등의 천연 고분자 재료를 사용한 경우와 마찬가지로, 파종 후의 세포에 사상 위족 모양의 위족의 신전이 관찰된다. 이 위족의 신전은, 종래의 합성 수지 재료를 사용한 스캐폴드 재료에서는, 거의 관찰되지 않는다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 세포의 파종 밀도가 작은 경우에도, 세포가 세포배양용 스캐폴드 재료에 양호하게 접착하고, 또한 세포가 양호하게 증식한다.
또한, 본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료에서는, 소수성을 낮게 할 수 있으므로, 액체 배지에 의해 세포배양용 스캐폴드 재료가 침지하거나, 팽윤하거나 하는 것을 효과적으로 억제할 수 있다. 그 때문에, 세포의 증식성을 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 종래의 천연 고분자를 사용한 세포 스캐폴드 재료와 비교하여, 저렴하고, 로트 간의 변동이 작고, 안전성이 우수하다. 본 발명에 따른 세포 스캐폴드 재료를 사용함으로써, 세포의 품질 관리의 부하를 저감할 수 있다.
(세포배양용 스캐폴드 재료)
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 폴리비닐알코올 유도체부와 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체를 포함한다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체는, 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다.
상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체는, 폴리비닐알코올 유도체부와 펩티드부를 갖는다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체에서는, 상기 폴리비닐알코올 유도체부와 상기 펩티드부가, 링커부를 통해 결합하고 있는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체는, 폴리비닐알코올 유도체부와, 펩티드부와, 링커부를 갖는 것이 바람직하다.
상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체는, 후술하는 바와 같이, 예를 들어 폴리비닐알코올 유도체와, 링커와, 펩티드를 반응시켜서 얻을 수 있다.
<폴리비닐알코올 유도체부>
상기 폴리비닐알코올 유도체부는, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체에 있어서, 상기 폴리비닐알코올 유도체에서 유래되는 구조 부분이다. 상기 폴리비닐알코올 유도체는, 폴리비닐알코올에 의해 유도되는 화합물이다. 상기 폴리비닐알코올 유도체는, 폴리비닐아세탈 수지인 것이 바람직하고, 상기 폴리비닐알코올 유도체부는, 폴리비닐아세탈 수지부인 것이 바람직하다. 즉, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체는, 폴리비닐아세탈 수지부와, 상기 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지인 것이 바람직하다. 상기 폴리비닐알코올 유도체 및 상기 폴리비닐아세탈 수지는, 각각 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다.
상기 폴리비닐알코올 유도체부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지부는, 측쇄에 아세탈기와, 수산기와, 아세틸기를 갖는 것이 바람직하다. 단, 상기 폴리비닐알코올 유도체부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지부는, 예를 들어 아세틸기를 갖지 않아도 된다. 예를 들어, 폴리비닐알코올 유도체부 및 폴리비닐아세탈 수지의 아세틸기 모두가, 상기 링커와 결합함으로써, 상기 폴리비닐알코올 유도체부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지부가 아세틸기를 갖고 있지 않아도 된다.
폴리비닐아세탈 수지는, 폴리비닐알코올을 알데히드에 의해 아세탈화함으로써 합성할 수 있다.
폴리비닐알코올의 아세탈화에 사용되는 상기 알데히드는, 특별히 한정되지 않는다. 상기 알데히드로서는, 예를 들어 탄소수가 1 내지 10의 알데히드를 들 수 있다. 상기 알데히드는, 쇄상 지방족기, 환상 지방족기 또는 방향족기를 갖고 있어도 되고, 갖고 있지 않아도 된다. 상기 알데히드는, 쇄상 알데히드여도 되고, 환상 알데히드여도 된다.
상기 알데히드로서는, 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부틸알데히드, 펜탄알, 헥산알, 헵탄알, 옥탄알, 노난알, 데칸알, 아크롤레인, 벤즈알데히드, 신남알데히드, 페릴알데히드, 포르밀피리딘, 포르밀이미다졸, 포르밀피롤, 포르밀피페리딘, 포르밀트리아졸, 포르밀테트라졸, 포르밀인돌, 포르밀이소인돌, 포르밀푸린, 포르밀벤즈이미다졸, 포르밀벤조트리아졸, 포르밀퀴놀린, 포르밀이소퀴놀린, 포르밀퀴녹살린, 포르밀신놀린, 포르밀프테리딘, 포르밀푸란, 포르밀옥솔란, 포르밀옥산, 포르밀티오펜, 포르밀티올란, 포르밀티안, 포르밀아데닌, 포르밀구아닌, 포르밀시토신, 포르밀티민 및 포르밀우라실 등을 들 수 있다. 상기 알데히드는, 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다.
상기 알데히드는, 포름알데히드, 아세트알데히드, 프로피온알데히드, 부틸알데히드, 또는 펜탄알인 것이 바람직하고, 부틸알데히드인 것이 보다 바람직하다. 따라서, 상기 폴리비닐아세탈 수지는, 폴리비닐부티랄 수지인 것이 보다 바람직하고, 상기 폴리비닐아세탈 수지부는, 폴리비닐부티랄 수지부인 것이 보다 바람직하고, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체는, 펩티드 함유 폴리비닐부티랄 수지인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 알데히드의 배합량은, 목적으로 하는 아세탈기량에 맞춰서 적절히 설정할 수 있다. 아세탈화 반응의 효율을 높이고, 또한 미반응된 알데히드를 용이하게 제거하는 관점에서는, 폴리비닐알코올 100몰％에 대하여, 상기 알데히드의 첨가량은, 바람직하게는 60몰％ 이상, 보다 바람직하게는 65몰％ 이상, 바람직하게는 95몰％ 이하, 보다 바람직하게는 90몰％ 이하이다.
상기 폴리비닐알코올 유도체부, 상기 폴리비닐아세탈 수지부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지의 평균 중합도는, 바람직하게는 100 이상, 보다 바람직하게는 200 이상, 더욱 바람직하게는 500 이상, 특히 바람직하게는 1500 이상, 바람직하게는 6000 이하, 보다 바람직하게는 3000 이하, 더욱 바람직하게는 2500 이하이다. 상기 평균 중합도가 상기 하한 이상이면, 액체 배지에 의한 팽윤을 효과적으로 억제할 수 있기 때문에, 세포배양용 스캐폴드 재료의 강도를 양호하게 유지할 수 있다. 그 때문에, 세포 증식성을 높일 수 있다. 또한, 상기 평균 중합도가 상기 상한 이하이면, 취급성을 높일 수 있고, 세포배양용 스캐폴드 재료의 성형성을 높일 수 있다. 또한, 상기 폴리비닐알코올 유도체부, 상기 폴리비닐아세탈 수지부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지의 평균 중합도는, 통상, 원료가 되는 폴리비닐알코올의 평균 중합도와 동일하고, 폴리비닐알코올의 평균 중합도에 의해 구할 수 있다.
상기 폴리비닐알코올 유도체부, 상기 폴리비닐아세탈 수지부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지의 수 평균 분자량(Mn)은, 바람직하게는 10000 이상, 바람직하게는 600000 이하이다. 상기 폴리비닐알코올 유도체부, 상기 폴리비닐아세탈 수지부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지의 중량 평균 분자량(Mw)은, 바람직하게는 2000 이상, 바람직하게는 1200000 이하이다. 또한, 상기 폴리비닐알코올 유도체부, 상기 폴리비닐아세탈 수지부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지에 있어서, 수 평균 분자량(Mn)에 대한 중량 평균 분자량(Mw)의 비(Mw/Mn)는, 바람직하게는 2.0 이상, 바람직하게는 40 이하이다. 상기 Mn, 상기 Mw, 상기 Mw/Mn이 상기 하한 이상 및 상기 상한 이하이면, 세포배양용 스캐폴드 재료의 강도를 높일 수 있다.
또한, 상기 폴리비닐알코올 유도체부, 상기 폴리비닐아세탈 수지부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지의 수 평균 분자량(Mn) 및 중량 평균 분자량(Mw)은, 예를 들어 용매로서 테트라히드로푸란(THF)을 사용한 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 분석에 의해, 폴리스티렌 환산값으로서 구할 수 있다.
상기 폴리비닐알코올 유도체부, 상기 폴리비닐아세탈 수지부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지의 아세탈화도(폴리비닐부티랄 수지의 경우에는 부티랄화도)는, 바람직하게는 40몰％ 이상, 보다 바람직하게는 50몰％ 이상, 바람직하게는 90몰％ 이하, 보다 바람직하게는 85몰％ 이하이다. 상기 아세탈화도가 상기 하한 이상이면, 세포의 정착성을 보다 높일 수 있고, 세포가 효율적으로 증식한다. 상기 아세탈화도가 상기 상한 이하이면, 용제에 대한 용해성을 양호하게 할 수 있다.
상기 폴리비닐알코올 유도체부, 상기 폴리비닐아세탈 수지부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지의 수산기 함유율(수산기량)은, 바람직하게는 15몰％ 이상, 보다 바람직하게는 20몰％ 이상, 바람직하게는 45몰％ 이하, 보다 바람직하게는 30몰％ 이하, 더욱 바람직하게는 25몰％ 이하이다.
상기 폴리비닐알코올 유도체부, 상기 폴리비닐아세탈 수지부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지의 아세틸화도(아세틸기량)는, 바람직하게는 1몰％ 이상, 보다 바람직하게는 2몰％ 이상, 바람직하게는 5몰％ 이하, 보다 바람직하게는 4몰％ 이하이다. 상기 아세틸화도가 상기 하한 이상 및 상기 상한 이하이면, 폴리비닐아세탈 수지와 링커와의 반응 효율을 높일 수 있다.
상기 폴리비닐알코올 유도체부, 상기 폴리비닐아세탈 수지부 및 상기 폴리비닐아세탈 수지의 아세탈화도, 아세틸화도 및 수산기량은, 1H-NMR(핵자기 공명 스펙트럼)에 의해 측정할 수 있다.
<펩티드부>
상기 펩티드부는, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체에 있어서, 상기 펩티드에서 유래되는 구조 부분이다. 상기 펩티드부는, 아미노산 서열을 갖는다. 상기 펩티드부를 구성하는 펩티드는, 올리고펩티드여도 되고, 폴리펩티드여도 된다. 상기 펩티드는, 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다.
상기 펩티드부는, 3개 이상의 아미노산에 의해 구성되는 것이 바람직하고, 4개 이상의 아미노산에 의해 구성되는 것이 보다 바람직하고, 5개 이상의 아미노산에 의해 구성되는 것이 더욱 바람직하고, 10개 이하의 아미노산에 의해 구성되는 것이 바람직하고, 6개 이하의 아미노산에 의해 구성되는 것이 보다 바람직하다. 상기 펩티드부를 구성하는 아미노산의 개수가 상기 하한 이상 및 상기 상한 이하이면, 세포의 접착성 및 증식성을 보다 한층 높일 수 있고, 또한, 위족의 신전성을 보다 한층 양호하게 할 수 있다.
상기 펩티드부는, 세포 접착성의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 세포 접착성의 아미노산 서열이란, 파지 디스플레이법, 세파로즈 비즈법, 또는 플레이트 코팅법에 의해 세포 접착 활성이 확인되고 있는 아미노산 서열을 말한다. 상기 파지 디스플레이법으로서는, 예를 들어 「The Journal of Cell Biology, Volume 130, Number 5, September 1995 1189-1196」에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 상기 세파로즈 비즈법으로서는, 예를 들어 「단백질 핵산 효소 Vol.45 No.15(2000) 2477」에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 상기 플레이트 코팅법으로서는, 예를 들어 「단백질 핵산 효소 Vol.45 No.15(2000) 2477」에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
상기 세포 접착성의 아미노산 서열로서는, 예를 들어 RGD 서열(Arg-Gly-Asp), YIGSR 서열(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR 서열(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), HAV 서열(His-Ala-Val), ADT 서열(Ala-Asp-Thr), QAV 서열(Gln-Ala-Val), LDV 서열(Leu-Asp-Val), IDS 서열(Ile-Asp-Ser), REDV 서열(Arg-Glu-Asp-Val), IDAPS 서열(Ile-Asp-Ala-Pro-Ser), KQAGDV 서열(Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val) 및 TDE 서열(Thr-Asp-Glu) 등을 들 수 있다. 또한, 상기 세포 접착성의 아미노산 서열로서는, 「병태 생리, 제9권 제7호, 527 내지 535 페이지, 1990년」 및 「오사카부립 모자 의료 센터 잡지, 제8권 제1호, 58 내지 66 페이지, 1992년」에 기재되어 있는 서열 등도 들 수 있다. 상기 펩티드부는, 상기 세포 접착성의 아미노산 서열을 1종만 갖고 있어도 되고, 2종 이상을 가져도 된다.
상기 세포 접착성의 아미노산 서열은, 상술한 세포 접착성의 아미노산 서열 중 적어도 어느 하나를 갖는 것이 바람직하고, RGD 서열, YIGSR 서열, 또는 PDSGR 서열을 적어도 갖는 것이 보다 바람직하고, 하기 식 (1)로 표시되는 RGD 서열을 적어도 갖는 것이 더욱 바람직하다. 이 경우에는, 세포의 접착성 및 증식성을 보다 한층 높일 수 있고, 위족의 신전성을 보다 한층 양호하게 할 수 있다.
Arg-Gly-Asp-X ···식 (1)
상기 식 (1) 중, X는, Gly, Ala, Val, Ser, Thr, Phe, Met, Pro 또는 Asn을 나타낸다.
상기 펩티드부가 상기 세포 접착성의 아미노산 서열을 갖는 경우에, 해당 세포 접착성의 아미노산 서열의 N 말단에 있어서의 아미노산 또는 C 말단에 있어서의 아미노산과, 링커가 결합하고 있어도 되고, 해당 세포 접착성의 아미노산 서열과는 다른 부분의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산과, 링커가 결합하고 있어도 된다.
상기 펩티드부는, 직쇄상이어도 되고, 환상 펩티드 골격을 갖고 있어도 된다. 상기 환상 펩티드 골격이란, 복수개의 아미노산에 의해 구성된 환상 골격이다. 본 발명의 효과를 한층 효과적으로 발휘시키는 관점에서는, 상기 환상 펩티드 골격은, 4개 이상의 아미노산에 의해 구성되는 것이 바람직하고, 5개 이상의 아미노산에 의해 구성되는 것이 보다 바람직하고, 10개 이하의 아미노산에 의해 구성되는 것이 바람직하다.
상기 펩티드부가 상기 세포 접착성의 아미노산 서열을 갖고 또한 상기 환상 펩티드 골격을 갖는 경우, 상기 세포 접착성의 아미노산 서열과는 다른 부분의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산과, 링커부가 결합하고 있는 것이 보다 바람직하다. 이 경우에는, 세포의 접착성 및 증식성을 보다 한층 높일 수 있고, 위족의 신전성을 보다 한층 양호하게 할 수 있다.
상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체 100중량％ 중, 상기 펩티드부의 함유율은, 바람직하게는 0.01중량％ 이상, 보다 바람직하게는 0.1중량％ 이상, 더욱 바람직하게는 1중량％ 이상, 특히 바람직하게는 5중량％ 이상이다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체 100중량％ 중, 상기 펩티드부의 함유율은, 바람직하게는 30중량％ 이하, 보다 바람직하게는 25중량％ 이하, 더욱 바람직하게는 20중량％ 이하, 특히 바람직하게는 15중량％ 이하이다. 상기 펩티드부의 함유율이 상기 하한 이상이면, 세포의 접착성 및 증식성을 더욱 보다 한층 높일 수 있고, 위족의 신전성을 더욱 보다 한층 양호하게 할 수 있다.
상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체에 있어서, 상기 펩티드부의 함유율은, 바람직하게는 0.01몰％ 이상, 보다 바람직하게는 0.1몰％ 이상, 보다 한층 바람직하게는 1몰％ 이상, 더욱 바람직하게는 5몰％ 이상, 특히 바람직하게는 10몰％ 이상이다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체에 있어서, 상기 펩티드부의 함유율은, 바람직하게는 60몰％ 이하, 보다 바람직하게는 50몰％ 이하, 더욱 바람직하게는 35몰％ 이하, 특히 바람직하게는 25몰％ 이하이다. 상기 펩티드부의 함유율이 상기 하한 이상이면, 세포의 접착성 및 증식성을 더욱 보다 한층 높일 수 있고, 위족의 신전성을 더욱 보다 한층 양호하게 할 수 있다. 상기 펩티드부의 함유율이 상기 상한 이하이면, 제조 비용을 억제할 수 있다. 또한, 상기 펩티드부의 함유율(몰％)은, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체를 구성하는 각 구조 단위의 물질량의 총합에 대한 상기 펩티드부의 물질량이다.
상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체에 있어서, 상기 아세탈기와 상기 수산기와 상기 아세틸기의 합계의 함유율에 대한, 상기 펩티드부의 함유율의 몰비(상기 펩티드부의 함유율/상기 아세탈기와 상기 수산기와 상기 아세틸기의 합계의 함유율)은, 바람직하게는 0.0001 이상, 보다 바람직하게는 0.001 이상이다. 상기 몰비(상기 펩티드부의 함유율/상기 아세탈기와 상기 수산기와 상기 아세틸기의 합계의 함유율)가 상기 하한 이상이면, 세포의 접착성 및 증식성을 더욱 보다 한층 높일 수 있고, 위족의 신전성을 더욱 보다 한층 양호하게 할 수 있다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체에 있어서, 상기 아세탈기와 상기 수산기와 상기 아세틸기의 합계의 함유율에 대한, 상기 펩티드부의 함유율의 몰비(상기 펩티드부의 함유율/상기 아세탈기와 상기 수산기와 상기 아세틸기의 합계의 함유율)의 상한은 특별히 한정되지 않는다. 제조 비용 등의 관점에서는, 상기 몰비(상기 펩티드부의 함유율/상기 아세탈기와 상기 수산기와 상기 아세틸기의 합계의 함유율)는, 바람직하게는 0.2 이하이다.
상기 펩티드부의 함유율은, FT-IR 또는 LC-MS에 의해 측정할 수 있다.
<링커부>
상기 링커부는, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체에 있어서, 상기 링커에서 유래되는 구조 부분이다. 상기 링커부는, 상기 폴리비닐알코올 유도체부와 상기 펩티드부 사이에 위치한다. 상기 폴리비닐알코올 유도체부와 상기 펩티드부가, 상기 링커부를 통해 결합하고 있다. 상기 링커부는, 링커(가교제)에 의해 형성된다. 상기 링커는, 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다.
상기 링커는, 상기 펩티드의 카르복실기 또는 아미노기와 축합 가능한 관능기를 갖는 화합물인 것이 바람직하다. 상기 펩티드의 카르복실기 또는 아미노기와 축합 가능한 관능기로서는, 카르복실기, 티올기 및 아미노기 등을 들 수 있다. 펩티드와 양호하게 반응시키는 관점에서는, 상기 링커는, 카르복실기를 갖는 화합물인 것이 바람직하다.
상기 카르복실기를 갖는 링커로서는, (메트)아크릴산 및 카르복실기 함유 아크릴아미드 등을 들 수 있다. 상기 카르복실기를 갖는 링커로서 중합성 불포화기를 갖는 카르복실산(카르복실산 모노머)을 사용함으로써, 링커의 도입 시에 그라프트 중합에 의해 해당 카르복실산 모노머를 중합시킬 수 있기 때문에, 펩티드와 반응시킬 수 있는 카르복실기의 개수를 증가시킬 수 있다.
폴리비닐알코올 유도체와 펩티드를 양호하게 결합시키는 관점에서는, 상기 링커는, (메트)아크릴산인 것이 바람직하고, 아크릴산인 것이 보다 바람직하다.
상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체는, 예를 들어 이하와 같이 하여 합성할 수 있다.
(1) 폴리비닐알코올 유도체(예를 들어 폴리비닐아세탈 수지)와, 링커를 반응시켜서, 폴리비닐아세탈 수지와 링커가 결합한 반응물을 얻는다. (2) 얻어진 반응물과, 펩티드를 반응시켜서, 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체(펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지)를 얻는다.
상기 (1)에 있어서, 상기 폴리비닐아세탈 수지와 상기 링커가 결합한 반응물을 얻는 방법으로서는, 폴리비닐알코올과 중합성 불포화기를 갖는 카르복실산과의 공중합체를 아세탈화하는 방법 및 폴리비닐아세탈 수지와 링커(예를 들어 카르복실산 모노머)를 자외선 조사 하에서 그라프트 공중합하는 방법 등을 들 수 있다. 상기 반응물을 얻는 방법은, 상기 그라프트 공중합하는 방법인 것이 바람직하다. 이 경우에는, 그라프트 중합에 의해 해당 카르복실산 모노머를 중합시킬 수 있기 때문에, 펩티드와 반응시킬 수 있는 카르복실기의 개수를 증가시킬 수 있다.
상기 (2)에 있어서, 얻어진 반응물에 있어서의 링커 유래의 카르복실기와, 펩티드의 아미노기를 탈수 축합시켜서, 폴리비닐아세탈 수지부와, 펩티드부와, 링커부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체(펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지)를 얻을 수 있다.
상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체는, 링커 유래의 카르복실기가 잔존하고 있어도 되고, 잔존하고 있지 않아도 된다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 상기 카르복실기의 함유율은, 바람직하게는 0.1몰％ 이상, 보다 바람직하게는 0.5몰％ 이상, 바람직하게는 2몰％ 이하, 보다 바람직하게는 1.5몰％ 이하이다. 상기 카르복실기의 함유율이 상기 하한 이상 및 상기 상한 이하이면, 세포의 접착성 및 증식성을 더욱 보다 한층 높일 수 있고, 위족의 신전성을 더욱 보다 한층 양호하게 할 수 있다. 또한, 상기 카르복실기의 함유율(몰％)은, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체를 구성하는 각 구조 단위의 물질량의 총합에 대한 상기 카르복실기의 물질량이다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 이하의 구성 (A) 또는 구성 (B)를 구비한다.
구성 (A): 상기 세포배양용 스캐폴드 재료의 수산기가가 1100mgKOH/g 이하이다.
구성 (B): 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 수산기가가 1100mgKOH/g 이하이다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 상기 구성 (A) 또는 상기 구성 (B)를 구비하므로, 상기 구성 (A) 및 상기 구성 (B)의 양쪽을 구비하지 않는 세포배양용 스캐폴드 재료와 비교하여, 소수성을 높일 수 있다. 그 때문에, 액체 배지에 의해 세포배양용 스캐폴드 재료가 침지하거나, 팽윤하거나 하는 것을 효과적으로 억제할 수 있고, 세포의 증식성을 높일 수 있다. 특히, 세포를 장기 배양한 경우에도 세포의 증식 성능을 높게 유지할 수 있다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 상기 구성 (A) 및 상기 구성 (B) 중 상기 구성 (A)만을 구비하고 있어도 되고, 상기 구성 (B)만을 구비하고 있어도 된다. 본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 상기 구성 (A)와 상기 구성 (B)를 구비하고 있어도 된다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료의 수산기가는, 바람직하게는 1100mgKOH/g 이하, 보다 바람직하게는 950mgKOH/g 이하, 더욱 바람직하게는 800mgKOH/g 이하이다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료의 수산기가가 상기 상한 이하이면, 해당 세포배양용 스캐폴드 재료의 소수성을 높일 수 있으므로, 액체 배지에 의해 세포배양용 스캐폴드 재료가 침지하거나, 팽윤하거나 하는 것을 보다 한층 효과적으로 억제할 수 있다. 그 때문에, 세포의 증식성을 보다 한층 높일 수 있다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료의 수산기가 하한은 특별히 한정되지 않는다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료의 수산기가는, 예를 들어 50mgKOH/g 이상이어도 되고, 100mgKOH/g 이상이어도 된다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료의 산가는, 바람직하게는 1mgKOH/g 이상, 보다 바람직하게는 15mgKOH/g 이상, 더욱 바람직하게는 50mgKOH/g 이상, 바람직하게는 1400mgKOH/g 이하, 보다 바람직하게는 800mgKOH/g 이하, 더욱 바람직하게는 600mgKOH/g 이하이다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료의 산가가 상기 하한 이상이면, 펩티드부가 충분히 도입됨으로써, 세포의 접착성을 높이기 쉬워진다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료의 산가가 상기 상한 이하이면, 세포의 증식성을 높이기 쉬워진다.
상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 수산기가는, 바람직하게는 1100mgKOH/g 이하, 보다 바람직하게는 950mgKOH/g 이하, 더욱 바람직하게는 800mgKOH/g 이하이다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 수산기가가 상기 상한 이하이면, 해당 세포배양용 스캐폴드 재료의 소수성을 높일 수 있으므로, 액체 배지에 의해 세포배양용 스캐폴드 재료가 침지하거나, 팽윤하거나 하는 것을 보다 한층 효과적으로 억제할 수 있다. 그 때문에, 세포의 증식성을 보다 한층 높일 수 있다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 수산기가 하한은, 특별히 한정되지 않는다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 수산기가는, 예를 들어 50mgKOH/g 이상이어도 되고, 100mgKOH/g 이상이어도 된다.
상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 산가는, 바람직하게는 1mgKOH/g 이상, 보다 바람직하게는 15mgKOH/g 이상, 더욱 바람직하게는 50mgKOH/g 이상, 바람직하게는 1400mgKOH/g 이하, 보다 바람직하게는 800mgKOH/g 이하, 더욱 바람직하게는 600mgKOH/g 이하이다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 산가가 상기 하한 이상이면, 펩티드부가 충분히 도입됨으로써, 세포의 접착성을 높이기 쉬워진다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 산가가 상기 상한 이하이면, 세포의 증식성을 높이기 쉬워진다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료 및 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 수산기가 및 산가는, JIS K0070의 중화 적정법을 참고로 하여 측정할 수 있다. 구체적으로는, 이하와 같이 하여 측정할 수 있다.
<산가의 측정>
이하의 기구 및 시약을 준비한다.
기구: 뷰렛
용매: 에탄올 50ml와 디에틸에테르 50ml의 혼합액
적정액: 0.1mol/L 수산화칼륨의 에탄올 용액
시료: 세포배양용 스캐폴드 재료 또는 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체
이하의 수순을 따라서 산가를 측정한다.
(1) 300mL의 삼각 플라스크에, 시료 5g과 용매 100mL를 첨가하고, 시료를 용매에 용해시킨다. 용해 후, JIS K8001을 따라서 조정한 페놀프탈레인 용액을 몇 방울 첨가한다.
(2) 25ml 뷰렛에 적정액을 충전하여 적정을 행하고, 페놀프탈레인 용액의 엷은 홍색 정색이 30초간 계속되었을 때를 종점으로 한다.
(3) 마찬가지로 하여 공시험도 행한다.
(4) 하기 식 (X)에 의해 산가를 산출한다.
산가(mgKOH/g)=V×f×5.611/S ···(X)
S: 시료의 질량(g)
V: 본 시험에서의 적정액량(mL)
f: 적정액의 팩터
<수산기가의 측정>
이하의 기구 및 시약을 준비한다.
기구: 뷰렛
아세틸화 시약: 무수아세트산 25g에 피리딘을 첨가하여 전량을 100mL로 한 액
적정액: 0.5mol/L 수산화칼륨의 에탄올 용액
시료: 세포배양용 스캐폴드 재료 또는 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체
이하의 수순을 따라서 수산기가를 측정한다.
(1) 100mL의 삼각 플라스크에, 시료와 아세틸화 시약 5mL를 첨가하고, 105℃의 유욕 중에서 1시간 반응시킨다.
(2) 방랭 후, 물 1mL를 첨가하고, 105℃의 유욕 중에서 10분간 반응시킨다.
(3) 방랭 후, 에탄올 5mL로 벽면을 씻어 버려서 희석한다. 희석 후, 페놀프탈레인 용액을 몇 방울 첨가한다.
(4) 25ml 뷰렛에 적정액을 충전하여 적정을 행하고, 페놀프탈레인 용액의 엷은 홍색 정색이 30초간 계속되었을 때를 종점으로 한다.
(5) 마찬가지로 하여 공시험도 행한다.
(6) 하기 식 (Y)에 의해 수산기가를 산출한다.
수산기가(mgKOH/g)=[(V0-V1)×f×28.05/S]+A ···(Y)
S: 시료의 질량(g)
V0: 공시험에서의 적정액량(mL)
V1: 본 시험에서의 적정액량(mL)
f: 적정액의 팩터
A: 산가
세포의 접착성 및 증식성을 보다 한층 높이는 관점에서, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 상분리 구조를 갖는 것이 바람직하다. 상기 상분리 구조는, 제1 상과 제2 상을 적어도 갖는다.
상기 상분리 구조로서는, 예를 들어 해도 구조, 실린더 구조, 자이로이드 구조 및 라멜라 구조 등의 마이크로 상분리 구조를 들 수 있다. 해도 구조에서는, 예를 들어 제1 상을 바다부로 하고, 제2 상을 섬부로 할 수 있다. 실린더 구조, 자이로이드 구조, 또는 라멜라 구조에서는, 예를 들어 표면적이 가장 큰 상을 제1 상으로 하고, 표면적이 2번째로 큰 상을 제2 상으로 할 수 있다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료가 연속상과 불연속상을 가짐으로써, 세포와의 친화성을 높이고, 세포의 접착성 및 증식성을 보다 한층 높일 수 있다.
상기 상분리 구조는, 해도 구조인 것이 바람직하다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 해도 구조를 갖는 것이 바람직하다. 이 경우에는, 세포의 접착성 및 증식성을 보다 한층 높일 수 있다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료가 해도 구조를 갖는 경우에, 세포배양용 스캐폴드 재료의 표면 전체에 대한, 섬부(제2 상)의 표면적 분율은, 바람직하게는 0.01 이상, 보다 바람직하게는 0.1 이상, 더욱 바람직하게는 0.2 이상이고, 바람직하게는 0.95 이하, 보다 바람직하게는 0.9 이하, 더욱 바람직하게는 0.8 이하이다. 상기 표면적 분율이 상기 하한 이상 및 상기 상한 이하이면, 세포의 접착성을 보다 한층 높일 수 있다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료가 해도 구조를 갖는 경우에, 섬부가 펩티드부를 포함하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 바다부와 섬부를 갖고, 섬부가 펩티드부를 포함하는 것이 바람직하다. 이 경우, 세포의 접착 도메인이 섬부에 집적함으로써, 세포의 접착성을 더욱 한층 높일 수 있다.
상분리 구조의 유무는, 예를 들어 원자간력 현미경(AFM), 투과형 전자 현미경(TEM), 주사 전자 현미경(SEM) 등에 의해 확인할 수 있다. 또한, 상기 표면적 분율은, 현미경 관찰 화상으로부터 예를 들어 ImageJ 등의 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 구할 수 있다.
상기 상분리 구조는, 예를 들어 펩티드부의 함유율을 높게 하고, 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 분자 간 또는 분자 내에 상분리 구조를 형성함으로써 형성시킬 수 있다.
본 발명의 효과를 효과적으로 발휘시키는 관점 및 생산성을 높이는 관점에서는, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료 100중량％ 중, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 함유량은, 바람직하게는 90중량％ 이상, 보다 바람직하게는 95중량％ 이상, 더욱 바람직하게는 97.5중량％ 이상, 특히 바람직하게는 99중량％ 이상, 가장 바람직하게는 100중량％(전량)이다. 따라서, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체인 것이 가장 바람직하다. 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 함유량이 상기 하한 이상이면, 본 발명의 효과를 보다 한층 효과적으로 발휘시킬 수 있다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체 이외의 폴리머를 포함하고 있어도 된다. 해당 폴리머로서는, 폴리비닐아세탈 수지, 폴리올레핀 수지, 폴리에테르 수지, 폴리비닐알코올 수지, 폴리에스테르, 에폭시 수지, 폴리아미드 수지, 폴리이미드 수지, 폴리우레탄 수지, 폴리카르보네이트 수지, 셀룰로오스 및 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 상기 폴리머는, 1종만이 사용되어도 되고, 2종 이상이 병용되어도 된다.
본 발명의 효과를 효과적으로 발휘시키는 관점에서는, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체 이외의 폴리머의 함유량은 적을수록 좋다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료 100중량％ 중, 해당 폴리머의 함유량은, 바람직하게는 10중량％ 이하, 보다 바람직하게는 5중량％ 이하, 더욱 바람직하게는 2.5중량％ 이하, 특히 바람직하게는 1중량％ 이하, 가장 바람직하게는 0중량％(미함유)이다. 따라서, 세포배양용 스캐폴드 재료는, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체 이외의 폴리머를 포함하지 않는 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 동물 유래의 원료를 실질적으로 포함하지 않는 것이 바람직하다. 동물 유래의 원료를 실질적으로 포함하지 않음으로써, 로트 간의 변동이 적고, 비용, 안전성이 우수한 세포배양용 스캐폴드 재료를 제공할 수 있다. 또한, 「동물 유래의 원료를 실질적으로 포함하지 않는다」란, 세포배양용 스캐폴드 재료 중에 있어서의 동물 유래의 원료가, 3중량％ 이하인 것을 의미한다. 본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 세포배양용 스캐폴드 재료 중에 있어서의 동물 유래의 원료가, 1중량％ 이하인 것이 바람직하고, 0중량％인 것이 보다 바람직하다. 즉, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 세포배양용 스캐폴드 재료 중에 동물 유래의 원료를 포함하지 않는 것이 보다 바람직하다.
또한, 세포배양용 스캐폴드 재료는, 후술하는 용기 본체의 표면 상에서 제작해도 된다. 예를 들어, 폴리비닐알코올 유도체부와 링커를 갖는 합성 수지를, 용기 본체의 표면 상에 코팅하여 수지막을 형성하고, 해당 수지막의 표면에 있어서 해당 합성 수지와 펩티드를 반응시켜서, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체를 얻어도 된다.
(세포배양용 스캐폴드 재료의 다른 상세)
본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 세포를 배양하기 위하여 사용된다. 본 발명에 따른 세포배양용 스캐폴드 재료는, 세포를 배양할 때의 해당 세포의 스캐폴드로서 사용된다.
상기 세포로서는, 인간, 마우스, 래트, 돼지, 소 및 원숭이 등의 동물 세포를 들 수 있다. 또한, 상기 세포로서는, 체세포 등을 들 수 있고, 예를 들어 줄기세포, 전구세포 및 성숙 세포 등을 들 수 있다. 상기 체세포는, 암세포여도 된다.
상기 성숙 세포로서는, 신경세포, 심근세포, 망막세포 및 간세포 등을 들 수 있다.
상기 줄기세포로서는, 간엽계 줄기세포(MSC), iPS 세포, ES 세포, Muse 세포, 배성 암세포, 배성 생식 줄기세포 및 mGS 세포 등을 들 수 있다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료의 형상은 특별히 한정되지 않는다. 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 막상이어도 되고, 입자상이어도 되고, 섬유상이어도 되고, 다공체상이어도 된다. 막상에는, 필름상, 시트상이 포함된다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 세포의 이차원 배양(평면 배양), 삼차원 배양 또는 부유배양에 사용되는 것이 바람직하고, 이차원 배양(평면 배양)에 사용되는 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 해당 세포배양용 스캐폴드 재료와, 다당류를 포함하는 세포배양용 담체(매체)로서 사용할 수도 있다. 상기 다당류는, 특별히 한정되지 않고, 종래 공지된 다당류를 사용할 수 있다. 상기 다당류는, 수용성 다당류인 것이 바람직하다.
또한, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료는, 섬유 본체와, 해당 섬유 본체의 표면 상에 배치된 세포배양용 스캐폴드 재료를 구비하는 세포배양용 섬유로서 사용할 수도 있다. 이 경우, 세포배양용 스캐폴드 재료는, 섬유 본체의 표면에 도포되어 있는 것이 바람직하고, 도포물인 것이 바람직하다. 이 세포배양용 섬유에서는, 섬유 본체 중에 세포배양용 스캐폴드 재료가 존재하고 있어도 된다. 예를 들어, 섬유 본체를 액상의 세포배양용 스캐폴드 재료에 함침하거나, 혼입하거나 함으로써 세포배양용 스캐폴드 재료를 섬유 본체 중에 존재시킬 수 있다. 줄기세포는, 일반적으로, 평면 구조에는 접착하기 어렵고, 섬유상 구조 등의 입체 구조에는 접착하기 쉬운 성질을 갖기 때문에, 세포배양용 섬유는, 줄기세포의 삼차원 배양에 적합하게 사용된다. 줄기세포 중에서도, 지방 줄기세포의 삼차원 배양에 보다 적합하게 사용된다.
상기 세포배양용 스캐폴드 재료에 있어서의 합성 수지는, 가교되어 있어도 된다. 가교된 합성 수지를 포함하는 세포배양용 스캐폴드 재료는, 수팽윤성이 효과적으로 억제되어, 강도를 높일 수 있다. 가교제를 사용함으로써, 합성 수지를 가교시킬 수 있다.
가교제로서는, 폴리알코올, 폴리카르복실산, 히드록시카르복실산, 금속 비누 및 다당류 등을 들 수 있다.
(세포배양용 용기)
본 발명에 따른 세포배양용 용기는, 용기 본체와, 상술한 세포배양용 스캐폴드 재료를 구비하고, 상기 용기 본체의 표면 상에, 해당 세포배양용 스캐폴드 재료가 배치되어 있다. 상기 세포배양용 용기는, 세포의 배양 영역의 적어도 일부에 상기 세포배양용 스캐폴드 재료를 구비한다.
도 1은, 본 발명의 일 실시 형태에 따른 세포배양용 용기를 모식적으로 도시하는 단면도이다.
세포배양용 용기(1)는, 용기 본체(2)와, 세포배양용 스캐폴드 재료(3)를 구비한다. 용기 본체(2)의 표면(2a) 상에 세포배양용 스캐폴드 재료(3)가 배치되어 있다. 용기 본체(2)의 저면 상에 세포배양용 스캐폴드 재료(3)가 배치되어 있다. 세포배양용 용기(1)에 액체 배지를 첨가하고, 또한, 세포괴 등의 세포를 세포배양용 스캐폴드 재료(3)의 표면에 파종함으로써, 세포를 평면 배양할 수 있다.
또한, 용기 본체는, 제1 용기 본체와, 해당 제1 용기 본체의 저면 상에 커버 유리 등의 제2 용기 본체를 구비하고 있어도 된다. 제1 용기 본체와 제2 용기 본체는 분리 가능하여도 된다. 이 경우, 제2 용기 본체의 표면 상에, 해당 세포배양용 스캐폴드 재료가 배치되어 있어도 된다.
상기 용기 본체로서, 종래 공지된 용기 본체(용기)를 사용할 수 있다. 상기 용기 본체의 형상 및 크기는 특별히 한정되지 않는다.
상기 용기 본체로서는, 1개 또는 복수개의 웰(구멍)을 구비하는 세포배양용 플레이트 및 세포배양용 플라스크 등을 들 수 있다. 상기 플레이트의 웰 수는 특별히 한정되지 않는다. 해당 웰 수로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 2, 4, 6, 12, 24, 48, 96, 384 등을 들 수 있다. 상기 웰의 형상으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 진원, 타원, 삼각형, 정사각형, 직사각형, 오각형 등을 들 수 있다. 상기 웰 저면의 형상으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 평평한 바닥, 둥근 바닥, 요철 등을 들 수 있다.
상기 용기 본체의 재질은 특별히 한정되지 않지만, 수지, 금속 및 무기 재료를 들 수 있다. 상기 수지로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 폴리이소프렌, 시클로올레핀 폴리머, 폴리이미드, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, (메트)아크릴 수지, 에폭시 수지, 실리콘 등을 들 수 있다. 상기 금속으로서는, 스테인리스, 구리, 철, 니켈, 알루미늄, 티타늄, 금, 은, 백금 등을 들 수 있다. 상기 무기 재료로서는, 산화규소(유리), 산화알루미늄, 산화티타늄, 산화지르코늄, 산화철, 질화규소 등을 들 수 있다.
이하에 실시예 및 비교예를 들어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명은 이들 실시예에만 한정되지 않는다.
또한, 얻어진 합성 수지에 있어서의 구조 단위의 함유율은, 합성 수지를 DMSO-d6(디메틸술폭시드)에 용해한 후, 1H-NMR(핵자기 공명 스펙트럼)에 의해 측정하였다. 또한, 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체에 있어서의 펩티드의 함유율은, FT-IR 또는 LC-MS에 의해 측정하였다. 얻어진 합성 수지의 아세탈화도(부티랄화도), 수산기량, 아세틸화도, 카르복실기의 함유율 및 펩티드부의 함유율을 표 1, 2에 나타내었다.
(실시예 1)
폴리비닐아세탈 수지(PVB1)의 제작:
교반 장치를 구비한 반응기에, 이온 교환수 2700mL, 평균 중합도 1700, 비누화도 99몰％의 폴리비닐알코올을 300중량부 투입하고, 교반하면서 가열 용해하고, 용액을 얻었다. 얻어진 용액에, 촉매로서, 염산 농도가 0.2중량％로 되도록 35중량％ 염산을 첨가하였다. 이어서, 온도를 15℃로 조정하고, 교반하면서 n-부틸알데히드 22중량부를 첨가하였다. 이어서, n-부틸알데히드 148중량부를 첨가하고, 백색 입자상의 폴리비닐아세탈 수지(폴리비닐부티랄 수지)를 석출시켰다. 석출하고 나서 15분 후에, 염산 농도가 1.8중량％가 되도록 35중량％ 염산을 첨가한 후, 50℃로 가열하고, 50℃에서 2시간 유지하였다. 이어서, 용액을 냉각하고, 중화한 후, 폴리비닐부티랄 수지를 수세하고, 건조시켜서, 폴리비닐아세탈 수지(폴리비닐부티랄 수지(PVB1), 평균 중합도 1700, 아세탈화도(부티랄화도) 70몰％, 수산기량 27몰％, 아세틸화도 3몰％)를 얻었다.
링커의 도입:
얻어진 폴리비닐아세탈 수지 99중량부와, 아크릴산(링커) 1중량부를 THF 300중량부에 용해하고, 광 라디칼 중합 개시제의 존재 하에서, 자외선 조사 하에서 20분간 반응시켜, 폴리비닐아세탈 수지와 아크릴산을 그라프트 공중합시킴으로써, 링커를 도입하였다. 링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지 1중량부를 부탄올 19중량부에 용해시켰다. 얻어진 용액 150μL를, 에어 더스터로 제진한 φ22mm의 커버 유리(마쓰나미사제 「22원 No.1」)의 표면 상에 토출하고, 스핀 코터를 사용하여 2000rpm, 20초 회전시킨 후, 60℃에서 60분간 가열하여, 표면이 평활한 수지막을 얻었다.
펩티드부의 형성:
Arg-Gly-Asp-Ser의 아미노산 서열을 갖는 직쇄상의 펩티드(아미노산 잔기수 4개, 표에서는 RGDS라고 기재)를 준비하였다. 이 펩티드 1중량부와, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(축합제) 1중량부를, 칼슘 및 마그네슘의 양쪽을 포함하지 않는 인산 완충 생리 식염수에 해당 펩티드의 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하고, 펩티드 함유액을 제작하였다. 이 펩티드 함유액 1중량부를, 스핀 코팅한 수지막(링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지)에 첨가하고, 반응시켜서, 링커의 카르복실기와, 펩티드의 Arg의 아미노기를 탈수 축합하였다. 이와 같이 하여, 폴리비닐아세탈 수지부와, 링커부와, 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
얻어진 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지는, 아세탈화도(부티랄화도) 69.3몰％, 수산기량 26.7몰％, 아세틸화도 3.0몰％, 카르복실기의 함유율 0.9몰％, 펩티드부의 함유율 0.1몰％였다.
세포배양용 용기의 제작:
얻어진 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지와 커버 유리와의 적층체를, φ22mm의 폴리스티렌 디쉬에 배치함으로써 세포배양용 용기를 얻었다.
(실시예 2)
실시예 1과 마찬가지로 하여, 수지막(링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지)을 얻었다.
펩티드부의 형성:
Arg-Gly-Asp-Phe-Lys의 아미노산 서열을 갖는 환상의 펩티드(아미노산 잔기 수 5개, Arg와 Lys가 결합함으로써 환상 펩티드 골격을 형성, Phe는 D체, 표에서는 c-RGDfK라고 기재)를 준비하였다. 이 펩티드 1중량부와, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(축합제) 1중량부를, 칼슘 및 마그네슘의 양쪽을 포함하지 않는 인산 완충 생리 식염수에 해당 펩티드의 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하고, 펩티드 함유액을 제작하였다. 이 펩티드 함유액 1중량부를, 스핀 코팅한 수지막(링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지)에 첨가하고, 반응시켜서, 링커의 카르복실기와, 펩티드의 Lys의 아미노기를 탈수 축합하였다. 이와 같이 하여, 폴리비닐아세탈 수지부와, 링커부와, 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
세포배양용 용기의 제작:
실시예 1과 마찬가지로 하여, 세포배양용 용기를 얻었다.
(실시예 3)
실시예 1과 마찬가지로 하여, 수지막(링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지)을 얻었다.
펩티드부의 형성:
Gly-Arg-Gly-Asp-Ser의 아미노산 서열을 갖는 직쇄상의 펩티드(아미노산 잔기 수 5개, 표에서는 GRGDS라고 기재)를 준비하였다. 펩티드의 첨가량을 10중량부로 한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
세포배양용 용기의 제작:
실시예 1과 마찬가지로 하여, 세포배양용 용기를 얻었다.
(실시예 4)
링커의 도입에 있어서, 70중량부의 PVB1과 30중량부의 아크릴산(링커)을 사용한 것, 펩티드부의 형성에 있어서, 펩티드의 첨가량을 30중량부로 변경한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지 및 세포배양용 용기를 제작하였다.
(실시예 5)
링커의 도입에 있어서, 50중량부의 PVB1과 50중량부의 아크릴산(링커)을 사용한 것, 펩티드부의 형성에 있어서, 펩티드의 첨가량을 40중량부로 변경한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지 및 세포배양용 용기를 제작하였다.
(실시예 6)
링커의 도입에 있어서, 30중량부의 PVB1과 70중량부의 아크릴산(링커)을 사용한 것, 펩티드부의 형성에 있어서, 펩티드의 첨가량을 70중량부로 변경한 것 이외에는, 실시예 3과 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지 및 세포배양용 용기를 제작하였다.
(실시예 7)
폴리비닐아세탈 수지(PVB2)의 제작:
교반 장치를 구비한 반응기에, 이온 교환수 2700mL, 평균 중합도 1700, 비누화도 99몰％의 폴리비닐알코올을 300중량부 투입하고, 교반하면서 가열 용해하고, 용액을 얻었다. 얻어진 용액에, 촉매로서, 염산 농도가 0.2중량％로 되도록 35중량％ 염산을 첨가하였다. 이어서, 온도를 15℃로 조정하고, 교반하면서 n-부틸알데히드 22중량부를 첨가하였다. 이어서, n-부틸알데히드 143중량부를 첨가하고, 백색 입자상의 폴리비닐아세탈 수지(폴리비닐부티랄 수지)를 석출시켰다. 석출하고 나서 15분 후에, 염산 농도가 1.8중량％가 되도록 35중량％ 염산을 첨가한 후, 50℃로 가열하고, 50℃에서 2시간 유지하였다. 이어서, 용액을 냉각하고, 중화한 후, 폴리비닐부티랄 수지를 수세하고, 건조시켜서, 폴리비닐아세탈 수지(폴리비닐부티랄 수지(PVB2), 평균 중합도 1700, 아세탈화도(부티랄화도) 69몰％, 수산기량 28몰％, 아세틸화도 3몰％)를 얻었다.
링커의 도입:
얻어진 폴리비닐아세탈 수지 70중량부와, 아크릴산(링커) 30중량부를 THF 300중량부에 용해하고, 광 라디칼 중합 개시제의 존재 하에서, 자외선 조사 하에서 20분간 반응시켜, 폴리비닐아세탈 수지와 아크릴산을 그라프트 공중합시킴으로써, 링커를 도입하였다. 링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지 1중량부를 부탄올 19중량부에 용해시켰다. 얻어진 용액 150μL를, 에어 더스터로 제진한 φ22mm의 커버 유리(마쓰나미사제 「22원 No.1」)의 표면 상에 토출, 스핀 코터를 사용하여 2000rpm, 20초 회전시킨 후, 60℃에서 60분간 가열하여, 표면이 평활한 수지막을 얻었다.
펩티드부의 형성:
얻어진 수지막(링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지)을 사용한 것 이외에는, 실시예 4와 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
세포배양용 용기의 제작:
실시예 1과 마찬가지로 하여, 세포배양용 용기를 얻었다.
(실시예 8)
폴리비닐아세탈 수지(PVB3)의 제작:
교반 장치를 구비한 반응기에, 이온 교환수 2700mL, 평균 중합도 1700, 비누화도 99몰％의 폴리비닐알코올을 300중량부 투입하고, 교반하면서 가열 용해하고, 용액을 얻었다. 얻어진 용액에, 촉매로서, 염산 농도가 0.2중량％로 되도록 35중량％ 염산을 첨가하였다. 이어서, 온도를 15℃로 조정하고, 교반하면서 n-부틸알데히드 22중량부를 첨가하였다. 이어서, n-부틸알데히드 138중량부를 첨가하고, 백색 입자상의 폴리비닐아세탈 수지(폴리비닐부티랄 수지)를 석출시켰다. 석출하고 나서 15분 후에, 염산 농도가 1.8중량％가 되도록 35중량％ 염산을 첨가한 후, 50℃로 가열하고, 50℃에서 2시간 유지하였다. 이어서, 용액을 냉각하고, 중화한 후, 폴리비닐부티랄 수지를 수세하고, 건조시켜서, 폴리비닐아세탈 수지(폴리비닐부티랄 수지(PVB3), 평균 중합도 1700, 아세탈화도(부티랄화도) 67몰％, 수산기량 30몰％, 아세틸화도 3몰％)를 얻었다.
링커의 도입:
얻어진 폴리비닐아세탈 수지를 사용한 것 이외에는 실시예 7과 마찬가지로 하여, 링커를 도입하였다.
펩티드부의 형성:
얻어진 수지막(링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지)을 사용한 것 이외에는, 실시예 4와 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
세포배양용 용기의 제작:
실시예 1과 마찬가지로 하여, 세포배양용 용기를 얻었다.
(실시예 9)
폴리비닐아세탈 수지(PVB4)의 제작:
교반 장치를 구비한 반응기에, 이온 교환수 2700mL, 평균 중합도 1700, 비누화도 99몰％의 폴리비닐알코올을 300중량부 투입하고, 교반하면서 가열 용해하고, 용액을 얻었다. 얻어진 용액에, 촉매로서, 염산 농도가 0.2중량％로 되도록 35중량％ 염산을 첨가하였다. 이어서, 온도를 15℃로 조정하고, 교반하면서 n-부틸알데히드 22중량부를 첨가하였다. 이어서, n-부틸알데히드 100중량부를 첨가하고, 백색 입자상의 폴리비닐아세탈 수지(폴리비닐부티랄 수지)를 석출시켰다. 석출하고 나서 15분 후에, 염산 농도가 1.8중량％가 되도록 35중량％ 염산을 첨가한 후, 50℃로 가열하고, 50℃에서 2시간 유지하였다. 이어서, 용액을 냉각하고, 중화한 후, 폴리비닐부티랄 수지를 수세하고, 건조시켜서, 폴리비닐아세탈 수지(폴리비닐부티랄 수지(PVB4), 평균 중합도 1700, 아세탈화도(부티랄화도) 50몰％, 수산기량 47몰％, 아세틸화도 3몰％)를 얻었다.
링커의 도입:
얻어진 폴리비닐아세탈 수지를 사용한 것 이외에는 실시예 7과 마찬가지로 하여, 링커를 도입하였다.
펩티드부의 형성:
얻어진 수지막(링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지)을 사용한 것 이외에는, 실시예 4와 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
세포배양용 용기의 제작:
실시예 1과 마찬가지로 하여, 세포배양용 용기를 얻었다.
(실시예 10)
실시예 4와 마찬가지로 하여, 수지막(링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지)을 얻었다.
펩티드부의 형성:
Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro의 아미노산 서열을 갖는 직쇄상의 펩티드(아미노산 잔기 수 6개, 표에서는 GRGDSP라고 기재)를 준비하였다. 이 펩티드를 사용한 것 이외에는 실시예 4와 마찬가지로 하여, 폴리비닐아세탈 수지부와, 링커부와, 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지를 제작하였다.
세포배양용 용기의 제작:
실시예 1과 마찬가지로 하여, 세포배양용 용기를 얻었다.
(비교예 1)
평균 중합도 1700, 비누화도 90몰％의 폴리비닐알코올 99중량부와, 아크릴산(링커) 1중량부를 에탄올 300중량부에 용해하고, 광 라디칼 중합 개시제의 존재 하에서, 자외선 조사 하에서 20분간 반응시켜, 폴리비닐알코올과 아크릴산을 그라프트 공중합 시킴으로써, 링커를 도입하였다. Gly-Arg-Gly-Asp-Ser의 아미노산 서열을 갖는 직쇄상의 펩티드(아미노산 잔기 수 5개, 표에서는 GRGDS라고 기재)를 사용한 것, 링커의 카르복실기와, 펩티드의 Gly의 아미노기를 탈수 축합한 것 이외에는, 실시예 1과 마찬가지로 하여, 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체 및 세포배양용 용기를 제작하였다.
(비교예 2)
실시예 1과 마찬가지로 하여, 수지막(링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지)을 얻었다. 비교예 2에서는, 펩티드부를 형성하지 않았다. 또한, 실시예 1과 마찬가지로 하여, 세포배양용 용기를 얻었다.
(참고예 A)
천연물 유래의 스캐폴드재의 제작:
인산 버퍼(PBS) 중에 5μg/ml로 조정한 비트로넥틴(코닝사제) 용액을 φ35mm 디쉬에 1ml 첨가하였다. 거기에 φ22mm의 커버 유리(마쓰나미사제 「22원 No.1」)를 침지시켜, 37℃에서 1시간 양생함으로써 비트로넥틴이 표면에 평활하게 흡착된 천연물 유래의 스캐폴드재(표 중에서는 VTN이라고 기재)를 얻었다.
세포배양용 용기의 제작:
실시예 1과 마찬가지로 하여, 세포배양용 용기를 얻었다. 또한, 비트로넥틴은 건조하면 변성되고, 접착 성능이 크게 저하되어 버리기 때문에, 세포배양용 용기의 제작 후 바로 PBS 용액으로 침지하였다.
(평가)
(1) 수산기가 및 산가의 측정
JIS K0070에 기재된 중화 적정법으로, 상술한 방법에 의해, 세포배양용 스캐폴드 재료의 수산기가 및 산가를 측정하였다.
(2) 해도 구조의 유무
얻어진 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지의 수지막(실시예 1 내지 10 및 비교예 1) 및 링커를 도입한 폴리비닐아세탈 수지의 수지막(비교예 2)을 PBS 용액에 30분간 침지하였다. 침지 후의 수지막을 원자간력 현미경(AFM, Bruker사제 「Dimension XR」)에 의해 관찰하였다. QNM 모드로 피크 세트 포인트를 2nN에 설정하는 측정 조건으로 하고, 1㎛×1㎛의 범위를 관찰하였다. 얻어진 높이 매핑 화상과 탄성률 매핑 화상을 비교하여 해도 구조의 유무를 판단하였다. 또한, 표에서는, 해도 구조가 관찰되는 경우에 「A」라고 기재하고, 해도 구조가 관찰되지 않는 경우에 「B」라고 기재하였다.
도 2의 (a)는, 해도 구조가 관찰된다고 판정되는 화상의 예이고, 도 2의 (b)는, 해도 구조가 관찰되지 않는다고 판정되는 화상의 예이다. 구체적으로는, 도 2의 (a)는, 실시예 7에서 얻어진 세포배양용 스캐폴드 재료의 화상이고, 도 2의 (b)는, 실시예 1에서 얻어진 세포배양용 스캐폴드 재료의 화상이다.
(3) 세포배양 평가
(3-1) iPS 세포의 파종 및 배양
이하의 액체 배지 및 ROCK(Rho 결합 키나아제) 특이적 저해제를 준비하였다.
TeSR E8 배지(STEM CELL사제)
ROCK-Inhibitor(Y27632)
얻어진 세포배양용 용기에 인산 완충 생리 식염수 1mL를 첨가하여 37℃의 인큐베이터 내에서 1시간 정치 후, 세포배양용 용기로부터 인산 완충 생리 식염수를 제거하였다.
φ35mm 디쉬에 콘플루언트 상태가 된 h-iPS 세포 253G1에 0.5mM 에틸렌디아민사아세트산/인산 완충 용액 1mL를 첨가하고, 실온에서 2분간 정치하였다. 에틸렌디아민사아세트산/인산 완충 용액을 제거한 후, 액체 배지 1mL로 피펫팅함으로써 50㎛ 내지 200㎛의 크기로 부서진 세포괴를 얻었다. 얻어진 세포괴(세포수 1.0×105cells)를 상기의 세포배양용 용기에 클램프 파종하였다.
1mL의 액체 배지와, 최종 농도가 10μM으로 되도록 ROCK 특이적 저해제를 세포배양용 용기에 첨가하여, 37℃ 및 CO2 농도 5％의 인큐베이터 내에서 배양을 행하였다. 24시간마다 액체 배지를 1mL 제거하고, 새로운 액체 배지를 1mL 가함으로써 배지 교환을 행하였다.
(3-2) MSC의 파종 및 배양
이하의 액체 배지 및 첨가제를 준비하였다. 액체 배지인 MesenCult-ACF Plus Medium에 최종 농도가 1X로 되도록, MesenCult-ACF Plus 500X Supplement 및 L-글루타민 200mmol/L(100X)을 첨가하였다.
MesenCult-ACF Plus Medium(Stemcell technologies사제)
MesenCult-ACF Plus 500X Supplement(Stemcell technologies사제)
L-글루타민 200mmol/L(100X)(후지필름 와코 준야쿠사제)
이하의 간엽계 줄기세포(MSC)를 준비하였다. MSC를 포함하는 골수 간질 세포를 MSC용 배지에서 순화하고, MSC의 양성 마커(CD73, CD90, CD105)가 95％ 이상, MSC의 음성 마커(CD14, CD34, CD45)가 5％ 미만의 순도인 세포를 MSC로서 사용하였다.
Human Bone Marrow Stromal Cells Derived in ACF Medium(Stemcell technologies사제)
얻어진 세포배양용 용기에 인산 완충 생리 식염수 1mL를 첨가하여 37℃의 인큐베이터 내에서 1시간 정치 후, 세포배양용 용기로부터 인산 완충 생리 식염수를 제거하였다.
φ35mm 디쉬에 콘플루언트 상태가 된 MSC를 배치하고, ACF Enzymatic Dissociation Solution(Stemcell technologies사제) 2mL를 첨가하고, 37℃ 및 CO2 농도 5％의 인큐베이터 내에서 3분간 정치하였다. 또한, ACF Enzyme Inhibition Solution(Stemcell technologies사제) 2mL를 첨가하였다. 300rpm으로 8분간 원심 후, 상청을 제거하여, 액체 배지에서 현탁하고 세포 현탁액을 얻었다. 얻어진 세포 현탁액(세포수 8.0×104cells)을 상기의 세포배양용 용기에 파종하였다.
파종 시는 1.5mL의 액체 배지를 세포배양용 용기에 첨가하였다. 또한, 37℃ 및 CO2 농도 5％의 인큐베이터 내에서 배양을 행하였다.
(3-3) 위족의 신전성
세포 파종으로부터 24시간 경과 후의 세포를 위상차 현미경(올림푸스사제 「IX73」, 10×20배)을 사용하여 관찰하였다. 관찰에 있어서, 세포배양용 용기 내의 가장 평균적인 접착 형태를 나타내는 시야의 화상을 취득하였다. 얻어진 화상으로부터, 셰이프 팩터(SF)를 구함으로써, 위족의 신전성을 평가하였다. 또한, 셰이프 팩터(SF)란, 세포를 배양한 후의 세포의 평면으로 보면 영역의 형상 평가 계수이고, 하기 식에 의해 구해진다.
식: SF=4×π×(세포의 평면적)/(세포의 외주연의 길이)2
도 3의 (a), (b) 및 (c)는, SF와 세포의 평면 형상과의 관계를 도시하는 도면이다. 도 3의 (a)에 도시하는 바와 같이, 상기 SF가 1이면 세포의 평면 형상은 원형으로 된다. SF가 작아질수록, 원형으로부터 멀어지고, 세포의 위족이 양호하게 신전하고 있는 것을 의미한다. 도 3의 (b)는, SF≒0.3인 경우의 세포의 평면 형상을 도시하는 사진이고, 도 3의 (c)는, SF≒1인 경우의 세포의 평면 형상을 도시하는 사진이다.
<위족의 신전성의 판정 기준>
○: SF가 0.1 이상 0.6 이하
×: SF가 0.6을 초과하고 1 이하
(3-4) 세포의 증식성(1)
세포 파종으로부터 5일 경과 후의 세포를 위상차 현미경으로 관찰하였다. 세포괴가 파종 시보다도 크게 되어 있는지의 여부를 눈으로 보아 확인하였다.
<세포의 증식성(1)의 판정 기준>
○: 파종 시와 비교하여 세포괴가 커지고 있고, 세포의 증식을 확인할 수 있다
×: 파종 시와 비교하여 세포괴가 변화하지 않거나, 또는, 세포괴가 박리하고 있고, 세포괴가 존재하지 않는다
(3-5) 세포의 증식성(2)
세포 파종으로부터 5일 경과 후의 세포수를 셀 카운터(Chemometec사제 「NucleoCounter Nc-3000」)를 사용하여 구하였다. 이어서, 하기 식을 사용하여 참고예 A에 대한 세포 증식률을 구하였다.
참고예 A에 대한 세포 증식률(％)=(실시예·비교예에 있어서의 세포수)/(참고예 A에 있어서의 세포수)×100
<세포의 증식성(2)의 판정 기준>
AA: 참고예 A에 대한 세포 증식률이 100％ 이상
A: 참고예 A에 대한 세포 증식률이 50％ 이상 100％ 미만
B: 참고예 A에 대한 세포 증식률이 10％ 이상 50％ 미만
C: 참고예 A에 대한 세포 증식률이 10％ 미만
상세 및 결과를 하기의 표 1, 2에 나타내었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
1: 세포배양용 용기
2: 용기 본체
2a: 표면
3: 세포배양용 스캐폴드 재료
SEQUENCE LISTING <110> SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. <120> Cell culture scaffold material and cell culture vessel <130> F2892PCT <150> JP 2019-092083 <151> 2019-05-15 <150> JP 2019-119079 <151> 2019-06-26 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 1 Arg Gly Asp Gly 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 2 Arg Gly Asp Ala 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 3 Arg Gly Asp Val 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 4 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 5 Arg Gly Asp Thr 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 6 Arg Gly Asp Phe 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 7 Arg Gly Asp Met 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 8 Arg Gly Asp Pro 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 9 Arg Gly Asp Asn 1 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 10 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 11 Pro Asp Ser Gly Arg 1 5 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 12 Arg Glu Asp Val 1 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 13 Ile Asp Ala Pro Ser 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 14 Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 15 Gly Arg Gly Asp Ser 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell adhesion peptide <400> 16 Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5

Claims (9)

  1. 폴리비닐알코올 유도체부와 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체를 포함하고,
    수산기가가, 1100mgKOH/g 이하인, 세포배양용 스캐폴드 재료.
  2. 폴리비닐알코올 유도체부와 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체를 포함하고,
    상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체의 수산기가가, 1100mgKOH/g 이하인, 세포배양용 스캐폴드 재료.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩티드부가, 세포 접착성의 아미노산 서열을 갖는, 세포배양용 스캐폴드 재료.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포 접착성의 아미노산 서열이, RGD 서열, YIGSR 서열, 또는 PDSGR 서열을 적어도 갖는, 세포배양용 스캐폴드 재료.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 세포 접착성의 아미노산 서열이, 하기 식 (1)로 표시되는 RGD 서열을 적어도 갖는, 세포배양용 스캐폴드 재료.
    Arg-Gly-Asp-X ···식 (1)
    상기 식 (1) 중, X는, Gly, Ala, Val, Ser, Thr, Phe, Met, Pro 또는 Asn을 나타낸다.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드부가, 3개 이상 10개 이하의 아미노산에 의해 구성되는, 세포배양용 스캐폴드 재료.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리비닐알코올 유도체부와 상기 펩티드부가, 링커부를 통해 결합하고 있는, 세포배양용 스캐폴드 재료.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 함유 폴리비닐알코올 유도체가, 폴리비닐아세탈 수지부와 상기 펩티드부를 갖는 펩티드 함유 폴리비닐아세탈 수지인, 세포배양용 스캐폴드 재료.
  9. 용기 본체와,
    제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 세포배양용 스캐폴드 재료를 구비하고,
    상기 용기 본체의 표면 상에, 상기 세포배양용 스캐폴드 재료가 배치되어 있는, 세포배양용 용기.
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