TW202104577A - 細胞培養用支架材料及細胞培養用容器 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種細胞之黏著性優異之細胞培養用支架材料。 本發明之細胞培養用支架材料包含具有聚乙烯醇衍生物部及肽部之含肽聚乙烯醇衍生物，且上述肽部具有環狀肽骨架。

Description

細胞培養用支架材料及細胞培養用容器
本發明係關於一種用於培養細胞之細胞培養用支架材料。又，本發明係關於一種使用上述細胞培養用支架材料之細胞培養用容器。
於學術領域、藥物開發領域及再生醫學領域等之研究開發中，使用人類、小鼠、大鼠、豬、牛及猴等動物細胞。作為用於培養動物細胞之支架材料，使用層黏連蛋白及玻連蛋白等黏著蛋白質、以及源自小鼠肉瘤之基質膠等天然高分子材料。藉由使用天然高分子材料作為支架材料，層黏連蛋白或玻連蛋白等所具有之具有細胞黏著性胺基酸序列(Arg-Gly-Asp等)之域與細胞表面之整合素結合，細胞良好地黏著於支架材料，且細胞良好地增殖。
又，於下述專利文獻1中揭示有一種包含重複結構及RGD序列等細胞黏著序列之蛋白質。該蛋白質具有特定之Ala富集部位與特定之Ala非富集部位連結而成之結構作為上述重複結構。又，於專利文獻1中記載有可使用包含該蛋白質之材料作為細胞支架材料。
又，如下述專利文獻2～5所示，亦已知有使用合成樹脂之支架材料。
於下述專利文獻2中揭示有一種細胞培養用載體，其含有：包含聚乙烯醇縮醛化合物之成形物、或包含該聚乙烯醇縮醛化合物及水溶性多糖類之成形物，且該聚乙烯醇縮醛化合物之縮醛化度為20～60莫耳%。
又，於下述專利文獻3中揭示有一種組合物(支架材料)，其包含第1纖維聚合物支架材，且該第1纖維聚合物支架材之纖維經排列。作為該纖維聚合物之材料，使用脂肪族聚酯等。
又，於下述專利文獻4中揭示有一種細胞培養方法：其係用於維持多能幹細胞之未分化性者，且包括於具有經聚輪烷嵌段共聚物被覆之表面之培養器上培養該多能幹細胞之步驟。
進而，於下述專利文獻5中揭示有一種細胞培養用製品，其具備：具有表面之基板、設置於上述基板之上述表面之親水性共聚物層、及分別與上述親水性共聚物層之表面結合之複數個肽鏈。上述親水性共聚物層係由複數個聚乙烯醇單元、複數個聚乙烯醇衍生物單元及複數個含羧酸基單元進行共聚而成之層。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開2018-064542號公報 [專利文獻2]日本專利特開2006-314285號公報 [專利文獻3]WO2007/090102A1 [專利文獻4]日本專利特開2017-023008號公報 [專利文獻5]日本專利特開2015-070832號公報
[發明所欲解決之問題]
藉由使用天然高分子材料作為支架材料，播種後之細胞良好地增殖，又，偽足良好地伸展。然而，天然高分子材料昂貴，或由於為源自天然之物質故而批次間之偏差較大，或有由源自動物之成分所引起之安全上之顧慮。又，於使用如專利文獻1所記載之具有RGD序列等細胞黏著序列之多肽作為支架材料之情形時，亦有因細胞黏著序列以外之胺基酸序列而細胞之黏著性或細胞之增殖性產生偏差之情況。
另一方面，如專利文獻2～5所記載之使用合成樹脂之支架材料與使用天然高分子材料之支架材料相比廉價，批次間之偏差較小，且安全性優異。然而，於如專利文獻2～4所記載之先前之使用合成樹脂之支架材料中，有細胞之黏著性較低之問題。又，於專利文獻5所記載之使用具有肽鏈之合成樹脂之支架材料中，有雖可以某種程度提高細胞之黏著性但不充分之情況。
本發明之目的在於提供一種細胞之黏著性優異之細胞培養用支架材料。又，本發明之目的亦在於提供一種使用上述細胞培養用支架材料之細胞培養用容器。 [解決問題之技術手段]
根據本發明之廣泛態樣，提供一種細胞培養用支架材料，其包含具有聚乙烯醇衍生物部及肽部之含肽聚乙烯醇衍生物，且上述肽部具有環狀肽骨架。
於本發明之細胞培養用支架材料之某一特定之態樣中，上述肽部具有細胞黏著性胺基酸序列。
於本發明之細胞培養用支架材料之另一特定之態樣中，上述細胞黏著性胺基酸序列至少具有RGD序列、YIGSR序列或PDSGR序列。
於本發明之細胞培養用支架材料之再一特定之態樣中，上述細胞黏著性胺基酸序列至少具有下述式(1)所表示之RGD序列。
Arg-Gly-Asp-X … 式(1)
上述式(1)中，X表示Gly、Ala、Val、Ser、Thr、Phe、Met、Pro或Asn。
於本發明之細胞培養用支架材料之再一特定之態樣中，上述環狀肽骨架包含4個以上10個以下之胺基酸。
於本發明之細胞培養用支架材料之再一特定之態樣中，上述聚乙烯醇衍生物部與上述肽部係經由連結子部結合。
於本發明之細胞培養用支架材料之再一特定之態樣中，上述細胞培養用支架材料具有海島結構。
於本發明之細胞培養用支架材料之再一特定之態樣中，上述含肽聚乙烯醇衍生物係具有聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述肽部之含肽聚乙烯醇縮醛樹脂。
根據本發明之廣泛態樣，提供一種細胞培養用容器，其具備容器本體、及上述細胞培養用支架材料，且上述細胞培養用支架材料配置於上述容器本體之表面上。 [發明之效果]
根據本發明，可提供一種細胞之黏著性優異之細胞培養用支架材料及細胞培養用容器。
以下，對本發明之詳細內容進行說明。
本發明之細胞培養用支架材料包含具有聚乙烯醇衍生物部及肽部之含肽聚乙烯醇衍生物。於本發明之細胞培養用支架材料中，上述肽部具有環狀肽骨架。
本發明之細胞培養用支架材料由於具備上述構成，故而細胞之黏著性優異。又，本發明之細胞培養用支架材料之偽足之伸展性優異，且細胞之增殖性優異。
包含具有聚乙烯醇衍生物部及肽部之含肽聚乙烯醇衍生物之細胞培養用支架材料可以某種程度提高細胞之黏著性。然而，於上述肽部不具有環狀肽骨架之情形時，若使用難黏著性細胞，則有難以提高細胞之黏著性之情況。針對於此，於本發明之細胞培養用支架材料中，上述肽部具有環狀肽骨架，故而即便為難黏著性細胞，亦可提高細胞之黏著性。
例如肽部不具有環狀肽骨架之細胞培養用支架材料有如下情況：於使用長期繼代而老化之間葉系幹細胞、或黏著性較低之一部分iPS細胞株等時，該細胞難以黏著於支架材。針對於此，於本發明之細胞培養用支架材料中，上述肽部具有環狀肽骨架，故而即便為此種難黏著性細胞，亦能夠提高細胞之黏著性。
作為藉由本發明之細胞培養用支架材料提高細胞之黏著性之機制，推定為以下之(1)及(2)之機制，但並不限定於此。 (1)藉由環狀肽骨架所具有之立體結構，肽部之特定之胺基酸序列(例如細胞黏著性胺基酸序列)有效地露出。因此，特定之胺基酸序列容易被細胞識別，又，肽部可與細胞穩定地結合。 (2)肽部不易被細胞產生之分解酵素分解，肽部之穩定性較高。
於本發明之細胞培養用支架材料中，與使用基質膠等天然高分子材料之情形同樣地，於播種後之細胞觀察到絲狀偽足樣之偽足之伸展。該偽足之伸展於先前之使用合成樹脂材料之支架材料中幾乎觀察不到。
關於本發明之細胞培養用支架材料，即便於細胞之播種密度較小之情形時，細胞亦良好地黏著於細胞培養用支架材料，且細胞良好地增殖。
又，本發明之細胞培養用支架材料與先前之使用天然高分子之細胞支架材料相比廉價，批次間之偏差較小，且安全性優異。藉由使用本發明之細胞支架材料，可降低細胞之品質管理之負荷。
(細胞培養用支架材料) 本發明之細胞培養用支架材料包含具有聚乙烯醇衍生物部及肽部之含肽聚乙烯醇衍生物。上述含肽聚乙烯醇衍生物可僅使用1種，亦可併用2種以上。
上述含肽聚乙烯醇衍生物具有聚乙烯醇衍生物部及肽部。於上述含肽聚乙烯醇衍生物中，較佳為上述聚乙烯醇衍生物部與上述肽部經由連結子部結合。因此，上述含肽聚乙烯醇衍生物較佳為具有聚乙烯醇衍生物部、肽部及連結子部。
如下所述，上述含肽聚乙烯醇衍生物例如可使聚乙烯醇衍生物、連結子及肽進行反應而獲得。再者，上述含肽聚乙烯醇衍生物例如亦可使聚乙烯醇、連結子及肽進行反應而獲得。
＜聚乙烯醇衍生物部＞ 上述聚乙烯醇衍生物部係上述含肽聚乙烯醇衍生物中源自上述聚乙烯醇衍生物之結構部分。上述聚乙烯醇衍生物係由聚乙烯醇衍生之化合物。上述聚乙烯醇衍生物較佳為聚乙烯醇縮醛樹脂，上述聚乙烯醇衍生物部較佳為聚乙烯醇縮醛樹脂部。即，上述含肽聚乙烯醇衍生物較佳為具有聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述肽部之含肽聚乙烯醇縮醛樹脂。上述聚乙烯醇衍生物及上述聚乙烯醇縮醛樹脂分別可僅使用1種，亦可併用2種以上。
上述聚乙烯醇衍生物部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂部較佳為於側鏈具有縮醛基、羥基及乙醯基。但是，上述聚乙烯醇衍生物部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂部例如可不具有乙醯基。例如藉由聚乙烯醇衍生物部及聚乙烯醇縮醛樹脂之乙醯基全部與上述連結子結合，上述聚乙烯醇衍生物部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂部可不具有乙醯基。
聚乙烯醇縮醛樹脂可藉由利用醛將聚乙烯醇縮醛化而合成。
聚乙烯醇之縮醛化所使用之上述醛並無特別限定。作為上述醛，例如可例舉碳數為1～10之醛。上述醛可具有鏈狀脂肪族基、環狀脂肪族基或芳香族基，亦可不具有。上述醛可為鏈狀醛，亦可為環狀醛。
作為上述醛，可例舉：甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、丙烯醛、苯甲醛、桂皮醛、紫蘇醛、甲醯基吡啶、甲醯基咪唑、甲醯基吡咯、甲醯基哌啶、甲醯基三唑、甲醯基四唑、甲醯基吲哚、甲醯基異吲哚、甲醯基嘌呤、甲醯基苯并咪唑、甲醯基苯并三唑、甲醯基喹啉、甲醯基異喹啉、甲醯基喹㗁啉、甲醯基㖕啉、甲醯基喋啶、甲醯基呋喃、甲醯基氧雜環戊烷、甲醯基㗁烷、甲醯基噻吩、甲醯基硫雜環戊烷、甲醯基噻烷、甲醯基腺嘌呤、甲醯基鳥嘌呤、甲醯基胞嘧啶、甲醯基胸腺嘧啶及甲醯基尿嘧啶等。上述醛可僅使用1種，亦可併用2種以上。
上述醛較佳為甲醛、乙醛、丙醛、丁醛或戊醛，更佳為丁醛。因此，上述聚乙烯醇縮醛樹脂更佳為聚乙烯醇縮丁醛樹脂，上述聚乙烯醇縮醛樹脂部更佳為聚乙烯醇縮丁醛樹脂部，上述含肽聚乙烯醇衍生物更佳為含肽聚乙烯醇縮丁醛樹脂。
再者，上述醛之調配量可根據目標縮醛基量來適當設定。就提高縮醛化反應之效率，且容易地去除未反應之醛之觀點而言，相對於聚乙烯醇100莫耳%，上述醛之添加量較佳為60莫耳%以上，更佳為65莫耳%以上，且較佳為95莫耳%以下，更佳為90莫耳%以下。
上述聚乙烯醇衍生物部、上述聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂之平均聚合度較佳為100以上，更佳為200以上，進而較佳為500以上，尤佳為1500以上，且較佳為6000以下，更佳為3000以下，進而較佳為2500以下。若上述平均聚合度為上述下限以上，則可有效地抑制由液體培養基所引起之膨潤，故而可良好地維持細胞培養用支架材料之強度。因此，可提高細胞增殖性。又，若上述平均聚合度為上述上限以下，則可提高操作性，可提高細胞培養用支架材料之成形性。再者，上述聚乙烯醇衍生物部、上述聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂之平均聚合度通常與成為原料之聚乙烯醇之平均聚合度相同，可藉由聚乙烯醇之平均聚合度求出。
上述聚乙烯醇衍生物部、上述聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂之數量平均分子量(Mn)較佳為10000以上，且較佳為600000以下。上述聚乙烯醇衍生物部、上述聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂之重量平均分子量(Mw)較佳為2000以上，且較佳為1200000以下。又，於上述聚乙烯醇衍生物部、上述聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂中，重量平均分子量(Mw)相對於數量平均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)較佳為2.0以上，且較佳為40以下。若上述Mn、上述Mw、上述Mw/Mn為上述下限以上及上述上限以下，則可提高細胞培養用支架材料之強度。
再者，上述聚乙烯醇衍生物部、上述聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂之數量平均分子量(Mn)及重量平均分子量(Mw)例如可藉由使用四氫呋喃(THF)作為溶劑之凝膠滲透層析(GPC)分析，以聚苯乙烯換算值求出。
上述聚乙烯醇衍生物部、上述聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂之縮醛化度(於聚乙烯醇縮丁醛樹脂之情形時為丁醛化度)較佳為40莫耳%以上，更佳為50莫耳%以上，且較佳為90莫耳%以下，更佳為85莫耳%以下。若上述縮醛化度為上述下限以上，則可進一步提高細胞之定殖性，細胞高效率地增殖。若上述縮醛化度為上述上限以下，則可使於溶劑中之溶解性良好。
上述聚乙烯醇衍生物部、上述聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂之羥基之含有率(羥基量)較佳為15莫耳%以上，更佳為20莫耳%以上，且較佳為45莫耳%以下，更佳為30莫耳%以下，進而較佳為25莫耳%以下。
上述聚乙烯醇衍生物部、上述聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂之乙醯化度(乙醯基量)較佳為1莫耳%以上，更佳為2莫耳%以上，且較佳為5莫耳%以下，更佳為4莫耳%以下。若上述乙醯化度為上述下限以上及上述上限以下，則可提高聚乙烯醇縮醛樹脂與連結子之反應效率。
上述聚乙烯醇衍生物部、上述聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述聚乙烯醇縮醛樹脂之縮醛化度、乙醯化度及羥基量可藉由1 H-NMR(核磁共振光譜)進行測定。
＜肽部＞ 上述肽部係上述含肽聚乙烯醇衍生物中源自上述肽之結構部分。上述肽部具有胺基酸序列。構成上述肽部之肽可為寡肽，亦可為多肽。上述肽可僅使用1種，亦可併用2種以上。
上述肽部具有環狀肽骨架。上述環狀肽骨架係包含複數個胺基酸之環狀骨架。上述肽部可僅具有環狀肽骨架，亦可具有環狀肽骨架及環狀肽骨架以外之骨架(鏈狀肽骨架等)。
上述肽部較佳為包含4個以上之胺基酸，更佳為包含5個以上之胺基酸，且較佳為包含15個以下之胺基酸，更佳為包含10個以下之胺基酸。若構成上述肽部之胺基酸之個數為上述下限以上及上述上限以下，則可提高細胞識別特定之胺基酸序列之識別性，可進一步提高細胞之黏著性及增殖性。又，若構成上述肽部之胺基酸之個數為上述下限以上及上述上限以下，則可使偽足之伸展性更良好。
上述環狀肽骨架較佳為包含4個以上之胺基酸，更佳為包含5個以上之胺基酸，且較佳為包含10個以下之胺基酸，更佳為包含7個以下之胺基酸。若構成上述環狀肽骨架之胺基酸之個數為上述下限以上，則可提高細胞識別特定之胺基酸序列之識別性，可進一步提高細胞之黏著性及增殖性。又，若構成上述環狀肽骨架之胺基酸之個數為上述下限以上及上述上限以下，則可使偽足之伸展性更良好。就將成本抑制得較低之觀點而言，較佳為構成上述環狀肽骨架之胺基酸之個數為5個。
上述肽部較佳為具有細胞黏著性胺基酸序列。再者，細胞黏著性胺基酸序列係指藉由噬菌體顯示法、瓊脂糖珠法或層板塗佈法確認到細胞黏著活性之胺基酸序列。作為上述噬菌體顯示法，例如可使用「The Journal of Cell Biology, Volume 130, Number 5, September 1995 1189-1196」所記載之方法。作為上述瓊脂糖珠法，例如可使用「蛋白質 核酸 酵素 Vol. 45 No.15 (2000) 2477」所記載之方法。作為上述層板塗佈法，例如可使用「蛋白質 核酸 酵素 Vol. 45 No.15 (2000) 2477」所記載之方法。
作為上述細胞黏著性胺基酸序列，例如可例舉：RGD序列(Arg-Gly-Asp)、YIGSR序列(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)、PDSGR序列(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg)、HAV序列(His-Ala-Val)、ADT序列(Ala-Asp-Thr)、QAV序列(Gln-Ala-Val)、LDV序列(Leu-Asp-Val)、IDS序列(Ile-Asp-Ser)、REDV序列(Arg-Glu-Asp-Val)、IDAPS序列(Ile-Asp-Ala-Pro-Ser)、KQAGDV序列(Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)及TDE序列(Thr-Asp-Glu)等。又，作為上述細胞黏著性胺基酸序列，亦可例舉「病態生理，第9卷 第7號，527～535頁，1990年」及「大阪府立母子醫療中心雜誌，第8卷 第1號，58～66頁，1992年」所記載之序列等。上述肽部可僅具有1種上述細胞黏著性胺基酸序列，亦可具有2種以上。
上述細胞黏著性胺基酸序列較佳為具有上述細胞黏著性胺基酸序列中之至少任一者，更佳為至少具有RGD序列、YIGSR序列或PDSGR序列，進而較佳為至少具有下述式(1)所表示之RGD序列。於該情形時，可進一步提高細胞之黏著性及增殖性，可使偽足之伸展性更良好。
Arg-Gly-Asp-X … 式(1)
上述式(1)中，X表示Gly、Ala、Val、Ser、Thr、Phe、Met、Pro或Asn。
於上述肽部具有上述細胞黏著性胺基酸序列之情形時，上述環狀肽骨架可具有上述細胞黏著性胺基酸序列，亦可不具有。就提高細胞識別上述細胞黏著性胺基酸序列之識別性，進一步提高細胞之黏著性及增殖性之觀點而言，較佳為上述環狀肽骨架具有上述細胞黏著性胺基酸序列。
於上述肽部具有上述細胞黏著性胺基酸序列之情形時，可該細胞黏著性胺基酸序列之N末端之胺基酸或C末端之胺基酸與連結子結合，亦可構成與該細胞黏著性胺基酸序列不同之部分之胺基酸序列之胺基酸與連結子結合。
於上述肽部具有上述細胞黏著性胺基酸序列之情形時，更佳為構成與上述細胞黏著性胺基酸序列不同之部分之胺基酸序列之胺基酸與連結子部結合。於該情形時，可進一步提高細胞之黏著性及增殖性，可使偽足之伸展性更良好。
於上述含肽聚乙烯醇衍生物100重量%中，上述肽部之含有率較佳為0.01重量%以上，更佳為0.1重量%以上，進而較佳為1重量%以上，尤佳為5重量%以上。於上述含肽聚乙烯醇衍生物100重量%中，上述肽部之含有率較佳為30重量%以下，更佳為25重量%以下，進而較佳為20重量%以下，尤佳為15重量%以下。若上述肽部之含有率為上述下限以上，則可更進一步提高細胞之黏著性及增殖性，可使偽足之伸展性進而更良好。
於上述含肽聚乙烯醇衍生物中，上述肽部之含有率較佳為0.01莫耳%以上，更佳為0.1莫耳%以上，進一步較佳為1莫耳%以上，進而較佳為5莫耳%以上，尤佳為10莫耳%以上。於上述含肽聚乙烯醇衍生物中，上述肽部之含有率較佳為60莫耳%以下，更佳為50莫耳%以下，進而較佳為35莫耳%以下，尤佳為25莫耳%以下。若上述肽部之含有率為上述下限以上，則可更進一步提高細胞之黏著性及增殖性，可使偽足之伸展性進而更良好。若上述肽部之含有率為上述上限以下，則可抑制製造成本。再者，上述肽部之含有率(莫耳%)係相對於構成上述含肽聚乙烯醇衍生物之各結構單元之物質量之總和的上述肽部之物質量。
於上述含肽聚乙烯醇衍生物中，上述肽部之含有率相對於上述縮醛基、上述羥基及上述乙醯基之合計含有率之莫耳比(上述肽部之含有率/上述縮醛基、上述羥基及上述乙醯基之合計含有率)較佳為0.0001以上，更佳為0.001以上。若上述莫耳比(上述肽部之含有率/上述縮醛基、上述羥基及上述乙醯基之合計含有率)為上述下限以上，則可更進一步提高細胞之黏著性及增殖性，可使偽足之伸展性進而更良好。於上述含肽聚乙烯醇衍生物中，上述肽部之含有率相對於上述縮醛基、上述羥基及上述乙醯基之合計含有率之莫耳比(上述肽部之含有率/上述縮醛基、上述羥基及上述乙醯基之合計含有率)的上限並無特別限定。就製造成本等觀點而言，上述莫耳比(上述肽部之含有率/上述縮醛基、上述羥基及上述乙醯基之合計含有率)較佳為0.2以下。
上述肽部之含有率可藉由FT-IR(fourier transform infrared radiation，傅立葉轉換紅外線光譜)或LC-MS(liquid chromatography-mass spectrometry，液相層析-質譜法)進行測定。
＜連結子部＞ 上述連結子部係上述含肽聚乙烯醇衍生物中源自上述連結子之結構部分。上述連結子部位於上述聚乙烯醇衍生物部與上述肽部之間。上述聚乙烯醇衍生物部與上述肽部係經由上述連結子部結合。上述連結子部係由連結子(交聯劑)形成。上述連結子可僅使用1種，亦可併用2種以上。
上述連結子較佳為具有可與上述肽之羧基或胺基縮合之官能基之化合物。作為可與上述肽之羧基或胺基縮合之官能基，可例舉：羧基、硫醇基及胺基等。就與肽良好地反應之觀點而言，上述連結子較佳為具有羧基之化合物。
作為上述具有羧基之連結子，可例舉(甲基)丙烯酸及含羧基丙烯醯胺等。藉由使用具有聚合性不飽和基之羧酸(羧酸單體)作為上述具有羧基之連結子，於導入連結子時可藉由接枝聚合而使該羧酸單體聚合，故而可增加可與肽反應之羧基之個數。
就使聚乙烯醇衍生物與肽良好地結合之觀點而言，上述連結子較佳為(甲基)丙烯酸，更佳為丙烯酸。
上述含肽聚乙烯醇衍生物例如可以如下方式合成。
(1)使聚乙烯醇衍生物(例如聚乙烯醇縮醛樹脂)與連結子進行反應，獲得聚乙烯醇縮醛樹脂與連結子結合而成之反應物。(2)使所獲得之反應物與肽進行反應，獲得含肽聚乙烯醇衍生物(含肽聚乙烯醇縮醛樹脂)。
於上述(1)中，作為獲得上述聚乙烯醇縮醛樹脂與上述連結子結合而成之反應物之方法，可例舉：將聚乙烯醇與具有聚合性不飽和基之羧酸之共聚物縮醛化之方法；及於紫外線照射下使聚乙烯醇縮醛樹脂與連結子(例如羧酸單體)接枝共聚之方法等。獲得上述反應物之方法較佳為上述接枝共聚之方法。於該情形時，可藉由接枝聚合而使該羧酸單體聚合，故而可增加可與肽反應之羧基之個數。
於上述(2)中，可使所獲得之反應物中之源自連結子之羧基與肽之胺基脫水縮合，而獲得具有聚乙烯醇縮醛樹脂部、肽部及連結子部之含肽聚乙烯醇衍生物(含肽聚乙烯醇縮醛樹脂)。
上述含肽聚乙烯醇衍生物可殘存源自連結子之羧基，亦可不殘存。上述含肽聚乙烯醇衍生物中之上述羧基之含有率較佳為0.1莫耳%以上，更佳為0.5莫耳%以上，且較佳為2莫耳%以下，更佳為1.5莫耳%以下。若上述羧基之含有率為上述下限以上及上述上限以下，則可更進一步提高細胞之黏著性及增殖性，可使偽足之伸展性進而更良好。再者，上述羧基之含有率(莫耳%)係相對於構成上述含肽聚乙烯醇衍生物之各結構單元之物質量之總和的上述羧基之物質量。
就進一步提高細胞之黏著性及增殖性之觀點而言，上述細胞培養用支架材料較佳為具有相分離結構。上述相分離結構至少具有第1相及第2相。
作為上述相分離結構，例如可例舉：海島結構、柱狀(cylinder)結構、螺旋(gyroid)結構及層狀(lamellar)結構等微相分離結構。於海島結構中，例如可將第1相設為海部，將第2相設為島部。於柱狀結構、螺旋結構或層狀結構中，例如可將表面積最大之相設為第1相，將表面積第二大之相設為第2相。藉由上述細胞培養用支架材料具有連續相及不連續相，可提高與細胞之親和性，進一步提高細胞之黏著性及增殖性。
上述相分離結構較佳為海島結構。上述細胞培養用支架材料較佳為具有海島結構。於該情形時，可進一步提高細胞之黏著性及增殖性。
於上述細胞培養用支架材料具有海島結構之情形時，島部(第2相)相對於細胞培養用支架材料之表面整體之表面積分率較佳為0.01以上，更佳為0.1以上，進而較佳為0.2以上，且較佳為0.95以下，更佳為0.9以下，進而較佳為0.8以下。若上述表面積分率為上述下限以上及上述上限以下，則可進一步提高細胞之黏著性。
於上述細胞培養用支架材料具有海島結構之情形時，較佳為島部包含肽部。即，較佳為上述細胞培養用支架材料具有海部及島部，且島部包含肽部。於該情形時，細胞之黏著域集聚於島部，藉此可進一步提高細胞之黏著性。
相分離結構之有無例如可藉由原子力顯微鏡(AFM)、穿透式電子顯微鏡(TEM)、掃描式電子顯微鏡(SEM)等來確認。又，上述表面積分率可根據顯微鏡觀察圖像，例如使用ImageJ等圖像解析軟體來求出。
上述相分離結構例如可藉由提高肽部之含有率，於含肽聚乙烯醇衍生物之分子間或分子內形成相分離結構而形成。
就有效地發揮本發明之效果之觀點及提高生產性之觀點而言，於上述細胞培養用支架材料100重量%中，上述含肽聚乙烯醇衍生物之含量較佳為90重量%以上，更佳為95重量%以上，進而較佳為97.5重量%以上，尤佳為99重量%以上，最佳為100重量%(全量)。因此，上述細胞培養用支架材料最佳為上述含肽聚乙烯醇衍生物。若上述含肽聚乙烯醇衍生物之含量為上述下限以上，則可更有效地發揮本發明之效果。
上述細胞培養用支架材料亦可包含上述含肽聚乙烯醇衍生物以外之聚合物。作為該聚合物，可例舉：聚乙烯醇縮醛樹脂、聚烯烴樹脂、聚醚樹脂、聚乙烯醇樹脂、聚酯、環氧樹脂、聚醯胺樹脂、聚醯亞胺樹脂、聚胺基甲酸酯樹脂、聚碳酸酯樹脂、纖維素及多肽等。上述聚合物可僅使用1種，亦可併用2種以上。
就有效地發揮本發明之效果之觀點而言，上述含肽聚乙烯醇衍生物以外之聚合物之含量越少則越佳。於上述細胞培養用支架材料100重量%中，該聚合物之含量較佳為10重量%以下，更佳為5重量%以下，進而較佳為2.5重量%以下，尤佳為1重量%以下，最佳為0重量%(不含有)。因此，細胞培養用支架材料最佳為不包含上述含肽聚乙烯醇衍生物以外之聚合物。
本發明之細胞培養用支架材料較佳為實質上不包含源自動物之原料。藉由實質上不包含源自動物之原料，可提供一種批次間之偏差較小，且成本、安全性優異之細胞培養用支架材料。再者，「實質上不包含源自動物之原料」意指細胞培養用支架材料中之源自動物之原料為3重量%以下。本發明之細胞培養用支架材料較佳為細胞培養用支架材料中之源自動物之原料為1重量%以下，更佳為0重量%。即，上述細胞培養用支架材料更佳為於細胞培養用支架材料中不包含源自動物之原料。
再者，細胞培養用支架材料可於下述容器本體之表面上製作。例如可將具有聚乙烯醇衍生物部及連結子之合成樹脂塗佈於容器本體之表面上而形成樹脂膜，使該合成樹脂與肽於該樹脂膜之表面進行反應，獲得上述含肽聚乙烯醇衍生物。
(細胞培養用支架材料之其他詳細內容) 本發明之細胞培養用支架材料係用於培養細胞。本發明之細胞培養用支架材料係用作培養細胞時之該細胞之支架。
作為上述細胞，可例舉：人類、小鼠、大鼠、豬、牛及猴等動物細胞。又，作為上述細胞，可例舉體細胞等，例如可例舉：幹細胞、前驅細胞及成熟細胞等。上述體細胞亦可為癌細胞。
作為上述成熟細胞，可例舉：神經細胞、心肌細胞、視網膜細胞及肝細胞等。
作為上述幹細胞，可例舉：間葉系幹細胞(MSC)、iPS細胞(induced Pluripotent Stem Cell，誘導性多能幹細胞)、ES細胞(embryonic stem cell，胚胎幹細胞)、Muse細胞(Multi-lineage differentiating stress enduring cell，多系分化持續應激細胞)、胚胎癌細胞、胚胎生殖幹細胞及mGS細胞(multipotent Germline Stem Cell，多能生殖幹細胞)等。
上述細胞培養用支架材料之形狀並無特別限定。上述細胞培養用支架材料可為膜狀，可為粒子狀，可為纖維狀，亦可為多孔體狀。膜狀包含膜狀、片狀。
上述細胞培養用支架材料較佳為用於細胞之二維培養(平面培養)、三維培養或懸浮培養，更佳為用於二維培養(平面培養)。
又，上述細胞培養用支架材料亦可以包含該細胞培養用支架材料及多糖類之細胞培養用載體(介質)之形式使用。上述多糖類並無特別限定，可使用先前公知之多糖類。上述多糖類較佳為水溶性多糖類。
又，上述細胞培養用支架材料亦可以具備纖維本體、及配置於該纖維本體之表面上之細胞培養用支架材料之細胞培養用纖維的形式使用。於該情形時，細胞培養用支架材料較佳為塗佈於纖維本體之表面，較佳為塗佈物。於該細胞培養用纖維中，纖維本體中可存在細胞培養用支架材料。例如可藉由將纖維本體含浸或混練於液狀細胞培養用支架材料中而使纖維本體中存在細胞培養用支架材料。幹細胞一般具有不易黏著於平面結構，容易黏著於纖維狀結構等立體結構之性質，故而細胞培養用纖維良好地用於幹細胞之三維培養。更良好地用於幹細胞中脂肪幹細胞之三維培養。
上述細胞培養用支架材料中之合成樹脂可經交聯。包含經交聯之合成樹脂之細胞培養用支架材料可有效地抑制水膨潤性，提高強度。藉由使用交聯劑，可使合成樹脂交聯。
(細胞培養用容器) 本發明之細胞培養用容器具備容器本體及上述細胞培養用支架材料，且該細胞培養用支架材料配置於上述容器本體之表面上。上述細胞培養用容器於細胞之培養區域之至少一部分具備上述細胞培養用支架材料。
圖1係模式性地表示本發明之一實施方式之細胞培養用容器之剖視圖。
細胞培養用容器1具備容器本體2及細胞培養用支架材料3。於容器本體2之表面2a上配置有細胞培養用支架材料3。於容器本體2之底面上配置有細胞培養用支架材料3。可於細胞培養用容器1中添加液體培養基，且將細胞塊等細胞播種於細胞培養用支架材料3之表面，藉此將細胞進行平面培養。
再者，容器本體可具備第1容器本體、及於該第1容器本體之底面上具備覆蓋玻璃等之第2容器本體。第1容器本體與第2容器本體可分離。於該情形時，可於第2容器本體之表面上配置有該細胞培養用支架材料。
作為上述容器本體，可使用先前公知之容器本體(容器)。上述容器本體之形狀及大小並無特別限定。
作為上述容器本體，可例舉具備一個或複數個孔(well)之細胞培養用盤及細胞培養用瓶等。上述培養盤之孔數並無特別限定。作為該孔數，例如可例舉：2、4、6、12、24、48、96、384等，但並無特別限定。作為上述孔之形狀，可例舉：真圓、橢圓、三角形、正方形、長方形、五邊形等，但並無特別限定。作為上述孔底面之形狀，可例舉：平底、圓底、凹凸等，但並無特別限定。
上述容器本體之材質並無特別限定，可例舉樹脂、金屬及無機材料。作為上述樹脂，可例舉：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚異戊二烯、環烯烴聚合物、聚醯亞胺、聚醯胺、聚醯胺醯亞胺、(甲基)丙烯酸系樹脂、環氧樹脂、聚矽氧等。作為上述金屬，可例舉：不鏽鋼、銅、鐵、鎳、鋁、鈦、金、銀、鉑等。作為上述無機材料，可例舉：氧化矽(玻璃)、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯、氧化鐵、氮化矽等。
以下示出實施例及比較例更詳細地說明本發明。本發明並不僅限定於該等實施例。
再者，所獲得之合成樹脂中之結構單元之含有率係將合成樹脂溶解於DMSO-d6(二甲基亞碸)中後，藉由1 H-NMR(核磁共振光譜)進行測定。又，含肽聚乙烯醇衍生物中之肽之含有率係藉由FT-IR或LC-MS進行測定。將所獲得之合成樹脂之縮醛化度(丁醛化度)、羥基量、乙醯化度、羧基之含有率及肽部之含有率示於表1～3。
(實施例1) 聚乙烯醇縮醛樹脂(PVB1)之製作： 於具備攪拌裝置之反應機中投入離子交換水2700 mL、平均聚合度1700且皂化度99莫耳%之聚乙烯醇300重量份，一面進行攪拌一面加熱溶解，獲得溶液。於所獲得之溶液中，以鹽酸濃度成為0.2重量%之方式添加35重量%鹽酸作為觸媒。繼而，將溫度調整為15℃，一面進行攪拌一面添加正丁醛22重量份。繼而，添加正丁醛148重量份，析出白色粒子狀聚乙烯醇縮醛樹脂(聚乙烯醇縮丁醛樹脂)。於析出後15分鐘後，以鹽酸濃度成為1.8重量%之方式添加35重量%鹽酸後，加熱至50℃，於50℃下保持2小時。繼而，將溶液冷卻，進行中和後，將聚乙烯醇縮丁醛樹脂水洗，使之乾燥，獲得聚乙烯醇縮醛樹脂(聚乙烯醇縮丁醛樹脂(PVB1)，平均聚合度1700、縮醛化度(丁醛化度)70莫耳%、羥基量27莫耳%、乙醯化度3莫耳%)。
連結子之導入： 將所獲得之聚乙烯醇縮醛樹脂99重量份及丙烯酸(連結子)1重量份溶解於THF 300重量份，於光自由基聚合起始劑之存在下，於紫外線照射下反應20分鐘，使聚乙烯醇縮醛樹脂與丙烯酸接枝共聚，藉此導入連結子。使導入有連結子之聚乙烯醇縮醛樹脂1重量份溶解於丁醇19重量份。將所獲得之溶液150 μL噴出至經除塵器除塵之ϕ22 mm之覆蓋玻璃(松浪公司製造之「22丸No.1」)之表面上，使用旋轉塗佈機，以2000 rpm旋轉20秒後，於60℃下加熱60分鐘，而獲得表面平滑之樹脂膜。
肽部之形成： 準備具有Arg-Gly-Asp-Phe-Lys之胺基酸序列之環狀肽(胺基酸殘基數5個，藉由Arg與Lys結合而形成環狀骨架，Phe為D體，於表中記載為c-RGDfK)。將該肽1重量份及1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(縮合劑)1重量份以該肽之最終濃度成為1 mM之方式添加於不包含鈣及鎂兩者之磷酸緩衝生理鹽水中，製作含肽液體。將該含肽液體1重量份添加於經旋轉塗佈之樹脂膜(形成有連結子之聚乙烯醇縮醛樹脂)，進行反應，將連結子之羧基與肽之Lys之胺基脫水縮合。如此，製作具有聚乙烯醇縮醛樹脂部、連結子部及肽部之含肽聚乙烯醇縮醛樹脂。
所獲得之含肽聚乙烯醇縮醛樹脂係縮醛化度(丁醛化度)69.3莫耳%、羥基量26.7莫耳%、乙醯化度3.0莫耳%、羧基之含有率0.9莫耳%、肽部之含有率0.1莫耳%。
細胞培養用容器之製作： 藉由將所獲得之含肽聚乙烯醇縮醛樹脂與覆蓋玻璃之積層體配置於ϕ22 mm之聚苯乙烯培養皿，而獲得細胞培養用容器。
(實施例2) 聚乙烯醇縮醛樹脂(PVB2)之製作： 於具備攪拌裝置之反應機中投入離子交換水2700 mL、平均聚合度1700且皂化度99莫耳%之聚乙烯醇300重量份，一面進行攪拌一面加熱溶解，獲得溶液。於所獲得之溶液中，以鹽酸濃度成為0.2重量%之方式添加35重量%鹽酸作為觸媒。繼而，將溫度調整為15℃，一面進行攪拌一面添加正丁醛22重量份。繼而，添加正丁醛143重量份，析出白色粒子狀聚乙烯醇縮醛樹脂(聚乙烯醇縮丁醛樹脂)。於析出後15分鐘後，以鹽酸濃度成為1.8重量%之方式添加35重量%鹽酸後，加熱至50℃，於50℃下保持2小時。繼而，將溶液冷卻，進行中和後，將聚乙烯醇縮丁醛樹脂水洗，使之乾燥，獲得聚乙烯醇縮醛樹脂(聚乙烯醇縮丁醛樹脂(PVB2)，平均聚合度1700、縮醛化度(丁醛化度)69莫耳%、羥基量28莫耳%、乙醯化度3莫耳%)。
連結子之導入： 將所獲得之聚乙烯醇縮醛樹脂70重量份及丙烯酸(連結子)30重量份溶解於THF 300重量份，於光自由基聚合起始劑之存在下，於紫外線照射下反應20分鐘，使聚乙烯醇縮醛樹脂與丙烯酸接枝共聚，藉此導入連結子。使導入有連結子之聚乙烯醇縮醛樹脂1重量份溶解於丁醇19重量份。將所獲得之溶液150 μL噴出至經除塵器除塵之ϕ22 mm之覆蓋玻璃(松浪公司製造之「22丸No.1」)之表面上，使用旋轉塗佈機，以2000 rpm旋轉20秒後，於60℃下加熱60分鐘，而獲得表面平滑之樹脂膜。
肽部之形成： 使用所獲得之樹脂膜(導入有連結子之聚乙烯醇縮醛樹脂)，且將肽之添加量設為30重量份，除該等以外，以與實施例1相同之方式製作含肽聚乙烯醇縮醛樹脂。
細胞培養用容器之製作： 以與實施例1相同之方式獲得細胞培養用容器。
(實施例3) 聚乙烯醇縮醛樹脂(PVB3)之製作： 於具備攪拌裝置之反應機中投入離子交換水2700 mL、平均聚合度1700且皂化度99莫耳%之聚乙烯醇300重量份，一面進行攪拌一面加熱溶解，獲得溶液。於所獲得之溶液中，以鹽酸濃度成為0.2重量%之方式添加35重量%鹽酸作為觸媒。繼而，將溫度調整為15℃，一面進行攪拌一面添加正丁醛22重量份。繼而，添加正丁醛133重量份，析出白色粒子狀聚乙烯醇縮醛樹脂(聚乙烯醇縮丁醛樹脂)。於析出後15分鐘後，以鹽酸濃度成為1.8重量%之方式添加35重量%鹽酸後，加熱至50℃，於50℃下保持2小時。繼而，將溶液冷卻，進行中和後，將聚乙烯醇縮丁醛樹脂水洗，使之乾燥，獲得聚乙烯醇縮醛樹脂(聚乙烯醇縮丁醛樹脂(PVB3)，平均聚合度1700、縮醛化度(丁醛化度)63莫耳%、羥基量34莫耳%、乙醯化度3莫耳%)。
連結子之導入： 使用所獲得之聚乙烯醇縮醛樹脂，除此以外，以與實施例2相同之方式導入連結子。又，以與實施例2相同之方式獲得表面平滑之樹脂膜。
肽部之形成： 使用所獲得之樹脂膜(導入有連結子之聚乙烯醇縮醛樹脂)，除此以外，以與實施例2相同之方式製作含肽聚乙烯醇縮醛樹脂。
細胞培養用容器之製作： 以與實施例1相同之方式獲得細胞培養用容器。
(實施例4) 聚乙烯醇縮醛樹脂(PVB4)之製作： 於具備攪拌裝置之反應機中投入離子交換水2700 mL、平均聚合度1700且皂化度99莫耳%之聚乙烯醇300重量份，一面進行攪拌一面加熱溶解，獲得溶液。於所獲得之溶液中，以鹽酸濃度成為0.2重量%之方式添加35重量%鹽酸作為觸媒。繼而，將溫度調整為15℃，一面進行攪拌一面添加正丁醛22重量份。繼而，添加正丁醛133重量份，析出白色粒子狀聚乙烯醇縮醛樹脂(聚乙烯醇縮丁醛樹脂)。於析出後15分鐘後，以鹽酸濃度成為1.8重量%之方式添加35重量%鹽酸後，加熱至50℃，於50℃下保持2小時。繼而，將溶液冷卻，進行中和後，將聚乙烯醇縮丁醛樹脂水洗，使之乾燥，獲得聚乙烯醇縮醛樹脂(聚乙烯醇縮丁醛樹脂(PVB4)，平均聚合度1700、縮醛化度(丁醛化度)50莫耳%、羥基量47莫耳%、乙醯化度3莫耳%)。
連結子之導入： 使用所獲得之聚乙烯醇縮醛樹脂，除此以外，以與實施例2相同之方式導入連結子。又，以與實施例2相同之方式獲得表面平滑之樹脂膜。
肽部之形成： 使用所獲得之樹脂膜(導入有連結子之聚乙烯醇縮醛樹脂)，除此以外，以與實施例2相同之方式製作含肽聚乙烯醇縮醛樹脂。
細胞培養用容器之製作： 以與實施例1相同之方式獲得細胞培養用容器。
(比較例1) 使用具有Arg-Gly-Asp-Ser之胺基酸序列之直鏈狀肽(胺基酸殘基數4個，於表中記載為RGDS)，且將連結子之羧基與肽之Arg之胺基脫水縮合，除該等以外，以與實施例1相同之方式製作含肽聚乙烯醇縮醛樹脂及細胞培養用容器。
(比較例2) 使用具有Gly-Arg-Gly-Asp-Ser之胺基酸序列之直鏈狀肽(胺基酸殘基數5個，於表中記載為GRGDS)，且將連結子之羧基與肽之Gly之胺基脫水縮合，除該等以外，以與實施例2相同之方式製作含肽聚乙烯醇縮醛樹脂及細胞培養用容器。
(比較例3) 使用具有Gly-Arg-Gly-Asp-Ser之胺基酸序列之直鏈狀肽(胺基酸殘基數5個，於表中記載為GRGDS)，且將連結子之羧基與肽之Gly之胺基脫水縮合，除該等以外，以與實施例3相同之方式製作含肽聚乙烯醇縮醛樹脂及細胞培養用容器。
(比較例4) 使用具有Gly-Arg-Gly-Asp-Ser之胺基酸序列之直鏈狀肽(胺基酸殘基數5個，於表中記載為GRGDS)，且將連結子之羧基與肽之Gly之胺基脫水縮合，除該等以外，以與實施例4相同之方式製作含肽聚乙烯醇縮醛樹脂及細胞培養用容器。
(比較例5) 未形成肽部，除此以外，以與實施例1相同之方式製作細胞培養用容器。
(實施例5) 將平均聚合度1700、皂化度90莫耳%之聚乙烯醇99重量份及丙烯酸(連結子)1重量份溶解於乙醇300重量份，於光自由基聚合起始劑之存在下，於紫外線照射下反應20分鐘，使聚乙烯醇與丙烯酸接枝共聚，藉此導入連結子。除該等以外，以與實施例1相同之方式製作含肽聚乙烯醇衍生物及細胞培養用容器。
(比較例6) 將平均聚合度1700、皂化度90莫耳%之聚乙烯醇99重量份及丙烯酸(連結子)1重量份溶解於乙醇300重量份，於光自由基聚合起始劑之存在下，於紫外線照射下反應20分鐘，使聚乙烯醇與丙烯酸接枝共聚，藉此導入連結子。使用具有Gly-Arg-Gly-Asp-Ser之胺基酸序列之直鏈狀肽(胺基酸殘基數5個，於表中記載為GRGDS)，且將連結子之羧基與肽之Gly之胺基脫水縮合，除該等以外，以與實施例1相同之方式製作含肽聚乙烯醇衍生物及細胞培養用容器。
(參考例A) 源自天然物之支架材之製作： 將於磷酸緩衝液(PBS)中調整為5 μg/ml之玻連蛋白(康寧公司製造)溶液1 ml添加於ϕ35 mm培養皿。使ϕ22 mm之覆蓋玻璃(松浪公司製造之「22丸No.1」)浸漬於其中，於37℃下固化1小時，藉此獲得玻連蛋白平滑地吸附於表面之源自天然物之支架材(於表中記載為VTN)。
細胞培養用容器之製作： 以與實施例1相同之方式獲得細胞培養用容器。再者，玻連蛋白若乾燥則變性，黏著性能大幅降低，故而製作細胞培養用容器後立即浸漬於PBS溶液中。
(評估) (1)海島結構之有無 將所獲得之含肽聚乙烯醇縮醛樹脂之樹脂膜浸漬於PBS溶液中30分鐘。藉由原子力顯微鏡(AFM，Bruker公司製造之「Dimension XR」)觀察浸漬後之樹脂膜。於QNM模式下設為將峰設定值設定為2 nN之測定條件，觀察1 μm×1 μm之範圍。將所獲得之高度映射圖像與彈性模數映射圖像進行比較而判斷海島結構之有無。再者，於表中，於觀察到海島結構之情形時記載為「A」，於未觀察到海島結構之情形時記載為「B」。
圖2(a)係判定觀察到海島結構之圖像之例，圖2(b)係判定未觀察到海島結構之圖像之例。
(3)細胞培養評估 (3-1)iPS細胞(201B7)之播種及培養 使用實施例1～4、比較例1～5及參考例A中所獲得之細胞培養用容器，進行以下操作。
準備以下之液體培養基及ROCK(Rho結合激酶)特異性抑制劑。
TeSR E8培養基(STEM CELL公司製造) ROCK抑制劑(Y27632)
於所獲得之細胞培養用容器中加入磷酸緩衝生理鹽水1 mL，於37℃之保溫箱內靜置1小時後，自細胞培養用容器去除磷酸緩衝生理鹽水。
向在ϕ35 mm培養皿中成為融合狀態之h-iPS細胞201B7加入0.5 mM乙二胺四乙酸/磷酸緩衝溶液1 mL，於室溫下靜置2分鐘。去除乙二胺四乙酸/磷酸緩衝溶液後，以液體培養基1 mL進行吸液，藉此獲得粉碎為50 μm～200 μm之大小之細胞塊。將所獲得之細胞塊(細胞數1.0×105 cells)夾持播種於上述細胞培養用容器。
將1 mL之液體培養基及以最終濃度成為10 μM之方式將ROCK特異性抑制劑添加於細胞培養用容器中，於37℃及CO2 濃度5%之保溫箱內進行培養。每24小時去除液體培養基1 mL，加入新液體培養基1 mL，藉此進行培養基更換。
(3-2)iPS細胞(253G1)之播種及培養 使用實施例5、比較例6及參考例A中所獲得之細胞培養用容器，且使用h-iPS細胞253G1，除該等以外，以與「(3-1)iPS細胞(201B7)之播種及培養」相同之方式進行細胞之播種及培養。
(3-3)偽足之伸展性 使用相位差顯微鏡(Olympus公司製造之「IX73」，10×20倍)觀察自細胞播種起經過24小時後之細胞。於觀察中，取得表示細胞培養用容器內之最平均之黏著形態之視野之圖像。藉由根據所獲得之圖像求出形狀係數(SF)，評估偽足之伸展性。再者，形狀係數(SF)係培養細胞後之細胞於俯視下之區域之形狀評估係數，根據下述式求出。
式：SF＝4×π×(細胞之平面面積)/(細胞之外周緣之長度)2
圖3(a)、(b)及(c)係表示SF與細胞之平面形狀之關係之圖。如圖3(a)所示，若上述SF為1，則細胞之平面形狀成為圓形。SF越小，則越遠離圓形，意味著細胞之偽足越良好地伸展。圖3(b)係表示SF≒0.3之情形時之細胞之平面形狀的照片，圖3(c)係表示SF≒1之情形時之細胞之平面形狀的照片。
＜偽足之伸展性之判定基準＞ ○：SF為0.1以上0.6以下 ×：SF超過0.6且為1以下
(3-4)細胞之增殖性 使用TryPLE Express剝離液1.0 mL將自細胞播種起經過5天後之定殖細胞塊剝離，使用細胞計數器(Chemometec公司製造之「NucleoCounter NC-3000」)求出細胞數。其次，使用下述式求出相對於參考例A之細胞增殖率。再者，相對於參考例A之細胞增殖率係於使用同一細胞種(iPS細胞(201B7)或iPS細胞(253G1))之實驗彼此間進行比較。
相對於參考例A之細胞增殖率(%)＝(實施例、比較例中之細胞數)/(參考例A中之細胞數)×100
＜細胞之黏著性之判定基準＞ A：相對於參考例A之細胞增殖率為50%以上 B：相對於參考例A之細胞增殖率為10%以上且未達50% C：相對於參考例A之細胞增殖率未達10%
將詳細內容及結果示於下述表1～3。
[表1]
   實施例1 實施例2 實施例3 實施例4
聚乙烯醇縮醛樹脂部 種類 - PVB1 PVB2 PVB3 PVB4
縮醛化度(丁醛化度) 莫耳% 69.3 62.8 56.2 44.6
羥基之含有率 莫耳% 26.7 23.5 30.1 41.8
乙醯基之含有率 莫耳% 3.0 2.7 2.7 2.6
連結子 羧基之含有率 莫耳% 0.9 1.0 1.0 1.0
肽部 種類 - c-RGDfK c-RGDfK c-RGDfK c-RGDfK
含有率 莫耳% 0.1 10.0 10.0 10.0
海島結構之有無 - B A A A
細胞培養評估 iPS細胞 (201B7) 偽足之伸展性 - ○ ○ ○ ○
細胞之增殖性 - B A A A
[表2]
   比較例1 比較例2 比較例3 比較例4 比較例5 參考例A
聚乙烯醇縮醛樹脂部 種類 - PVB1 PVB2 PVB3 PVB4 PVB1 VTN
縮醛化度(丁醛化度) 莫耳% 64.2 62.8 56.2 44.6 69.3
羥基之含有率 莫耳% 22.1 23.5 30.1 41.8 26.7
乙醯基之含有率 莫耳% 2.7 2.7 2.7 2.6 3.0
連結子 羧基之含有率 莫耳% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
肽部 種類 - RGDS GRGDS GRGDS GRGDS -
含有率 莫耳% 10.0 10.0 10.0 10.0 -
海島結構之有無 - B A A A B -
細胞培養評估 iPS細胞 (201B7) 偽足之伸展性 - ○ ○ ○ ○ × -
細胞之增殖性 - C C C C C -
[表3]
   實施例5 比較例6 參考例A
聚乙烯醇衍生物部 種類 - PVA PVA VTN
縮醛化度(丁醛化度) 莫耳% 0 0
羥基之含有率 莫耳% 90 90
乙醯基之含有率 莫耳% 9.8 9.8
連結子 羧基之含有率 莫耳% 0.1 0.1
肽部 種類 - c-RGDfK GRGDS
含有率 莫耳% 0.1 0.1
海島結構之有無 - B B -
細胞培養評估 iPS細胞 (253G1) 偽足之伸展性 - ○ ○ -
細胞之增殖性 - B C -
實施例中所獲得之細胞培養用支架材料相較於比較例中所獲得之細胞培養用支架材料，細胞之黏著性優異，且如表1～3所示，偽足之伸展性及細胞之增殖性優異。
1:細胞培養用容器 2:容器本體 2a:表面 3:細胞培養用支架材料
圖1係模式性地表示本發明之一實施方式之細胞培養用容器之剖視圖。 圖2(a)及(b)係表示海島結構之有無之情況之圖像。 圖3(a)、(b)及(c)係表示SF與細胞之平面形狀之關係之圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005

Claims (9)

  1. 一種細胞培養用支架材料，其包含具有聚乙烯醇衍生物部及肽部之含肽聚乙烯醇衍生物，且 上述肽部具有環狀肽骨架。
  2. 如請求項1之細胞培養用支架材料，其中上述肽部具有細胞黏著性胺基酸序列。
  3. 如請求項2之細胞培養用支架材料，其中上述細胞黏著性胺基酸序列至少具有RGD序列、YIGSR序列或PDSGR序列。
  4. 如請求項2之細胞培養用支架材料，其中上述細胞黏著性胺基酸序列至少具有下述式(1)所表示之RGD序列： Arg-Gly-Asp-X … 式(1) 上述式(1)中，X表示Gly、Ala、Val、Ser、Thr、Phe、Met、Pro或Asn。
  5. 如請求項1至4中任一項之細胞培養用支架材料，其中上述環狀肽骨架包含4個以上10個以下之胺基酸。
  6. 如請求項1至4中任一項之細胞培養用支架材料，其中上述聚乙烯醇衍生物部與上述肽部係經由連結子部結合。
  7. 如請求項1至4中任一項之細胞培養用支架材料，其具有海島結構。
  8. 如請求項1至4中任一項之細胞培養用支架材料，其中上述含肽聚乙烯醇衍生物係具有聚乙烯醇縮醛樹脂部及上述肽部之含肽聚乙烯醇縮醛樹脂。
  9. 一種細胞培養用容器，其具備容器本體、及 如請求項1至8中任一項之細胞培養用支架材料，且 上述細胞培養用支架材料配置於上述容器本體之表面上。
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