CN117795056A - 细胞培养用支架材料 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明提供一种能够长期维持细胞的培养稳定性的细胞培养用支架材料。本发明的细胞培养用支架材料，包括含肽(甲基)丙烯酸类共聚物，其含有(甲基)丙烯酸类共聚物部和与该(甲基)丙烯酸类共聚物部键合的肽部，所述(甲基)丙烯酸类共聚物部具有源自式(A1)或式(A2)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元，所述(甲基)丙烯酸类共聚物部的全部结构单元100摩尔％中，源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元的含有比例为25摩尔％以上且98摩尔％以下。所述式(A1)中，R表示碳原子数2以上且18以下的烃基。所述式(A2)中，R表示碳原子数2以上且18以下的烃基。[化学式1][化学式2]
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞培养用支架材料。
背景技术
在学术领域、药物发现领域和再生医疗领域等的研究与开发中，使用了人类、小鼠、大鼠、猪、牛和猴等动物细胞。作为用于培养动物细胞的支架材料，使用了层粘连蛋白和玻连蛋白等粘附蛋白、以及源自小鼠肉瘤的基质胶等天然高分子材料。
此外，使用了合成树脂的支架材料和使用了键合了肽的合成树脂的支架材料也是已知的。
下述专利文献1公开了一种被含有丙烯酸类聚合物和多肽键合而成的聚合物的组合物包覆的细胞培养用物品。在专利文献1中，作为所述丙烯酸类聚合物，使用了将亲水性丙烯酸类单体聚合而成的亲水性丙烯酸类聚合物。
下述专利文献2公开了一种使不溶于水的高分子化合物溶解于低级醇或低级醇与水的混合溶剂中的粘附性细胞培养用包覆组合物。专利文献2中，作为所述不溶于水的高分子化合物，记载了通过肽修饰的(甲基)丙烯酸衍生物与亲水性丙烯酸酯化合物的共聚物。此外，作为所述共聚物，使用了亲水性丙烯酸酯化合物的含有率相对较高的共聚物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2012/158235A2
专利文献2：日本特开平5-292957号公报
发明内容
发明所解决的技术问题
如专利文献1、2记载的那样，已知使用了键合了肽的丙烯酸类共聚物的细胞培养用支架材料。可以使用已加工或模制成给定的形状的支架材料在液体培养基中培养细胞。
然而，在如专利文献1、2所记载的以往的支架材料中，由于使用了较高亲水性的丙烯酸类共聚物，因此在细胞培养过程中支架材料逐渐溶出到液体培养基中，并且在细胞培养过程中支架材料容易从容器等上剥离。因此，在专利文献1、2等现有的支架材料中，随着细胞培养天数增加，细胞的增殖速度降低等、细胞的培养稳定性容易降低。
本发明的目的是提供一种能够长期维持细胞的培养稳定性的细胞培养用支架材料。
解决问题的技术手段
若根据本发明的广义方面，本发明提供了一种细胞培养用支架材料，其含有含肽(甲基)丙烯酸类共聚物，所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物具有(甲基)丙烯酸类共聚物部和与所述(甲基)丙烯酸类共聚物部键合的肽部，所述(甲基)丙烯酸类共聚物部具有源自下式(A1)或下式(A2)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元，在所述(甲基)丙烯酸类共聚物的全部结构单元100摩尔％中，源自(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元聚合物部分的含有率为25摩尔％以上且98摩尔％以下。
[化学式1]
在所述化学式(A1)中，R表示具有2个以上且18个以下碳原子的烃基。
[化学式2]
在所述化学式(A2)中，R表示具有2个以上且18个以下碳原子的烃基。
根据本发明的细胞培养用支架材料的一个特定方面，所述(甲基)丙烯酸类共聚物部具有源自具有能够与氨基或羧基反应的官能团的(甲基)丙烯酸酯化合物(B)的结构单元，在所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物中，所述肽部与所述能够与氨基或羧基反应的官能团进行了键合。
根据本发明的细胞培养用支架材料的一个特定方面，所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的数均分子量为5000以上。
根据本发明的细胞培养用支架材料的一个特定方面，在所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物中，所述肽部的含有率为0.5摩尔％以上且25摩尔％以下。
根据本发明的细胞培养用支架材料的特定方面，所述肽部具有RGD序列。
发明的效果
本发明的细胞培养用支架材料含有含肽(甲基)丙烯酸类共聚物，所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物具有(甲基)丙烯酸类共聚物部和与所述(甲基)丙烯酸类共聚物部键合的肽部。根据本发明的细胞培养用支架材料，所述(甲基)丙烯酸类共聚物部具有源自化学式(A1)或化学式(A2)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元。在本发明的细胞培养用支架材料中，所述(甲基)丙烯酸类共聚物部的全部结构单元100摩尔％中，源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元的含有率为25摩尔％以上且98摩尔％以下。本发明的细胞培养用支架材料具备了所述的构成，因此能够长期维持细胞的培养稳定性。
附图说明
[图1]图1是示意性地表示本发明的一个实施方式的细胞培养用容器的截面图。
[图2]图2是示意性地表示本发明的一个实施方式的细胞培养用微载体的截面图。
[图3]图3是使用通过实施例3、12以及比较例2而获得的细胞培养用支架材料进行了细胞培养时的细胞接种24小时、48小时和72小时的相差显微照片。
具体实施方式
下文中，对于本发明的具体情况进行说明。
本发明的细胞培养用支架材料(下文中有时简称为“支架材料”)含有含肽(甲基)丙烯酸类共聚物，所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物具有(甲基)丙烯酸类共聚物部和与所述(甲基)丙烯酸类共聚物部键合的肽部。本发明的支架材料中，所述(甲基)丙烯酸类共聚物部具有源自下述的式(A1)或下述的式(A2)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元。本发明的支架材料中，所述(甲基)丙烯酸类共聚物部的全部结构单元100摩尔％中，源自(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元的含有率为25摩尔％以上且98摩尔％以下。
本发明的支架材料中，由于具备所述的构成，因此能够长期维持细胞的培养稳定性。本发明的支架材料中，由于使用了所述具有较高疏水性的含肽(甲基)丙烯酸类共聚物，因此该支架材料在细胞培养过程中难以溶出到液体培养基中，并且难以从容器等上剥离。因此，本发明的支架材料中，即使长时间培养细胞，细胞的增殖速度也难以降低。
此外，本发明的支架材料中，可以提高在乙醇等醇溶剂中的溶解性。因此，例如，可以通过将使该支架材料溶解于乙醇的涂布液涂布于容器等的表面，然后使乙醇挥发，从而在容器等的表面上形成具有给定的形状的支架材料层。可以根据在醇溶剂中的良好的溶解性，可以提高涂布液中的支架材料的浓度，因此形成较厚的支架材料层。
此外，本发明的支架材料中，不需要将细胞外基质(ECM)等天然聚合物材料作为材料来使用，因此价格便宜，批次间差异小，并且安全性极好。
下文中，进一步说明所述支架材料的具体情况。需要说明的是，在本说明书中，所谓“(甲基)丙烯酸，”意指“丙烯酸”和“甲基丙烯酸”中的一者或两者，所谓“(甲基)丙烯酸酯，”意指“丙烯酸酯”和“甲基丙烯酸酯”中的一者或两者。
(含肽(甲基)丙烯酸类共聚物)
所述支架材料含有含肽(甲基)丙烯酸类共聚物。所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物是键合了肽的(甲基)丙烯酸类共聚物。所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物具有(甲基)丙烯酸类共聚物部和与该(甲基)丙烯酸类共聚物部键合的肽部。所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物可以只使用一种，也可以两种以上组合使用。
<(甲基)丙烯酸类共聚物部>
所述(甲基)丙烯酸类共聚物部具有源自下式(A1)或下式(A2)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元。由此，可以提高含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的疏水性，可以发挥本发明的效果。所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)可以含有下式(A1)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物，也可以含有下式(A2)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物，也可以含有下式(A1)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物和下式(A2)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物中的两者。所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)在含有下式(A1)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物和下式(A2)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物中的两者的情况下，下式(A1)中的R和下式(A2)中的R可以相同，也可以不同。所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)可以只使用一种，也可以两种以上组合使用。此外，下式(A1)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物和下式(A2)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物可以只使用一种，也可以两种以上组合使用。
[化学式3]
在所述式(A1)中，R表示碳原子数2以上且18以下的烃基。
[化学式4]
在所述式(A2)中，R表示碳原子数2以上且18以下的烃基。
所述式(A1)中的R和所述式(A2)中的R分别可以为脂肪族烃基，也可以为芳香族烃基。从提高含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的溶解度的观点考虑，所述式(A1)中的R和所述式(A2)中的R分别优选为脂肪族烃基。所述脂肪族烃基可以为直链，也可以具有支链结构，也可以具有双键，也可以不具有双键。所述式(A1)中的R和所述式(A2)中的R分别可以为烷基，也可以为亚烷基。
所述式(A1)中的R的碳原子数和所述式(A2)中的R的碳原子数分别优选为4以上，更优选为6以上，进一步优选为8以上，特别优选为10以上，优选为16以下，更优选为14以下，最优选为12。所述碳原子数为所述下限以上时，可以进一步提高含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的疏水性，可以更有效地发挥本发明的效果。所述碳原子数为所述上限以下时，可以进一步提高在乙醇等醇溶剂中的溶解性，因此可以进一步提高涂布性和加工性。特别是，所述碳原子数为12时，可以更有效地发挥本发明的效果，并且可以进一步提高涂布性和加工性。
所述(甲基)丙烯酸类共聚物部的全部结构单元100摩尔％中，源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元的含有率为25摩尔％以上且98摩尔％以下。由此，可以提高含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的疏水性，可以发挥本发明的效果。
所述(甲基)丙烯酸类共聚物部的全部结构单元100摩尔％中，源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元的含有率优选为30摩尔％以上，更优选为40摩尔％以上，进一步优选为50摩尔％以上，优选为95摩尔％以下，更优选为90摩尔％以下，进一步优选为80摩尔％以下。所述(甲基)丙烯酸类共聚物部的全部结构单元100摩尔％中，源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元的含有率优选为30摩尔％以上且95摩尔％以下，更优选为40摩尔％以上且90摩尔％以下，进一步优选为50摩尔％以上且80摩尔％以下。所述含有量为所述下限以上时，可以进一步提高含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的疏水性，可以更有效地发挥本发明的效果。所述含有量为所述上限以下时，可以进一步提高在乙醇等醇类溶剂中的溶解性，因此可以进一步提高涂布性和加工性。
所述(甲基)丙烯酸类共聚物部优选具有源自含有能够与氨基或羧基反应的官能团的(甲基)丙烯酸酯化合物(B)的结构单元。所述(甲基)丙烯酸酯化合物(B)可以具有能够与氨基反应的官能团、可以具有能够与羧基反应的官能团、可以具有能够与氨基反应的官能团和与羧基反应的官能团。所述(甲基)丙烯酸酯化合物(B)可以只使用一种，也可以两种以上组合使用。
作为能够与所述氨基或羧基反应的官能团，可举出羧基、硫醇基、氨基和氰基等。
从有效地发挥本发明的效果的观点出发，在所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物中，所述肽部优选为能够与所述氨基或羧基反应的官能团键合的。更具体而言，构成所述肽部的氨基酸的羧基或氨基优选为能够与所述氨基或羧基反应的官能团结合的。
能够与所述氨基或羧基反应的官能团优选为羧基或氨基。所述(甲基)丙烯酸酯化合物(B)优选为具有羧基或氨基。
作为所述(甲基)丙烯酸酯化合物(B)，可举出(甲基)丙烯酸、3-丁烯酸、4-戊烯酸、5-己烯酸、6-庚烯酸、7-辛烯酸、苯丙烯酸、琥珀酸(甲基)丙烯酰氧基乙酯、邻苯二甲酸(甲基)丙烯酰氧基乙酯、琥珀酸(甲基)丙烯酰氧基丙酯、邻苯二甲酸(甲基)丙烯酰氧基丙酯、六氢琥珀酸(甲基)丙烯酰氧基乙酯、六氢邻苯二甲酸(甲基)丙烯酰氧基乙酯、六氢琥珀酸(甲基)丙烯酰氧基丙酯和六氢邻苯二甲酸(甲基)丙烯酰氧基丙酯等。
所述(甲基)丙烯酸酯化合物(B)优选为(甲基)丙烯酸、琥珀酸(甲基)丙烯酰氧基乙酯、琥珀酸(甲基)丙烯酰氧基丙酯、六氢琥珀酸(甲基)丙烯酰氧基乙酯、六氢琥珀酸(甲基)丙烯酰氧基丙酯或丁烯酸，更优选为(甲基)丙烯酸。在该情况下，可以更有效地发挥本发明的效果。
所述(甲基)丙烯酸类共聚物部的全部结构单元100摩尔％中，源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(B)的结构单元的含有率优选为2摩尔％以上，更优选为5摩尔％以上，进一步更优选10摩尔％以上，优选为75摩尔％以下，更优选为70摩尔％以下，进一步更优选为60摩尔％以下。所述含有率为所述下限以上时，变得容易提高的溶解性。所述含有率为所述上限以下时，变得容易长期维持细胞的培养稳定性。
(甲基)丙烯酸类共聚物部的全部结构单元100摩尔％中，源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元和源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(B)的结构单元的总含有率优选为50摩尔％以上，更优选为65摩尔％以上，进一步优选为80摩尔％以上，更进一步优选为90摩尔％以上，特别优选为95摩尔％以上，最优选为100摩尔％。所述总含有率为所述下限以上时，可以更有效地发挥本发明的效果。需要说明的是，所述总含有率可以为100摩尔％以下，也可以为90摩尔％以下。
所述(甲基)丙烯酸类共聚物部只要不违背本发明的目的，则可以含有源自与所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)和所述(甲基)丙烯酸酯化合物(B)这两者不同的(甲基)丙烯酸酯化合物的结构单元。此外，所述(甲基)丙烯酸类共聚物部只要不违背本发明的目的，则可以含有源自能够与(甲基)丙烯酸酯化合物共聚的乙烯基化合物的结构单元。
所述(甲基)丙烯酸类共聚物部中的源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元的含有率和源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(B)的结构单元的含有率可以通过例如NMR(核磁共振)进行测量。
<肽部>
所述肽部是源自肽的结构部分。所述肽部具有氨基酸序列。构成所述肽部的肽可以为寡肽，也可以为多肽。所述肽可以单独使用，也可以两种以上组合使用。
所述肽部的氨基酸残基的数量优选为3个以上，更优选为4个以上，进一步优选为5个以上，优选为10个以下，更优选为8个以下，进一步优选为6个以下。所述氨基酸残基的数量为所述下限以上且为所述上限以下时，可以进一步提高与接种后的细胞的粘附性，可以进一步提高细胞的增殖率。然而，所述肽部的氨基酸残基的数量可以超过10个，也可以超过15个。
所述肽部优选为具有细胞粘附性的氨基酸序列。需要说明的是，所谓细胞粘附性的氨基酸序列，是指通过噬菌体展示法、琼脂糖珠法或平板涂布法确认了细胞粘附活性的氨基酸序列。作为所述噬菌体展示法，例如可以使用“The Journal of Cell Biology,Volume 130,Number 5,September 1995 1189-1196”中记载的方法。作为所述琼脂糖珠法，例如可以使用“蛋白质核酸酶Vol.45No.15(2000)2477”中记载的方法。作为所述平板涂布方法，例如可以使用“蛋白质核酸酶Vol.45No.15(2000)2477”中记载的方法。
作为所述细胞粘附性的氨基酸序列，可举出例如RGD序列(Arg-Gly-Asp)、YIGSR序列(Tyr-IIe-Gly-Ser-Arg)、PDSGR序列(Pro-Asp-Ser-Gly-Arg)、HAV序列(His-Ala-Val)、ADT序列(Ala-Asp-Thr)、QAV序列(Gln-Ala-Val)、LDV序列(Leu-Asp-Val)、IDS序列(IIe-Asp-Ser)、REDV序列(Arg-Glu-Asp-Val)、IDAPS序列(IIe-Asp-Ala-Pro-Ser)、KQAGDV序列(Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val)和TDE序列(Thr-Asp-Glu)等。另外，作为所述细胞粘附性的氨基酸序列，可举出“病理生理，第9卷第7号，527-535页，1990年”和“大阪府立母子医疗中心杂志，第8卷第1号，58～66页，1992年”中记载的序列等。所述肽部可以仅具有一种所述细胞粘附性的氨基酸序列，也可以具有两种以上。
所述细胞粘附性的氨基酸序列，优选为具有所述细胞粘附性的氨基酸序列中的至少一种，更优选为至少具有RGD序列、YIGSR序列或PDSGR序列，进一步优选为具有RGD序列，特别优选为至少具有下式(1)表示的RGD序列。在这种情况下，可以进一步提高与接种后的细胞的粘附性，可以进一步提高细胞的增殖率。
Arg-Gly-Asp-X···式(1)
所述式(1)中，X表示Gly、Ala、Val、Ser、Thr、Phe、Met、Pro或Asn。
所述肽部可以为直链，也可以具有环肽骨架。所谓所述环肽骨架，是指由多个氨基酸构成的环状骨架。从更有效地发挥本发明的效果的观点出发，所述环肽骨架优选为由4个以上氨基酸构成，更优选由5个以上氨基酸构成，优选为由10个以下氨基酸构成。
在所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物中，所述肽部的含有率优选为0.5摩尔％以上，更优选为1摩尔％以上，进一步优选为5摩尔％以上，优选为25摩尔％以下，更优选为20摩尔％以下，进一步优选为15摩尔％以下。所述肽部的含有率为所述下限以上时，可以进一步提高与接种后的细胞的粘附性，可以进一步提高细胞的增殖率。另外，所述肽部的含有率为所述上限以下时，可以进一步提高细胞的培养稳定性，并且可以降低制造成本。需要说明的是，所述肽部的含有率(摩尔％)为相对于构成含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的各个结构单元的物质量的总和的、所述肽部的物质量。
所述肽部的含有率可以通过例如NMR(核磁共振)进行测量。
<含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的其他具体情况>
所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的数均分子量优选为5000以上，更优选为10000以上，进一步优选为30000以上，特别优选为50000以上，优选为5000000以下，更优选为2500000以下，进一步优选为1000000以下。所述数均分子量为所述下限以上时，可以进一步降低含肽(甲基)丙烯酸类共聚物在水中的溶解性，可以更有效地发挥本发明的效果。数均分子量为所述上限以下时，可以进一步提高在醇溶剂中的溶解性。
需要说明的是，所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的数均分子量可以通过例如以下方法进行测量。将所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物溶解在四氢呋喃(TH F)中，制备含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的0.2重量％溶液。接下来，使用凝胶渗透色谱(GPC)测量装置(APC系统，Waters公司制造)，根据以下测量条件进行评价。
柱：HSPgel HR MB-M 6.0×150mm
流量：0.5mL/min
柱温：40℃
进样量：10μL
检测器：RI、PDA
标准样品：聚苯乙烯
所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的制造方法没有特别限制。所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物例如可以以如下方式进行制备。
使含有(甲基)丙烯酸酯化合物(A)和(甲基)丙烯酸酯化合物(B)的单体混合物聚合而获得(甲基)丙烯酸酯共聚物。使所得的(甲基)丙烯酸酯共聚物与肽反应，得到含肽(甲基)丙烯酸类共聚物。
(细胞培养用支架材料的其他具体情况)
所述支架材料用于培养细胞。所述支架材料作为培养细胞时的该细胞的支架而使用。
作为所述细胞，可举出人类、小鼠、大鼠、猪、牛和猴等动物细胞。此外，作为所述细胞，可举出体细胞等，例如可举出干细胞、前体细胞、成熟细胞等。所述体细胞也可以是癌细胞。
作为所述干细胞，可举出间充质干细胞(MSC)、iPS细胞、ES细胞、Mu se细胞、胚胎癌细胞、胚胎生殖干细胞和mGS细胞等。
作为所述成熟细胞可举出神经细胞、心肌细胞、视网膜细胞和肝细胞等。
所述支架材料优选为用于细胞的二维培养(平面培养)、三维培养或悬浮培养，更优选为用于二维培养(平面培养)或三维培养，进一步优选为用于二维培养。
所述支架材料优选为用于无血清培养基培养。所述支架材料由于含有所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物，因此即使为不含饲养细胞、粘附蛋白的无血清培养基培养，也可以提高细胞的粘附性，特别是可以提高细胞接种后的初始植板率。另外，所述支架材料由于含有所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物，因此即使为无血清培养基培养，也可以发挥本发明的效果。
所述支架材料100重量％中，所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的含有率优选为90重量％以上，更优选为95重量％以上，进一步优选为97.5重量％以上，特别优选为99重量％以上，最优选100重量％(全部量)。所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的含有率为下限以上时，可以更有效地发挥本发明的效果。然而，所述支架材料100重量％中，所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的含有率可以为100重量％以下，也可以为98重量％以下。
所述支架材料可以包含除了所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物之外的成分。作为所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物以外的成分，可举出聚烯烃树脂、聚醚树脂、聚乙烯醇树脂、聚酯、环氧树脂、聚酰胺树脂、聚酰亚胺树脂、聚氨酯树脂、聚碳酸酯树脂、多糖类、纤维素、多肽、合成肽等。
所述支架材料优选为实质上不含动物来源的原料。通过不含动物来源的原料，可以提供安全性较高且在制造时品质偏差较小的支架材料。需要说明的是，所谓“实质上不含动物来源的原料，”意指所述支架材料中的动物来源的原料为3重量％以下。在所述支架材料中，支架材料中的动物来源的原料优选为1重量％以下，最优选为0重量％。即，所述支架材料最优选完全不含动物来源的原材料。
所述支架材料的形状没有特别限制。所述支架材料的形状可以是颗粒状、可以是纤维状、可以是多孔状、也可以是膜状。
所述支架材料优选为树脂膜。所述树脂膜优选为由所述支架材料形成的树脂膜。所述树脂膜是膜状的支架材料。
所述树脂膜的厚度没有特别限制。所述树脂膜的平均厚度可以为10nm以上、可以为50nm以上、可以为500nm以上、可以为1000μm以下、可以为500μm以下。
(细胞培养用容器)
细胞培养用容器优选为在细胞的培养区域的至少一部分上具备所述树脂膜。所述细胞培养用容器优选为具备容器主体和所述树脂膜，并在所述容器主体的表面上配置了该树脂膜。所述树脂膜优选为膜状的支架材料、优选为支架材料层。
图1是示意性地表示本发明的一个实施方式的细胞培养用容器的截面图。
细胞培养用容器1具备容器主体2和树脂膜3。在容器主体2的表面2a上配置了树脂膜3。在容器主体2的底表面上配置了树脂膜3。可以将液体培养基添加到细胞培养用容器1中，并通过将细胞团等细胞接种到树脂膜3的表面上，将细胞进行平面培养。
需要说明的是，容器主体可以具备第1的容器主体和在该第1的容器主体的底表面上具备盖玻璃的第2的容器主体。第1的容器主体和第2容器主体可以是可分离的。在这种情况下，在第2的容器主体的表面上可以配置所述树脂膜。
作为所述容器主体，可以使用以往公知的容器主体(容器)。所述容器主体的形状和尺寸没有特别限制。作为所述容器主体，例如可以使用2～384孔板、单层培养瓶、多层培养瓶、多面培养瓶、培养皿、滚瓶、培养袋、插入式培养器、微流道芯片等。
容器主体的材料没有特别限制，可举出树脂、金属和玻璃等。作为所述树脂，可举出聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚醚砜、聚碳酸酯、聚酯、聚异戊二烯、环烯烃聚合物、聚酰亚胺、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、(甲基)丙烯酸树脂、环氧树脂、硅酮等。
(细胞培养用微载体)
细胞培养用微载体(以下有时简称为“微载体”)具备基材颗粒和包覆该基材颗粒的外表面的包覆层，所述包覆层优选由所述支架材料形成得到。所述包覆层优选为支架材料层。作为所述基材颗粒，可以使用用于微载体的以往公知的基材颗粒。作为所述基材颗粒，可举出树脂颗粒。
图2是示意性地表示本发明的一个实施方式的细胞培养用微载体的截面图。
图2所示的细胞培养用微载体5具备基材颗粒6和包覆基材颗粒6的外表面的包覆层7。包覆层7配置于基材颗粒6的表面上，并与基材颗粒6的表面相接。包覆层7包覆了基材颗粒6的整个外表面。
(细胞的培养方法)
可以使用所述支架材料、所述树脂膜、所述微载体来培养细胞。所述细胞的培养方法是使用所述支架材料的细胞的培养方法。所述细胞的培养方法优选为使用所述树脂膜的细胞的培养方法、优选为使用所述微载体的细胞的培养方法。作为所述细胞，可举出如上所述的细胞。
所述细胞的培养方法优选为具备将细胞接种到所述支架材料上的工序。所述细胞的培养方法优选为具备将所述细胞接种到所述树脂膜上的工序。所述细胞的培养方法优选为具备将细胞接种到所述微载体上的工序。所述细胞可以是细胞团。所述细胞团可以通过将细胞脱离剂添加到已融合的培养容器中，并通过移液均匀地进行破碎处理而获得。作为细胞脱离剂，没有特别限制，优选为乙二胺/磷酸缓冲溶液。细胞团的大小优选为50μm～200μm。
下文中举出实施例和比较例并对本发明进行更详细的说明。本发明不限于这些实施例。
需要说明的是，就得到的含肽(甲基)丙烯酸类共聚物中的源自(甲基)丙烯酸酯化合物的结构单元的含有率和肽部的含有率而言，将该共聚物溶解到DMSO-d6(二甲基亚砜)后，通过1H-NMR(核磁共振谱)进行测量。
(实施例1)
含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的制备：
将丙烯酸乙酯10重量份和丙烯酸20重量份溶解在四氢呋喃30重量份中获得丙烯酸单体溶液。将Irgacure184(BASF公司制造)0.15重量份溶解在得到的丙烯酸单体溶液中，将获得的液体涂布到PET膜上。通过将涂布材料在25℃下，使用UV传送装置(EYE GRAPHICS公司制造“ECS301G1”)以2000mJ/cm2的积分光量照射波长365nm的光，获得(甲基)丙烯酸类共聚物溶液。将得到的(甲基)丙烯酸类共聚物溶液在80℃下真空干燥3小时，得到了(甲基)丙烯酸类共聚物。
准备了具有Arg-Gly-Asp-Phe-Lys的氨基酸序列的环状的肽(氨基酸残基数为5个，通过Arg和Lys键合形成环状骨架，Phe为D型，在表中记载为c-RGDfK)作为肽。准备了1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐作为缩合剂。将(甲基)丙烯酸类共聚物50重量份和肽10重量份溶解在1000重量份的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，制备了第1的溶液。另外，将缩合剂1重量份混合到1000重量份的DMF中，制备了第2的溶液。将第1的溶液和第2的溶液混合，制备了含有(甲基)丙烯酸类共聚物、肽和缩合剂的溶液。使所得溶液在40℃下反应2小时，使(甲基)丙烯酸类共聚物的源自丙烯酸的结构单元中的羧基与肽的Lys的氨基进行脱水缩合，得到了含有含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的溶液。
涂布液的制备:
将得到的含有含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的溶液用DMF稀释100倍，以0.3mL/min的速度滴加到填充有离子交换树脂(ORGANO公司制造)的柱中进行清洗。将清洗后的溶液在60℃下真空干燥3小时，并将所得干燥固体溶解在乙醇中，得到了含有含肽(甲基)丙烯酸类共聚物和乙醇的涂布液。需要说明的是，涂布液中的含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的含有率为0.1重量％。
细胞培养用容器的制备:
将得到的涂布液20μL通过铸涂法涂布至6孔板的各个孔后，通过在60℃下真空干燥3小时而除去了乙醇。由此，得到了在各个孔的底面配置有由支架材料形成得到的树脂膜(膜状的支架材料)的细胞培养用容器。
(实施例2～15、17以及比较例1、2)
除改变了(甲基)丙烯酸酯化合物的种类或配比量以外，与实施例1同样进行，得到了含有表1～4所示的构成的含肽(甲基)丙烯酸类共聚物。另外，除使用了所得的含肽(甲基)丙烯酸类共聚物以外，与实施例1同样进行，得到了细胞培养用容器。
(实施例16)
改变了(甲基)丙烯酸酯化合物的种类和配比量。另外，作为肽，使用了具有Gly-Arg-Gly-Asp-Ser的氨基酸序列的直链状的肽(氨基酸残基数为5个，表中记载为GRGDS)。将(甲基)丙烯酸类共聚物的源自丙烯酸的结构单元中的羧基与肽的Gly的氨基进行了脱水缩合。除此之外，与实施例1同样进行，得到了具备表4所示的构成的含肽(甲基)丙烯酸类共聚物。另外，除使用了所得的含肽(甲基)丙烯酸类共聚物以外，与实施例1同样进行，得到了细胞培养用容器。
(评价)
(1)含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的数均分子量
将所得的含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的数均分子量通过所述方法进行了测定。
(2)细胞的培养稳定性(长期的培养稳定性)
准备了以下液体培养基。
R-STEM(乐敦制药株式会社制造)
将1mL磷酸缓冲生理盐水加入到所得的细胞培养用容器中并在37℃的培养箱中静置1小时后，从细胞培养用容器中除去了磷酸缓冲生理盐水。
准备了在1.5mL液体培养基中含有5×104个细胞(由LONZA公司制造，人类脂肪来源的间充质干细胞，型号：PT-5006)的细胞悬浮液。将该细胞悬浮液接种到6孔板的每个孔中。接下来，将6孔板左右摇动5次，放入37℃、CO2浓度5％的培养箱中进行了培养。
对从细胞的接种起24小时后、48小时后、72小时后的细胞数使用Nucl eoCounterNC-3000(MS TECHNO SYSTEMS公司制造)进行了计数。在从接种24小时后到48小时后之间的细胞的倍增时间作为T1，从接种48小时后到72小时后之间的细胞的倍增时间作为T2时，T1和T2分别按下式进行了计算。
T1＝24log2/(log(N(48)/N(24))
T2＝24log2/(log(N(72)/N(48))
T1：从接种24小时后到48小时后的细胞的倍增时间
T2：从接种48小时后到72小时后的细胞的倍增时间
N(24)：接种24小时后的细胞数(cells)
N(48)：接种48小时后的细胞数(cells)
N(72)：接种72小时后的细胞数(cells)
由倍增时间(Tl)和倍增时间(T2)计算出Tl相对于T2的比值(T1/T2)。通过以下标准评价了细胞的培养稳定性。意思是比值(T1/T2)越大，细胞的增殖速度没有降低。
<细胞的培养稳定性(长期的培养稳定性)的判断标准>
○○：比值(T1/T2)为0.9以上
○：比值(T1/T2)为0.7以上且小于0.9
×：比值(T1/T2)小于0.7
图3是使用通过实施例3、12以及比较例2而获得的细胞培养用支架材料进行了细胞培养时的细胞接种24小时、48小时和72小时的相差显微照片。需要说明的是，实施例3中所述比值(T1/T2)为0.85，实施例12中所述比值(T1/T2)为0.99，比较例2中所述比值(T1/T2)为0.5。
(3)在乙醇中的溶解度
通过以下标准评价了所得的支架材料在乙醇(60℃)中的溶解性。
<在乙醇(60℃)中的溶解性的判断标准>
○○：溶解度为1重量％以上
○：溶解度为0.1重量％以上且小于1重量％
△：溶解度小于0.1重量％
具体情况和结果如下表1～4所示。
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符号的说明
1...细胞培养用容器
2...容器主体
2a…表面
3...树脂膜
5...细胞培养用微载体
6...基材颗粒
7...包覆层。
Claims (5)
1.一种细胞培养用支架材料，其含有含肽(甲基)丙烯酸类共聚物，所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物具有(甲基)丙烯酸类共聚物部和与所述(甲基)丙烯酸类共聚物部键合的肽部，
所述(甲基)丙烯酸类共聚物部具有源自下式(A1)或下式(A2)表示的(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元，
在所述(甲基)丙烯酸类共聚物部的全部结构单元100摩尔％中，源自所述(甲基)丙烯酸酯化合物(A)的结构单元的含有率为25摩尔％以上且98摩尔％以下，
[化学式1]
所述式(A1)中，R表示碳原子数2以上且18以下的烃基，
[化学式2]
所述式(A2)中，R表示碳原子数2以上且18以下的烃基。
2.根据权利要求1所述的细胞培养用支架材料，其中，
所述(甲基)丙烯酸类共聚物部具有源自具有能够与氨基或羧基反应的官能团的(甲基)丙烯酸酯化合物(B)的结构单元，
在所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物中，所述肽部与所述能够与氨基或羧基反应的官能团进行了键合。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养用支架材料，其中，
所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物的数均分子量为5000以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养用支架材料，其中，
在所述含肽(甲基)丙烯酸类共聚物中，所述肽部的含有率为0.5摩尔％以上且25摩尔％以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞培养用支架材料，其中，
所述肽部具有RGD序列。
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