WO2023027050A1 - 細胞構造体製造用容器、細胞構造体製造用容器の製造方法、細胞構造体の製造方法、及び細胞構造体製造用容器に用いられる基材 - Google Patents

細胞構造体製造用容器、細胞構造体製造用容器の製造方法、細胞構造体の製造方法、及び細胞構造体製造用容器に用いられる基材 Download PDF

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WO2023027050A1
WO2023027050A1 PCT/JP2022/031646 JP2022031646W WO2023027050A1 WO 2023027050 A1 WO2023027050 A1 WO 2023027050A1 JP 2022031646 W JP2022031646 W JP 2022031646W WO 2023027050 A1 WO2023027050 A1 WO 2023027050A1
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cell structure
base film
producing
substrate
region
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佳臣 広井
美耶 廣飯
康平 鈴木
祐揮 上田
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日産化学株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a container for producing a cell structure, a method for producing a container for producing a cell structure, a method for producing a cell structure, and a base material used for the container for producing a cell structure.
  • Cell structures or cell aggregates are cell aggregates in which cells self-assemble and aggregate three-dimensionally. can be maintained for a long period of time, and physiological functions have been reported to improve. Therefore, there are increasing expectations for the use of cell aggregates in drug discovery research, cell therapy, and regenerative therapy.
  • the present inventors have investigated the preparation of cell aggregates using a coating agent that induces spontaneous aggregation (self-assembly) of adherent cells and a cell culture vessel that is coated with the same coating agent. reported (see, for example, Patent Document 1).
  • Patent Document 1 leaves room for improvement in obtaining a cell structure-producing container capable of mass-producing a plurality of uniform cell structures by a simple method.
  • the present invention provides a cell structure production container capable of producing a plurality of uniform cell structures in large quantities, which is a simple method.
  • An object of the present invention is to provide a cell structure manufacturing container that can be obtained in
  • the present inventors have found that a coating film can be formed when a coating agent that induces spontaneous assembly (self-assembly) of adherent cells is provided all over the surface of a substrate at once.
  • the present inventors have found that a cell structure-producing container having the ability to form a coating film can solve the above-described problems by having the base material surface at a plurality of locations, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a substrate A cell structure-producing container having a base film capable of producing a cell structure formed on the surface of the base material, the surface of the base material has a plurality of first regions and a second region surrounding each of the plurality of first regions;
  • the base film-forming agent for forming the base film is provided all at once on the entire surface of the base material including the first region and the second region, each of the plurality of first regions present on the surface is
  • a cell structure-producing container having a base film-forming ability capable of forming the base film on the surface of the first region.
  • U a1 and U a2 each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and R a1 is a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms and R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms]
  • R a1 is a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms
  • a method for producing a cell structure-producing container comprising the step of forming a base film on which a cell structure can be produced on the surface of a base material, the surface of the base material has a plurality of first regions and a second region surrounding each of the plurality of first regions;
  • the base film-forming agent for forming the base film is provided all at once on the entire surface of the base material including the first region and the second region, each of the plurality of first regions present on the surface is
  • a method for producing a container for producing a cell structure which has base film-forming ability to form the base film on the surface of the first region.
  • the step of forming the base film includes providing the base film-forming agent to the entire surface of the base material including the first region and the second region all at once.
  • a method for manufacturing a container for manufacturing a cell structure includes providing the base film-forming agent to the entire surface of the base material including the first region and the second region all at once.
  • a method for manufacturing a container for manufacturing a cell structure includes providing the base film-forming agent to the entire surface of the base material including the first region and the second region all at once.
  • a method for manufacturing a container for manufacturing a cell structure includes providing the base film-forming agent to the entire surface of the base material including the first region and the second region all at once.
  • a substrate A substrate used in a cell structure-producing container having a base film on which a cell structure can be produced and formed on the surface of the substrate, the surface of the base material has a plurality of first regions and a second region surrounding each of the plurality of first regions;
  • the base film-forming agent for forming the base film is provided all at once on the entire surface of the base material including the first region and the second region, each of the plurality of first regions present on the surface is A base material having base film forming ability capable of forming the base film on the surface of the first region.
  • a container for producing a cell structure that can produce a plurality of uniform cell structures in large quantities, and a simple method. It is possible to provide a cell structure manufacturing container that can be obtained in.
  • FIG. 1A is a schematic diagram showing an example of a substrate used in a cell structure-producing container.
  • FIG. 1B is a schematic diagram further explaining the bottom surface 3 in FIG. 1A.
  • FIG. 1C is an enlarged view of a portion 3a of the bottom surface 3 in FIG. 1B.
  • FIG. 2A is a schematic diagram showing another example of a substrate used in a cell structure-producing container.
  • FIG. 2B is a schematic diagram further explaining the bottom surface 3 in FIG. 2A.
  • FIG. 2C is an enlarged view of a portion 3a of the bottom surface 3 in FIG. 2B.
  • FIG. 3A is a schematic diagram showing another example of a substrate used in a cell structure-producing container.
  • FIG. 3B is a schematic diagram further explaining the bottom surface 3 in FIG.
  • FIG. 3A is an enlarged view of a portion 3a of the bottom surface 3 in FIG. 3B.
  • FIG. 4A is a schematic diagram for explaining a series of flows from manufacturing a cell structure-manufacturing container to manufacturing a cell structure.
  • FIG. 4B is a schematic diagram for explaining a series of flows from the manufacture of the cell structure-manufacturing container to the manufacture of the cell structure.
  • FIG. 4C is a schematic diagram for explaining a series of flows from the manufacture of the cell structure-manufacturing container to the manufacture of the cell structure.
  • FIG. 4D is a schematic diagram for explaining a series of flows from manufacturing a cell structure-manufacturing container to manufacturing a cell structure.
  • FIG. 5A is a photograph of the state of the surface of the base material when the base film-forming agent was provided on the surface of the base material in Example 1.
  • FIG. 5B is a photograph of the state of the surface of the base material when the base film-forming agent was provided on the surface of the base material in Example 2.
  • FIG. 5C is a photograph of the state of the surface of the base material when the base film-forming agent was provided on the surface of the base material in Example 3.
  • FIG. 5D is a photograph of the state of the surface of the base material when the base film-forming agent was provided on the surface of the base material in Example 4.
  • FIG. 5E is a photograph of the state of the surface of the base material when the base film-forming agent was provided on the surface of the base material in Example 5.
  • FIG. 5A is a photograph of the state of the surface of the base material when the base film-forming agent was provided on the surface of the base material in Example 1.
  • FIG. 5B is a photograph of the state of the surface of the base material when the
  • FIG. 5F is a photograph of the state of the surface of the base material when the base film-forming agent was provided on the surface of the base material in Example 6.
  • FIG. FIG. 5G is a photograph of the surface of the base material when the base film-forming agent was provided on the surface of the base material in Example 7;
  • 6A is a photograph of cells on the substrate surface 24 hours after the start of observation in the cell adhesion confirmation test of Example 1.
  • FIG. 6B is a photograph of cells on the substrate surface 24 hours after the start of observation in the cell adhesion confirmation test of Example 2.
  • FIG. 6C is a photograph of cells on the substrate surface 24 hours after the start of observation in the cell adhesion confirmation test of Example 3.
  • FIG. 6D is a photograph of cells on the substrate surface 24 hours after the start of observation in the cell adhesion confirmation test of Example 4.
  • FIG. 6E is a photograph of cells on the substrate surface 24 hours after the start of observation in the cell adhesion confirmation test of Example 5.
  • FIG. 6F is a photograph of cells on the substrate surface 24 hours after the start of observation in the cell adhesion confirmation test of Example 6.
  • FIG. 6G is a photograph of cells on the substrate surface 24 hours after the start of observation in the cell adhesion confirmation test of Example 7.
  • the cell structure-producing container of the present invention has a substrate and a base film formed on the surface of the substrate.
  • a cell structure can be produced in the region where the base film is formed on the substrate surface.
  • the surface of the substrate has a plurality of first regions and a second region surrounding each of the plurality of first regions.
  • each of the plurality of first regions present on the base material surface has a base film forming ability.
  • the ability to form a base film refers to the ability to form a base film on the surface of a base material when a base film-forming agent for forming the base film is provided on the surface of the base material.
  • the base film-forming agent can be applied all at once to the entire surface of the base material, including the first region and the second region.
  • the base film can be reliably formed in each of the plurality of first regions present on the base material surface.
  • the base material has the ability to form a base film.
  • a coating film having cell adhesion inhibitory ability as described in [0067] of Patent Document 1 is formed.
  • a coating agent that induces spontaneous aggregation (self-assembly) of adherent cells (corresponding to the base film-forming agent in the present invention, hereinafter referred to as a base film-forming agent) is applied onto the coated substrate using an inkjet method or the like. ) must be applied in spots. At this time, the application must be controlled and accurately performed so that the base film-forming agent is applied to a predetermined position on the substrate.
  • the base film-forming ability is imparted to the substrate side, there is no need to control the placement of the base film-forming agent on the substrate, and high precision is not required.
  • the cell structure can be produced in the region where the base film is formed on the first region of the substrate surface, that is, in the region of the two-layer structure of the base material and the base film.
  • Patent Document 1 a cell structure is formed in a three-layered region in which a coating film having cell adhesion inhibitory ability is formed on a base material, and a film of a base film forming agent is formed thereon. produced.
  • a cell structure can be produced in a cell structure-producing container having a small number of layers. Therefore, the cell structure-producing container of the present invention can obtain a cell structure-producing container capable of producing a plurality of cell structures in large quantities by a simpler method than the conventional cell structure-producing container. can be done.
  • first region and second region may be formed in any manner as long as the substrate is manufactured so that the base film forming ability in the first region is higher than that in the second region.
  • a preferred embodiment of the base material is a base material in which the difference in base film forming ability between the first region and the second region is caused by the difference in the shape of the base material.
  • the shape of the substrate is uneven, and the convex portion of the substrate is the first region.
  • region is mentioned. As a result, the ability to form a base film in the first region can be made higher than in the second region.
  • FIGS. 1A to 1C show schematic diagrams of substrates used in containers for cell structure production.
  • the rough outline of the substrate is a cylinder.
  • a reverse-tapered quadrangular prism-shaped hole is formed from the center of the upper surface of the cylinder to the vicinity of the lower surface, and the bottom (bottom surface) of the hole is formed with an uneven shape.
  • a substrate 1 shown in FIG. 1 has a bottom surface 3 formed in an uneven shape and side walls 2 surrounding the bottom surface.
  • the bottom surface 3 has a surface 4 .
  • FIG. 1B is a schematic diagram showing a region including the first region and the second region on the bottom surface 3. As shown in FIG. The size of the area shown in FIG. 1B is an area of 5.5 mm ⁇ 5.5 mm, taking the substrate used in the following examples as an example. Excluding the second region of the outer peripheral portion, 9 ⁇ 9 convex portions, which are the first regions, are formed in an area of 5.3 mm ⁇ 5.3 mm. Each convex part is formed in the same substantially rectangular shape.
  • the substantially quadrangular shape is not limited to a quadrilateral shape, and may be a quadrilateral shape with chamfered or rounded corners.
  • the same shape does not require that the dimensions are exactly the same, and even if there are some deviations in the dimensions at the time of manufacture, it can be regarded as being formed to almost the same standard. If there is, it can be said that they have the same shape in the present invention.
  • the side length (g in FIG. 1) of the substantially square shape of the convex portion shown in FIG. 1 is 0.5 mm, taking the example below as an example.
  • the maximum length of the bottom surface (h in FIG. 1) between the adjacent protrusions in the recesses is 0.1 mm.
  • the height of the protrusion (i in FIG. 1) is 0.1 mm.
  • the height of the protrusion means the distance from the bottom surface of the recess to the protrusion.
  • j in FIG. 1 indicates the thickness of the bottom surface of the substrate.
  • the size of the protrusions and recesses can be appropriately set according to the types of cells and substrates to be used, the desired size of the cell structure, and the like.
  • the size of the recess when the groove width is narrow and deep, when the base film forming agent is provided all over the surface of the base material, air bubbles are likely to be generated in the recess, which is the second region. It is preferable to make the groove as narrow and deep as possible because it is possible to prevent the formation of the underlying film.
  • the ratio of width to depth of the concave portion may be, for example, in the range of 1:3 to 1:0.5 (specifically, 1:2, 1:1, etc.).
  • the shape of the convex portion includes, in addition to a substantially circular shape, a substantially polygonal shape such as a substantially triangular shape, a substantially square shape, a substantially pentagonal shape, and a substantially hexagonal shape.
  • each of the plurality of first regions present on the surface of the base material has a convex shape of substantially the same shape and substantially the same size. This is because it facilitates the formation of a plurality of cell structures of uniform size.
  • the maximum length of the sides of the substantially square shape of the projection is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, and can be selected as appropriate. More preferably, it is 3 to 2 mm.
  • the maximum length of the bottom surface between adjacent convex portions is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, and can be selected as appropriate. It is preferably 2 mm, more preferably 0.05 to 0.2 mm, even more preferably 0.05 to 0.15 mm.
  • the height of the convex portion is not particularly limited as long as the effect of the present invention can be obtained, and can be appropriately selected. It is preferably 0.05 to 0.5 mm, particularly preferably 0.05 to 0.2 mm.
  • the arrangement of the projections formed on the base material is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, and any arrangement may be used.
  • the arrangement of projections shown in FIGS. 3A to 3C (hereinafter also collectively referred to as FIG. 3) produced in the following example may be used.
  • the substrate of FIG. 3 formed with an arrangement of protrusions different from the arrangement of protrusions shown in FIG. 1 will be described below.
  • the convex shapes of the substrate shown in FIG. 1 are arranged in a row in the horizontal direction, and are also arranged in the same row in the vertical direction, but the convex shapes of the substrate shown in FIG.
  • the convex shapes arranged in a row in the direction are alternately shifted in the vertical direction.
  • Such an array of convex portions may be used.
  • the protrusions of the substrate shown in FIG. 3 are arranged as follows, as shown in FIG. 3B. - Nine ridges in the bottom row, then ⁇ In the second row from the bottom, there are 8 projections that are the same size as the projections in the bottom row, and 2 projections that are half smaller than the projections, for a total of 10 projections.
  • the protrusions located at the ends that do not satisfy the set desired size, which are caused by shifting the arrangement of the protrusions, are not regarded as the "same shape" protrusions in the present invention. .
  • a convex portion that does not conform to the standard may be formed at the end.
  • the protrusions other than the protrusions located at the ends of the protrusions arranged in a row in the horizontal direction have the same identity that can be regarded as being formed to substantially the same standard, in the present invention, the "identical It can be said that a convex portion having a shape is formed.
  • a total of 77 protrusions, which can be said to be protrusions having the same shape are formed, accounting for 90% or more of the total protrusions.
  • the material of the substrate preferably exhibits hydrophobicity (water contact angle is ⁇ 90°).
  • the material of the base material for example, polydimethylsiloxane (PDMS), polystyrene (PS), cycloolefin polymer (COP), polyacrylonitrile (PAN), polyester polymer alloy, etc.
  • PEPA polysulfone
  • PEF polyethylene terephthalate
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PVA polyurethane
  • EVAL ethylene vinyl alcohol
  • PE polyethylene
  • PET polymethyl methacrylate
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • PES polyethersulfone
  • PC polycarbonate
  • PVC polyvinyl chloride
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • UHPE ultra-high molecular weight polyethylene
  • UHPE acrylonitrile-butadiene-styrene resin
  • ABS Teflon (registered trademark), and the like.
  • PS polystyrene
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • a cell structure can be produced in the region where the base film is formed on the substrate surface.
  • the base film is formed with a base film forming agent.
  • the base film-forming agent to be used can be appropriately selected without any particular limitation. It is preferred to use agents.
  • the term "cationic membrane” refers to a membrane whose charge density is greater than 0 mV when measured with a zeta potential measuring device or the like.
  • a preferred embodiment of the base film-forming agent includes a base film-forming agent containing a polymer containing a repeating unit derived from a monomer represented by the following formula (I).
  • U a1 and U a2 each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and R a1 is a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms and R a2 represents a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms]
  • the base film-forming agent can contain a solvent in addition to the above specific polymer.
  • the base film-forming agent can also contain a cell-adhesive substance as needed.
  • the polymer contained in the base film-forming agent is preferably a polymer containing repeating units derived from the monomer represented by formula (I) above.
  • the above polymer is preferably a polymer obtained by polymerizing an anionic monomer represented by the following formula (II) together with a cationic monomer represented by the above formula (I).
  • R b represents a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • the "linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms” includes, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, s-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group, 1-methylbutyl group, 2-methylbutyl group, 3-methylbutyl group, 1,1-dimethylpropyl group, 1,2-dimethylpropyl group, 2 , 2-dimethylpropyl group or 1-ethylpropyl group.
  • R a1 and R b are each independently selected from a hydrogen atom and a methyl group.
  • U a1 and U a2 are preferably each independently selected from hydrogen atom, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group and n-butyl group, but are preferably methyl group or ethyl group. Preferred are methyl groups.
  • the "linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms" includes, for example, methylene group, ethylene group, propylene group, trimethylene group, tetramethylene group, 1-methyl propylene group, 2-methylpropylene group, dimethylethylene group, ethylethylene group, pentamethylene group, 1-methyl-tetramethylene group, 2-methyl-tetramethylene group, 1,1-dimethyl-trimethylene group, 1,2- dimethyl-trimethylene group, 2,2-dimethyl-trimethylene group, 1-ethyl-trimethylene group and the like.
  • R a2 is preferably selected from an ethylene group and a propylene group.
  • cationic monomers represented by formula (I) above include 2-N,N-dimethylaminoethyl methacrylate, N,N-dimethylaminomethyl methacrylate and the like, and 2-N,N-dimethylaminoethyl Methacrylates are preferred.
  • anionic monomer represented by formula (II) include acrylic acid and methacrylic acid, with methacrylic acid being preferred.
  • the molar ratio of units derived from the monomer represented by formula (I)/units derived from the monomer represented by formula (II) in the polymer is 100/0 to 50/50. It is preferably 98/2 to 50/50. More preferably 98/2 to 60/40, particularly preferably 98/2 to 70/30. When the molar ratio of the formula (II) is 50 or less, it is possible to suppress a decrease in cell adhesive force due to the anionicity of the polymer.
  • the polymer may be a polymer obtained by polymerizing a monomer represented by Formula (I)/Formula (II) and a monomer having two or more carbon-carbon unsaturated bonds.
  • a monomer having two or more carbon-carbon unsaturated bonds is specifically a monomer having two or more carbon-carbon double bonds, such as polyfunctional acrylate compounds, polyfunctional acrylamide compounds, polyfunctional A polyester or an isoprene compound may be used.
  • Preferred specific examples include monomers represented by the following formulas (III) to (V).
  • R c and R d each independently represent a hydrogen atom or a linear or branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms
  • R e is a linear or branched alkylene group having 1 to 5 carbon atoms. group
  • n represents a number from 1 to 50.
  • the monomer represented by Formula (III) is preferred.
  • the molar ratio of the monomers represented by formulas (III)-(V) to the total polymer is preferably 0-50%, more preferably 2-25%.
  • the molar ratio of the formulas (III) to (V) is 50% or less, gelation of the solid content during production due to high molecular weight due to excessive cross-linking can be suppressed, and production can be facilitated.
  • R c and R d are each independently selected from a hydrogen atom and a methyl group.
  • R e is preferably selected from a methylene group, an ethylene group and a propylene group, most preferably an ethylene group.
  • n is a number from 1 to 50, n is preferably a number from 1 to 30, and n is preferably a number from 1 to 10.
  • the difference between the mol% value of the monomer represented by the formula (II) with respect to the entire polymer and the mol% value of the monomer represented by the formula (II) with respect to the total amount of monomer charged during the preparation process is , 0 to 10 mol %.
  • the polymer according to the present invention has a small difference between the charged monomer ratio and the measured value of the polymer produced by the production method described later, and is 0 to 10 mol %, more preferably 0 to 8 mol %.
  • the number average molecular weight (Mn) of the polymer is from 20,000 to 1,000,000, more preferably from 50,000 to 800,000.
  • the ratio (Mw/Mn) of the weight average molecular weight (Mw) to the number average molecular weight (Mn) of the polymer is 1.01 to 10.00, preferably 1.2 to 8.0. It is preferably 4 to 6.0, preferably 1.5 to 5.0, preferably 1.6 to 4.5.
  • the number average molecular weight (Mn) and the number average molecular weight (Mn) can be determined, for example, by Gel Filtration Chromatography described in Examples.
  • the cell structure refers to a structure formed as a result of aggregation of cells, and the shape is not limited to a spherical shape, a ring shape, or the like.
  • the size adjustment of cell aggregates by defining the adhesion area can be produced).
  • Polymers can be produced by thermal polymerization methods.
  • the monomer of the above formula (I), optionally the above formula (II), and optionally a monomer having two or more carbon-carbon unsaturated bonds (formulas (III) to (V))
  • a polymer can be synthesized by dissolving a radical polymerization initiator and a radical polymerization initiator in an organic solvent to form a mixture, followed by dropwise polymerization in an organic solvent at a reflux temperature.
  • the obtained polymer may be purified by reprecipitation and dialysis.
  • organic solvent used in the production of the polymer examples include ether solvents such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane, aliphatic alcohol solvents having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol and isopropanol, and aromatic hydrocarbon solvents such as toluene.
  • ether solvents such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane
  • aliphatic alcohol solvents having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol and isopropanol
  • aromatic hydrocarbon solvents such as toluene.
  • a hydrogen solvent or a mixed solvent thereof can be mentioned.
  • radical polymerization initiators include dimethyl 1,1′-azobis(1-cyclohexanecarboxylate) (VE-073, manufactured by FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2,2′-azobis(2,4- dimethylvaleronitrile) (V-65, manufactured by FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2,2'-azobis(isobutyronitrile) (AIBN, manufactured by FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2,2' -Azobis[N-(2-carboxyethyl)-2-methylpropionamidine] n-hydrate (VA-057, manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2,2'-(N-butyl-2- methylpropionamide) (VAm-110, manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries,
  • the amount of the polymerization initiator added is 0.05% by mass to 5% by mass with respect to the total mass of the monomers used for polymerization.
  • the use of a polymerization initiator not only makes the polymerization reaction more efficient, but also enables adjustment of polymer physical properties by modification of terminal functional groups.
  • the base film-forming agent can contain a cell adhesive substance in addition to the above polymer.
  • a cell adhesive substance By containing a cell adhesive substance, cell adhesion, spreading, proliferation and differentiation can be promoted.
  • a cell adhesive substance By including a cell adhesive substance, it is possible to achieve more uniform adhesion of cells to the underlying membrane and to produce a cell structure of good quality.
  • known substances such as biological substances such as extracellular matrix (ECM) proteins, glycoproteins, and peptides, and synthetic compounds (low molecular weight, high molecular weight) can be used. It is preferably a non-substance compound, such as a synthetic compound (low molecular weight, high molecular weight).
  • a low molecular weight compound is, for example, a compound having a weight average molecular weight of 2,000 or less, and a high molecular weight compound is, for example, a weight average molecular weight of 2,000 or more, and the upper limit is, for example, 1,000,000.
  • extracellular matrix (ECM) proteins examples include collagen (e.g. Merck type I collagen (product numbers C9791, C7661, C1809, C2249, C2124), type II collagen (product number C9301), type IV collagen (product numbers C0543, C5533). ), elastin (e.g. Merck product numbers: E1625, E6527), fibronectin (e.g. Merck product numbers F1141, F0635, F2518, F0895, F4759, F2006), laminin (e.g.
  • the cell adhesive substance is preferably a glycoprotein. Specifically, it is preferably selected from vitronectin, integrin, cadherin, fibronectin, laminin, tenascin, osthiopontin and bone sialoprotein. Also, a protein having an RGD sequence as an amino acid sequence is preferred.
  • peptides examples include ECM peptide (MAPTrix (registered trademark) from Kollodis Bio Sciences) and RGD peptide (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries: 180-01531).
  • ECM peptide MAPTrix (registered trademark) from Kollodis Bio Sciences
  • RGD peptide manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries: 180-01531.
  • Examples of synthetic compounds include polylysine (eg Merck products: P4707, P4832, P7280, P9155, P6407, P6282, P7405, P5899) and polyornithine (eg Merck product number P4975).
  • Examples of synthetic compounds low molecular weight include adhesamine (eg AD-00000-0201 manufactured by Nagase & Co., Ltd.) and synthetic cyclic RGD peptide (eg LS-3920.0010 manufactured by IRIS BIOTECH).
  • the ratio (mass basis) of the polymer to the cell-adhesive substance in the base film-forming agent is not particularly limited as long as the base film-forming agent can form a cell structure, but is, for example, 100:0.1. ⁇ 100:100 is preferred.
  • the cell adhesion substance is 0.1 or more, cell adhesiveness is sufficiently exhibited, and when the cell adhesion substance is 100 or less, cell aggregation after cell adhesion (formation of cell aggregates) is facilitated. can.
  • the base film-forming agent can contain a solvent.
  • the solvent is not limited as long as it can dissolve the polymer, but a water-containing solution containing water is preferable.
  • the aqueous solution includes water, a salt-containing aqueous solution such as physiological saline or a phosphate buffer solution, or a mixed solvent in which water or a salt-containing aqueous solution and alcohol are combined.
  • Alcohols include alcohols having 2 to 6 carbon atoms, such as ethanol, propanol, isopropanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutanol, t-butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol.
  • the concentration of the polymer in the base film-forming agent is preferably 0.005 to 1% by mass, more preferably 0.005 to 0.1% by mass, and 0 0.065 to 0.015% by weight is more preferred, and 0.075 to 0.015% by weight is particularly preferred.
  • the base film-forming agent may optionally contain other substances within a range that does not impair the performance of the obtained base film.
  • Other substances include pH adjusters, cross-linking agents, preservatives, surfactants, primers that improve adhesion to containers or substrates, antifungal agents, sugars, and the like.
  • the method for producing a cell structure-producing container of the present invention includes the step of forming a base film on the surface of a substrate.
  • the substrate used in the manufacturing method has the following characteristics 1) and 2) as described above. 1)
  • the surface of the substrate has a plurality of first regions and a second region surrounding each of the plurality of first regions. 2)
  • Each of the plurality of first regions present on the surface has a base film forming ability.
  • a preferred embodiment of the method for producing a cell structure-producing container of the present invention includes a method for producing a cell structure-producing container including steps 1 to 3 below.
  • FIGS. 4A to 4D (FIGS. 4A to 4D are collectively referred to as FIG. 4) are schematic diagrams for explaining a series of steps from manufacturing a cell structure manufacturing container to manufacturing a cell structure. Steps 1 to 3 will be described below with reference to FIGS. 4A to 4C of FIG.
  • Step 1 (corresponding to (I) in FIG. 4A> A substrate having an uneven shape is prepared.
  • the material of the base material and the size of the unevenness of the base material are as described above.
  • a base film forming agent is provided all at once over the surface of the substrate including the first region and the second region. More specifically, for example, as a base film-forming agent, a water-soluble varnish containing a polymer containing a repeating unit derived from a monomer represented by formula (I), optionally a cell adhesive substance, and a solvent. prepare. Then, the water-soluble varnish 11 is collectively provided on the surface 4 of the substrate 1 including the first region 5 and the second region 6 .
  • the entire surface provided with the base film-forming agent does not necessarily have to be 100% of the substrate surface as long as the base film-forming agent is provided in a plurality of first regions.
  • providing the base film-forming agent all at once over the entire surface of the substrate does not include the case of selectively providing only the first region. Regardless of whether the first region or the second region, if the base film forming agent is randomly provided to both regions, it corresponds to "provided all over the surface at once" of the present invention.
  • providing the base film-forming agent on the substrate surface does not necessarily mean that the base film-forming agent is in direct contact with the surface as long as the base film-forming agent is provided on the surface. .
  • FIG. 4B (II) shows how the water-soluble varnish 11, which is the base film forming agent, is collectively provided on the surface 4 of the substrate 1 including the first region 5 and the second region 6.
  • air bubbles 12 are generated in the concave portion of the second region 6 as shown in (II) of FIG. 4B. It is possible to prevent the base film from being formed in the second region 6 .
  • the coating amount of the base film forming agent is small. This is because if the coating amount is large, the base film forming agent tends to flow into the concave portions due to gravity.
  • an immersion method can be used as a method for providing the base film-forming agent to the substrate surface.
  • the substrate In order to immerse the substrate surface in the substrate film-forming agent, the substrate (container) is filled with the substrate film-forming agent without applying excessive pressure using a pipette, syringe, etc., or an injection nozzle attached to an automatic dispensing device. A surface addition method is used.
  • Step 3 (corresponding to (III) in FIG. 4C>
  • excess of the base film-forming agent is sucked up with a waste liquid nozzle such as a pipette or dropper, and is used for waste liquid.
  • a film made of the base film forming agent is selectively formed on the projections, which are the first regions.
  • a film comprising the base film-forming agent may then be subjected to a drying step. By removing the solvent in the base film-forming agent by the drying process, the base film-forming agent is completely fixed to the surface of the substrate.
  • the cationic underlayer 13 formed using the underlayer-forming agent containing the polymer containing the repeating unit derived from the monomer represented by the above formula (I) is the convex portion of the first region 5 . It is shown formed on top.
  • a step of washing with at least one solvent selected from aqueous solutions containing water and electrolytes may be carried out. Cleaning is preferably performed with running water, ultrasonic cleaning, or the like.
  • Aqueous solutions containing electrolytes are preferably PBS, physiological saline (containing only sodium chloride), Dulbecco's phosphate-buffered saline, Tris-buffered physiological saline, HEPES-buffered physiological saline, and Veronal-buffered physiological saline, and PBS is preferred. Especially preferred.
  • the base film After being fixed, the base film is not eluted even if it is washed with water, PBS, alcohol, or the like, and remains firmly fixed to the base material.
  • the maximum and minimum film thicknesses of the underlying film are in the range of 1 to 1000 nm, preferably in the range of 5 to 500 nm.
  • the method for producing a cell structure of the present invention includes the step of seeding cells using the container for producing a cell structure of the present invention.
  • a cell is the most basic unit that constitutes an animal or a plant, and has cytoplasm and various cell organelles inside the cell membrane as its elements. At this time, the nucleus containing the DNA may or may not be contained inside the cell.
  • animal-derived cells in the present invention include germ cells such as sperm and ova, somatic cells that constitute living organisms, stem cells (such as pluripotent stem cells), progenitor cells, cancer cells isolated from living organisms, and cancer cells isolated from living organisms.
  • Cells that have acquired immortalization ability and are stably maintained outside the body (cell lines), cells that have been isolated from the living body and have been artificially genetically modified, cells that have been isolated from the living body and have their nuclei artificially exchanged etc. are included.
  • somatic cells that make up living organisms include, but are not limited to, fibroblasts, bone marrow cells, B lymphocytes, T lymphocytes, neutrophils, erythrocytes, platelets, macrophages, monocytes, and bones.
  • myeloid cells myeloid cells, pericytes, dendritic cells, keratinocytes, adipocytes, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells, endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatocytes, chondrocytes, cumulus cells, nervous system cells, glial cells, neurons, oligodendrocytes, microglia, astrocytes, cardiac cells, esophageal cells, muscle cells (e.g. smooth or skeletal muscle cells), pancreatic beta cells, melanocytes, hematopoietic progenitor cells (e.g. umbilical cord blood-derived CD34-positive cells), and mononuclear cells.
  • myeloid cells pericytes, dendritic cells, keratinocytes, adipocytes, mesenchymal cells
  • epithelial cells epidermal cells
  • endothelial cells vascular endothelial cells
  • the somatic cells are, for example, skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, bladder, prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, bone, cartilage, blood vessels. Included are cells harvested from any tissue such as tissue, blood (including cord blood), bone marrow, heart, myocardium, eye, brain or nerve tissue. Furthermore, the somatic cells include cells induced to differentiate from stem cells or progenitor cells.
  • Stem cells are cells that have both the ability to replicate themselves and the ability to differentiate into other cells of multiple lineages, examples of which include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells) , embryonic tumor cells, embryonic germ stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells), neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, liver stem cells, pancreatic stem cells, muscle stem cells, germ stem cells, intestinal stem cells, cancer stem cells, Hair follicle stem cells and the like are included.
  • Pluripotent stem cells include ES cells, embryonic germ stem cells, and iPS cells among the above stem cells.
  • Progenitor cells are cells that are in the process of differentiating from the stem cells to specific somatic cells or germ cells.
  • Cancer cells are cells that are derived from somatic cells and have acquired unlimited proliferative potential.
  • a cell line is a cell that has acquired unlimited proliferative capacity through artificial manipulation in vitro.
  • fibroblasts, stem cells, and among stem cells, pluripotent stem cells are more preferable.
  • a preferred embodiment of the method for producing a cell structure of the present invention includes a production method in which a cell structure is produced through the following step 4 using the cell structure-producing container obtained in step 3 above. Step 4 will be described below with reference to FIG. 4D of FIG.
  • Step 4 (corresponding to (IV) in FIG. 4D>
  • the cell structure-producing container of the present invention on the base film 13 formed on the first region 5, which has a size that allows cell structures to be produced, is densely and preferably regularly arranged, Seed the cells.
  • the cell seeding step is not particularly limited, and can be performed by a suitable known method depending on the cell type.
  • the cell structure 14 can be produced in the area of the base film 13 formed on the first area 5 .
  • a cell structure refers to a structure formed as a result of sterically aggregated cells, and the shape is not particularly limited. It may have any shape such as a spherical shape, a hemispherical shape, and a ring shape.
  • cell aggregates When a cationic underlayer is used, cell aggregates (spheroids) can be produced satisfactorily. In addition, when a base film made of a base film-forming agent containing the above polymer is used, spherical cell aggregates (spheroids) can be favorably produced.
  • a base film made of a base film-forming agent containing the above polymer when a base film made of a base film-forming agent containing the above polymer is used, spherical cell aggregates (spheroids) can be favorably produced.
  • the cell structure-producing container of the present invention since each of the first regions has a uniform size, when a predetermined amount of cells are seeded on the base film formed on the first region, cells of uniform size can be obtained. Structures can be made.
  • the base film-forming agent when the base film-forming agent is provided on the surface of the substrate, air bubbles 12 are likely to form in the narrow grooves of the recesses of the second region 6 . is susceptible to inhibition.
  • GFC Gel Filtration Chromatography
  • a polymer was synthesized by dropwise polymerization with respect to 166.63 g of 2-propanol.
  • the reaction product was reprecipitated with hexane, which is a poor solvent, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure.
  • the weight average molecular weight of this polymer by GFC was 350,000 (hereinafter referred to as "Synthetic Example Polymer 1").
  • a mold is prepared to transfer the uneven shape of the bottom surface 3 of the substrate shown in FIG. 10.00 g of SYLGARD 184 silicone elastomer (manufactured by Dow Corning) as a main agent and 1.00 g of a curing agent are mixed and stirred, and poured into a prepared mold. After defoaming with a vacuum pump, it is dried in an oven at 100° C. for 1 hour. After cooling to room temperature, the cured product of polydimethylsiloxane (PDMS) is removed from the mold. The cured product is immersed in pure water and subjected to autoclave sterilization at 120° C. for 15 minutes.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the distance between dimples is 0.5mm, and the distance between dimples is 0.1mm. is 0.1 mm and the depth is 0.1 mm, the PDMS substrate 1 shown in FIG. 1 having 81 protrusions was obtained.
  • the length of b is 7 mm
  • the length of c is 4 mm
  • the length of d is 5.5 mm
  • the length of e is
  • the height is 4.5 mm and the length of f is 7 mm.
  • the length of g is 0.5 mm
  • the length of h is 0.1 mm
  • the length of i is 0.1 mm.
  • the length of j is obtained by adding a thickness of 1 mm or more to i of 0.1 mm.
  • FIGS. 2A to 2C are collectively referred to as FIG. 2, similarly to FIG. 10.00 g of SYLGARD 184 silicone elastomer (manufactured by Dow Corning) as a main agent and 1.00 g of a curing agent are mixed and stirred, and poured into a prepared mold. After defoaming with a vacuum pump, it is dried in an oven at 100° C. for 1 hour. After cooling to room temperature, the cured product of polydimethylsiloxane (PDMS) is removed from the mold.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the cured product is immersed in pure water and subjected to autoclave sterilization at 120° C. for 15 minutes.
  • the distance between dimples is 0.5mm, and the distance between dimples is 0.1mm. is 0.2 mm and the depth is 0.2 mm, the PDMS substrate 2 shown in FIG. 2 having 64 protrusions was obtained.
  • the length of b is 7 mm
  • the length of c is 4 mm
  • the length of d is 5.8 mm
  • the length of e is
  • the height is 4.5 mm and the length of f is 7 mm.
  • the length of g is 0.5 mm
  • the length of h is 0.2 mm
  • the length of i is 0.2 mm.
  • the length of j is obtained by adding a thickness of 1 mm or more to i of 0.2 mm.
  • FIGS. 3A to 3C are collectively referred to as FIG. 3, similarly to FIG. 10.00 g of SYLGARD 184 silicone elastomer (manufactured by Dow Corning) as a main agent and 1.00 g of a curing agent are mixed and stirred, and poured into a prepared mold. After defoaming with a vacuum pump, it is dried in an oven at 100° C. for 1 hour. After cooling to room temperature, the cured product of polydimethylsiloxane (PDMS) is removed from the mold.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the cured product is immersed in pure water and subjected to autoclave sterilization at 120° C. for 15 minutes.
  • the distance between dimples is 0.5mm, and the distance between dimples is 0.1mm. is 0.1 mm and the depth is 0.15 mm, the PDMS substrate 3 shown in FIG. 3 was obtained.
  • the convex shapes of the PDMS substrate shown in FIGS. 1 and 2 are aligned in a row in the horizontal direction and arranged in the same row in the vertical direction.
  • the convex shapes are arranged in a line in the horizontal direction and alternately shifted in the vertical direction. That is, the convex portions of the PDMS substrate 3 shown in FIG. 3 are arranged as follows, as shown in FIG. 3B.
  • the PDMS base material 3 has a total of 85 protrusions formed on the inner side surrounded by the recesses.
  • the length of b is 7 mm
  • the length of c is 4 mm
  • the length of d is 5.5 mm
  • the length of e is The height is 4.5 mm
  • the length of f is 7 mm.
  • the length of g is 0.5 mm
  • the length of h is 0.1 mm
  • the length of i is 0.15 mm.
  • the length of j is obtained by adding a thickness of 1 mm or more to i of 0.15 mm.
  • Example 1 50 ⁇ L of the base film-forming agent prepared in Preparation Example 1 was added to the PDMS substrate 1 .
  • Table 1 shows the coating state of the base film forming agent in the grooves at this time.
  • photographed the state of the base material surface at that time is shown to FIG. 5A.
  • the excessive base film-forming agent out of the base film-forming agent provided on the substrate was drained.
  • the PDMS substrate 1 was dried in an oven at 70° C. for 24 hours. As a result, a cell structure-producing container 1 having a base film formed on the projections of the base material was obtained.
  • Example 2 200 ⁇ L of the base film-forming agent prepared in Preparation Example 1 was added to the PDMS substrate 1 .
  • Table 1 shows the coating state of the base film forming agent in the grooves at this time.
  • photographed the state of the base-material surface at that time is shown in FIG. 5B.
  • the excessive base film-forming agent out of the base film-forming agent provided on the substrate was drained.
  • the PDMS substrate 1 was dried in an oven at 70° C. for 24 hours. As a result, a cell structure-producing container 2 having a base film formed on the projections of the base material was obtained.
  • Example 3 50 ⁇ L of the base film-forming agent prepared in Preparation Example 1 was added to the PDMS substrate 2 .
  • Table 1 shows the coating state of the base film forming agent in the grooves at this time.
  • photographed the state of the base-material surface at that time is shown in FIG. 5C.
  • the excessive base film-forming agent out of the base film-forming agent provided on the substrate was drained.
  • the PDMS substrate 2 was dried in an oven at 70° C. for 24 hours. As a result, a cell structure-producing container 3 having a base film formed on the projections of the base material was obtained.
  • Example 4 200 ⁇ L of the base film-forming agent prepared in Preparation Example 1 was added to the PDMS substrate 2 .
  • Table 1 shows the coating state of the base film forming agent in the grooves at this time.
  • photographed the state of the base-material surface at that time is shown in FIG. 5D.
  • the excessive base film-forming agent out of the base film-forming agent provided on the substrate was drained.
  • the PDMS substrate 2 was dried in an oven at 70° C. for 24 hours. As a result, a cell structure-producing container 4 having a base film formed on the projections of the base material was obtained.
  • Example 5 50 ⁇ L of the base film-forming agent prepared in Preparation Example 2 was added to the PDMS substrate 3 .
  • Table 1 shows the coating state of the base film forming agent in the grooves at this time.
  • FIG. 5E shows a photograph of the state of the substrate surface at that time.
  • the excessive base film-forming agent out of the base film-forming agent provided on the substrate was drained.
  • the PDMS substrate 3 was dried in an oven at 70° C. for 24 hours. As a result, a cell structure-producing container 5 having a base film formed on the projections of the base material was obtained.
  • Example 6 50 ⁇ L of the base film-forming agent prepared in Preparation Example 3 was added to the PDMS substrate 3 .
  • Table 1 shows the coating state of the base film forming agent in the grooves at this time.
  • photographed the state of the base-material surface at that time is shown in FIG. 5F.
  • the excessive base film-forming agent out of the base film-forming agent provided on the substrate was drained.
  • the PDMS substrate 3 was dried in an oven at 70° C. for 24 hours. As a result, a cell structure-producing container 6 having a base film formed on the projections of the base material was obtained.
  • Example 7 50 ⁇ L of the base film-forming agent prepared in Preparation Example 4 was added to the PDMS substrate 3 .
  • Table 1 shows the coating state of the base film forming agent in the grooves at this time.
  • FIG. 5G shows a photograph of the state of the substrate surface at that time.
  • the excessive base film-forming agent out of the base film-forming agent provided on the substrate was drained.
  • the PDMS substrate 3 was dried in an oven at 70° C. for 24 hours. As a result, a cell structure-producing container 7 having a base film formed on the projections of the base material was obtained.
  • ADSC human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells
  • a low serum medium Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 manufactured by Takara Bio Inc., serum concentration 2
  • the cells were statically cultured in a 10 cm diameter petri dish (10 mL medium) for 2 days or longer in a 37° C./CO 2 incubator while maintaining a 5% carbon dioxide concentration.
  • the cells were washed with 3 mL of PBS solution (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 3 mL of trypsin-EDTA solution (manufactured by PromoCell) was added, and the cells were detached by standing at room temperature for 3 minutes. 7 mL of the above low serum medium was added to collect the cells. After centrifugation of this suspension (manufactured by Tomy Seiko Co., Ltd., model number LC-230, 200 x g / 3 minutes, room temperature), the supernatant was removed, and the above medium was added to prepare a cell suspension. .
  • PBS solution manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • trypsin-EDTA solution manufactured by PromoCell
  • ⁇ Cell adhesion confirmation test> The cell suspension was seeded into the cell structure-producing containers 1 to 7 prepared in Examples 1 to 7 so as to give 1.0 ⁇ 10 4 cells/container. After that, it was allowed to stand in a 37° C./CO 2 incubator while maintaining a carbon dioxide concentration of 5%. Cells were observed using a time-lapse imaging device CytoSMART Lux2 (manufactured by CytoSMART Technologies). Table 2 below shows the state of the cells in the cell structure-producing container 24 hours after the start of observation. Photographs of cells on the substrate surface at that time are shown in FIGS. 6A to 6G (FIGS. 6A to 6G are collectively referred to as FIG. 6).
  • Examples 1, 6 and 7 showed good results, and Examples 1 and 6 in particular showed better results.
  • the base film was formed only on the projections, which were the first regions on the substrate surface. It was also confirmed that uniform cell aggregates (spheroids) were formed in the base film on the first region. It was confirmed that some of the cells adhered to the base film were detached from the base film and aggregated to form cell aggregates (spheroids) two days after the observation.
  • the present invention can manufacture such a cell structure-producing container by a simple method, it can contribute to the improvement of the operability and mass productivity in the production of cell structures.

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Abstract

細胞構造体の作製の操作性及び量産性を向上させるため、複数の均一な細胞構造体を大量に作製することができる細胞構造体製造用容器であって、簡便な方法で得ることができる細胞構造体製造用容器を提供する。　基材と、前記基材の表面に形成された、細胞構造体を作製することが可能な下地膜とを有する細胞構造体製造用容器であって、　前記基材の前記表面は、複数の第１領域と、前記複数の第１領域の各々を囲む第２領域とを有し、　前記下地膜を形成する下地膜形成剤を前記第１領域及び前記第２領域を含む前記基材の表面全体に一括で提供した場合、前記表面に存在する複数の前記第１領域の各々は、前記第１領域の表面に前記下地膜を形成することができる下地膜形成能を有している、細胞構造体製造用容器である。

Description

細胞構造体製造用容器、細胞構造体製造用容器の製造方法、細胞構造体の製造方法、及び細胞構造体製造用容器に用いられる基材
　本発明は、細胞構造体製造用容器、細胞構造体製造用容器の製造方法、細胞構造体の製造方法、及び細胞構造体製造用容器に用いられる基材に関する。
　細胞構造体又は細胞凝集塊（スフェロイドまたは細胞塊ともいう）は、細胞同士が自己集合し、三次元的に凝集化した細胞集合体であり、生体様構造が構築されることから、細胞の機能を長期間維持でき、生理的機能が向上することが報告されている。そのため、細胞凝集塊の、創薬研究における、又は細胞治療や再生治療における利用についての期待が高まっている。
　それに伴い、細胞構造体又は細胞凝集塊を簡便かつ迅速に、均一かつ大量に作製できる組織工学技術の開発が再生医療の実用化や創薬試験の効率化のための重要課題とされているが、従来の細胞低接着性培養皿（例えば、マルチウェルプレート）を用いた浮遊細胞のランダムな凝集化現象を利用する方法では１ウェルに１個のスフェロイドしか形成しないため、操作性及び量産性に優れないという課題があった。
　本発明者らは、接着細胞の自発的な集合（自己集合化）を誘導するコーティング剤と、同コーティング剤でコーティングされていることを特徴とする細胞培養容器を用いた細胞凝集塊の作製について報告した（例えば、特許文献１参照）。
国際公開第２０２０／０４０２４７号
　しかし、特許文献１の記載内容は、細胞構造体の作製において、操作性や量産性を向上させるという観点からは、十分であるとはいえなかった。
　特許文献１は、複数の均一な細胞構造体を大量に作製することができる細胞構造体製造用容器を、簡便な方法で得ようとすると、改良の余地があった。
　そこで、本発明は、細胞構造体の作製の操作性及び量産性を向上させるため、複数の均一な細胞構造体を大量に作製することができる細胞構造体製造用容器であって、簡便な方法で得ることができる細胞構造体製造用容器を提供することを目的とする。
　本発明者らは、接着細胞の自発的な集合（自己集合化）を誘導するコーティング剤を、基材の表面全体に一括で提供した場合、コーティング膜を形成することができるコーティング膜形成能を基材表面の複数箇所に持たせることで、該コーティング膜形成能を有する細胞構造体製造用容器が、前述の課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の態様を包含するものである。
[１]　基材と、
　前記基材の表面に形成された、細胞構造体を作製することが可能な下地膜とを有する細胞構造体製造用容器であって、
　前記基材の前記表面は、複数の第１領域と、前記複数の第１領域の各々を囲む第２領域とを有し、
　前記下地膜を形成する下地膜形成剤を前記第１領域及び前記第２領域を含む前記基材の表面全体に一括で提供した場合、前記表面に存在する複数の前記第１領域の各々は、前記第１領域の表面に前記下地膜を形成することができる下地膜形成能を有している、細胞構造体製造用容器。
[２]　前記基材は凹凸形状を有し、前記第１領域は基材の凸部であり、前記第２領域は基材の凹部である、[１]に記載の細胞構造体製造用容器。
[３]　前記下地膜はカチオン性の下地膜である、[１]又は[２]に記載の細胞構造体製造用容器。
[４]　前記第１領域の表面に形成された前記カチオン性の下地膜の領域において、細胞構造体を形成する、[３]に記載の細胞構造体製造用容器。
[５]　前記下地膜形成剤が、下記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマーを含む、[１]～[４]のいずれかに記載の細胞構造体製造用容器。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］
[６]　前記凸部が、同一形状である、[２]～[５]のいずれかに記載の細胞構造体製造用容器。
[７]　前記凸部の辺の最大長さが、０．１～２ｍｍである、[６]に記載の細胞構造体製造用容器。
[８]　前記凹部において、隣り合う前記凸部と前記凸部との間の最大長さが、０．０１～０．２ｍｍである、[２]～[７]のいずれかに記載の細胞構造体製造用容器。
[９]　前記凸部高さが、０．０１～１ｍｍである、[２]～[７]のいずれかに記載の細胞構造体製造用容器。
[１０]　前記下地膜形成剤が、さらに細胞接着性物質を含む、[１]～[９]のいずれかに記載の細胞構造体製造用容器。
[１１]　前記下地膜形成剤が、前記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマーと、細胞接着性物質とを含む、[５]に記載の細胞構造体製造用容器。
[１２]　前記ポリマーと、前記細胞接着性物質の質量比が、１００：０．１～１００：１００である、[１１]に記載の細胞構造体製造用容器。
[１３]　基材の表面に細胞構造体を作製することが可能な下地膜を形成する工程を含む、細胞構造体製造用容器の製造方法であって、
　前記基材の前記表面は、複数の第１領域と、前記複数の第１領域の各々を囲む第２領域とを有し、
　前記下地膜を形成する下地膜形成剤を前記第１領域及び前記第２領域を含む前記基材の表面全体に一括で提供した場合、前記表面に存在する複数の前記第１領域の各々は、前記第１領域の表面に前記下地膜を形成することができる下地膜形成能を有している、細胞構造体製造用容器の製造方法。
[１４]　前記下地膜を形成する工程が、前記下地膜形成剤を前記第１領域及び前記第２領域を含む前記基材の表面全体に一括で提供することを含む、[１３]に記載の細胞構造体製造用容器の製造方法。
[１５]　[１４]に記載の細胞構造体製造用容器の製造方法により得られる細胞構造体製造用容器を用い、さらに細胞を播種する工程を含む、細胞構造体の製造方法。
[１６]　基材と、
　前記基材の表面に形成された、細胞構造体を作製することが可能な下地膜とを有する細胞構造体製造用容器に用いられる基材であって、
　前記基材の前記表面は、複数の第１領域と、前記複数の第１領域の各々を囲む第２領域とを有し、
　前記下地膜を形成する下地膜形成剤を前記第１領域及び前記第２領域を含む前記基材の表面全体に一括で提供した場合、前記表面に存在する複数の前記第１領域の各々は、前記第１領域の表面に前記下地膜を形成することができる下地膜形成能を有している、基材。
[１７]　前記基材は凹凸形状を有し、前記第１領域は基材の凸部であり、前記第２領域は基材の凹部である、[１６]に記載の基材。
[１８]　前記凸部が、同一形状である、[１７]に記載の基材。
[１９]　前記凸部の辺の最大長さが、０．１～２ｍｍである、[１８]に記載の基材。
[２０]　前記凹部において、隣り合う前記凸部と前記凸部との間の最大長さが、０．０１～０．２ｍｍである、[１７]～[１９]のいずれかに記載の基材。
[２１]　前記凸部高さが、０．０１～１ｍｍである、[１７]～[２０]のいずれかに記載の基材。
　本発明によれば、細胞構造体の作製の操作性及び量産性を向上させるため、複数の均一な細胞構造体を大量に作製することができる細胞構造体製造用容器であって、簡便な方法で得ることができる細胞構造体製造用容器を提供することができる。
図１Ａは、細胞構造体製造用容器に用いられる基材の一例を示す模式図である。 図１Ｂは、図１Ａにおける底面３をさらに説明する模式図である。 図１Ｃは、図１Ｂにおける底面３の一部３ａの拡大図である。 図２Ａは、細胞構造体製造用容器に用いられる基材の他の一例を示す模式図である。 図２Ｂは、図２Ａにおける底面３をさらに説明する模式図である。 図２Ｃは、図２Ｂにおける底面３の一部３ａの拡大図である。 図３Ａは、細胞構造体製造用容器に用いられる基材の他の一例を示す模式図である。 図３Ｂは、図３Ａにおける底面３をさらに説明する模式図である。 図３Ｃは、図３Ｂにおける底面３の一部３ａの拡大図である。 図４Ａは、細胞構造体製造用容器の製造から細胞構造体の製造までの一連の流れを説明するための模式図である。 図４Ｂは、細胞構造体製造用容器の製造から細胞構造体の製造までの一連の流れを説明するための模式図である。 図４Ｃは、細胞構造体製造用容器の製造から細胞構造体の製造までの一連の流れを説明するための模式図である。 図４Ｄは、細胞構造体製造用容器の製造から細胞構造体の製造までの一連の流れを説明するための模式図である。 図５Ａは、実施例１において、下地膜形成剤を基材表面に提供した際の基材表面の様子を撮影した写真である。 図５Ｂは、実施例２において、下地膜形成剤を基材表面に提供した際の基材表面の様子を撮影した写真である。 図５Ｃは、実施例３において、下地膜形成剤を基材表面に提供した際の基材表面の様子を撮影した写真である。 図５Ｄは、実施例４において、下地膜形成剤を基材表面に提供した際の基材表面の様子を撮影した写真である。 図５Ｅは、実施例５において、下地膜形成剤を基材表面に提供した際の基材表面の様子を撮影した写真である。 図５Ｆは、実施例６において、下地膜形成剤を基材表面に提供した際の基材表面の様子を撮影した写真である。 図５Ｇは、実施例７において、下地膜形成剤を基材表面に提供した際の基材表面の様子を撮影した写真である。 図６Ａは、実施例１の細胞接着確認試験において、観察開始から２４時間後における基材表面における細胞の様子を撮影した写真である。 図６Ｂは、実施例２の細胞接着確認試験において、観察開始から２４時間後における基材表面における細胞の様子を撮影した写真である。 図６Ｃは、実施例３の細胞接着確認試験において、観察開始から２４時間後における基材表面における細胞の様子を撮影した写真である。 図６Ｄは、実施例４の細胞接着確認試験において、観察開始から２４時間後における基材表面における細胞の様子を撮影した写真である。 図６Ｅは、実施例５の細胞接着確認試験において、観察開始から２４時間後における基材表面における細胞の様子を撮影した写真である。 図６Ｆは、実施例６の細胞接着確認試験において、観察開始から２４時間後における基材表面における細胞の様子を撮影した写真である。 図６Ｇは、実施例７の細胞接着確認試験において、観察開始から２４時間後における基材表面における細胞の様子を撮影した写真である。
（細胞構造体製造用容器）
　本発明の細胞構造体製造用容器は、基材と、基材の表面に形成された下地膜とを有する。
　基材表面に下地膜が形成された領域において、細胞構造体を作製することができる。
＜基材＞
　基材の表面は、複数の第１領域と、複数の第１領域の各々を囲む第２領域とを有する。
　ここで、基材表面に存在する複数の第１領域の各々は、下地膜形成能を有している。この下地膜形成能とは、下地膜を形成する下地膜形成剤を基材の表面に提供した場合、基材表面に下地膜を形成することができる能力をいう。
　このように、基材表面に存在する複数の第１領域の各々に下地膜形成能を持たせることで、下地膜形成剤を第１領域及び第２領域を含む基材の表面全体に一括で提供した場合に、基材表面に存在する複数の第１領域の各々において、下地膜を確実に形成させることができる。
　本発明では、基材側に下地膜形成能を持たせたことが特徴の一つである。従来の方法、例えば、上記特許文献１に記載の方法で、複数の細胞構造体を作製しようとすると、特許文献１の［００６７］で記載されているような細胞付着抑制能を持つコーティング膜が塗布された基材上に、インクジェット法等を用いて、接着細胞の自発的な集合（自己集合化）を誘導するコーティング剤（本発明でいう下地膜形成剤に対応、以下、下地膜形成剤ともいう）をスポット状に塗布する必要がある。この際、基材上の所定の位置に下地膜形成剤が塗布されるよう、塗布は制御されたうえ精度よく行われる必要がある。
　しかし、本発明によれば、基材側に下地膜形成能を持たせているため、下地膜形成剤を基材上に配するのに特に制御する必要はなく高い精度も求められない。単に下地膜形成剤を基材の表面全体に一括提供すればよい。また、本発明では、基材表面の第１領域上に下地膜が形成された領域、つまり基材と下地膜の２層構成の領域において、細胞構造体の作製が可能である。一方、上記特許文献１では、基材上に、細胞付着抑制能を持つコーティング膜が形成され、さらにその上に下地膜形成剤による膜が形成された３層構成の領域において、細胞構造体が作製される。したがって、本発明によれば、少ない層数からなる細胞構造体製造用容器において、細胞構造体を作製することができる。
　よって、本発明の細胞構造体製造用容器は、従来の細胞構造体製造用容器にくらべ、複数の細胞構造体を大量に作製することができる細胞構造体製造用容器を簡便な方法で得ることができる。
＜＜第１領域と第２領域＞＞
　上述したように、基材表面に第１領域は複数存在する。そして、第２領域は、複数の第１領域の各々を囲むようにして、基材表面に存在する。
　基材表面に存在する複数の第１領域の各々は、下地膜形成能を有している。
　本発明では、第１領域における下地膜形成能が第２領域に比べ高くなるように基材が作製されていれば、どのような態様で第１領域と第２領域が形成されていても構わないが、例えば、基材の好ましい実施態様として、第１領域と第２領域の下地膜形成能の違いを、基材形状の違いにより生じさせている基材が挙げられる。
　さらに、第１領域と第２領域の違いが基材の形状で表れている基材の好ましい実施態様として、基材形状が凹凸形状であり、基材の凸部を第１領域として、基材の凹部を第２領域として作製された基材が挙げられる。これにより、第１領域における下地膜形成能を第２領域に比べ高くすることができる。
＜＜凹凸形状の基材＞＞
　基材の好ましい実施態様として、基材の第１領域及び第２領域の形状が凹凸形状の基材について以下説明する。
　図１Ａ～図１Ｃ（以下、まとめて図１ともいう）は、細胞構造体製造用容器に用いられる基材の模式図を表す。基材の大まかな外形は、円柱である。円柱の上面の中心から下面近くに渡って逆テーパー状の四角柱状の孔が開けられており、孔の底（底面）に、凹凸形状が形成されている。
　図１で示される基材１は、凹凸形状で形成された底面３とその底面を囲む側壁２を有する。底面３は、表面４を有する。ここで、「表面」とは、下地膜形成剤が一括提供される面をいう。表面４は、第１領域５と第２領域６を有する。
　図１Ｂは、底面３における第１領域と第２領域を含む領域を取り出して表した模式図である。図１Ｂで示す領域の大きさは、下記実施例で使用した基材を例にとると、５．５ｍｍ×５．５ｍｍの面積である。外周部の第２領域を除くと、５．３ｍｍ×５．３ｍｍの面積に、第１領域である凸部が、９×９個形成されている。
　それぞれの凸部は、略四角形状の同一形状で形成されている。ここで、略四角形状とは、四角形だけでなく、角部が、面取りまたは丸められた形状の四角形であってもよい。
　また、同一形状とは、厳密に寸法がぴったり合っている厳密な同一が要求されるわけではなく、作製時の多少の寸法のブレがあっても、ほぼ同じ規格で形成されたとみなし得るものであれば、本発明では、同一形状であるといえる。
　図１で示される凸部の略四角形状の辺の長さ（図１中のｇ）は、下記実施例を例にとると、０．５ｍｍである。
　また、同様に下記実施例を例にとると、凹部において、隣り合う凸部と凸部との間の底面の最大長さ（図１中のｈ）は、０．１ｍｍである。
　また、同様に下記実施例を例にとると、凸部高さ（図１中のｉ）は、０．１ｍｍである。本発明において、凸部の高さとは、凹部の底面から、凸部までの距離をいう。
　図１中のｊは、基材の底面の厚みを示す。
　本発明において、凸部や凹部のサイズは、用いる細胞や基材の種類、細胞構造体の所望のサイズ等に応じて、適宜設定することができる。
　例えば、凹部（溝）のサイズは、溝幅を狭く深くすると、下地膜形成剤を基材の表面全体に一括提供した際、第２領域である凹部において気泡を発生しやすくして、凹部に下地膜を形成させないようにすることができるため、できるだけ狭く深くする方が好ましい。ただし、加工限界があるため、その点も考慮する必要がある。尚、加工技術の点からは、凹部の幅：深さは、例えば１：３～１：０．５の範囲（具体的には１：２、１：１など）で形成させてよい。
　本発明では、本発明の効果が得られれば、特に、凸部の形状や、凸部と凹部のサイズに制限はない。
　例えば、凸部の形状としては、略円形状に加え、略三角形状、略四角形状、略五角形状、略六角形状等の略多角形状が挙げられるが、中でも製造上の容易性から略四角形状であることが好ましい。また、基材表面上に複数存在する第１領域のそれぞれは、ほぼ同じ形状のほぼ同じ大きさの凸部形状であることが好ましい。これにより、複数の均一な大きさの細胞構造体を形成しやすいからである。
　凸部の略四角形状の辺の最大長さは、本発明の効果が得られる限り特に制限はなく、適宜選択することができるが、例えば、０．１～２ｍｍであることが好ましく、０．３～２ｍｍであることがより好ましい。
　凹部において、隣り合う凸部と凸部との間の底面の最大長さは、本発明の効果が得られる限り特に制限はなく、適宜選択することができるが、例えば、０．０１～０．２ｍｍであることが好ましく、０．０５～０．２ｍｍであることがより好ましく、０．０５～０．１５ｍｍであることがさらに好ましい。
　凸部高さは、本発明の効果が得られる限り特に制限はなく、適宜選択することができるが、例えば、０．０１～１ｍｍであることが好ましく、０．０５～１ｍｍであることがより好ましく、０．０５～０．５ｍｍであることがさらに好ましく、０．０５～０．２ｍｍであることが特に好ましい。
　また、基材に形成される凸部の配列は、本発明の効果が得られれば、特に制限はなく、どのような配列であっても構わない。
　例えば、下記実施例で作製した図３Ａ～図３Ｃ（以下、まとめて図３ともいう）で示される凸部の配列であってもよい。
　図１で示す凸部の配列とは異なる凸部の配列で形成された図３の基材について以下説明する。
　図１で示す基材の凸形状は、横方向の一列に揃って配置された凸形状が、縦方向にも同じ列で配置されているが、図３で示す基材の凸形状は、横方向の一列に揃って配置された凸形状が、縦方向には、交互にずれて配置されている。このような凸部の配列であってもよい。
　図３で示す基材の凸部について、より詳しく説明すると、図３Ｂで示すように、図３の基材の凸部は、以下のように配置されている。
・一番下の列に９個の凸部が、次に、
・下から２番目の列に、一番下の列の凸部と同じ大きさの凸部が８個と、その凸部より小さい半分欠けた凸部が２個の計１０個の凸部が、そして、
・これら９個の凸部と、１０個の凸部が、交互に繰り返されて配置されている。
　つまり、図３で示す基材には、周囲を凹部で囲まれた内側に、計８５個の凸部が形成されている。
　尚、図３で示すように、横方向の一列に揃って配置された凸形状を、縦方向では、交互にずらして配置するような場合、上述したように、列の端部に配置された凸部は、欠けてしまい設定した所望の大きさを満たさないということが生じる場合がある。
　このような場合、凸部の配置をずらしたことにより生じる、設定した所望の大きさを満たさない端部に位置する凸部については、本発明でいう「同一形状」の凸部としては見なさない。配置をずらした場合、端部に規格にそわない凸部が形成されてしまう場合があるからである。
　横方向の一列に揃って配置された凸部のうち端部に位置する凸部以外の凸部が、ほぼ同じ規格で形成されたとみなし得る同一性を有していれば、本発明では「同一形状」の凸部が形成されているといえる。図３で示す基材には、「同一形状」の凸部であるといえる凸部が、全体の凸部のうち９０％以上を占める計７７個形成されている。
　基材の材質としては、疎水性（水の接触角が≧９０°）を示すものであることが好ましい。
　また、基材の材質としては、凹凸形状の加工のしやすさから、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン（ＰＳ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＡＬ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＨＰＥ）、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン樹脂（ＡＢＳ）、テフロン（登録商標）等が挙げられる。中でも、成形加工性と細胞培養の観察のしやすさのための透明性という観点から、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）がより好ましい。
＜下地膜＞
　基材表面に下地膜が形成された領域において、細胞構造体を作製することができる。
　下地膜は、下地膜形成剤により形成される。
　下地膜は、細胞構造体を作製することができれば、用いられる下地膜形成剤の種類に特に制限はなく適宜選択することができるが、下地膜がカチオン性の下地膜となるような下地膜形成剤を用いることが好ましい。
　ここで、「カチオン性の膜」とは、電荷密度をゼータ電位測定装置等で測定したときに測定値が０ｍＶより大きくなる膜をいう。
　下地膜形成剤の好ましい実施態様としては、下記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマーを含む下地膜形成剤が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式中、
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］
　下地膜形成剤は、上記特定のポリマーの他に、溶媒を含むことができる。また、下地膜形成剤は、必要に応じて細胞接着性物質を含むこともできる。
＜＜ポリマー＞＞
　下地膜形成剤に含まれるポリマーとしては、好ましくは、上記式（Ｉ）表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマーである。
　上記ポリマーは、上記式（Ｉ）で表されるカチオン性モノマーと共に、下記式（ＩＩ）で表されるアニオン性モノマーを重合することで得られるポリマーであることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ［式中、
　Ｒｂは、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表す］
　本明細書において、他に定義のない限り、「炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基」としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、t－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル基又は１－エチルプロピル基が挙げられる。
　Ｒa１及びＲｂは、それぞれ独立して、水素原子及びメチル基から選ばれることが好ましい。
　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基及びｎ－ブチル基から選ばれることが好ましいが、メチル基又はエチル基であることが好ましく、メチル基が最も好ましい。
　本明細書において、他に定義のない限り、「炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキレン基」としては、例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、１－メチルプロピレン基、２－メチルプロピレン基、ジメチルエチレン基、エチルエチレン基、ペンタメチレン基、１－メチル－テトラメチレン基、２－メチル－テトラメチレン基、１，１－ジメチル－トリメチレン基、１，２－ジメチル－トリメチレン基、２，２－ジメチル－トリメチレン基、１－エチル－トリメチレン基等が挙げられる。これらの中で、Ｒa２としてはエチレン基及びプロピレン基から選ばれることが好ましい。
　したがって、上記式（Ｉ）で表されるカチオン性モノマーとしては、２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチルメタクリレートなどが挙げられ、２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートが好ましい。
　上記式（ＩＩ）で表されるアニオン性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸などが挙げられ、メタクリル酸が好ましい。
　前記ポリマー中の式（Ｉ）で表されるモノマー由来の単位／式（ＩＩ）で表されるモノマー由来の単位のモル比が、１００／０～５０／５０である。好ましくは９８／２～５０／５０である。より好ましくは９８／２～６０／４０であり、特に好ましくは９８／２～７０／３０である。
　式（ＩＩ）のモル比が５０以下であると、ポリマーのアニオン性による細胞の接着力低下を抑制できる。
　上記ポリマーは、式（Ｉ）／式（ＩＩ）で表されるモノマーと共に、さらに２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーとを重合することで得られるポリマーであってもよい。
　２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマーとは、具体的には、２つ以上の炭素－炭素二重結合を有するモノマーであり、例えば多官能アクリレート化合物、多官能アクリルアミド化合物、多官能ポリエステル、又はイソプレン化合物などが挙げられる。
　好ましい具体例としては下記式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式中、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒeは、炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、ｎは１～５０の数を表す。これらの中で、式（ＩＩＩ）で表されるモノマーであることが好ましい。
　上記ポリマー全体に対する式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマーのモル比は、好ましくは０～５０％であり、さらに好ましくは２～２５％である。
　式（ＩＩＩ）～（Ｖ）のモル比が５０％以下であると、過度な架橋による高分子量化による製造中の固形分のゲル化を抑制でき、製造を容易にできる。
　Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、水素原子及びメチル基から選ばれることが好ましい。
　Ｒｅはメチレン基、エチレン基及びプロピレン基から選ばれることが好ましく、エチレン基が最も好ましい。
　ｎは１～５０の数であるが、ｎは１～３０の数であることが好ましく、ｎは１～１０の数であることが好ましい。
　上記ポリマー全体に対する式（ＩＩ）で表されるモノマーの占めるモル％の値と、調製工程時のモノマー仕込み量全体に対する式（ＩＩ）で表される単量体の占めるモル％の値の差は、０～１０モル％である。本発明に係るポリマーは後述する製造方法により、モノマー仕込み比と、製造されたポリマーの実測値との差が少なく、０～１０モル％であり、さらに好ましくは０～８モル％である。
　ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、２０，０００～１，０００，０００であり、５０，０００～８００，０００であることがさらに好ましい。
　ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）が、１．０１～１０．００であり、１．２～８．０であることが好ましく、１．４～６．０であることが好ましく、１．５～５．０であることが好ましく、１．６～４．５であることが好ましい。
　数平均分子量（Ｍｎ）と数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば実施例に記載のＧｅｌ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙにより求めることができる。
　上記ポリマーを細胞構造体製造の下地膜として利用することで、例えば、細胞を接着させた後に剥離させて細胞凝集塊を形成させることが可能である。なお細胞構造体とは、細胞が凝集した結果形成する構造体を示し、球状やリング状などのように形状が限定されない。従来の細胞低接着プレート上での非接着培養により作製される細胞凝集塊と比較し、接着面積の規定による細胞凝集塊のサイズ調整（任意の大きさの細胞凝集塊が製造できる）などの点でメリットがある。
　国際公開第２０２０／０４０２４７号公報に記載の内容は、参照として本発明に援用することができる。
＜＜＜ポリマーの製造方法＞＞
　ポリマーは、熱重合法により製造することができる。例えば、上記式（Ｉ）のモノマーと、必要に応じて上記式（ＩＩ）、さらに必要に応じて２つ以上の炭素－炭素不飽和結合を有するモノマー（式（ＩＩＩ）～（Ｖ）で表されるモノマー等）と、ラジカル重合開始剤を有機溶媒に溶解し、混合物とした後、リフラックス温度とした有機溶媒に対して滴下重合することでポリマーを合成することができる。得られたポリマーを再沈殿、透析により精製してもよい。
　上記ポリマーの製造において使用する有機溶媒としては、例えばテトラヒドロフラン、１，４－ジオキサンなどのエーテル溶媒、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの炭素原子数１～４の脂肪族アルコール溶媒、トルエンなどの芳香族炭化水素溶媒あるいはその混合溶媒が挙げられる。
　上記式（Ｉ）のモノマーの重合反応を効率的に進めるためには、ラジカル重合開始剤を使用することが望ましい。
　ラジカル重合開始剤の例としては、ジメチル１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）、２，２’－アゾビス（２，４－ジメチルバレロニトリル）（Ｖ－６５、富士フイルム和光純薬（株）製）、２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ、富士フイルム和光純薬（株）製）、２，２’－アゾビス［Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２－メチルプロピオンアミジン］ｎ水和物（ＶＡ-０５７、富士フイルム和光純薬（株）製）、２，２’－（Ｎ－ブチル－２－メチルプロピオンアミド）（ＶＡｍ-１１０、富士フイルム和光純薬（株）製）などのアゾ重合開始剤が挙げられる。
　重合開始剤の添加量としては、重合に用いられるモノマーの合計質量に対し、０．０５質量％～５質量％である。
　重合開始剤の使用は、重合反応の効率化のみならず、末端官能基の修飾による重合体物性の調整が可能となる。
＜＜細胞接着物質＞＞
　下地膜形成剤は、上記ポリマーの他に、細胞接着性物質を含むことができる。
　細胞接着性物質を含むことにより、細胞の接着、伸展、増殖及び分化を促進することができる。
　細胞接着性物質を含むことにより、下地膜に対する細胞のより均一な接着が実現でき、良質な細胞構造体を製造することが可能となる。
　細胞接着性物質としては、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質、糖タンパク質、ペプチドなどの生物由来物質や、合成化合物（低分子、高分子）等の公知の物質を使用することができるが、生物由来物質でない化合物、例えば合成化合物（低分子、高分子）であることが好ましい。低分子とは、例えば重量平均分子量が２，０００以下の化合物であり、高分子とは、例えば重量平均分子量が２，０００以上であり、上限は例えば１，０００，０００である。
　細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質の例としては、コラーゲン（例えばメルク社のＩ型コラーゲン（品番Ｃ９７９１、Ｃ７６６１、Ｃ１８０９、Ｃ２２４９、Ｃ２１２４）、ＩＩ型コラーゲン（品番Ｃ９３０１）、ＩＶ型コラーゲン（品番Ｃ０５４３、Ｃ５５３３）、エラスチン（例えばメルク社品番：Ｅ１６２５、Ｅ６５２７）、フィブロネクチン（例えばメルク社品番Ｆ１１４１、Ｆ０６３５、Ｆ２５１８、Ｆ０８９５、Ｆ４７５９、Ｆ２００６）、ラミニン（例えばメルク社品番：Ｌ６７２４、Ｌ２０２０、Ｌ４５４４）、ラミニン断片（例えばマトリクソーム社製：８９２０１１）、ビトロネクチン（例えばＶＴＮ－Ｎ（ギブコ社）、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ,Ｈｕｍａｎ, Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ,Ａｎｉｍａｌ　Ｆｒｅｅ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）、メルク社品番：Ｖ０１３２、Ｖ９８８１、Ｖ８３７９、０８－１２６、ＳＲＰ３１８６）が挙げられる。
　細胞接着性物質が、糖タンパク質であることが好ましい。具体的にはビトロネクチン、インテグリン、カドヘリン、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、オスチオポンチン及び骨シアロタンパク質から選ばれることが好ましい。また、アミノ酸配列としてＲＧＤ配列を持つタンパク質であることが好ましい。
　ペプチドの例としては、ＥＣＭペプチド（Ｋｏｌｌｏｄｉｓ　Ｂｉｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＭＡＰＴｒｉｘ（登録商標）、ＲＧＤペプチド（富士フイルム和光純薬社製：１８０－０１５３１）が挙げられる。
　合成化合物（高分子）の例としては、ポリリジン（例えばメルク社製品：Ｐ４７０７、Ｐ４８３２、Ｐ７２８０、Ｐ９１５５，Ｐ６４０７，Ｐ６２８２，Ｐ７４０５，Ｐ５８９９）、ポリオルニチン（例えばメルク社品番Ｐ４９７５）が挙げられる。合成化合物（低分子）の例としてはアドヘサミン（例えば長瀬産業社製：ＡＤ－０００００－０２０１）、合成環状ＲＧＤペプチド（例えばＩＲＩＳ　ＢＩＯＴＥＣＨ社製：ＬＳ－３９２０．００１０）が挙げられる。
　下地膜形成剤中の、上記ポリマーと、細胞接着性物質の比（質量基準）は、細胞構造体が作製可能な下地膜形成剤が形成できれば特に制限はないが、例えば、１００：０．１～１００：１００であることが好ましい。細胞接着性物質が０．１以上であると、細胞接着性が十分に発揮され、細胞接着性物質が１００以下であると、細胞接着後の細胞の凝集（細胞凝集塊の形成）が容易にできる。
＜＜溶媒＞＞
　下地膜形成剤は、溶媒を含むことができる。
　溶媒としては、上記ポリマーを溶解できるものであれば限定されないが、水を含む含水溶液であることが好ましい。
　含水溶液とは、水、生理食塩水又はリン酸緩衝溶液などの塩含有水溶液、あるいは水又は塩含有水溶液とアルコールとを組み合わせた混合溶媒が挙げられる。
　アルコールとしては、炭素原子数２～６のアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブタノール、ｔ－ブタノール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、２，２－ジメチル－１－プロパノール（＝ネオペンチルアルコール）、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－１－ブタノール、２－メチル－２－ブタノール（＝ｔ－アミルアルコール）、３－メチル－１－ブタノール、３－メチル－３－ペンタノール、シクロペンタノール、１－ヘキサノール、２－ヘキサノール、３－ヘキサノール、２，３－ジメチル－２－ブタノール、３，３－ジメチル－１－ブタノール、３，３－ジメチル－２－ブタノール、２－エチル－１－ブタノール、２－メチル－１－ペンタノール、２－メチル－２－ペンタノール、２－メチル－３－ペンタノール、３－メチル－１－ペンタノール、３－メチル－２－ペンタノール、３－メチル－３－ペンタノール、４－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、４－メチル－３－ペンタノール及びシクロヘキサノールが挙げられ、単独で又はそれらの組み合わせの混合溶媒を用いてもよい。
　含水溶液中の水の含有量は、例えば５０質量％～１００質量％、８０質量％～１００質量％、９０質量％～１００質量％である。
　下地膜形成剤が、上記ポリマーと溶媒とを含む場合、該下地膜形成剤におけるポリマーの濃度は、０．００５～１質量％が好ましく、０．００５～０．１質量％がより好ましく、０．０６５～０．０１５質量％がさらに好ましく、０．０７５～０．０１５質量％が特に好ましい。
　さらに下地膜形成剤は、上記ポリマー、細胞接着性物質及び溶媒の他に、必要に応じて得られる下地膜の性能を損ねない範囲でその他の物質を添加することもできる。
　その他の物質としては、ｐＨ調整剤、架橋剤、防腐剤、界面活性剤、容器又は基材との密着性を高めるプライマー、防カビ剤及び糖類等が挙げられる。
（細胞構造体製造用容器の製造方法）
　本発明の細胞構造体製造用容器の製造方法は、基材の表面に下地膜を形成する工程を含む。
　製造方法で用いられる基材は、上述した通り、下記１）及び２）の特徴を有する。
　１）基材の表面は、複数の第１領域と、複数の第１領域の各々を囲む第２領域とを有する。
　２）表面に存在する複数の第１領域の各々は、下地膜形成能を有している。
　本発明の細胞構造体製造用容器の製造方法の好ましい実施態様としては、下記工程１～工程３を含む細胞構造体製造用容器の製造方法が挙げられる。
　図４Ａ～Ｄ（図４Ａ～図４Ｄをまとめて図４ともいう）は、細胞構造体製造用容器の製造から細胞構造体の製造までの一連の流れを説明するための模式図である。
　以下、図４のうち図４Ａ～Ｃを用いて、工程１～工程３について説明する。
＜工程１（図４Ａにおける（Ｉ）に対応＞
　凹凸形状の基材を用意する。
　基材の素材、基材の凹凸の大きさについては、上述したとおりである。
＜工程２（図４Ｂにおける（ＩＩ）に対応＞
　下地膜形成剤を第１領域及び第２領域を含む基材の表面全体に一括で提供する。
　より具体的には、例えば、下地膜形成剤として、式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマー、必要に応じて細胞接着性物質、及び溶媒を含む水溶性ワニスを用意する。そして、該水溶性ワニス１１を第１領域５及び第２領域６を含む基材１の表面４上に一括で提供する。
　本発明において、下地膜形成剤が提供される表面全体とは、複数の第１領域に下地膜形成剤が提供されていれば、必ずしも基材表面の１００％である必要はない。
　また、本発明において、下地膜形成剤を基材の表面全体に一括で提供するとは、第１領域にのみ選択的に提供するような場合は含まない。第１領域及び第２領域を問わず、両方の領域に無作為に下地膜形成剤が提供されれば、本発明の「表面全体に一括で提供」に該当する。
　また、本発明において、下地膜形成剤を基材表面に提供するとは、表面上に下地膜形成剤が提供されれば、必ずしも下地膜形成剤が直接表面上に触れる場合を意図するものではない。つまり、例えば、第２領域に気泡が存在し、第２領域の基材表面に下地膜形成剤が直接接しない場合であっても、第２領域上にも下地膜形成剤が提供されており、第２領域をまたいで隣り合う第１領域上に下地膜形成剤が提供されていれば、本発明の「基材表面に下地膜形成剤が提供されている」に該当する。
　図４Ｂの（ＩＩ）では、下地膜形成剤である水溶性ワニス１１を、第１領域５及び第２領域６を含む基材１の表面４上に一括で提供する様子を示している。
　凹部のサイズや下地膜形成剤の塗布量を適宜調整することにより、図４Ｂの（ＩＩ）で示すように、第２領域６の凹部に気泡１２（本発明では、泡噛みともいう）を生じさせ、第２領域６に下地膜を形成させないようにすることができる。
　第２領域６に下地膜を形成させないようにするには、下地膜形成剤の塗布量は、少ない方が好ましい。塗布量が多いと、重力で凹部に下地膜形成剤が流れ込みやすくなるからである。
　下地膜形成剤を基材表面に提供する方法としては、例えば、浸漬法を用いることができる。
　基材表面が下地膜形成剤に浸漬するよう、ピペットやシリンジ等、或いは自動分注装置に付帯した注入ノズルを用いて過剰の圧力をかけないように下地膜形成剤を基材（容器）の表面に添加する方法が用いられる。
＜工程３（図４Ｃにおける（ＩＩＩ）に対応＞
　工程２で基材表面上に提供された下地膜形成剤のうち、過剰の下地膜形成剤は、ピペットやスポイト等の廃液ノズルで吸い取り、廃液に供する。
　これにより、第１領域である凸部に選択的に下地膜形成剤からなる膜が形成される。
　該下地膜形成剤からなる膜は、その後、乾燥工程に供してもよい。乾燥工程により、下地膜形成剤中の溶媒を取り除くことで、基材表面へ完全に固着する。
　図４Ｃでは、例えば、上記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマー含む下地膜形成剤を用いて形成されたカチオン性の下地膜１３が第１領域５の凸部上に形成されている様子が示されている。
　また、下地膜に残存する不純物、未固着のポリマー等を無くすために、水及び電解質を含む水溶液から選ばれる少なくとも１種の溶媒で洗浄する工程を実施してもよい。洗浄は、流水洗浄又は超音波洗浄等が望ましい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ、生理食塩水（塩化ナトリウムのみを含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。
　固着後は水、ＰＢＳ及びアルコール等で洗浄しても下地膜は溶出せずに基材に強固に固着したままである。
　下地膜の膜厚は、最大膜厚と最小膜厚が１～１０００ｎｍの範囲であり、好ましくは５～５００ｎｍの範囲である。
　下地膜形成剤を基材表面に塗布し乾燥することにより、基材表面に複数存在する第１領域に下地膜を一度に形成することができる。特に本発明によれば、基材表面に複数存在する第１領域の形状をそれぞれ、同じ形及び大きさに揃えることができ、これにより、これら第１領域上に形成された下地膜において、均一なサイズの細胞構造体を作製することが可能となる。つまり、本発明により、複数の均一な細胞構造体を大量に作製することができる細胞構造体製造用容器を、簡便な方法で製造することができる。
（細胞構造体の製造方法）
　本発明の細胞構造体の製造方法は、本発明の細胞構造体製造用容器を用い、さらに細胞を播種する工程を含む。
＜細胞＞
　細胞とは、動物又は植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。
　生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、心筋、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。さらに当該体細胞は、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導された細胞が含まれる。
　幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。
　前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
　癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。
　細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。
　これらの中でも、線維芽細胞、幹細胞、幹細胞の中でも多能性幹細胞がより好ましい。
　本発明の細胞構造体の製造方法の好ましい実施態様としては、上記工程３により得られた細胞構造体製造用容器を用い、下記工程４を経て細胞構造体を製造する製造方法が挙げられる。
　以下、図４のうち図４Ｄを用いて、工程４について説明する。
＜工程４（図４Ｄにおける（ＩＶ）に対応＞
　本発明の細胞構造体製造用容器を用い、細胞構造体を製造し得るサイズで、高密度にかつ好ましくは規則的に配された第１領域５の上に形成された下地膜１３上に、細胞を播種する。
　細胞の播種工程は、特に限定はなく、細胞の種類に応じて適切な公知の方法で行うことができる。
　細胞を播種することにより、第１領域５の上に形成された下地膜１３の領域において、細胞構造体１４を作製することができる。
　細胞構造体とは、細胞が立体的に凝集した結果、形成された構造体をいい、特に形状は限定されない。球状、半球状、リング状等、どの形状であってもよい。
　カチオン性の下地膜を用いた場合には、細胞凝集塊（スフェロイド）を良好に作製することができる。
　また、上記ポリマーを含む下地膜形成剤からなる下地膜を用いた場合には、球状の細胞凝集塊（スフェロイド）を良好に作製することができる。
　本発明の細胞構造体製造用容器では、第１領域の各々のサイズが揃っているため、該第１領域の上に形成された下地膜に所定量の細胞を播種すると、均一なサイズの細胞構造体を作製することができる。
　本発明の細胞構造体製造用容器では、下地膜形成剤を基材表面に提供した際、第２領域６の凹部の狭い溝に気泡１２が生じやすいため、第２領域６における下地膜の形成は阻害されやすい。
　また、凹部に下地膜が形成されているか否かにかかわらず、たとえ、凹部の溝に細胞が入ったとしても、溝幅が狭いため凹部に存在する細胞は、凸部上の細胞と勝手に集合する自己凝集が起こり、第１領域の凸部上に形成されている細胞構造体に取り込まれる傾向が強い。
　つまり、本発明では、細胞構造体は第２領域において作製されにくくしており、細胞構造体の作製は、もっぱら第１領域において行われるように構成している。
　したがって、大きさを揃え、規則的に配置した複数の第１領域上に下地膜を形成してなる本発明の細胞構造体製造用容器を用いると、第１領域の下地膜上の各々において、均一なサイズの細胞構造体を作製することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
＜重量平均分子量の測定方法＞
　下記合成例に示す重量平均分子量はＧｅｌ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（以下、ＧＦＣと略称する）による結果である。
（測定条件）
　・装置：ＨＬＣ－８３２０ＧＰＣ（東ソー（株）製）
　・ＧＦＣカラム：ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ　６０００＋３０００ＰＷＸＬ－ＣＰ
　・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
　・溶離液：塩含有の水／有機混合溶媒
　・カラム温度：４０℃
　・検出器：ＲＩ
　・注入濃度：ポリマー固形分０．０５質量％
　・注入量：１００μＬ
　・検量線：三次近似曲線
　・標準試料：ポリエチレンオキサイド（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）×１０種
＜合成例１＞
　メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル（東京化成工業（株）製）２４．００ｇ、メタクリル酸（東京化成工業（株）製）１．４６ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（東京化成工業（株）製）５．０９ｇ、ジメチル　１，１’－アゾビス（１－シクロヘキサンカルボキシレート）（ＶＥ－０７３、富士フイルム和光純薬（株）製）０．３１ｇ、２－プロパノール１１１．０９ｇを混合し、リフラックス温度とした２－プロパノール１６６．６３ｇに対して滴下重合することでポリマーを合成した。反応生成物を貧溶媒であるヘキサンで再沈殿させ、析出物を濾過により回収し減圧乾燥させた。
　ＧＦＣによるこのポリマーの重量平均分子量は３５０，０００であった（以下、「合成例ポリマー１」と称す）。
＜調製例１＞
　上記合成例１で得られたポリマー０．００１５ｇに、純水２０．０ｇ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）０．０００３０ｇを加えて十分に撹拌し、下地膜形成剤を調製した。
＜調製例２＞
上記合成例１で得られたポリマー０．０２ｇに、純水２０．０ｇを加えて十分に撹拌し、下地膜形成剤を調製した。
＜調製例３＞
上記合成例１で得られたポリマー０．００３ｇに、純水２０．０ｇを加えて十分に撹拌し、下地膜形成剤を調製した。
＜調製例４＞
　上記合成例１で得られたポリマー０．００１３ｇに、純水２０．０ｇ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）０．０００２６ｇを加えて十分に撹拌し、下地膜形成剤を調製した。
＜細胞構造体製造用容器に使用するための基材の作製例１＞
　図１に記載の基材の底面３の凹凸形状を転写できるような金型を作成する。
　ＳＹＬＧＡＲＤ　１８４シリコーン・エラストマー（ダウコーニング社製）の主剤１０．００ｇと硬化剤１．００ｇの比率で混合・撹拌し、作成した金型に流し込む。
　減圧ポンプで泡抜きをおこなったあと１００℃で１時間オーブンにて乾燥する。室温まで冷却してから金型からポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の硬化物を取り出す。純水の中に硬化物を浸漬させ、１２０℃で１５分間オートクレーブ滅菌処理を行う。
　凸部を中心縦横距離が０．５ｍｍで、４点の角部分から対角線上に内側に０．１ｍｍを中心に半径０．１ｍｍの円で描いた形状、それ以外の部分を溝部としてディンプル間距離が０．１ｍｍ、深さ０．１ｍｍとすることで、凸部が８１個を有する図１に示すＰＤＭＳ基材１を得た。
　図１において、ａの長さは直径（φ）＝１５ｍｍであり、ｂの長さは７ｍｍであり、ｃの長さは４ｍｍであり、ｄの長さは５．５ｍｍであり、ｅの長さは４．５ｍｍであり、ｆの長さは７ｍｍである。
　また、図１において、ｇの長さは０．５ｍｍであり、ｈの長さは０．１ｍｍであり、ｉの長さは０．１ｍｍである。ｊの長さはｉの０．１ｍｍにさらに１ｍｍ以上の厚みを足したものとなる。
＜細胞構造体製造用容器に使用するための基材の作製例２＞
　図２に記載の基材の形状を転写できるような金型を作成する。図２も、図１と同様、図２Ａ～図２Ｃをまとめて図２という。
　ＳＹＬＧＡＲＤ　１８４シリコーン・エラストマー（ダウコーニング社製）の主剤１０．００ｇと硬化剤１．００ｇの比率で混合・撹拌し、作成した金型に流し込む。
　減圧ポンプで泡抜きをおこなったあと１００℃で１時間オーブンにて乾燥する。室温まで冷却してから金型からポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の硬化物を取り出す。純水の中に硬化物を浸漬させ、１２０℃で１５分間オートクレーブ滅菌処理を行う。
　凸部を中心縦横距離が０．５ｍｍで、４点の角部分から対角線上に内側に０．１ｍｍを中心に半径０．１ｍｍの円で描いた形状、それ以外の部分を溝部としてディンプル間距離が０．２ｍｍ、深さ０．２ｍｍとすることで、凸部が６４個を有する図２に示すＰＤＭＳ基材２を得た。
　図２において、ａの長さは直径（φ）＝１５ｍｍであり、ｂの長さは７ｍｍであり、ｃの長さは４ｍｍであり、ｄの長さは５．８ｍｍであり、ｅの長さは４．５ｍｍであり、ｆの長さは７ｍｍである。
　また、図２において、ｇの長さは０．５ｍｍであり、ｈの長さは０．２ｍｍであり、ｉの長さは０．２ｍｍである。ｊの長さはｉの０．２ｍｍにさらに１ｍｍ以上の厚みを足したものとなる。
＜細胞構造体製造用容器に使用するための基材の作製例３＞
　図３に記載の基材の底面３の凹凸形状を転写できるような金型を作成する。図３も、図１と同様、図３Ａ～図３Ｃをまとめて図３という。
　ＳＹＬＧＡＲＤ　１８４シリコーン・エラストマー（ダウコーニング社製）の主剤１０．００ｇと硬化剤１．００ｇの比率で混合・撹拌し、作成した金型に流し込む。
　減圧ポンプで泡抜きをおこなったあと１００℃で１時間オーブンにて乾燥する。室温まで冷却してから金型からポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の硬化物を取り出す。純水の中に硬化物を浸漬させ、１２０℃で１５分間オートクレーブ滅菌処理を行う。
　凸部を中心縦横距離が０．５ｍｍで、４点の角部分から対角線上に内側に０．１ｍｍを中心に半径０．１ｍｍの円で描いた形状、それ以外の部分を溝部としてディンプル間距離が０．１ｍｍ、深さ０．１５ｍｍとすることで、図３に示すＰＤＭＳ基材３を得た。
　図１及び図２で示すＰＤＭＳ基材の凸形状は、横方向の一列に揃って配置された凸形状が、縦方向にも同じ列で配置されているが、図３で示すＰＤＭＳ基材の凸部形状は、横方向の一列に揃って配置された凸形状が、縦方向には、交互にずれて配置されている。
　つまり、図３で示すＰＤＭＳ基材３の凸部は、図３Ｂで示すように、以下のように配置されている。
・一番下の列に９個の凸部が、次に、
・下から２番目の列に、一番下の列の凸部と同じ大きさの凸部が８個と、その凸部より小さい半分欠けた凸部が２個の計１０個の凸部が、そして、
・これら９個の凸部と、１０個の凸部が、交互に繰り返されて配置されている。
　ＰＤＭＳ基材３には、図３Ｂで示すように、周囲を凹部で囲まれた内側に、計８５個の凸部が形成されている。
　図３において、ａの長さは直径（φ）＝１５ｍｍであり、ｂの長さは７ｍｍであり、ｃの長さは４ｍｍであり、ｄの長さは５．５ｍｍであり、ｅの長さは４．５ｍｍであり、ｆの長さは７ｍｍである。
　また、図３において、ｇの長さは０．５ｍｍであり、ｈの長さは０．１ｍｍであり、ｉの長さは０．１５ｍｍである。ｊの長さはｉの０．１５ｍｍにさらに１ｍｍ以上の厚みを足したものとなる。
＜実施例１＞
　ＰＤＭＳ基材１に対して調製例１で作製した下地膜形成剤５０μＬを加えた。
　この時の溝部における下地膜形成剤の塗布状態を下記表１に記載する。また、その時の基材表面の様子を撮影した写真を図５Ａに示す。
　次に、基材上に提供した下地膜形成剤のうち過剰の下地膜形成剤は廃液した。その後、７０℃のオーブンにてＰＤＭＳ基材１を２４時間乾燥した。
　これにより、基材の凸部上に下地膜が形成された細胞構造体製造用容器１を得た。
＜実施例２＞
　ＰＤＭＳ基材１に対して調製例１で作製した下地膜形成剤２００μＬを加えた。
　この時の溝部における下地膜形成剤の塗布状態を下記表１に記載する。また、その時の基材表面の様子を撮影した写真を図５Ｂに示す。
　次に、基材上に提供した下地膜形成剤のうち過剰の下地膜形成剤は廃液した。その後、７０℃のオーブンにてＰＤＭＳ基材１を２４時間乾燥した。
　これにより、基材の凸部上に下地膜が形成された細胞構造体製造用容器２を得た。
＜実施例３＞
　ＰＤＭＳ基材２に対して調製例１で作製した下地膜形成剤５０μＬを加えた。
　この時の溝部における下地膜形成剤の塗布状態を下記表１に記載する。また、その時の基材表面の様子を撮影した写真を図５Ｃに示す。
　次に、基材上に提供した下地膜形成剤のうち過剰の下地膜形成剤は廃液した。その後、７０℃のオーブンにてＰＤＭＳ基材２を２４時間乾燥した。
　これにより、基材の凸部上に下地膜が形成された細胞構造体製造用容器３を得た。
＜実施例４＞
　ＰＤＭＳ基材２に対して調製例１で作製した下地膜形成剤２００μＬを加えた。
　この時の溝部における下地膜形成剤の塗布状態を下記表１に記載する。また、その時の基材表面の様子を撮影した写真を図５Ｄに示す。
　次に、基材上に提供した下地膜形成剤のうち過剰の下地膜形成剤は廃液した。その後、７０℃のオーブンにてＰＤＭＳ基材２を２４時間乾燥した。
　これにより、基材の凸部上に下地膜が形成された細胞構造体製造用容器４を得た。
＜実施例５＞
　ＰＤＭＳ基材３に対して調製例２で作製した下地膜形成剤５０μＬを加えた。
　この時の溝部における下地膜形成剤の塗布状態を下記表１に記載する。また、その時の基材表面の様子を撮影した写真を図５Ｅに示す。
　次に、基材上に提供した下地膜形成剤のうち過剰の下地膜形成剤は廃液した。その後、７０℃のオーブンにてＰＤＭＳ基材３を２４時間乾燥した。
　これにより、基材の凸部上に下地膜が形成された細胞構造体製造用容器５を得た。
＜実施例６＞
　ＰＤＭＳ基材３に対して調製例３で作製した下地膜形成剤５０μＬを加えた。
　この時の溝部における下地膜形成剤の塗布状態を下記表１に記載する。また、その時の基材表面の様子を撮影した写真を図５Ｆに示す。
　次に、基材上に提供した下地膜形成剤のうち過剰の下地膜形成剤は廃液した。その後、７０℃のオーブンにてＰＤＭＳ基材３を２４時間乾燥した。
　これにより、基材の凸部上に下地膜が形成された細胞構造体製造用容器６を得た。
＜実施例７＞
　ＰＤＭＳ基材３に対して調製例４で作製した下地膜形成剤５０μＬを加えた。
　この時の溝部における下地膜形成剤の塗布状態を下記表１に記載する。また、その時の基材表面の様子を撮影した写真を図５Ｇに示す。
　次に、基材上に提供した下地膜形成剤のうち過剰の下地膜形成剤は廃液した。その後、７０℃のオーブンにてＰＤＭＳ基材３を２４時間乾燥した。
　これにより、基材の凸部上に下地膜が形成された細胞構造体製造用容器７を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
＜細胞の調製＞
　細胞は、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ：セルソース（株）製）を用いた。細胞の培養には、低血清培地Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２（タカラバイオ（株）製：血清濃度２％）を用いた。細胞は、３７℃／ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ溶液（富士フイルム和光純薬（株）製）３ｍＬで洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）３ｍＬを添加して室温で３分間静置し細胞を剥離した。上記の低血清培地を７ｍＬ添加して細胞を回収した。本懸濁液を遠心分離（（株）トミー精工製、型番ＬＣ―２３０、２００×ｇ／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。
＜細胞接着確認試験＞
　実施例１～７で作製した細胞構造体製造用容器１～７に対して、細胞懸濁液を１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／容器となるように播種した。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃／ＣＯ２インキュベーター内にて静置した。タイムラプスイメージングデバイスＣｙｔｏＳＭＡＲＴ　Ｌｕｘ２（ＣｙｔｏＳＭＡＲＴ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用いて細胞の様子を観察した。
　観察開始から２４時間後における細胞構造体製造用容器内の細胞の様子を下記表２に記載する。また、その時の基材表面における細胞の様子を撮影した写真を図６Ａ～図６Ｇ（図６Ａ～図６Ｇをまとめて図６ともいう）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　図６で示すように、実施例の中でも、実施例１、６、７が良好な結果を、特に実施例１、６がより良好な結果を示した。実施例１、６では、基板表面の第１領域である凸部にのみ下地膜が形成されていることが確認できた。また、該第１領域上の下地膜において、均一な細胞凝集塊（スフェロイド）が作製できていることが確認できた。尚、観察２日後の時点で、下地膜に接着した細胞の一部が下地膜から剥がれて凝集し、細胞凝集塊（スフェロイド）を形成していることが確認できた。
　本発明の細胞構造体製造用容器によれば、複数の均一な細胞構造体を大量に作製することができる。
　そして、本発明は、係る細胞構造体製造用容器を簡便な方法で製造することができるため、細胞構造体の作製の操作性及び量産性の向上に寄与することができる。
　１　　基材
　２　　側壁
　３　　底面
　４　　表面
　５　　第１領域
　６　　第２領域
　１１　水溶性ワニス
　１２　気泡（泡噛み）
　１３　下地膜
　１４　細胞構造体

Claims (21)

  1. 　基材と、
    　前記基材の表面に形成された、細胞構造体を作製することが可能な下地膜とを有する細胞構造体製造用容器であって、
    　前記基材の前記表面は、複数の第１領域と、前記複数の第１領域の各々を囲む第２領域とを有し、
    　前記下地膜を形成する下地膜形成剤を前記第１領域及び前記第２領域を含む前記基材の表面全体に一括で提供した場合、前記表面に存在する複数の前記第１領域の各々は、前記第１領域の表面に前記下地膜を形成することができる下地膜形成能を有している、細胞構造体製造用容器。
  2. 　前記基材は凹凸形状を有し、前記第１領域は基材の凸部であり、前記第２領域は基材の凹部である、請求項１に記載の細胞構造体製造用容器。
  3. 　前記下地膜はカチオン性の下地膜である、請求項１に記載の細胞構造体製造用容器。
  4. 　前記第１領域の表面に形成された前記カチオン性の下地膜の領域において、細胞構造体を形成する、請求項３に記載の細胞構造体製造用容器。
  5. 　前記下地膜形成剤が、下記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマーを含む、請求項１に記載の細胞構造体製造用容器。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    　Ｕａ１及びＵａ２は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa１は、水素原子又は炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒa２は、炭素原子数１～５の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表す］
  6. 　前記凸部が、同一形状である、請求項２に記載の細胞構造体製造用容器。
  7. 　前記凸部の辺の最大長さが、０．１～２ｍｍである、請求項６に記載の細胞構造体製造用容器。
  8. 　前記凹部において、隣り合う前記凸部と前記凸部との間の最大長さが、０．０１～０．２ｍｍである、請求項２に記載の細胞構造体製造用容器。
  9. 　前記凸部高さが、０．０１～１ｍｍである、請求項２に記載の細胞構造体製造用容器。
  10. 　前記下地膜形成剤が、さらに細胞接着性物質を含む、請求項１に記載の細胞構造体製造用容器。
  11. 　前記下地膜形成剤が、前記式（Ｉ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位を含むポリマーと、細胞接着性物質とを含む、請求項５に記載の細胞構造体製造用容器。
  12. 　前記ポリマーと、前記細胞接着性物質の質量比が、１００：０．１～１００：１００である、請求項１１に記載の細胞構造体製造用容器。
  13. 　基材の表面に細胞構造体を作製することが可能な下地膜を形成する工程を含む、細胞構造体製造用容器の製造方法であって、
    　前記基材の前記表面は、複数の第１領域と、前記複数の第１領域の各々を囲む第２領域とを有し、
    　前記下地膜を形成する下地膜形成剤を前記第１領域及び前記第２領域を含む前記基材の表面全体に一括で提供した場合、前記表面に存在する複数の前記第１領域の各々は、前記第１領域の表面に前記下地膜を形成することができる下地膜形成能を有している、細胞構造体製造用容器の製造方法。
  14. 　前記下地膜を形成する工程が、前記下地膜形成剤を前記第１領域及び前記第２領域を含む前記基材の表面全体に一括で提供することを含む、請求項１３に記載の細胞構造体製造用容器の製造方法。
  15. 　請求項１４に記載の細胞構造体製造用容器の製造方法により得られる細胞構造体製造用容器を用い、さらに細胞を播種する工程を含む、細胞構造体の製造方法。
  16. 　基材と、
    　前記基材の表面に形成された、細胞構造体を作製することが可能な下地膜とを有する細胞構造体製造用容器に用いられる基材であって、
    　前記基材の前記表面は、複数の第１領域と、前記複数の第１領域の各々を囲む第２領域とを有し、
    　前記下地膜を形成する下地膜形成剤を前記第１領域及び前記第２領域を含む前記基材の表面全体に一括で提供した場合、前記表面に存在する複数の前記第１領域の各々は、前記第１領域の表面に前記下地膜を形成することができる下地膜形成能を有している、基材。
  17. 　前記基材は凹凸形状を有し、前記第１領域は基材の凸部であり、前記第２領域は基材の凹部である、請求項１６に記載の基材。
  18. 　前記凸部が、同一形状である、請求項１７に記載の基材。
  19. 　前記凸部の辺の最大長さが、０．１～２ｍｍである、請求項１８に記載の基材。
  20. 　前記凹部において、隣り合う前記凸部と前記凸部との間の最大長さが、０．０１～０．２ｍｍである、請求項１７に記載の基材。
  21. 　前記凸部高さが、０．０１～１ｍｍである、請求項１７に記載の基材。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2020040247A1 (ja) * 2018-08-24 2020-02-27 日産化学株式会社 細胞培養の下地膜として使用するポリマーの製造方法及び細胞培養容器

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