JP2009511054A - 生物学的材料および非生物学的材料をパターン化するための微小泡プレート - Google Patents

Abstract

プレート上の特定部位で生物学的材料および非生物学的材料をパターン化するため、ならびに三次元構造を成長するためのシステムおよび方法。好ましい実施形態は、上記プレートが液体中に沈められたとき、通常は泡の形態でガスをトラップする領域をもつプレートを含む。本発明のその他の実施形態は、トラップされたガスの使用によりプレート上の所定の位置に材料を配置し、材料が所望されない領域で収集されることを防ぐ。このプレートは、アレイ上のように、特定部位に細胞および組織を配置するために大きな有用性を有する。開示される方法はまた、パターン化されたコーティング適用のために特定位置でプレートの表面をコートするため、および、微小機械的構造であって、これら構造が、生存材料または非生存材料、有機または無機などから形成され得る構造を含む三次元構造を生成するよう材料を構築するに用いられ得る。

Description

（分野）
本発明は、生化学的分析に、そしてより詳細には、生物学的材料および非生物学的材料をパターン化するための微小泡プレートに関する。

（背景）
細胞、組織、生物、コロニー、胚、およびその他の生物学的材料、ならびに非生物学的材料を、プレート上の特定部位でパターン化する能力は、科学的研究および医学の多くの領域のために重要である。このような材料を既知の位置に配置することにより、研究者は、各サンプルを、独立して、かつ経時的にモニターしながら、同一かつ制御された条件下で多くのサンプルを研究し得る。各サンプルは、既知の位置にあるので、多くの数のサンプルが研究され得、統計学的に有意なデータセットを得る。隔離された生物学的媒体のアレイは、未知の薬剤または病原体の存在下、制御された条件下でこの媒体を観察することによる診断で支援するために用いられ得る。

媒体のパターン化を達成するために、従来の技法は、３つの主要な戦略：（１）パターン化された表面処理、（２）構造化マイクロウェル、（３）物理的刷込み型（ｓｔｅｎｃｉｌｌｉｎｇ）に依存し、これらすべては、本発明によって克服される欠点を有している。

パターン化された表面処理は、所定の位置で特定の化学的性質を有する表面を生成する。これは、リソグラフィー方法により（すなわち、写真マクスを通じるＵＶ照射）、または化学物質がパターン化されたゴムスタンプによってプレート表面に物理的に移されるゴムスタンプアプローチによって実施される。表面処理の結果は、領域が媒体付着（例えば、細胞成長、タンパク質結合）のために、好都合または不都合にされることである。媒体とのインキュベーションの後、この媒体および緩衝液は、洗い流される。これらの方法は、高度に選択的でなく−媒体のパターン化は、特に良好ではなく、そして各媒体／プレートは、この媒体／プレート組み合わせに特異的な異なる表面処理を必要とする。

構造化マイクロウェルは、リソグラフィーエッチングまたは表面中に腔を成形することにより、表面にパターン化され得る。このようなマイクロウェルは、使用が限られる。なぜなら、細胞は、これら腔からでて容易に成長し、そして媒体は、マイクロウェルのすべての部位を容易にコートし得るからである。最良の結果のために、（生物学的媒体を含むために）高いアスペクト比のウェルが要求され、製造困難性およびコストを増加する。

物理的刷込み型技法は、目的のプレート上に配置される剛直性の一時的バリアを用いる。このバリアは、ステンシルまたは微小流体デバイスの形態である。これに従って、媒体は、ステンシルによって許可される位置で表面に導入、かつ付着するようにされる。付着の後、このステンシルは除去され、パターン化されたる媒体を残す。この方法は欠点をもつ、なぜなら、多数の正確な穴とともに、高解像度のステンシルを生成することが困難（および高価）であるからである。これらステンシルは、インキュベーション（付着）の全部の期間の間で表面と緊密な接触のままでなければならない。一般に、ステンシルは、開口部間で漏れ、パターン解像度をさらに低減する。最後に、このようなステンシルは高価であり、そして単一のステンシルが、パターン化されるべき各表面に対して全体のインキュベーション期間の間用いられなければならない。

従って、プレート上の特定部位で生物学的材料および非生物学的材料をパターン化する改良された方法およびシステムが所望される。

（要旨）
本明細書中に提供される種々の実施形態および実施例は、一般に、プレート上の特定部位で生物学的材料および非生物学的材料をパターン化するため、ならびに、この材料から三次元構造を成長または構築するためのシステムおよび方法に関する。好ましい実施形態は、このプレートが液体中に沈められるとき、通常、泡の形態でガスをトラップする領域を備えるプレートを含む。本発明のその他の実施形態は、材料が所望されない領域で集められるのを防ぐようにトラップガスの使用により所定の位置でプレート上に材料を配置する方法を含む。このプレートは、細胞および組織をアレイ上のような特定部位に配置するために大きな有用性を有する。開示される方法はまた、プレートの表面を、パターン化されたコーティング適用のための特定部位でコーティングを用いてコートするため、および、微小機械的構造であって、これら構造が、生存材料または非生存材料、組織または非組織、有機または無機などから形成され得る構造を含む三次元構造を生成するよう材料を構築するに用いられ得る。

トラップガス腔またはトラフは、生物学的媒体および非生物学的媒体のパターン化を容易するために用いられ、これは、有利には、アレイにあるか、またはアドレス化可能部位および／または取り外し可能な部位にあり得る。ガスの泡は、好ましくは、腔の表面、すなわち、乾燥領域上の細胞および媒体付着に対する連続的な不透過性バリアを提供し、特定位置または部位、すなわち、細胞および媒体が付着するために適切である「湿潤領域」をプレート上で互いから効率的に隔離する。このガスの泡は、マイクロメートル未満の幅または直径寸法をもつ極度に小さい腔についてでさえ、疎水性または液体撥水性腔を用いて非常に容易に作製され得る。このガスの泡は、好ましくは、これら腔の開口部を超え、そして湿潤領域を超えて延びるが、湿潤領域までか、またはその真下に延び得る。ガスの泡の形成は、有利には、外部取り扱いまたは操作を必要とせず、生物学的機能を損傷または妨害せず、そして任意のときに容易に除去され得る。

このガスの泡はまた、組織成長または非組織構造の成長もしくは形成のための一時的足場を提供するために用いられ得る。従来方法は、経時的に腐食し、組織構造を放出する生分解性のポリマー足場を用いる。ガスの泡は、微小機械加工および組織エンジニアリング適用のための一時的３−Ｄ足場構造を生成するための安価で便利な単純な方法を提供する。

さらに本発明の目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
以下に開示されるさらなる特徴および教示の各々は、その他の特徴および教示とは別個に、またはそれらと組み合わせて利用され得、生物学的材料および非生物学的材料をパターン化するための微小泡プレートを提供する。その実施例が、別個にそして組み合わせての両方で多くのこれらのさらなる特徴および教示を利用する本発明の代表的な実施例は、ここで、添付の図面を参照してさらに詳細に説明される。この詳細な説明は、当業者に、本教示の好ましい局面を実施するためのさらなる詳細を教示することを単に意図し、そして本発明の範囲を制限することは意図されない。従って、以下の詳細な説明で開示される特徴および工程の組み合わせは、最も広い意味で本発明を実施するために必ずしも必要ではなくてもよく、そしてその代わりに、本教示の代表的な実施例を詳細に記載することが単に教示されている。

さらに、代表的な実施例および従属請求項の種々の特徴は、本教示のさらなる有用な実施形態を提供するために、詳細に、そして明示して列挙されていない方法で組み合わされ得る。さらに、本明細書および／または請求項に記載されるすべての特徴は、当初の開示の目的のため、ならびに実施形態および請求項における特徴の組み合わせとは独立して請求講に記載の主題を制限する目的のために、別個に、そして互いから独立して開示されることが意図されることが明示して注記される。すべての値の範囲または実体のグループの指標は、すべての可能な中間値または中間の実体を、当初の開示の目的のため、および請求項に記載の主題を制限する目的のために開示することがまた明示して注記される。

本明細書に提供される種々の実施形態は、一般に、プレート上の特定部位で生物学的および非生物学的材料をパターン化するためのシステムおよび方法に関する。好ましい実施形態は、液体が接触をなすことが意図される表面を含む領域（湿潤領域）、および好ましくはこの湿潤領域を取り囲み、かつ隔離する接触をなすことが意図されないその他の領域（泡または乾燥領域）からなるプレートを含む。これは、特異的位置または既知の位置で連続的な空気またはガス充填された領域を生成する構造化材料の使用により可能とされる。使用において、このプレートは、所定の位置で、生物学的材料、細胞または小さな生存生物をパターン化すること、組織成長を行うこと、所定の位置に無機および有機材料を堆積すること、化学反応を局在化すること、およびコーティングをパターン化することを可能にする。

図１を参照して、コンテナ２は、目的の材料５、この例では細胞を含む溶液４で満たされている。描写されるようにし、プレート６は、液体で充填されたコンテナ２中に配置される。プレート６上の領域は、異なる高さで表面８、目的の材料５がプレート６と接触し、そしてそれに付着する「湿潤領域」を含んで製作される。腔、トラフまたはギャップ１６、すなわち、「乾燥領域」は、好ましくは、プレート６中に形成され、そして疎水性または液体撥水性にされ、そしてそれ故、目的の材料５に対して連続的な不浸透性のバリアを形成するガスの泡１０をトラップする。この泡１０は、好ましくは腔１６の開口部を超え、そして湿潤領域８の上に延びるが、湿潤領域８までまたはその真下に延び得、乾燥領域１６上の材料５の付着を防ぐ。

図２および３に描写されるように、腔またはトラフ１６は、好ましくは、プレート６を横切って連続的に走って互いに十字に横切り、湿潤領域、すなわち、高くされた表面８を隔離する。この湿潤領域８は、アレイにパターン化され得、各領域または位置はアドレス化可能である。図１に描写されるように、多くの泡１０を含む領域１４は、多数の腔１６を緊密濃度で生成することによって生成され得る。

操作において、溶液４からの材料５、例えば細胞は、沈み、そしてプレート６上に上陸する。細胞５が剥き出た表面８に上陸する場合、それらは、点１２で表面と粘着するか、または反応し得る。それらが泡１０上に上陸するとき、それらは粘着しないが、代表的には、剥き出たプレート領域８にスライドする。それらが、多くの泡１０を含む領域１４上に上陸するとき、それらは泡１０の表面に浮遊するが、プレート６には粘着しない。

泡領域１４の液体撥水性は、この泡領域を疎水性（例えば水に対して）、脂質非親和性（例えば油に対して）、またはそうでなければ液体に対して撥水性にするプレート材料の使用または表面処理の使用により増大され得る。安定泡形成を増大する最も単純な方法は、ガスをトラップする小さな腔を生成することである。ガストラップ腔１６は、疎水性材料から構築されるか、または疎水性であるように処理されるべきである。領域を疎水性または親水性にするための方法は変動し得、そしてＵＶグラフト化、ステンシルによるような非選択的処置によって付与されたコーティング、他ではなく１つの材料上に自然に形成するシラン、または材料の選択により自然に付与される、すなわち、ガラス表面対プラスチック表面のような選択的処理によって付与されるコーティングを含み得る。

プレート６を液体４中に沈めた後、またはプレート６の表面上に液体４を添加した後、疎水性腔１６は、トラップされたガスの泡１０を生成する。平坦または湿潤表面８は、液体をはねつけず、そしてこれら表面８は、液体４と接触したままである。腔１６を適切に配列することにより、任意形状およびサイズのガス領域１４が調製され得る。

これらガスの泡の安定性は、プレートをコートする液体の表面張力、およびギャップまたは腔の形状およびサイズに依存する。泡は、液体がギャップ中に流れることを防ぐ表面張力に起因して生成する。液体がプレート上を流れるとき、液体の先導エッジは、ギャップまたは腔に侵入できない（皮膚のような）表面メニスカスを有する。この表面張力はまた、液体がギャップまたは腔の頂部に着座するときに作用する。しかし、大きな腔は、一般により安定でなく、そしてそれ故、ガスの泡を形成する可能性はより少ない。泡領域のための代表的な腔は、好ましくは、５０ナノメートル〜５００マイクロメートルの範囲である。深い腔は、最も安定な泡を生成する。さらに、これらの泡は、液体の温度または圧力に依存して成長または収縮するようにされ得る。泡は、溶液に代表的には数気圧の圧力を付与することにより溶液中に再吸収され得る。

上記プレートは、種々の製造方法によって産生され得る。１つの実施形態では、プレートはプラスチックから調製される。小さな腔は、ポリマーに対して浮彫りパターンを含む加熱された鋳型を押すことによりプラスチックの表面に浮彫り細工される。この金属が除去されるとき、プラスチック表面は、金属鋳型中の特徴を写す構造を含む。所望であれば、ＵＶグラフト化または上記に記載のその他の方法のようなさらなる表面処理が、親水性または細胞成長との適合性の最高の表面を作製するために付与され得る。このプレートは、それ故、ガスの腔が形成する領域、および液体が表面と直接接触するようになる領域を含む。上記に記載の実施形態に加え、表面上にパターン化された領域を構築することを含むプレートを構築し、表面中に腔をエッチングし、キャスティング、成形、微小機械加工などを行うために利用可能な多くの方法がある。これらの腔は、それが空気またはガスの安定な領域を生成し得ることを条件に、任意の形状、サイズ、および深さであり得る。例えば、マイクロメートルまたはナノメートルスケールの小さな「ヘア」が、大きな領域のトラップされた空気またはガスを生成するために用いられ得る。

好ましい実施形態の方法は、プレート上の特定の隔離された部位で細胞またはその他の生存産物のパターン化を可能にし得る。この方法は以下のようである。最初に、プレート６が、先に記載のような製造プロセスのような任意の適切な製造プロセスにより、湿潤（または材料保持）領域８および泡（または材料抑止）領域１４を含んで調製される。次いで、このプレート６は、細胞のような目的の材料５を懸濁物に含む溶液４中に配置される。泡領域１４中の腔１６は、ガスでこの領域１４をコートするガスの泡１０を形成し、ガスでコートされない領域８を隔離する。特定時間の後、細胞５は、プレート６に沈む。泡１０上に落ちる細胞５は、表面８に付着することはできない。湿潤化表面８上に落ちる細胞は、付着し、そして成長する。適切な期間の後、溶液４が洗浄され、そして清澄緩衝液で置換される。表面８に付着した細胞５は残り、その一方、泡領域１４上に残った細胞５は除去される。それ故、得られるプレート６は、図３に示される写真で描写されるように、高くされた表面８上でパターン化された形態にある細胞５を含む。

図３を参照して、この写真は、上記に記載された方法を用いてプレートの高くされた表面８上にパターン化された細胞５を示す。高くされた領域８の間には腔１６中に細胞はない。なぜなら、それらは、ガスの泡によって保護されたからである。この好ましい方法が用いられなかった場合、高くされた表面の１％未満が、それらの上に培養された細胞を有し得、そして細胞の位置は、高くされた表面間の領域にランダムに分布され得る。

本明細書中で論議される方法は、細胞またはその他の生存産物の使用を可能にし、微小機械的適用のため、または複雑な組織構造を生成するために有用であり得る三次元構造を生成する。この実施形態では、細胞は、コンフルエントまで成長される。さらなる成長に際し、細胞は、泡の上に延び、架橋構造を形成する。トラップされたガスは、細胞成長の特定の特徴を増大するよう、または所望の成長性質を産生するために選択され得る。泡が除去されるとき、残る細胞は、生存３−Ｄ組織構造を形成する。

図４を参照して、３−Ｄ構造がガスの泡を用いて細胞からどのように構築され得るのかを示す図が呈示されている。細胞がコンフルエントを超えて成長するとき、それらは、泡の上に、これらの泡が除去されるとき三次元構造を生じるブリッジを形成する。細胞成長を促進する高くされた表面２２が調製される。ガスの泡は、細胞が架橋しなければならない開口部２４を提供する。得られる組織構造は、高くされた表面２８間のスペース２４にまたがる架橋された組織２６である。

図５を参照して、上記に記載された方法を用いてプレートの高くされた表面上でパターン化された細胞を示す写真が提供される。この画像では、細胞は、空気またはガスのギャップの上で成長して三次元構造を生成して観察される。

細胞固定方法は、固化された構造を生成するように生存３−Ｄ組織構造中に分子を架橋するために用いられ得る。さらに、モノマーのような化学的添加物が組織に添加され得、次いで、重合または固化され、より強力な特徴、または特定の機械的、光学的または電気的性質をもつ特徴を作製する。この方法は、次いで非生存構造に転換される構造を構築するために生存生物を用いることを可能にする。

有機および無機両方の非生存材料がまた、このようにしてパターン化され得る。その一方、溶液中では、化学物質、化合物、ナノ粒子、またはその他の材料が沈殿され得、表面上に層を形成する。泡領域はプレートの領域を保護するために供され、その一方、非泡領域は、沈殿物が粘着することを可能にし得、パターン化された領域を形成する。この堆積された層が、十分に厚い場合、それらは、泡の上に三次元構造を形成し得る。表面上に材料を堆積する、物理的吸着、化学反応、ＵＶグラフト化などのようなその他の方法が、この技法によってすべてパターン化され得る。さらに、腔中のガスは、液体との好ましい化学反応を生成するよう選択され得る。

図６を参照して、化学材料、沈殿物、ポリマーなどから３−Ｄ構造がどのように構築され得るかを示す図が提供される。材料は、泡の上に堆積され、そして高くされた表面２２に付着される。泡は、材料が腔２４に付着することを防ぐ。この堆積が十分に厚い場合、得られる構造は、架橋構造２６を有する。ガスが液体と反応する場合、ガスの存在に起因して凝固が生じ得る。架橋が生じない場合、この結果は、材料１５のパターン化された堆積、例えば、図７に示されるような高くされた表面８の頂部上の電気メッキ金属である。本明細書中に記載されるパターン化された堆積方法は、米国出願番号第１１／２４３，９２６号および米国仮出願番号第６０／７４６，００８号に記載される除去可能なパレットの表面上のパターン化された堆積物を形成するために用いられ得、これらの出願は、本明細書中に参考として援用される。

これらの実施形態は、例示の実施例であることが意味され、そしてプレート上でガスの腔をパターン化することによって構築され得る有用なデバイスのタイプを枯渇するものではない。上記で論議されるプレートおよび方法は、制限されないで：（１）特にアレイのための、細胞アッセイ、（２）組織エンジニアリング、（３）微小機械的製作を含む種々の適用のために大きな有用性を有する。

本発明は、種々の改変、および代替の形態を受けるが、その特定の実施例は、図面中に示され、そして本明細書中で詳細に記載される。しかし、本発明は、開示される特定の形態または方法に制限されず、反対に、本発明は、添付の請求項の思想および範囲内に入るすべての改変物、等価物および代替物を包含することが理解されるべきである。

図１は、目的の材料を含む溶液内でコンテナ中に沈められた泡プレートの概略断面図である。 図２は、図１に示される泡プレートの概略平面図である。 図３は、本明細書に記載される好ましい方法を用いる泡プレートの高くされた表面上でパターン化された細胞を示す写真である。 図４は、一時的足場としてガスの泡を用い、３−Ｄ構造が細胞からどのように構築され得るのかを示す泡プレートの概略断面図である。 図５は、本明細書に記載される好ましい方法を用い、泡プレートの高くされた表面上でパターン化され、そしてこのプレートの腔上を延びる細胞を示す写真である。 図６は、一時的足場としてガスの泡を用い、３−Ｄ構造が化学的材料、沈殿物、ポリマーなどからどのように構築され得るのかを示す泡プレートの概略断面図である。 図７は、本明細書に記載される好ましい方法を用い、泡プレートの高くされた表面上でパターン化されたコーティング材料を示す泡プレートの概略断面図である。

Claims (33)

1. 微小パターン化プレートであって、
   該プレートを液体中に沈める際に、該液体と接触する表面を備える複数の湿潤領域、および
   該湿潤領域に隣接し、そして該湿潤領域の各々を互いから隔離する１つ以上の連続的トラップガス領域であって、該プレートを液体中に沈める際に、該液体と接触しない表面を含むトラップガス領域、を備える、プレート。
2. 前記トラップガス領域が、幾何学的パターンにある隔離された湿潤領域を形成する、請求項１に記載のプレート。
3. 前記幾何学的パターンが、アドレス化可能な、請求項２に記載のプレート。
4. 前記幾何学的パターンが、アレイを形成する、請求項２に記載のプレート。
5. 前記トラップガス領域が、前記プレート中に形成され、そしてガスをトラップするような形態である腔を備える、請求項１に記載のプレート。
6. 前記腔が、約５０ナノメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の寸法を有する、請求項５に記載のプレート。
7. 前記湿潤領域が前記腔に隣接する高くされた表面を有する、請求項５に記載のプレート。
8. 前記高くされた表面が、前記プレートから取り外し可能である、請求項７に記載のプレート。
9. 前記腔の表面が、液体撥水材である、請求項５に記載のプレート。
10. 前記腔の表面が、液体撥水疎水性である、請求項５に記載のプレート。
11. 前記湿潤領域の表面が、親水性である、請求項１０に記載のプレート。
12. 複数の湿潤および泡領域を有する微小パターン化プレートを形成する方法であって、
    プレートの本体を形成する工程、および
    該本体中に複数の腔および複数の湿潤表面を形成する工程であって、該本体が液体中に沈められるとき、または該液体が該本体上に注がれて該湿潤表面を互いから隔離するとき、該複数の腔がガスをトラップする工程、を包含する、方法。
13. 前記本体が、成形可能な材料から形成され、そして前記腔を形成する工程が、該本体に対する浮彫りパターンを備える加熱鋳型を押すことを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記湿潤表面が親水性であり、そして前記腔の表面が疎水性である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記湿潤表面を、該表面を疎水性にするために処理する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
16. 前記湿潤表面を、該表面を細胞成長と適合性にするために処理する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
17. 前記腔の表面を、該表面を疎水性にするために処理する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
18. 前記湿潤表面が、幾何学的パターンで配列される、請求項１２に記載の方法。
19. 前記幾何学的パターンが、アドレス化可能である、請求項１８に記載のプレート。
20. 前記幾何学的パターンが、アレイを形成する、請求項１８に記載のプレート。
21. プレート上の特定部位で目的の材料をパターン化する方法であって、
    該プレートを、目的の材料を懸濁物で含む溶液中に沈める工程、
    該目的の材料を、該プレートの本体上の第１の複数の所定の部位に付着する工程、
    該第１の複数の所定の部位の各々を互いから隔離する工程、および
    該目的の材料を、第２の複数の所定部位に付着することを防ぐ工程、を包含する、方法。
22. 前記防ぐ工程が、前記プレートの表面を、前記第２の複数の所定の部位でコートするガスの泡を形成することを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記隔離する工程が、前記プレートの表面を、前記第２の複数の所定の部位でコートするガスの泡を形成することを含む、請求項２１に記載の方法。
24. 前記ガスの泡を形成する工程が、前記プレートが液体中に沈められるとき複数の腔中にガスをトラップする工程を含む、請求項２２に記載の方法。
25. 前記材料が、細胞、組織、または生存生物である、請求項２１に記載の方法。
26. 前記材料が、コーティング材料である、請求項２１に記載の方法。
27. 前記コーティング材料が、ポリマーである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記コーティング材料が、電気メッキ金属である、請求項２６に記載の方法。
29. 前記第２の複数の所定の部位上の材料から複数のブリッジを形成する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
30. 前記第２の複数の所定の部位を前記材料と架橋することにより三次元構造を形成する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
31. 前記材料が生存組織であり、そして前記ブリッジを形成する工程が、前記第２の複数の所定の部位上で該材料を成長することを含む、請求項２９に記載の方法。
32. 前記生存組織を、非生存材料に変換する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
33. 前記材料にモノマーを添加する工程、および該モノマーのコンポジット材料を重合する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。

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