KR20080091827A - 생물유사 스캐폴드 - Google Patents

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KR20080091827A
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샤얌 파텔
크레이그 하시
응안 퐁 황
카일 쿠르핀스키
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Abstract

본 발명은 나노섬유 중합체의 섬유가 정렬되고 분자가 상기 나노섬유 중합체에 직접적으로나 링커를 통해 공유결합되는 나노섬유 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 분자는 세포외 기질 성분, 성장 인자 및 이들의 조합 중에서 선택되는 일원에 공유적으로나 비-공유적으로 부착될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 제조하는 방법 및 피검체, 예를 들어 사람에게 새로운 조직을 가하기 위해 상기 조성물을 이용하는 방법을 제공한다.
Figure P1020087021025
섬유 중합체 스캐폴드, 나노섬유, 마이크로섬유, 정렬

Description

생물유사 스캐폴드{BIOMIMETIC SCAFFOLDS}
연관 출원의 상호 참조
본원은 미국 특허 가출원 번호 제60/861,780호 (2006년 11월 30일 출원), 제60/804,350호 (2006년 6월 9일 출원) 및 제60/763,111호 (2006년 1월 27일 출원) (이들 문헌이 모든 점에서 전부 본원에 참조로 삽입됨)을 우선권으로 주장한다.
당해 기술 분야에서는 피검체에서의 생물학적 기능을 대신하거나 개선시킬 수 있는 조성물이 필요하다. 또한, 당해 기술 분야에서는 피검체에서 새로운 조직의 성장을 촉진하거나 손상된 조직을 대체할 수 있는 조성물이 필요하다. 본원에 기술된 발명에 의해 이러한 요구 및 기타 요구가 검토된다.
발명의 요지
제1 양태에서, 본 발명은 제1 섬유 중합체 스캐폴드를 포함하고 제1 섬유 중합체 스케폴드의 섬유 또는 섬유들이 정렬되어 있는 조성물을 제공한다. 예시적 양태에서, 상기 제1 섬유 중합체 스케폴더의 길이는 약 0.01 cm 내지 약 20 cm, 약 0.05 cm 내지 약 5 cm, 약 0.5 cm 내지 약 5 cm, 약 1 cm 내지 약 5 cm, 약 2 cm 내지 약 5 cm, 약 1 cm 내지 약 3 cm, 약 2 cm 내지 약 10 cm, 및 약 5 cm 내지 약 15 cm 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 조성물의 형태는 시트, 도관, 충전된 도관 및 막대 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 조성물의 형태는 도관, 충전된 도관 및 막대 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 조성물은 막태 형태이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 본질적으로 세로 방향 및 원주 방향 중에서 선택되는 일원인 방향으로 정렬된다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 이은 자리 (seam)를 갖는다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 이은 자리를 갖지 않는다 (seamless). 또 다른 예시적 양태에서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 통채로 (monolithically) 형성된다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 하나 이상의 섬유는 지방족 폴리에스테르, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리디메틸실록산, 폴리카프롤락톤, 폴리리신, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 알기네이트, 피브린, 하이알루론산, 프로테오글리칸, 폴리펩타이드 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원인 중합체 또는 서브유닛을 포함한다. 또다른 예시적 양태에서, 상기 지방족 폴리에스테르는 락트산 (D- 또는 L-), 락타이드, 폴리(락트산), 폴리(락타이드) 글리콜산, 폴리(글리콜산), 폴리(글리콜라이드), 글리콜라이드, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(락트산-코-글리콜산) 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유 중 하나 이상은 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA)를 포함한다.
또 다른 예시적 양태에서, 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 폴리에틸렌 옥사이 드, 폴리프로필렌 옥사이드 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 세포를 추가로 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 세포는 제1 섬유 중합체 스캐폴드 내에 삽입되거나 표면에 존재한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 세포는 줄기 세포 및 전구 세포 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 세포는 성체 혈관 세포, 혈관 전구 세포, 혈관 줄기 세포, 성체 근육 세포, 근육 전구 세포, 근육 줄기 세포, 성체 신경 세포, 신경 전구 세포, 신경 줄기 세포, 슈반 (Schwann) 세포, 섬유아세포, 성체 피부 세포, 피부 전구 세포, 및 피부 줄기 세포 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 상기 제1 스캐폴드에 직접적으로나 링커를 통해 공유적으로 부착되는 분자를 추가로 포함하고, 상기 분자는 세포외 기질 성분, 성장 인자, 분화 인자 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원에 공유적으로나 비공유적으로 부착될 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 분자는 링커를 통해 공유적으로 부착되고, 상기 링커는 디-아미노 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 글리콜) 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 분자는 헤파린, 헤파란 설페이트, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 세포외 기질 성분은 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 비트로넥틴, 피브리노겐, 폴리리신 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 성장 인자는 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 뇌-유도된 향신경성 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 전환 성장 인자 베타, 혈관 내피 성장 인자, 표피 성장 인자,각질형성세포 성장 인자 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 분화 성장 인자는 간질세포 유도된 인자, 소닉 헤지호그 (sonic hedgehog), 골 형태형성 단백질, 노치 리간드 (notch ligand), Wnt 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 도관, 충전된 도관 또는 막대 형태이고, 상기 중합체는 이은 자리가 없다.
또 다른 예시적 양태에서, 상기 조성물은 중합체를 포함하는 중합체 용액을 회전 심축 (mandrel)에 적용시킴으로써 생성된다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 중합체 스캐폴드는 시트, 도관 또는 충전된 도관 형태이고, 하나 이상의 비-전도 영역을 갖는 회전 심축을 포함하는 전기방사 공정으로 생성된다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 중합체 스캐폴드는 막대 형태이고, 에어 갭 (air gap)을 갖는 회전 심축을 포함하는 전기방사 공정에 의해 생성된다.
또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 (a) 상기된 조성물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 조성물은 막대 또는 도관이고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유 중 하나 이상은 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA)를 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 조성물의 길이는 약 0.5 cm 내지 50 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 제1 섬유 중합체 스캐폴드를 둘러싸는 슬리브를 추가로 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 슬리브는 제2 섬유 중합체 스캐폴드을 포함하고, 상기 제2 섬유 중합체 스캐폴드는 정렬되거나 임의 배향을 갖는다. 또 다 른 예시적 양태에서, 본 발명은 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 제1 말단을 둘러싸는 제1 슬리브 및 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 제2 말단을 둘러싸는 제2 슬리브를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 상기 조성물을 피검체의 목적하는 부위에 상해를 치료하기에 충분한 양 및 조건 하에 적용시키는 것을 포함하여, 피검체의 상해를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 상해는 심각한 신경, 손상된 신경, 심각한 근육, 손상된 근육, 심각한 혈관, 손상된 혈관, 피부 손상 및 멍든 피부 상해 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 상해는 심각한 신경 상해를 수반하고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 제1 말단 및 제2 말단을 포함하는 도관, 충전된 도관 또는 막대 형태이고, 상기 심각한 신경 상해는 제1 신경 스텀프 (stump) 및 제2 신경 스텀프를 포함하며, 상기 적용은 (ii) 상기 조성물의 제1 말단을 제1 신경 스텀프에 부착시키고; (iii) 상기 조성물의 제2 말단을 제2 신경 스텀프에 부착시키는 것을 포함한다.
또 다른 예시적 양태에서, 상기 상해는 손상된 신경 상해를 수반하고, 상기 적용은 (ii) 상기 조성물을 손상된 신경 상해 주위에 감싸는 것을 포함하며, 상기 조성물은 시트 형태이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 상해는 손상된 신경 상해를 수반하고, 상기 적용은 (ii) 상기 조성물을 손상된 신경 상해에 삽입하는 것을 포함하며, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 막대, 도관 또는 충전된 도관 형태이다. 또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 (i) 상기 조성물을 피검체의 목적하는 신경 부위에 신경 성장을 향상시키기에 충분한 양 및 조건 하에 적용시키는 것을 포함하여, 피검체의 신경 성장을 향상시키는 방법을 제공한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 상해는 절개된 피부 또는 멍든 피부를 수반하고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 시트 형태이며, 상기 적용은 (i) 상기 조성물을 절개된 피부에 부착시켜 상해를 치료하는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 시트 형태이고, (i) 상기 조성물을 피검체의 목적하는 피부 부위에 피부 성장을 향상시키기에 충분한 양 및 조건 하에 적용시키는 것을 포함하는, 피검체의 피부 성장을 향상시키는 방법을 제공한다.
또 다른 예시적 양태에서, 상기 상해는 심각한 혈관 상해를 수반하고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 제1 말단 및 제2 말단을 포함하는 도관 또는 충전된 도관 형태이고, 상기 심각한 혈관 상해는 제1 혈관 스텀프 및 제2 혈관 스텀프를 포함하며, 상기 적용은 (ii) 상기 조성물의 제1 말단을 제1 혈관 스텀프에 부착시키고; (iii) 상기 조성물의 제2 말단을 제2 혈관 스텀프에 부착시키는 것을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 상기 조성물을 피검체의 목적하는 혈관 부위에 혈관 성장을 향상시키기에 충분한 양 및 조건 하에 적용시키는 것을 포함하여, 피검체의 혈관 성장을 향상시키는 방법을 제공한다.
또 다른 예시적 양태에서, 상해는 심각한 근육 상해를 수반하고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 제1 말단 및 제2 말단을 포함하는 도관, 충전된 도관 또는 막대 형태이고, 상기 심각한 근육 상해는 제1 근육 스텀프 및 제2 근육 스텀프를 포함하며, 상기 적용은 (ii) 상기 조성물의 제1 말단을 제1 근육 스텀프에 부착시키고; (iii) 상기 조성물의 제2 말단을 제2 근육 스텀프에 부착시키는 것을 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 상해는 손상된 근육 상해를 수반하고, 상기 적용은 (ii) 상기 조성물을 손상된 근육 상해 주위에 감싸는 것을 포함하며, 상기 조성물은 시트 형태이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 상해는 손상된 근육 상해를 수반하고, 상기 적용은 (ii) 상기 조성물을 손상된 근육 상해에 삽입하는 것을 포함하며, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드는 막대, 도관 또는 충전된 도관 형태이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 상기 조성물을 피검체의 목적하는 근육 부위에 근육 성장을 향상시키기에 충분한 양 및 조건 하에 적용시키는 것을 포함하여, 피검체의 근육 성장을 향상시키는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 방법은 (i) 섬유 또는 섬유들을 전기방사 공정에 적용시켜 상기 조성물을 제조함을 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 전기방사 공정은 에어 갭 또는 하나 이상의 비-전도 영역을 갖는 회전 심축을 포함한다.
제2 양태에서, 본 발명은 제1 전기 전도 영역; 제2 전기 전도 영역; 및 제1 전기 전도 영역과 제2 전도 영역 사이에서 연장되는 비-전기 전도 영역을 포함하고, 상기 비-전기 전도 영역은 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 형성을 위한 섬유 중합체를 수령하는 치수 및 배치를 갖는, 전기방사 장치를 위한 심축을 제공한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 비-전기 전도 영역은 심축 주위에 놓인 슬리브이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 비-전기 전도 영역은 테이프, 전기 테이프, 테플론 및 플라스틱 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 비-전기 전도 영역은 2개의 전도 심축 영역을 서로 연결한다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 비-전기 전도 영역은 2개의 전도 심축 영역 사이에서 연장되는 분리된 부분이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 비-전기 전도 영역은 테플론 및 플라스틱 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 비-전도 전도 영역의 직경은 상기 전기 전도 영역보다 큰 직경 및 작은 직경 중에서 선택되는 일원이다.
제3 양태에서 본 발명은 제1 전기 전도 영역 및 제1 전기 전도 영역을 포함하고, 제1 전기 영역과 제2 전기 전도 영역 사이에 위치된 에어 갭이 제1 전기 전도 영역과 제1 전기 전도 영역 사이의 비-전도 영역을 형성하는 심축을 제공한다. 또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 제1 전기 전도 부분의 적어도 일부분 위에 위치된 제1 비-전기 전도 슬리브, 및 제2 전기 전도 부분의 적어도 일부분 위에 위치된 제2 비-전기 전도 슬리브를 추가로 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 비-전도 영역을 갖는 심축은 전기방사 시스템과 조합된다. 또 다른 예시적 양태에서, 에어 갭을 갖는 심축은 전기방사 시스템과 조합된다.
도 1은 심축 (56A)을 갖는 전기방사 장치의 도식도이다.
도 2는 심축 (56A)을 갖는 전기방사 장치의 투시도이다.
도 2A는 중합체 스캐폴드 (90)를 형성하는 심축 (56A)를 갖는 전기방사 장치의 일부를 나타낸다.
도 2B는 중합체 스캐폴드 (90)를 형성하는 심축 (56A)를 갖는 전기방사 장치의 일부를 나타낸다.
도 3은 섬유 중합체 스캐폴드의 제조에 사용되는 다양한 심축 디자인을 나타낸다. (A) 전체 표면이 전도되는 심축 (56); (B) 제1 전도 영역 (57A), 제2 전도 영역 57(B), 비-전도 영역 (55), 제1 경계면 (55A), 및 제2 경계면 (55B)를 갖는 심축 (56A); (C) 비전도 영역 (55)이 2개의 전도 심축 영역을 서로 연결하는 심축 (56A)의 단면도; (D) 비전도 영역 (55A)이 전도 영역 (57)의 표면의 일부를 감싸는 슬리브인 심축 (56A)의 단면도; (E) 제1 전도 영역 (57A), 제2 전도 영역 (57B), 제1 전도 영역면 (57C), 제2 전도 영역면 (57D)을 갖는 심축 (56B). 전도 영역은 에어 갭 (58)에 의해 분리된다.
도 4A는 세로 방향으로 정렬된 마이크로/나노섬유로 구성된 도관형 중합체 스캐폴드를 나타낸다. 도 4B는 세로 방향으로 정렬된 마이크로/나노섬유로 구성된 막대형 중합체 스캐폴드를 나타낸다. 주: 섬유 크기를 일정한 비율로 나타내지 않음
도 5A는 도 4A의 도관에 대한 단면도를 도시한다. 도 5B는 도 4B의 막대에 대한 단면도를 도시한다.
도 6은 심축 (56B)을 갖는 전기방사 장치의 도식도이다.
도 7은 심축 (56B)을 갖는 전기방사 장치의 투시도이다.
도 7A는 중합체 스캐폴드 (92)를 형성하는 심축 (56B)을 갖는 전기방사 장치의 일부를 나타낸다.
도 8은 세로 방향으로 정렬된 중합체 스캐폴드 시트 (96)를 나타낸다.
도 9는 정렬된 중합체 스캐폴드 시트로부터 이은 자리를 갖는 섬유 중합체 도관을 제조하는 회전 공정을 나타내는 도식적 다이아그램이다. 여기서, 세포로 정렬된 중합체 스캐폴드 시트는 막대 (97) 주위로 회전된 후, 봉합되거나 접착된다.
도 10은 정렬된 시트 (96) 및 (100)를 포함하는 '십자방향' 시트 (102)을 나타낸다.
도 11은 심축 (56B)을 갖는 다수의 방적돌기 전기방사 장치 (110)의 도식도이다. 중합체 용액 (38), (38A) 및 (38B)은 용매에 용해된 중합체를 포함하고, 시린지 어셈블리 (36), (36A) 및 (36B) 각각에 포함된다. 시린지 어셈블리는 컴퓨터 (34)가 압력 또는 유속을 조절함으로써 시린지를 빠져나가는 중합체 용액의 속도를 조절하는 시린지 펌프 어셈블리 (32)의 일부이다. 임의로, 상이한 유속이 선택된 방적돌기에 제공되고 조절될 수 있다. 유속은 중합체 스캐폴드의 목적하는 물리적 특성, 즉 막 두께, 섬유 직경, 세공 크기, 막 밀도 등에 따라 달라질 것이다.
시린지 펌프 어셈블리 (32)는 플랫폼 (44)에 놓인 방적돌기 (42), (42A) 및 (42B)에 중합체 용액을 공급한다. 방적돌기는 방해 없이 제트 형성 및 운반을 가능하게 하는 팁 (tip) 기하학을 갖는다. 약 10 내지 약 30 kV 범위의 하전이 와이어 (41A)를 통해 고전압 전원 (48)에 의해 방적돌기에 적용된다.
심축 (56B) (이는 도 3B에서 설명한 바와 같이, (57A), (57B) 및 (58)을 포함한다)은 전기장이 하전된 방적돌기와 심축 (56A) 사이에 발생되도록 방적돌기 (42), (42A) 및 (42B) 사이에 위치된다. 전기장은 중합체 용액의 제트가 방적돌기로부터 분출되고 심축 (56B)을 향해 분무되도록 하여 마이크론 또는 나노미터 직경의 필라멘트 또는 섬유 (46), (46A) 및 (46B)을 형성한다. 접지선 (41B) 및 (41C)를 사용하여 드릴 척을 접지시킨다.
심축 (56B)은 모터 (52)에 연결된 제1 드릴 척 (54) (비-전도 베어링 (60)에 부착됨) 및 제2 드릴 척 (54A) (비전도 베어링 (60A)에 부착됨)에 부착된다. 모터 (52)는 모터가 심축 (56B)을 회전시키는 속도를 조절하는 속도 조절기 (50A)에 연결된다. 임의로, 상이한 회전 속도가 제공될 수 있다. 회전 속도는 중합체 스캐폴드의 목적하는 물리적 특징, 즉 막 두께, 섬유 직경, 세공 크기, 막 밀도 등에 따라 변화할 것이다.
도 12는 비정렬된 (A) 및 정렬된 (B) PLLA 나노섬유의 SEM 이미지이다. (C) 헤파린으로의 PLLA 나노섬유의 화학적 변형 및 bFGF 및 라미닌의 비공유적 부착을 도시한다. 변형된 ELISA 기술을 이용하여 비처리, 디-NH2-PEG 변형, 및 헤파린 기 능화된 (functionalized) PLLA 나노섬유 (D) 및 폴리(아크릴산) 코팅된 폴리스티렌 표면 (E)에 대한 bFGF 부착의 상대적 수준을 나타낸다.
도 13은 비정렬된 나노섬유에 대한 DRG 조직으로부터의 신경돌기 연장을 도시한다. 신경필라멘트에 대한 면역형광 염색을 이용하여 생체 외 배양 6일 후 비처리, LAM 및 LAM+bFGF 비정렬된 나노섬유에 대한 DRG 조직으로부터의 신경돌기 연장을 시각화한다. 눈금자 막대 = 200 μm.
도 14는 정렬된 나노섬유에 대한 DRG 조직으로부터의 신경돌기 연장을 도시한다. 신경필라멘트에 대한 면역형광 염색을 이용하여 생체 외 배양 6일 후 비처리, LAM 및 LAM+bFGF 정렬된 나노섬유에 대한 DRG 조직으로부터의 신경돌기 연장을 가시화한다. 눈금자 막대 = 200 μm.
도 15는 비정렬 및 정렬된 LAM+bFGF PLLA 나노섬유에 대한 신경돌기 형태의 고배율 공초점 현미경 검사 이미지이다. 정렬된 나노섬유는 수직 방향이다.
도 16은 사람 중간엽 줄기 세포가 1, 3 또는 6일 동안 PLLA 마이크로/나노섬유 막서 펠렛으로서 배양된 결과를 도시한다. 비정렬된 마이크로/나노섬유는 시간의 경과에 따라 조금씩 이동하며 무작위 정렬을 보인다. 정렬된 마이크로/나노섬유 상의 세포는 3일 및 6일에 섬유 방향으로 증진된 이동을 나타낼 뿐만 아니라 섬유 방향으로의 전체적인 정렬을 나타낸다. 눈금자 막대 = 200 μm.
도 17은 다양한 세포 타입을 사용한 마이크로/나노섬유 스캐폴드에서의 상처 치유 모델을 나타낸다. MSCs: 2일 후의 중간엽 줄기 세포. FFs: 5일후의 포레스킨 섬유아세포. ECs: 1일 후의 내피 세포. 비정렬된 마이크로/나노섬유 스캐폴드 에서, 상처 보호 범위는 최소 (MSC 샘플) 내지 중간 (EC 샘플)이다. 마이크로/나노섬유를 상처 길이 축 (A-Para)에 평행하게 정렬하는 경우, 상처로의 세포 이동은 심하게 손상된다. 마이크로/나노섬유가 상처 길이 축에 대해 수직으로 정렬되는 경우, 세포 이동 및 상처 보호 범위가 가장 크다.
도 18은 액틴 (팔로이딘) 및 핵 (프로피듐 요오다이드)에 대한 형광 염색을 도시하며, (A) 자연적인 생체 내 일반적 목동맥에 대한 평활근 세포 배향과 (B) 사람 평활근 세포로 씨딩된 정렬된 나노섬유 중합체 시트 사이의 유사한 세포골격 구조를 입증한다.
도 19는 나노섬유의 줄기 세포 삽입된 혈관 이식편의 제작을 도시한다. (A) 줄기 세포가 생물분해성 나노섬유의 정렬된 시트에 씨딩된다. (B) 튜브 구조가 막대 주위로 시트를 회전시킴으로써 형성된다. (C) 막대를 제거하고 봉합술을 이용해 이식편의 형태를 유지시킨다.
도 20은 혈관 이식편 및 래트 동맥이 단면에 대한 페르훼프 (Verhoeff) 염색을 도시한다. 콜라겐 (적색) 및 엘라스틴 (검정) 섬유 생성이 1 내지 3주에 상당히 개선된다. 3주에 조직 조작된 혈관 이식편은 천연 래트 동맥과 강한 유사성을 갖는다.
도 21은 이식 3주 후 혈관 이식편에서의 CD31 (내피 세포 마커)에 대한 단면의 면역조직화학 염색 (갈색)을 나타낸다. (A) 래트 동맥. (B) 3주 후의 혈관 이식편.
도 22는 이식 3주 후 혈관 이식편에서의 α-액틴 (평활근 마커)에 대한 단면 의 면역조직화학 염색 (갈색)을 나타낸다. (A) 래트 동맥. (B) 3주 후의 혈관 이식편.
도 23은 근아세포가 비정렬된 또는 비-패턴화된 표면에서 성장하는 경우 근아세포가 임의 방식으로 모양을 이루고, 정렬된 나노섬유 또는 미세패턴화된 표면에서 성장하는 경우 정렬된 방식으로 모양을 이루는 것을 도시한다.
도 24는 정렬된 PLLA 나노섬유 스캐폴드에서의 근아세포 정렬 및 근관 어셈블리를 도시한다. SEM 이미지는 (A) 임의 배향된 스캐폴드 및 (B) 정렬된 나노섬유 스캐폴드의 구조를 나타내고, 분화 배지에서의 3일 후 (C) 임의로 배향된 스캐폴드 및 (D) 정렬된 나노섬유 스캐폴드에서의 근아세포에 대한 F-액틴 면역형광 염색을 나타낸다. 골격 MHC에 대한 면역형광 염색은 3일 (E, F) 및 7일 (G, H)에 임의 (E, G) 및 정렬된 (F, H) 나노섬유 스캐폴드에서의 근관 나타내도록 수행되었다. 7일 후 (I) 임의로 배향된 기판 및 (J) 정렬된 기판에서의 골격 MHC 염색에 대한 저배율 융합 이미지는 근관에 대한 전체적인 정렬 및 길이를 나타낸다. 화살표는 나노섬유의 방향을 나타낸다. E 및 F에서의 화살표 촉은 핵을 나타낸다. 눈금자 막대는 각각 50 μm (A-H) 및 100 μm (I, J)이다.
도 25는 정렬된 나노섬유 기판에서의 근관 체계 및 형태를 정량화한다. (A) 나노섬유 방향에 관한 근관 정렬각. (B) 7일 후 근관 길이. (C) 7일 후 근관 폭. *는 통계학적으로 유의한 차이 (P<0.05)를 나타낸다.
도 26은 정렬된 나노섬유 스캐폴드에 대한 근아세포 증식 및 근관 줄무늬를 정량화한다. (A) 세포 증식을 위한 BrdU 삽입 (R, 임의; A, 정렬). (B) 정렬된 나노섬유 스캐폴드에서 줄무늬의 근관을 나타내는 항-MHC의 면역형광 염색 (눈금자 막대: 20 μm). (C) 7일 후 줄무늬 세포의 백분율을 정량화한다. *는 통계학적으로 유의한 차이 (P<0.05)를 나타낸다.
도 27은 미세패턴화된 PDMS 기판에서의 근아세포 정렬 및 근관 체계를 나타낸다. (A) SEM (측면도) 및 (B) 위상차 현미경 검사에 의해 미세패턴화된 PDMS 기판을 나타낸다. (C) 비-패턴화된 기판 및 (D) 미세패턴화된 기판에서의 분화 배지 중 2일 후의 F-액틴 분포를 나타낸다. 골격 MHC의 면역형광 염색은 2일 (E-F) 및 7일 (G-H) 후 비-패턴화된 막 (E, G) 및 미세패턴화된 막 (F, H)에서의 세포 융합을 나타내기 위해 수행하였다. 화살표는 미세홈의 방향을 나타낸다. 눈금자 막대는 각각 5 μm (A), 20 μm (B) 및 50 μm (C-H)이다.
도 28은 미세패턴화된 막에서의 근관 체계 및 형태를 정량화한다. (A) 비-패턴화된 막 (Con) 및 미세패턴화된 막 (Pat)에서의 미세홈에 대한 근관 정렬각. (B) 7일 후 근관 길이. (C) 7일 후 근관 폭. *는 통계학적으로 유의한 차이 (P<0.05)를 나타낸다.
도 29는 미세패턴화된 PDMS 막에서의 근아세포 증식 및 줄무늬를 정량화한다. (A) 비-패턴화된 막 (Con) 및 미세패턴화된 막 (Pat)에서의 초기 단계 융합에서 세포 증식을 위한 BrdU 삽입. (B) 7일 후 줄무늬 세포의 백분율에 대한 정량화. *는 통계학적으로 유의한 차이 (P<0.05)를 나타낸다.
도 30은 나노섬유 스캐폴드에서의 근관 형성에 대한 SEM 이미지이다. (A) 임의 배향된 PLLA 나노섬유 스캐폴드 및 (B) 정렬된 PLLA 나노섬유 스캐폴드에서의 분화 배지 중 7일 후의 근관 정렬. (눈금자 막대: 50 μm).
도 31은 미세패턴화된 생분해성 PLGC 기판에서의 근아세포 정렬을 나타낸다. (A) PLGC 기판에서의 지형학적으로 미세패턴화된 홈의 SEM 이미지. (B-C) 비-패턴화된 PLGC 기판 (B) 및 미세패턴화된 PLGC 기판 (C)에서의 분화 배지 중 5일 후의 근아세포의 F-액틴 염색. 미세패턴화된 PLGC 기판에서의 정렬되고 체계화된 액틴 스트레스 섬유를 주목한다. 눈금자 막대는 각각 10 μm (A) 및 50 μm (B)이다.
도 32는 3차원의 근섬유-씨딩된 관모양 스캐폴드를 제조하기 위한 회전 공정을 나타내는 도식적 다이아그램이다. 근아세포는 정렬된 나노섬유의 막에서 정렬된 근관으로 분화되었다. 분화 7일 후, 시트는 막대 기둥을 갖는 관모양 스캐폴드로 회전되고 봉합되었다.
도 33은 저배율 (좌측) 및 고배율 (우측)로 3차원의 관모양 나노섬유 스캐폴드의 체계화를 도시하는 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 나타낸다.
도 34는 단면 양상 (A) 및 길이-축 양상 (B)으로 3차원의 관모양 나노섬유 스캐폴드에서의 근아세포 및 근관의 세포 형태를 나타내는 레이저 공초점 현미경 검사를 도시한다. 샘플은 F-액틴 (녹색) 및 핵 (적색)에 대해 면역형광법으로 염색되었다.
도 35는 정렬되거나 비정렬된 섬유에서의 시험관 내 상처 치유 모델에 대한 도식도이다. (A) 마이크로/나노섬유가 비정렬 섬유 또는 상처의 긴 가장자리에 대해 평행하게 또는 수직으로 배향될 수 있는 정렬 섬유를 갖는 메쉬로서 제조된다. (B) 납작하게 된 18 게이지 주사기 바늘이 세포 부착을 차단하기 위해 나노섬유 메 쉬에 놓인다. (C) 세포를 나노섬유 메쉬에 씨딩한다. (D) 세포가 나노섬유에 부착한 후, 바늘을 제거하여 세포가 상처로 이동하게 한다.
도 36은 비정렬된 나노섬유에 대한 정렬된 나노섬유에서의 NHDF를 갖는 시험관내 상처 치유 모델을 나타낸다. 48시간 후, 비정렬된 마이크로/나노섬유에 있는 NHDF (A)는 중간 정도의 이동 및 상처 보호, 및 임의의 세포 정렬을 나타낸다. 섬유가 상처의 가장자리에 대해 수직으로 정렬되는 경우 (B), 이동 및 상처 보호 범위가 크게 향상되며, 세포는 섬유와 함께 정렬된다. 섬유가 상처의 가장자리에 대해 평행하게 정렬되는 경우 (C), 상처 보호 범위는 크게 감소된다. 염색은 전체 액틴 (녹색) 및 훽스트 (Hoechst) 핵 염색 (청색)이다. 흰색 점선은 0시간에서이 초기 상처 가장자리를 나타낸다. 눈금자 막대는 300μm이다.
도 37은 화학적 변형을 갖거나 갖지 않는 정렬된 마이크로/나노섬유에서의 NHDF를 갖는 시험관 내 상처 치유 모델을 나타낸다. 모든 그룹에서, 마이크로/나노섬유는 상처의 길이 방향 가장자리에 대해 수직으로 배향되었다. 24시간 후, NHDF는 추가의 화학적 변형을 갖는 섬유 상에서 향상된 이동 및 상처 보호 범위를 나타내었다. 비처리된 섬유에서, 세포는 상처 부위를 완전히 보호하지 못하였다. 라미닌을 섬유에 가하는 경우, 세포는 보다 빠르게 이동하였다. 기용성 형태 또는 마이크로/나노섬유에 고정된 형태로의 bFGF의 첨가는 이동을 보다 더 향상시켰다. 염색은 전체 액틴 (녹색) 및 핵 (청색) 염색이다. 흰색 점선은 0시간에서의 초기 상처 가장자리를 나타낸다. 눈금자 막대는 300 μm이다.
도 38은 다층 마이크로/나노섬유 조직 이식편의 어셈블리를 나타낸다. 개개 의 마이크로/나노섬유 시트가 복합 건축물을 갖는 구조물을 만들기 위해 각각의 시트의 상단에 놓일 수 있다. 본 도면은 십자방향 섬유 구조를 갖는 이식편의 어셈블리를 나타낸다. 각각의 개별 시트의 섬유 배향에 따라 추가의 건축물이 제조될 수 있다.
도 39는 미세패턴화된 중합체 필름의 제작을 도시한다. (A) 네가티브 포토레지스트가 실리콘 웨이퍼에 스핀-코팅되고 포토마스크를 통해 UV 광에 노출되었다. (B) UV-중합화가 없는 포토레지스트가 현상되어 제거됨으로써 패턴화된 표면이 생겼다. (C) 중합체 용액을 웨이퍼에 캐스팅하고, 스핀-코팅한 후, 중합화시켰다. (D) 이어서 필름을 실리콘 웨이퍼로부터 벗겨내었다.
도 40은 다수 세포 타입 이식편을 나타낸다. (A) 정렬되거나 임의 배향된 나노섬유 시트. (B) 시트의 상이한 부위에 다수 세포 타입 씨딩. (C) 이식편의 상이한 위치에 있는 다수 세포 타입을 갖는 관모양 구조물의 제조.
도 41은 회전 드럼 수집기를 갖는 본 발명에 따른 전기방사 장치를 도시한다.
I. 정의 및 약어
본원에 사용된 약어는 일반적으로 화학 및 생물 분양에서의 통상의 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 것으로서, 단수 형태의 표현들 "하나 (a)", "및 (and)", 및 "상기 (the)"는, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 복수의 인용을 포함한다.
본원에서 사용되는 것으로서, 달리 언급이 없는 한, 임의의 성분이 "본질적으로 없는" 조성물이란, 이 조성물이 임의의 성분을 약 20 중량% 미만, 예를 들어 약 10 중량% 미만, 약 5 중량% 미만, 또는 약 3 중량% 미만으로 포함하는 것을 의미한다.
"펩타이드"는 단량체가 아미노산이고 아미드 결합을 통해 함께 연결되는 중합체를 말하며, 달리는 폴리펩타이드로 언급된다. 또한, 비천연 아미노산, 예를 들어 β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌도 포함될 수 있다. 유전자-암호화되지 않는 아미노산도 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 반응성 그룹, 글리코실화 부위, 중합체, 치료적 잔기, 생물분자 등을 포함하도록 변형된 아미노산도 본 발명에 포함될 수 있다. 본 발명에 사용되는 모든 아미노산은 D- 또는 L-이성체일 수 있다. 또한, 다른 펩타이드유사체 (peptidomimetics)도 본 발명에 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 것으로서, "펩타이드"는 글리코실화 펩타이드 및 비글리코실화 펩타이드 모두를 언급한다. 또한, 펩타이드를 발현시키는 시스템에 의해 불완전하게 글리코실화되는 펩타이드도 포함된다. 일반적인 고찰을 위해 문헌 [참조: Spatola, A. F., Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)]을 참조한다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산 및 합성 아미노산뿐만 아니라 천연 발생의 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 동족체 (analogs) 및 아미노산 유사체 (mimetics)를 언급한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화되는 아미노산뿐만 아니라 후에 변형되는 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포린을 포함한다. 아미노산 동족체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소에 결합된 α탄소, 카복실 그룹, 아미노 그룹 및 R 그룹을 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르루이신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 언급한다. 이러한 동족체는 변형된 R 그룹 (예: 노르루이신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 가지나, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 유사체는 아미노산의 일반적 화학 구조와는 상이하나 천연 발명 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 구조를 갖는 화학적 화합물을 언급한다.
본원에 사용되는 용어 "핵산"은, DNA, RNA, 단쇄, 이쇄, 또는 보다 고도로 집합된 하이브리드화 모티브, 및 이들의 임의의 화학적 변형물을 의미한다. 변형은, 이로 제한되지 않는 것으로서, 핵산 리간드 염기에 또는 핵산 리간드 전체에 추가의 하전, 분극성, 수소 결합, 정전기적 상호작용, 부착을 위한 포인트 및 기능성을 삽입하는 화학적 그룹을 제공하는 것을 포함한다. 이러한 변형은, 이로 제한되지 않는 것으로서, 펩타이드 핵산 (PNAs), 포스포디에스테르 그룹 변형 (예: 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트), 2'-위치 슈가 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 퓨린 변형, 엑소사이클릭 아민에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요오도-우라실의 치환; 골격 변형, 메틸화, 통상적이지 않은 염기쌍 조합, 예를 들어 이소염기, 이소시티딘 및 이소구아니딘 등을 포함한다. 또한, 핵산은 비-천연 염기, 예를 들어 니트로인돌을 포함할 수 있다. 또한, 변형은 3' 및 5' 변형, 예를 들어 형광발색단 (예: 양자점) 또는 또 다른 잔기로의 캡핑을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어인 항체는 일반적으로 면역글로불린으로부터의 프레임웍 영역 또는 항원을 특이적으로 결합하고 인지하는 면역글로불린의 단편 또는 면역접합체를 언급한다. 인지되는 면역글로불린은 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 (mu) 불변 영역 유전자뿐만 아니라 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 각각 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다.
본원에서 사용되는 용어 "공중합체"는 하나 이상의 타입의 서브유닛을 포함하는 중합체를 기술한다. 이 용어는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 타입의 서브유닛을 포함하는 중합체를 포함한다.
용어 "분리된"은 물질을 생성하기 위해 사용된 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 언급한다. 조성물에 대한 순도 범위의 하한은 약 60%, 약 70%, 또는 약 80%이고, 순도 범위의 상한은 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 90% 초과이다.
"하이드로겔"은 그 자신의 중량의 적어도 3배, 바람직하게는 적어도 10배의 액체를 흡수할 수 있는 수불용성 및 수팽윤성 가교 중합체를 언급한다. "하이드로겔" 및 "열-반응성 중합체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "부착되는"은, 이로 제한됨이 없이, 공유 결합, 이온 결합, 화학적 흡착, 물리적 흡착 및 이들의 조합을 포함하는 상호작용을 포함한다.
용어 "생물분자" 또는 "생물유기 분자"는 통상적으로 살아있는 유기체에 의해 만들어지는 유기 분자를 언급한다. 이는, 예를 들어 뉴클레오타이드, 아미노산, 슈가, 지방산, 스테로이드, 핵산, 폴리펩타이드, 펩타이드, 펩타이드 단편, 탄수화물, 지질, 및 이들의 배합물 (예: 당단백질, 리보핵산단백질, 지단백질 등)을 포함한다.
"소분자"는 분자량이 1 kD 미만, 바람직하게는 600 D 미만인 종을 언급한다.
본원에서 사용되는 "본 발명의 조성물"은 본원에서 논의되는 조성물, 약제학적으로 허용되는 염 및 이들 조성물의 프로드럭을 언급한다.
치환 그룹이 이들의 통상의 화학식 (좌측으로부터 우측으로 작성됨)으로 구체화되는 경우, 이들은 우측으로부터 좌측으로 구조물을 작성함으로써 발생되는 화학적으로 동일한 치환체를 포함하며, 예를 들어 -CH2O-는 또한 -OCH2-을 인용하는 것이다.
약물, 제형물 또는 침투물 (permeant)의 "유효"량은 목적하는 국소적 또는 전신적 효과를 제공하기 위한 활성제의 충분량을 의미한다. "국소적 유효량, 향장학적 유효량, 약제학적 유효량, 또는 치료학적 유효량"은 목적하는 처치 결과를 수행하는데 필요한 약물의 양을 언급한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은, 본원에 기술된 화합물에서 발견되는 특정 치환체에 따라, 상대적 무독성인 산 또는 염기로 제조되는 본 발명의 화합물의 염을 포함하도록 의도된다. 본 발명의 화합물이 상대적 산성 작용기를 포함하는 경우, 염기부가염은 이러한 화합물의 중성 형태를 충분량의 목적하는 염기와 그대로 또는 적합한 불활성 용매 중에서 접촉시킴으로써 수득될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염기부가염의 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 알루미늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사 염을 포함한다. 본 발명이 화합물이 상대적으로 염기성인 작용기를 포함하는 경우, 산부가염은 중성 형태의 이러한 화합물을 충분량의 목적하는 산과 그대로 또는 적합한 불활성 용매 중에서 접촉함으로써 수득될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 산부가염은 무기산, 예를 들어 염산, 브롬산, 질산, 카본산, 일수소카본산 (monohydrogencarbonic acid), 인산 (phosphoric acid), 일수소인산 (monohydrogenphosphoric acid), 이수소인산 (dihydrogenphosphoric acid), 황산, 일수소황산 (monohydrogensulfuric acid), 요오드산 또는 인산 (phosphorous acid)로부터 유도되는 염뿐만 아니라 상대적 무독성 유기염, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨릴설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄설폰산 등으로부터 유도되는 산을 포함한다. 또한, 아미노산, 예를 들어 아르기네이트 등의 염, 및 유기산, 예를 들어 글루쿠론산 또는 갈락투노르산 등의 염을 포함하며, 예를 들어 문헌 [Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science 66: 1-19 (1977)]을 참조한다. 본 발명의 특정한 구체적 화합물은, 이들 화합물을 염기부가염 또는 산부가염으로 전환시키는 염기성 작용기 및 산성 작용기를 모두 포함한다.
중성 형태의 화합물은 바람직하게는 염을 염기 또는 산과 접촉시키고 통상의 방법으로 모화합물을 분리함으로써 재생성된다. 모 형태의 화합물은 다양한 염 형태와는 특정한 물리적 특성, 예를 들어 극성 용매에서의 용해도가 다르다.
염 형태 이외에, 본 발명은 프로드럭 형태인 화합물을 제공한다. 본원에서 기술되는 화합물의 프로드럭 또는 복합물은 본 발명의 화합물을 제공하도록 물리적 조건 하에서 화학적 변화를 쉽게 겪는다. 또한, 프로드럭은 생체외 환경에서 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 이러한 화합물을 구성하는 원자 중 하나 이상이 자연적이지 않은 비율의 원자적 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 방사성 동위원소, 예를 들어 삼중수소 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C)로 방사선 표지될 수 있다. 본 발명의 화합물에 대한 모든 동위원소적 변형물을, 방사성인지의 여부와 상관없이, 본 발명의 범위에 포함시키고자 한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "약제학적으로 허용되는 비히클"은 본원에서 정의되는 활성제의 유효량을 적절히 전달하며, 활성제의 생물학적 활성의 유효성을 해치지 않고, 호스트 또는 환자에게 충분히 무독성인 임의의 제형물 또는 담체 매질을 언급한다. 대표적 담체는 물, 오일 (식물성 및 광물성 모두), 크림 기재, 로션 기재, 연고 기재 등을 포함한다. 이러한 기재는 현탁제, 농조화제, 침투 증진제 등을 포함한다. 이러한 제형물은 향장 및 국부적 제약 분야에서 널리 공지되어 있다. 담체에 대한 추가의 정보는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2005), 본원에 참조로 삽입됨]에서 찾을 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 국소적 담체" 및 동등한 용어는 국소적 적용에 적합한 본원에서 기술되는 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 언급한다. 활성제(들)를 현탁시키거나 용해시킬 수 있고, 피부, 손톱 및 발톱 (nail), 모발, 손 (claw), 발 (hoof)에 적용하는 경우 무독성이고 비염증성인 비활성의 액체 또는 크림 비히클이 약제학적으로 허용되는 국소적 담체의 예이다. 이 용어는 특정하게는 국부적 향장학에서 사용이 승인된 담체 물질을 포함하고자 하는 것이다.
용어 "약제학적으로 허용되는 첨가제"는, 약물 제형 분야에서 공지되어 있거나 사용되는 것으로서 활성제의 생물학적 활성의 유효성을 과도히 해치지 않고 호스트 또는 환자에게 충분히 무독성인, 보존제, 항산화제, 방향제, 유화제, 염료 및 부형제를 언급한다. 국소 제형물을 위한 첨가제는 당해 기술 분야에서 널리 공지되어 있고, 약제학적으로 허용되고 상피 세포 또는 이들의 기능에 해롭지 않은 한 국소 조성물에 첨가될 수 있다. 또한, 이들은 조성물의 안정성에 유해하지 않아야 한다. 예를 들어, 불활성 충전제, 항-자극제, 점착제, 부형제, 방향제, 유백제, 항산화제, 겔화제, 안정화제, 계면활성제, 연화제, 착색제, 보존제, 완충제, 기타 침투 증진제, 및 당해 기술 분야에서 공지된 기타 국소적 또는 경피 전달 제형물의 통상의 성분들을 포함한다.
본원에서 사용되는 "투여"는 피검체에 대한 경구 투여, 좌약으로의 투여, 국소 접촉, 정맥내, 복강내, 근육내, 병변내, 비내 또는 피하 투여, 또는 서방 장치, 예를 들어 미미-삼투 펌프의 이식을 의미한다.
용어 "부형제"는 통상적으로 목적하는 용도에 유효한 약물 조성물을 제형하는데 사용되는 담체, 희석제 및/또는 비히클을 의미하는 것으로 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "자가 세포"는 피검체 자체의 세포 또는 이의 클론인 세포를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "동종이형 세포"는 제1 피검체 자체의 세포 또는 이의 클론은 아니나 제1 피검체와 동일한 종인 제2 피검체로부터 유도되는 세포 또는 이의 클론인 세포를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "이종 세포"는 제1 피검체 자체의 세포 또는 이의 클론으로부터 세포가 아니고, 제1 피검체와는 종이 다fms제2의 피검체로부터의 세포 또는 이의 클론인 세포를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포"는 특정한 구체적인 기능을 갖는 세포 (즉, 최종적으로 분화된 세포, 예를 들어 적혈구, 대식구 등)를 포함하여 다른 세포 타입으로 분화될 수 있는 세포를 언급한다. 줄기 세포는 이들의 기원 (성체/체세포 줄기 세포, 배아 줄기 세포)에 따라, 또는 이들의 잠재능 (분화전능 (totipotent), 다능 (pluripotent), 다능성 (multipotent), 단능성 (unipotent))에 따라 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단능성 (unipotent)"은 단지 하나의 세포 타입을 생성할 수 있으나, 비-줄기 세포와 구분되게 자가-재개 (self-renewal) 특성을 갖는 세포를 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성(multipotent)" 또는 "전구 세포 (progenitor)"는 수개의 상이한 최종 분화 세포 타입 중 어느 하나를 생성할 수 있는 세포를 언급한다. 이러한 상이한 세포 타입은 통상 밀접히 관련된다 (예, 적혈구, 백혈구 및 혈소판과 같은 혈구 세포). 예를 들어, 중간엽 줄기 세포 (골수 간질 세포로도 알려짐)는 다능성 세포이며, 조골세포, 연골세포, 근아세포, 지방세포, 뉴우런 세포, 및 β-췌장 섬세포를 형성할 수 있다. 또 다른 예는 개별 세포의 다수핵 근관 (myotube)으로의 융합을 수반하는 분화 과정에 의해 우선적으로 골격 근육 세포를 생성하는 골격 근아세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "다능 (pluripetent)"은 유기체에 대한 일부 또는 많은 (단 모두는 아님) 세포 타입을 생성하는 세포를 언급한다. 다능 줄기 세포는, 비록 재프로그램화 (reprogrammng) 없이는 이들이 유도되는 세포로 탈-분화될 수 없지만, 성숙한 유기체의 신체에 있는 임의 세포 타입으로 분화될 수 있다. "다능성"/전구 세포 (예: 신경 줄기 세포)는 다능 줄기 세포보다 좁은 분화 잠재력을 갖는다는 것으로 구별될 수 있다. 다능 줄기 세포보다 더욱 미발달된 또 다른 부류의 세포 (즉, 특정 분화 운명이 정해지지 않은 세포)가 소위 "분화 전능 (totipotent)" 줄기 세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "분화 전능"은 수정된 알 세포의 처음 수개의 분할에 의해 생성되는 세포 (예를 들어 2개 및 4개 세포의 발달 단계에 있는 배아)뿐만 아니라 수정된 난모세포를 언급한다. 분화 전능 세포는 특정 종에 대한 세포의 어떠한 타입으로도 분화될 수 있는 능력을 갖는다. 예를 들어, 단일의 분화 전능 줄기 세포는 특정 종 (예: 사람)에서 발견되는 무수히 많은 세포 타입 중의 임의의 세포뿐만 아니라 완전한 동물을 생성할 수 있다. 본원에서는 완전한 기관 또는 조직으로의 분화를 위한 잠재능을 갖는 세포뿐만 아니라 다능 및 분화 전능 세포를 "초생 (primordial)" 줄기 세포로 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "탈분화 (dedifferentiation)"는 세포의 덜 특수화된 상태로의 회귀를 언급한다. 세포는 탈분화 후 재프로그램화 이전에 가능했던 것보다 많고 상이한 세포 타입으로 분화되는 능력을 가질 것이다. 역분화의 과정 (즉, 탈분화")는 분화보다 복잡할 것이며 세포가 보다 미발달되도록 "재프로그램화"하는 것을 필요로 한다. 탈분화의 예는 근원성 전구 세포, 예를 들어 초기의 원시적 근아세포를 근육 줄기 세포 또는 위성 세포로 전환하는 것이다.
용어 "정상" 줄기 세포는 비정상적 표현형을 나타내지 않거나 비정상적 유전형을 갖지 않아 줄기 세포로부터 유도되는 전체 범위의 세포를 생성할 수 있는 줄기 세포 (또는 이의 자손)을 언급한다. 분화 전능 줄기 세포의 맥락에서, 정상 줄기 세포는 예를 들어 건강한 모든 정상적 동물에 대해 생성될 수 있다. 이와는 대조적으로, "비정상적" 줄기 세포는, 예를 들어 하나 이상이 돌연변이 또는 유전적 변형 또는 병원체 때문에 정상적이지 않은 줄기 세포를 언급한다. 따라서, 비정상적 줄기 세포는 정상적 줄기 세포와 상이하다.
"성장 환경"은 줄기 세포가 시험관 내에서 증식하는 환경이다. 이러한 환경에 대한 특징은 세포가 배양되는 배지 및, 존재하는 경우, 지지 구조물 (예: 고체 표면상의 기판)을 포함한다.
"성장 인자"는 세포의 성장을 촉진시키고, 보충물로서 배양 배지에 추가되지 않는 한, 기본 배지의 성분이 아닌 물질을 언급한다. 달리, 성장 인자는 배양되는 세포 (존재하는 경우, 임의의 피더 세포를 포함)에 의해 분비되지 않거나, 배양 배지에 있는 세포에 의해 분비되는 경우, 외인적으로 성장 인자를 첨가함으로써 수득되는 결과를 달성하기에 충분한 양으로 분비되지 않는 분자이다. 성장 인자는, 이로 제한됨이 없이, 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린-유사 성장 인자 -I (IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자-II (IGF-II), 혈소판-유래된 성장 인자-AB (PDGF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 악티빈-A, 골 형태발생 단백질 (BMPs), 인슐린, 사이토킨, 케모킨, 모르포겐, 중화 항체, 기타 단백질, 및 소분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "분화 인자"는 줄기 세포 또는 전구 세포가 특정한 구체화된 세포 타입이 되도록 유도하는 분자를 언급한다.
"세포외 기질 (extracellular matrix)" 또는 "기질"은 피더 세포에 의해 합성되는 세포외 기질에 의해 제공되는 바와 실질적으로 동일한 조건을 제공하는 하나 이상의 물질을 언급한다. 기질은 기판에 제공될 수 있다. 달리, 기질을 포함하는 성분(들)은 용액에 제공될 수 있다. 세포외 기질의 성분은 라미닌, 콜라겐 및 피브로넥틴을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "재생 능력"은 줄기 세포의 분열하는 전구 세포 및 분화된 조직-특이적 세포로의 전환을 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "자가-재개"는 계통에 대한 구체화가 없는 증식을 언급한다.
본원에서 사용되는 용어 "정렬된"은 섬유의 50% 이상이 하나의 일반적인 방향으로 배향되고 이들의 배향이 정렬에 대한 평균 축을 형성하는 섬유 중합체 스캐폴드에 있는 섬유의 배향을 언급한다. 임의의 지정된 섬유에 대한 배향은 정렬물의 평균 축으로부터 편향될 수 있으며, 편향은 정렬 축과 섬유의 배향 사이에 형성되는 각으로서 표현될 수 있다. 편향각 0 °는 정확한 정렬을 나타내며, 90°(또는 -90°)는 정렬물의 평균 축에 대해 섬유의 직각 정렬을 나타낸다. 예시적 양태에서, 정렬물의 평균 축으로부터 섬유의 표준 편향은 0° 내지 1°, 0° 내지 3°, 0° 내지 5°, 0° 내지 10°, 0° 내지 15°, 0° 내지 20° 또는 0° 내지 30° 중에서 선택되는 각일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "막대"는 본질적으로 충전된 실린더의 형태인 섬유 중합체 스캐폴드를 언급한다. 공간 및 채널이 막대를 구성하는 개개 섬유 사이에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "도관"은 본질적으로 실린더 형태인 대상을 언급한다. 도관은 내벽 및 외벽, 내부 직경, 외부 직경, 및 도관의 내부 직경 뿐만 아니라 이의 길이에 의해서도 정의되는 내부 공간을 갖는다. 공간 및 채널이 도관을 구성하는 개개 섬유 사이에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "충전된 도관"은 내부 공간의 일부가 충전제 물질로 구성되는 도관을 언급한다. 이러한 충전 물질은 섬유 중합체 스캐폴드일 수 있다. 공간 및 채널이 충전된 도관을 구성하는 개개 섬유 사이에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "이은 자리 (seam)" 또는 "이은 자리를 갖는 (seamed)"은 2개의 섹션을 서로 꼭 맞추거나 연결하거나 포갬으로써 형성되는 연결을 언급한다. 이들 2개의 섹션은 기계적 수단, 예를 들어 봉합에 의하거나, 화학적 수단, 예를 들어 어닐링 또는 접착제에 의해 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 이은 자리는 시트의 한 영역을 다른 영역에 연결시킴으로써 형성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "이은 자리가 없는 (seamless)"은 이은 자리가 부재하다는 것을 언급한다.
용어 "세포"는 단일 ("세포") 또는 다수 ("세포") 상태를 언급할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "세포외 기질 성분'은 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴 및 엘라스틴으로부터 선택되는 일원이다.
본원에서 사용되는 용어 "스텐트"는 특히 금속 및 유기 중합체로 제조될 수 있는 튜브이다. 스텐트가 유기 중합체로 제조되는 경우, 중합체는 본원에서 기술되는 바와 같이 나노섬유 또는 마이크로섬유 중합체 스캐폴드이다. 달리, 스텐트가 섬유 중합체 스캐폴드로부터 제조되는 경우, 섬유의 평균 직경은 100 마이크론 내지 약 50 cm일 것이다. 일부 예에서, 전체 스텐트는 제1 직경으로부터 제2 직경까지 연장될 수 있으며, 이때 제2 직경은 제1 직경보다 크다.
II . 조성물
이들 조성물은 중합체 스케폴드를 포함할 수 있다. 이러한 중합체 스캐폴드는 섬유 중합체 스캐폴드, 예를 들어 마이크로섬유 중합체 스캐폴드 또는 나노섬유 중합체 스캐폴드일 수 있다. 이들 중합체 스캐폴드는 또한 미세패턴화된 중합체 스캐폴드일 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드는 임의로 비정렬되거나 예를 들어 세로 방향으로 또는 원주 방향으로 정렬될 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드는 임의로 시트, 예를 들어 십자방향 시트, 도관, 막대 또는 충전된 도관과 같은 형태로 형성될 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드는 이은 자리를 갖거나 이은 자리가 없을 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물 또는 중합체는 임의로 세포, 생물분자 또는 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 이들 정렬, 형태 및 추가 성분은 생물학적 기능을 개선 또는 재생 또는 대체하는 것을 도울 수 있다. 본 발명의 조성물은 스텐트를 포함하지 않는다. 본 조성물은 생물학적 기능을 개선, 재생 또는 대체하도록 조직을 조작 (engineering)하는데 사용될 수 있다.
II . a) 섬유 중합체 스캐폴드
제1 양태에서, 본 발명은 섬유 중합체 스캐폴드를 포함하는 조성물을 제공한다. 섬유 중합체 스캐폴드는 일정한 범위의 직경을 가질 수 있는 섬유 또는 섬유들을 포함한다. 예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드에 있는 섬유의 평균 직경은 약 0.1 nm 내지 약 50,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 25 nm 내지 약 25,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 50 nm 내지 약 20,000 nm이다. 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 100 nm 내지 약 5,000 nm이다. 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 1,000 nm 내지 약 20,000 nm이다. 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 10 nm 내지 약 1,000 nm이다. 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 2,000 nm 내지 약 10,000 nm이다. 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 0.5 nm 내지 약 100 nm이다. 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 0.5 nm 내지 약 50 nm이다. 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 1 nm 내지 약 35 nm이다. 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 2 nm 내지 약 25 nm이다. 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 90 nm 내지 약 1,000 nm이다. 예시적 양태에서, 섬유의 평균 직경은 약 500 nm 내지 약 1,000 nm이다.
예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드는 나노섬유 중합체 스캐폴드 및 마이크로섬유 중합체 섬유 중합체 스캐폴드 중에서 선택되는 일원이다. 마이크로섬유 중합체 스캐폴드는 마이크로-규모의 특징 (평균 섬유 직경: 약 1,000 nm 내지 약 50,000 nm, 특히 약 1,000 nm 내지 약 20,000 nm)인 반면, 나노섬유 중합체 스캐폴드는 서브마이크론-규모 특징 (평균 섬유 직경: 약 10 nm 내지 약 1,000 nm, 특히 약 50 nm 내지 약 1,000 nm)을 갖는다. 이들 중합체 스캐폴드 각각은 처리 범위에 있는 물리적 구조물, 예를 들어 천연 콜라겐 피브릴 또는 기타 세포외 기질과 닮을 수 있다.
합성 및/또는 천연 공급원으로부터의 다양한 중합체가 이들 섬유 중합체 스캐폴드를 구성하는데 사용될 수 있다. 섬유는 하나의 단량체 또는 서브유닛으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 락트산 또는 폴리락트산 또는 글리콜산 또는 폴리글리콜산을 사용하여 폴리(락타이드) (PLA) 또는 폴리(L-락타이드) (PLLA) 나노섬유 또는 폴리(글리콜라이드) (PGA) 나노섬유를 형성할 수 있다. 또한, 섬유는 하나를 초과하는 단량체 또는 서브유닛으로부터 제조되어 공중합체, 3원 중합체 등을 형성할 수 있다. 예를 들어, 락트산 또는 폴리락트산이 글리콜산 또는 폴리글리콜산과 배합되어 공중합체 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA)를 형성할 수 있다. 본 발명에 사용되는 기타 공중합체는 폴리(에틸렌-코-비닐) 알콜을 포함한다. 예시적 양태에서, 섬유는 지방족 폴리에스테르, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리디메틸실록산, 폴리비닐알콜, 폴리리신, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 알기네이트, 피브린, 하이알루론산, 프로테오글리칸, 폴리펩타이드 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원인 중합체 또는 서브유닛을 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 섬유는 지방족 폴리에스테르, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리디메틸실록산, 폴리비닐알콜, 폴리리신, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 알기네이트, 피브린, 하이알루론산, 프로테오글리칸, 폴리펩타이드 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원인 2개의 상이한 중합체 또는 서브유닛을 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 섬유는 지방족 폴리에스테르, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리디메틸실록산, 폴리비닐알콜, 폴리리신, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 알기네이트, 피브린, 하이알루론산, 프로테오글리칸, 폴리펩타이드 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원인 3개의 상이한 중합체 또는 서브유닛을 포함한다. 예시적 양태에서, 지방족 폴리에스테르는 직쇄 또는 측쇄이다. 또 다른 예시적 양태에서, 직쇄 지방족 폴리에스테르는 락트산 (D- 또는 L-), 락타이드, 폴리(락트산), 폴리(락타이드) 글리콜산, 폴리(글리콜산), 폴리(글리콜라이드), 글리콜라이드, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리카프롤락톤 및 이의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 직쇄 지방족 폴리에스테르는 측쇄이고, 링커 또는 생물분자에 결합되는 락트산 (D- 또는 L-), 락타이드, 폴리(락트산), 폴리(락타이드) 글리콜산, 폴리(글리콜산), 폴리(글리콜라이드), 글리콜라이드, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리카프롤락톤 및 이의 배합물 중에서 선택되는 하나 이상의 일원을 포함한다. 예시적 양태에서, 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥사이드, 폴리프로필렌 글리콜 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다.
일부 양태에서, 스캐폴드는 단일 연속 섬유로 구성된다. 다른 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드는 적어도 2개, 3개, 4개, 또는 5개 섬유로 구성된다. 예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유의 수는 2 내지 100,000개 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유의 수는 2 내지 50,000개 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유의 수는 50,000 내지 100,000개 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유의 수는 10 내지 20,000개 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유의 수는 15 내지 1,000개 중에서 선택되는 일원이다.
스캐폴드는 하나 이상의 조성물이 섬유를 포함할 수 있다. 예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드는 다수의 상이한 타입의 섬유를 포함하며, 이러한 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 중에서 선택되는 일원이다.
또 다른 예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유 또는 섬유들은 생분해성이다. 또 다른 예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유들은 생분해성 중합체를 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 생분해성 중합체는 락트산 및 글리콜산 중에서 선택되는 일원인 단량체를 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 생분해성 중합체는 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 또는 이들의 공중합체이다. 바람직한 생분해성 중합체는 임상적 사용에 대해 FDA에서 승인된 것들, 예를 들어 폴리(락트산) 및 폴리(글리콜산)이다. 또 다른 예시적 양태에서, 본 발명의 생분해성 중합체 스캐폴드는 조작된 조직의 형태형성을 이끌고 조직의 어셈블리 후 점진적으로 분해하는데 사용될 수 있다. 중합체의 분해 속도는 조직 생성 속도와 조화되도록 당업자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 빠르게 생분해하는 중합체가 필요한 경우, 약 50:50 PLGA 배합이 선택될 수 있다. 중합체 스캐폴드 생물분해성을 증가시키는 추가의 방법은 보다 친수성인 공중합체 (예: 폴리에틸렌 글리콜)을 선택하고, 고분자량은 종종 보다 느린 분해 속도를 의미하므로 중합체의 분자량을 감소시키며, 보다 다공성이고 낮은 섬유 밀도가 종종 보다 많은 물 흡수 및 신속한 분해를 이끌기 때문에 다공성 또는 섬유 밀도를 변화시키는 것을 수반할 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 조직은 근육 조직, 혈관 조직, 신경 조직, 척수 조직 및 피부 조직 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 생분해성 섬유 스캐폴드를 사용하여 조작된 근육 조직의 형태형성을 유도하고 근아세포, 근관 및 골격 근육 세포의 어셈블리 후 점진적으로 분해할 수 있다.
섬유 중합체 스캐폴드를 제조하는 방법
본 발명의 중합체 스캐폴드는 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드는 전기방사에 의해 생성될 수 있다. 전기방사는 정전기장과 전도 유체 사이의 상호작용을 이용하는 전도 유체의 미립자화 공정이다. 외부 정전기장이 전도 유체 (예: 세미-희석 중합체 용액 또는 중합체 용융물)에 적용되는 경우, 현수식 원뿔형 소적이 형성되어 소적의 표면 장력이 전기장과 평형을 이룬다. 정전기 미립자화는 정전기 장이 액체의 표면 장력을 극복하도록 충분히 강한 경우에 발생한다. 이어서, 액체 소적은 불안정하게 되고 소적의 표면으로부터 아주 작은 제트가 분출된다. 분출물이 접지된 표적물에 도달될 때, 물질은 비교적 미세한, 즉 소직경의 섬유를 포함하는 상호연결된 웹으로서 수집될 수 있다. 이들 소직경 섬유로부터 생성된 필름 (또는 막)은 매우 큰 표면적 대 부피의 비율 및 작은 세공 크기를 갖는다. 전기방사 장치에 대한 상세한 설명은 문헌 [Zong, et al., Polymer, 43(16):4403-4412 (2002); Rosen et al., Ann Plast Surg., 25:375-87 (1990) Kim, K., Biomaterials 2003, 24, (27), 4977-85; Zong, X., Biomaterials 2005, 26, (26), 5330-8]에 기술되어 있다. 전기방사 후, 압출 및 몰딩을 이용하여 중합체를 추가 처리될 수 있다. 섬유 체계를 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드로 조절하기 위해서, 패턴화된 전극, 와이어 드럼 수집기, 또는 포스트-프로세싱 방법, 예를 들어 단축 스트레칭을 이용하는 것이 성공적이었다 [Zong, X., Biomaterials 2005, 26, (26), 5330-8; Katta, P., Nano Lett 2004, 4, (11), 2215-2218; Li, D., Nano Lett 2005, 5, (5), 913-6].
중합체 용액은 수개의 방법으로 생성될 수 있다. 하나의 방법은 단량체를 중합화하고 생성된 중합체를 적합한 용매에 용해시키는 것을 수반한다. 이러한 공정은 시린지 어셈블리에서 달성되거나 후속적으로 시린지 어셈블리로 로딩될 수 있다. 또 다른 방법은 시판되는 중합체 용액 또는 시판되는 중합체를 구입하고 이들을 용해시켜 중합체 용액을 제조하는 것을 수반한다. 예를 들어, PLLA는 DuPont (Wilmington, DE)으로부터 구입할 수 있고, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)는 Ethicon (Somerville, NJ), Birmingham Polymers (Birmingham, AL), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 및 Polysciences (Warrington, PA)로부터 구입할 수 있다. 기타 제조자는 Lactel Absorbable Polymers (Pelham, AL)를 포함한다. 또한, 본 발명의 추가의 중합체 스캐폴드 성분, 예를 들어 세포 및 생물분자가 공급자, 예를 들어 Invitrogen (San Diego, CA), Cambrex (Walkersville, MD), Sigma-Aldrich, Peprotech (Rocky Hill, NJ), R&D Systems (Minneapolis, MN), ATCC (Manassas, VA), Pierce Biotechnology (Rockford, IL)로부터 시판된다.
중합체 스캐폴드를 형성하기 위해 사용되는 중합체는 먼저 용매에 용해된다. 용매는 중합체 단량체 및/또는 서브유닛을 용해시키고 전도 및 전기방사성 중합체 용액을 제공할 수 있는 임의의 용매일 수 있다. 전형의 용매는 N,N-디메틸 포름아미드 (DMF), 테트라하이드로푸란 (THF), 메틸렌 클로라이드, 디옥산, 에탄올, 헥사플루오로이소프로판올 (HFIP), 클로로포름, 물 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 용매를 포함한다.
중합체 용액은 임의로 전기방사 공정을 용이하게 하도록 과량의 하전 효과를 발생시키는 염을 포함할 수 있다. 적합한 염의 예는 NaCl, KH2PO4, K2HPO4, KIO3, KCl, MgSO4, MgCl2, NaHCO3, CaCl2 또는 이들 염의 혼합물을 포함한다.
전도 유체를 형성하는 중합체 용액은 바람직하게는 약 1 내지 약 80 중량%, 보다 바람직하게는 약 8 내지 약 60 중량% 범위의 중합체 농도를 갖는다. 전도 유체는 바람직하게는 약 50 내지 약 2000 mPa X s, 보다 바람직하게는 약 200 내지 약 700 mPa X s의 점도를 갖는다.
전기방사 공정에서 발생되는 전기장은 바람직하게는 약 5 내지 약 100 kV, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 50 kV의 범위일 것이다. 전도 유체의 방적돌기 (또는 전극)로의 공급 속도는 바람직하게는 약 0.1 내지 약 1000 μl/min, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 250 μl/min의 범위일 것이다.
단일 또는 다수의 방적돌기가, 플랫폼과 접지된 수집기 기판 사이의 거리를 변화시키면서 조절될 수 있는 플랫폼에 놓인다. 거리는 중합체를 접지된 수집기 기판과 접촉시키기 전에 용매를 본질적으로 완전히 증발시키는 임의의 거리일 수 있다. 예시적 양태에서, 거리는 1 cm 내지 25 cm로 다양할 수 있다. 접지된 수집기 기판과 플랫폼 사이의 거리를 증가시키면 일반적으로 보다 가는 섬유가 생성된다.
회전 심축이 필요한 전기방사의 경우, 심축은 종종 드릴 척을 통해 모터에 기계적으로 부착된다. 예시적 양태에서, 모터는 약 1 rpm 내지 약 500 rpm의 속도로 심축을 회전시킨다. 예시적 양태에서, 모터 회전 속도는 200 rpm 내지 약 500 rpm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 모터 회전 속도는 약 1 rpm 내지 약 100 rpm이다.
전기방사 공정 및 장치에 대한 추가의 양태 또는 변형이 본원에 기술된다.
전도 유체의 전기/기계적 특성의 변화
전기방사에 의해 생성되는 막의 특성은 전도 유체의 전기적 및 기계적 특성에 의해 영향을 받을 것이다. 중합체 용액의 전도도는 이온성 무기/유기 화합물을 가함으로써 크게 변화될 수 있다. 중합체 용액의 자기-유체역학 (magneto-hydrodynamic) 특성은 물리적 및 기계적 특성 (예: 유체의 표면 장력, 점도 및 점탄성 거동) 및 전기적 특성 (예: 유체의 전하 밀도 및 분극성)의 조합에 의존할 수 있다. 예를 들어, 중합체 용액에 계면활성제를 첨가함으로써, 유체 표면 장력이 감소되어 정전기장이 넓은 범위의 조건에 걸쳐 제트 형태 및 제트 유동에 영향을 끼칠 수 있다. 일정한 압력으로나 일정한 유속으로 유동 속도를 조절할 수 있는 시린지 펌프를 커플링시킴으로써 전도 유체의 점성에 대한 효과를 완화시킬 수 있다.
전극 디자인
본 발명에 따른 막을 제조하는 또 다른 양태에서, 전기방사 동안의 제트 형성 공정은 여러 섬유 크기에서 보다 우수한 조절을 제공하도록 더욱 개선될 수 있다. 단순히 하전된 방적돌기 및 그라운드 플레이트를 제공하는 것이 아니라, 상술된 바와 같이, 양으로 하전된 방적돌기는 여전히 중합체 용액 소적을 형성시키고 중심에 작은 출구 구멍을 갖는 플레이트 전극은 제트 스트림을 형성시킨다. 이러한 출구 구멍은 제트 스트림이 플레이트 전극을 통과하도록 하는 수단을 제공할 것이다. 따라서, 양으로 하전된 방적돌기에서의 중합체 소적은 2 내지 3 mm의 전형적인 크기를 갖고, 플레이트 전극은 방적돌기로부터 약 10 mm의 거리에 놓이며, 합리적인 정전기 전위가 발생될 수 있다. 2개의 전극 사이의 짧은 거리는 정전기 전위가 상당히 낮을 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 생성된 전기장 세기는 전기방사 공정에 대해 충분히 강할 수 있다. 방적돌기의 전기적 전위를 변화시킴으로써, 제트 형성이 조절되고 적합하게 될 수 있다. 이러한 전극 배치는 방적돌기에서의 필요 적용 전위를 통상 약 15 kV에서 통상 약 1.5 내지 2 kV (그라운드 플레이트 전위에 대해 상대적임)로 크게 감소시킨다. 안정한 제트 형성에 필요한 정확한 방적돌기 전위는 특정 전위 유체의 전기적/기계적 특성에 따를 것이다.
제트 가속화 및 수송의 조절
본 발명의 중합체 스캐폴드를 제조하는 또 다른 바람직한 양태에서, 제트 스트림 비행도 정확히 조절된다. 플레이트 전극 출구 구멍을 통과하는 제트 스트림은 양으로 하전된다. 이러한 스트림은 비행 동안 그 자체를 곧게 하는 경향이 있지만, 외부 전기장 제한 없이 제트는 즉시 이의 비행 경로가 불안정하게 될 것이다. 달리, 하전된 흐름은 탈초점화되어 유체의 현미경적 및 육안적 특성에 걸쳐 조절을 상실한다. 이러한 불안정성은 플레이트 전극 및 일련의 (동일하게) 간격을 둔 플레이트 전극을 사용한 직후 신중하게 고안된 프로브 전극을 사용함으로써 제거될 수 있다. 전극 어셈블리 (또는 복합 전극), 즉 프로브 전극 및 플레이트 전극은 (곧은) 비행길을 따라 정전기 전위의 균일한 분포를 만들 수 있다. 프로브 전극의 정전기 전위는 플레이트 전극의 기본 전위 약간 아래로 조절될 수 있는 반면, 가속 전위는 (대지 전위의) 표적물 위에 약 +20 내지 +30 kV의 방적돌기 기본 전위를 가함으로써 형성된다. 복합 전극은 목적하는 표적물의 면적에 제트 스트림을 전달할 수 있다. 또한, 복합 전극은 제트 스트림을 조작하는데 사용될 수 있다. 정전기 전위를 변화시킴으로써 제트 스트림 가속화가 변화되며, 이로써 형성되는 중합체 섬유의 직경이 다양해진다. 이러한 정전기 전위 변화는 제트 스트림 안정성을 변화시키고, 그 결과, 복합 전극에서의 상응하는 변화가 새로운 제트 스트림을 안정화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 공정은 전기방사 공정 동안 섬유 직경을 조정하고 변화시키는데 이용될 수 있다.
제트 조작
또 다른 양태에서, 제트 스트림은 고에너지 물리학의 가속화기 기술에 널리 사용되는 "AG (Alternating Gradient)" 기술을 이용함으로써 집중될 수 있다. 기본 생각은 2개 쌍의 정전기 4극자 렌즈를 사용하는 것이다. 두 번째 렌즈는 역전형 (교류) 전기적 기울기를 갖는 첫 번째 렌즈와 동일한 기하적적 배열을 갖는다. 양으로 하전된 제트 스트림은, 예를 들어 제1 렌즈 다음의 xz 평면에 집중된 후 제2 렌즈 다음의 yz 평면에 재집중될 것이다. z-방향은 초기 비행길의 방향을 나타낸다는 것을 주목한다. 4극자의 쌍 중 하나의 전위에 추가의 삼각형 파형을 적용시킴으로써, 표적물 영역을 가로질러 제트가 스위핑 (sweep)될 수 있으며, 이는 제트 스트림의 방향 조절을 가능하게 한다. 또한, '스위핑' 전위의 파형을 변화시킴으로써 표적물 상에 목적하는 패턴이 형성될 수 있다.
비전형적 심축을 갖는 전기방사 장치
전기방사 중합체 섬유는 정지 기판 또는 회전 기판에 침착 (deposit)될 수 있다. 과거에, 정지 금속 수집기는 전기방사 섬유의 임의 침착에 사용되어 왔다. 회전 금속 심축은 전기방사 동안 사용되어 왔다. 회전 금속 심축은 이의 표면에 임의의 섬유 침착을 일으켜 심축이 제거되는 경우 도관을 생성할 수 있다. 또한, 원주형 섬유 정렬을 갖는 도관은 이 방법을 변형시키고 심축을 고속 (>100 rpm)으로 회전시켜 제조될 수도 있다. 직경 및/또는 길이가 큰 회전 드럼을 수집기 기판으로 사용하는 경우, 드럼으로부터 침착된 섬유 중합체 스캐폴드를 잘라 분리시키면 비정렬된 섬유 중합체 스캐폴드 및 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드의 시트가 제조될 수 있다. 정지 금속 수집기 내에 에어 갭 (구멍)을 생성함으로써 갭을 가로질러 침착되는 전기방사 섬유의 정렬을 유도하는 것은 이전에 밝혀졌다 [Li, D., Wang Y. L., Xia, Y. N., Electrospinning of Polymeric and Ceramic Nanofibers as Uniaxially Aligned Arrays. Nano Letters, 2003. 3(8): p. 1167-71]. 그러나, 상기 문헌 및 어디에서도, 정렬을 갖는 3차원 도관 또는 막대를 제조하거나 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성된 도관 또는 막대를 직접적으로 전기방사하는 것에 대한 기술을 없다.
또 다른 양상으로, 본 발명은 회전 심축에 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드를 전기방사하는 방법을 포함한다. 이러한 섬유 중합체 스캐폴드는 사용자에 의해 목적되는 어떠한 배향으로도 정렬될 수 있다. 예시적 양태에서, 스캐폴드는 본질적으로 세로 방향이거나 본질적으로 원주 방향으로 정렬된다. 이러한 방법으로 제조된 섬유 중합체 스캐폴드는 이은 자리를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드는 이은 자리를 갖지 않는다. 또 다른 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드는 중합체 스캐폴드의 세로축에 대해 본질적으로 평행한 축을 따라 이은 자리가 없다.
또 다른 양상으로, 본 발명은 이은 자리가 없는 도관, 이은 자리가 없는 충전된 도관 및 이은 자리가 없는 막대의 전기방사를 가능하게 하는 비전형적 심축을 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 이은 자리가 없는 도관, 이은 자리가 없는 충전된 도관 및 이은 자리가 없는 막대는 비정렬된 섬유 배향을 갖는다. 또 다른 예시적 양태에서, 이은 자리가 없는 도관, 이은 자리가 없는 충전된 도관 및 이은 자리가 없는 막대는 정렬된다. 또 다른 양태에서 이은 자리가 없는 도관, 이은 자리가 없는 충전된 도관 및 이은 자리가 없는 막대는 본질적으로 세로 방향으로 정렬된 섬유를 갖는다.
또 다른 양상으로, 본 발명은 통채로 (monolithically) 형성되는 도관, 충전된 도관 및 막대의 전기방사를 가능하게 하는 비전형적 심축을 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 통채로 형성되는 도관, 통채로 형성되는 충전된 도관 및 통채로 형성되는 막대는 비정렬된 섬유 배향을 갖는다. 또 다른 예시적 양태에서, 통채로 형성되는 도관, 통채로 형성되는 충전된 도관 및 통채로 형성되는 막대는 정렬된다. 또 다른 예시적 양태에서, 통채로 형성되는 도관, 통채로 형성되는 충전된 도관 및 통채로 형성되는 막대는 본질적으로 세로 방향으로 정렬된 섬유를 갖는다.
예시적 양태에서, 심축은 이의 세로축 둘레로 심축을 회전시킬 수 있는 모토 어셈블리에 부착된다. 전기방사 장치에서, 회전 심축은 접지되고 방적돌기 아래에 놓인다. 중합체 용액은 방적돌기의 팁으로 전달되고 전원에 의해 하전된다. 방적돌기와 심축 사이에 형성되는 전기장은 방적돌기의 팁에 있는 하전된 중합체 용액이 제트를 형성하도록 유도한다. 제트는 심축을 향해 분무된다. 중합체는 심축의 일 전도 영역과 접촉한 후 심축의 제2 전도 영역과 접촉하여 심축의 비-전도 영역 또는 에어 갭을 가로질러 섬유를 침착시킨다. 그 결과, 비-전도 영역 또는 에어 갭에 침착된 정렬된 섬유를 형성한다. 심축을 회전시킴으로써 균등하게 적용된 층을 갖는 정렬된 섬유가 제조된다. 침착된 섬유층은 심축 또는 심축 사이의 에어 갭의 형태를 따르며, 경우에 따라 시트. 경우에 따라 도관 또는 또 다른 경우에 따라 막대를 형성한다. 시트, 도관 또는 막대를 포함하는 섬유는 도관 또는 막대의 길이를 따라 정렬되어 세로 방향으로 정렬된 섬유를 갖는 시트, 도관 또는 막대를 형성한다. 예시적 양태에서, 도관 또는 막대는 이은 자리가 없을 수 있다. 예시적 양태에서, 도관 또는 막대는 본질적으로 이의 길이축에 평행한 축을 따라 이은 자리가 없을 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 2개 이상의 전도 영역 및 하나 이상의 비-전도 영역을 갖는 심축을 제공한다. 이러한 심축은 다양한 방식으로 디자인될 수 있다; 심축에 대한 예시적 도시가 도 3B에 나타나 있으며, 본 발명의 시트 및/또는 도관을 제조하는 장치의 일부로서의 심축에 대한 예시적 도시가 도 1, 2, 2A 및 2B에 나타나 있다. 예시적 양태에서, 전기적 전도 물질은 금속이다. 또 다른 예시적 양태에서, 금속은 강철 및 알루미늄 중에서 선택된다. 하나의 예에서, 전도 심축의 영역은 비-전기적 전도 물질로 가려질 수 있다. 이러한 심축에 대한 예시적 단면도가 도 3D에 나타나 있다. 예시적 양태에서, 비-전기적 전도 물질은 테이프, 전기 테이프, 테플론 및 플라스틱 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예에서, 2개의 전도 심축 영역을 상호연결하는 비-전기적 전도 영역을 적어도 3개의 섹션에서 갖는 심축이 제조될 수 있다. 또 다른 예에서, 비-전기적 전도 영역은 2개의 전도 심축 영역 사이에서 연장되는 분리된 부분이다. 이러한 심축에 대한 예시적 단면도가 도 3C에 나타나 있다. 심축의 전도 영역 위에 비-전도 영역을 놓거나 심축의 2개의 전도 영역 사이의 비-전도 영역을 상호연결함으로써 추가의 비-전도 영역을 심축에 가할 수 있다. 이러한 추가의 비-전도 영역은, 추가의 방적돌기와 함께 사용되는 경우, 동일한 심축에서 1개 초과의 도관을 동시에 제조하는 것을 용이하게 할 수 있다. 하나의 양태에서, 본 발명은 3개 이상의 전도 영역 및 2개 이상의 비-전도 영역을 갖는 심축을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 4개 이상의 전도 영역 및 3개 이상의 비-전도 영역을 갖는 심축을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 5개 이상의 전도 영역 및 4개 이상의 비-전도 영역을 갖는 심축을 제공한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 제1 전도 영역, 제2 전도 영역, 및 제1 전도 영역과 제2 전도 영역 사이의 에어 갭을 갖는 심축을 제공한다. 이러한 심축은 다양한 방식으로 디자인될 수 있다; 심축에 대한 하나의 예시적 도시가 도 3E에 제공되며, 본 발명의 막대를 제조하기 위한 장치의 일부로서의 심축에 대한 예시적 도시가 도 6, 7 및 7A에 나타나 있다. 다수 방적돌기를 갖는 양태가 도 11에 나타나 있다. 예시적 양태에서, 전기적 전도 물질은 금속이다. 또 다른 예시적 양태에서, 금속은 강철 및 알루미늄 중에서 선택되는 일원이다. 하나의 예시적 양태에서, 심축의 각각의 전도 영역은 다른 전도 영역과 함께 정렬된다. 예시적 양태에서, 심축의 각각의 전도 영역은 동일한 속도로 회전할 수 있는 어셈블리에 부착된다. 이는 모터 어셈블리를 심축의 각각의 전도 영역에 부착시키고 각각의 모토가 동일한 속도로 작동하도록 함으로써 달성될 수 있다. 이는 또한 심축의 각각의 전도 영역을 동일한 모터에 연결시킴으로써 달성될 수도 있다.
전기방사가 완성된 후, 본 발명의 중합체 스캐폴드는 심축으로부터 떼어낸다. 시트 중합체 스캐폴드에 대해서는, 심축으로부터 시트를 벗겨낼 수 있다. 도관 중합체 스캐폴드에 대해서는, 심축을 모터 어셈블리로부터 꺼낸 후 도관을 떼어낼 수 있다. 일부 양태에서, 제거는 심축을 중간에서 단절시키거나 도관을 잘라내어 달성할 수도 있다. 막대 중합체 스캐폴드에 대해서는, 막대를 전도 영역의 금속 말단으로부터 벗겨낼 수 있다. 일부 예에서, 침착된 섬유의 길이는 동일하지 않아, 중합체 스캐폴드의 말단 또는 말단들에 톱날같은 테두리가 생길 수 있다. 임의로, 중합체 스캐폴드의 말단은 본질적으로 동일한 크기의 길이를 갖는 중합체 스캐폴드를 제조하도록 절단될 수 있다. 이러한 절단은 중합체 스캐폴드가 심축 상에 있을 때 수행되거나 심축으로부터 떼어낸 후 수행될 수 있다.
본원에 기술된 중합체 스캐폴드의 특징은 다양한 변수를 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 단독 또는 조합식으로 섬유 중합체 스캐폴드에 있는 섬유의 평균 직경을 감소시킬 수 있는 수개의 방법이 있다. 하나의 방법은 중합체 용액에 보다 많은 염을 가하는 것이다. 또한, 중합체 용액에 보다 극성인 용매를 사용하는 경우, 방적돌기와 심축 사이의 거리가 증가함에 따라 평균 섬유 직경이 감소되는 경향이 있다. 스캐폴드의 직경을 감소시키는 추가의 방법은 장치 전압을 증가시고 중합체 농도를 증가시키는 것을 포함한다.
다층 중합체 스캐폴드는 수개의 심축 회전을 완성함으로써 본원에 기술된 방법으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 다층 도관은 수개의 심축 회전을 완성함으로써 형성될 수 있다. 또한, 하나 이상의 타입의 층을 갖는 추가의 중합체 스캐폴드도 제조될 수 있다. 예시적 양태에서, 섬유의 원주 방향 정렬도 심축이 회전하는 속도를 변화시킴으로써 조절되거나 변화될 수 있다. 따라서, 내부에 세로 방향 정렬층을 갖고 외부에 원주 방향 정렬층을 갖는 중합체 스캐폴드가 생성될 수 있다. 특정 정렬의 각각의 층을 갖는 다층 유공 도관 스캐폴드를 제조하기 위해, 다양한 심축 및 회전 속도가 이용될 수 있다. 예시적 양태에서, 세로 방향 정렬 섬유로 구성된 루미날 (luminal) 층 및 원주 방향 정렬 섬유를 갖는 외층을 갖는 유공 도관 형태를 갖춘 섬유 스캐폴드가 제조된다. 이러한 스캐폴드을 제조하는 하나의 방법은 전술된 바와 같이 비-전도 영역을 갖는 심축을 이용하는 것을 수반한다. 심축은 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성된 도관 형태를 갖는 섬유 스캐폴드의 형성을 가능케하는 느린 속도로 회전된다. 이어서, 심축의 회전 속도가 증가되며, 이는 전기방사 섬유가 세로 방향으로 정렬된 섬유 도관 주위에 원주 방향으로 정렬되도록 한다. 또 다른 예시적 양태에서, 외층을 임의 정렬된 섬유로 구성되는 반면, 내층은 세로 방향으로 정렬된다. 이는, 외층을 형성할 때 심축이 섬유의 세로 방향 및 원주 방향 정렬을 막는 중간 속도로 회전하는 것을 제외하고는, 전술된 바와 동일한 방식을 이용해 달성될 수 있다.
II . b) 미세패턴화된 중합체 스캐폴드
제2 양태에서, 본 발명은 미세패턴의 중합체 스캐폴드를 포함하는 중합체를 제공한다. 미세패턴화와 함께, 중합체의 공간 및 기하학적 체계를 지형학적으로나 화학적으로 변형시키고 기판 표면에 마이크로-규모 특징을 만드는데 소프트 리소그래피가 이용된다 [Taylor, A.M., Nat Methods 2005, 2, (8), 599-605; Dow, J.A., J Cell Sci Suppl 1987, 8, 55-79; Kane, R.S., Biomaterials 1999, 20, (23-24), 2363-76]. 이러한 기술에 의해 제조된 중합체 스캐폴드는 세포 크기, 형태, 공간 체계, 증식 및 생존을 포함한 많은 양상의 세포 거동을 조절하는데 사용될 수 있다 [Chen, C.S., Science 1997, 276, (5317), 1428-8; Bhatia, S.N., Faseb J 1999, 13, (14), 1883-900; Deutsch, J., J Biomed Mater Res 2000, 53, (3), 267-76; Folch, A., Annu Rev Biomed Eng 2000, 2, 227-56; Whitesides, G.M., Annu Rev Biomed Eng 2001, 3, 335-73]. 폴리(디메틸실록산) (PDMS)는 고도의 재생성으로 미세패턴화될 수 있으며 세포 부착에 대해 유연한 기판을 제공하는 탄성중합체이다 [Wang, N., Cell Motil Cytoskeleton 2002, 52, (2), 97-106].
II . c) 중합체 스캐폴드의 정렬
본 발명의 중합체 스캐폴드는 정렬된 배향 또는 임의 배향을 가질 수 있다. 정렬된 배향에서, 중합체 스캐폴드를 포함하는 섬유의 50% 이상이 평균 정렬축을 따라 배향된다.
예시적 양태에서, 조성물은 본질적으로 세로 방향, 본질적으로 원주 방향, '십자방향' 중에서 선택되는 일원인 정렬을 갖는다. 섬유가 도관, 충전된 도관 또는 막대 형태의 중합체 스캐폴드의 장축 방향으로 정렬되는 경우, 세로방향 정렬이 존재한다. 섬유가 중합체 스캐폴드의 단축을 따라 정렬되는 경우, 원주 방향 정렬이 존재한다. 제1 중합체 섬유 중합체 스캐폴드의 평균 정렬축이 제1 중합체 스캐폴드에 인접한 제2 중합체 스캐폴드의 평균 정렬축에 대해 상대적인 각으로 존재하도록 조성물 중의 하나의 중합체 스캐폴드의 섬유가 정렬되는 경우, 십자방향 정렬이 존재한다. 세로 방향으로 정렬되거나 원주 방향으로 정렬된 중합체 스캐폴드는 하나 초과의 섬유층을 가질 수 있다. 십자방향 정렬 중합체 스캐폴드는 하나 초과의 섬유층을 필요로 한다.
또 다른 예시적 양태에서, 중합체 섬유는 섬유 번들의 중심축으로부터 표준편차를 가질 수 있다. 예시적 양태에서, 섬유의 표준편차는 약 0° 내지 약 1° , 약 0° 내지 약 3° , 약 0° 내지 약 5°, 약 0° 내지 약 10°, 약 0° 내지 약 15°, 약 0° 내지 약 20° 및 약 0° 내지 약 30° 중에서 선택되는 일원이다.
정렬된 중합체 스캐폴드는 세포의 세포골격 정렬, 세포 이동 및 세포 기능에 큰 영향을 끼친다. 정렬된 중합체 스캐폴드는 세포 이동을 유도하고 지시하여 조직 재생을 증진시킬 수 있다. 이러한 스캐폴드는 다양한 조직 재생, 예를 들어 근육, 피부, 혈관 조직, 신경 및 척수 재생을 위한 전망 있는 해결책이다. 예를 들어, 세로 방향으로 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드는 상해 갭을 가로질러 신경, 피부, 근육 및/또는 혈관 조직 성장을 증진시키고 구체적으로 지시할 수 있다.
정렬된 중합체 스캐폴드가 놓여지는 방향은 정렬된 중합체 스캐폴드가 대체하거나 개선하는 생물학적 기능에 영향을 끼칠 수 있다. 예를 들어, 정렬된 중합체 스캐폴드가 상처에 놓여지는 경우, 정렬된 중합체 스캐폴드가 상처의 장축에 대해 평행인 것보다는 수직인 경우, 상처 치유가 보다 신속하다. 예시적 양태에서, 정렬된 중합체 스캐폴드의 번들의 중심 장축은 정렬된 중합체 스캐폴드가 개선시키거나 대체하는 물질의 방향에 대해 수직으로 놓인다. 또 다른 양태에서, 정렬된 중합체 스캐폴드의 번들의 중심 장축은 정렬된 중합체 스캐폴드가 개선시키거나 대체하는 물질의 방향에 대해 평행하게 위치된다.
또 다른 예시적 양태에서, 본 발명의 정렬된 조성물 (예: 중합체 스캐폴드)은 생분해성 중합체를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 이방성 구조를 갖는 다른 타입의 조직, 예를 들어 신경, 피부, 혈관, 골격근, 심장근, 힘줄 및 인대의 형태형성을 이끄는데 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 정렬된 생분해성의 조성물은 또한 3차원 조직의 발달에도 사용될 수 있다. 전기방사되는 생분해성 섬유 중합체 스캐폴드를 사용하여, 신경 조직, 척수 조직, 피부 조직, 혈관 조직 및 근육 조직의 3차원 구조물이 생성될 수 있다.
예시적 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 하나 초과의 중합체 스캐폴드를 포함할 수 있다. 이러한 중합체 스캐폴드 각각은 조성물 중의 다른 중합체 스캐폴드 또는 스캐폴드들과는 동일하거나 상이한 정렬을 가질 수 있다.
예시적 양태에서, 조성물은 2개의 중합체 스캐폴드를 포함한다. 제1 중합체 스캐폴드는 도관의 형태를 갖고, 세로 방향으로 정렬된다. 제2 중합체 스캐폴드는 제1 중합체 스캐폴드의 외부를 둘러싸고 임의 방향, 원주 방향, 십자방향 및 세로 방향 중에서 선택되는 일원인 배향을 갖는다. 예시적 양태에서, 제2 중합체 스캐폴드의 배향은 임의 방향 및 원주 방향 중에서 선택되는 일원이다.
II . d) 중합체 스캐폴드의 형태/중합체 스캐폴드를 제조하는 방법
본 발명의 중합체 스캐폴드는 해결될 문제의 특성에 따라 다양한 형태로 형성될 수 있다.
본 발명의 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드는 다양한 치수를 가질 수 있다. 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 0.1 mm 내지 50 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 0.1 mm 내지 1 mm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 1mm 내지 1 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 1 cm 내지 10 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 10 cm 내지 50 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 1 cm 내지 5 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 2.5 cm 내지 15 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 5 mm 내지 6 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 8 mm 내지 3 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 10 cm 내지 25 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 0.5 cm 내지 2 cm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 길이는 0.1 cm 내지 2 cm이다.
본 발명의 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드는 다양한 섬유층으로 구성될 수 있다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 1 내지 약 2,000개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 1 내지 약 1,000개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 1 내지 약 500개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 1 내지 약 20개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 1 내지 약 10개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 5 내지 약 25개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 500 내지 약 1,500개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 10 내지 약 20개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 35 내지 약 80개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 10 내지 약 100개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 5 내지 약 600개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 10 내지 약 80개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 2 내지 약 12개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 60 내지 약 400개의 섬유층을 갖는다. 예시적 양태에서, 조성물은 약 1,200 내지 약 1,750개의 섬유층을 갖는다.
예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드는 시트 또는 막의 형태를 갖는다. 중합체 스캐폴드 막은 전기방사에 의해 제조될 수 있다. 막 내의 개개의 섬유는 수집기로서 회전 드럼을 사용하는 전기방사 동안 또는 기계적 단축 스트레칭 후 정렬될 수 있다.
또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드는 '십자방향' 시트의 형태를 갖는다. 십자방향 시트를 형성하기 위해, 정렬된 중합체 시트 또는 막의 층은 서로에 대해, 20°초과 160°미만, 30°초과 150°미만, 40°초과 140°미만, 50°초과 130°미만, 60°초과 120°미만, 70°초과 110°미만, 및 80°초과 100°미만 중에서 선택되는 일원인 각으로 정렬된다.
'십자방향' 시트를 제조하는 다양한 방법이 있다. 하나의 예시적 양태에서, 비-전도 영역을 포함하지 않는 회전 금속 드럼 수집기가 사용된다. 정렬된 섬유의 층이 드럼에 제조되며, 이어 드럼으로부터 벗겨낸다. 정렬층은 90°회전된 후 드럼에 다시 놓인다. 이어서, 드럼을 고속으로 회전시키면서 추가의 전기방사 섬유층을 가한다. 추가의 십자방향 층이 이러한 단계를 반복함으로써 가해질 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 비-전도 영역을 갖는 드럼이 사용된다. 여기서, 드럼은 비-전도 섹션에 섬유가 침착하여 세로 방향으로 정렬되도록 제1 기간 동안에는 서서히 회전된다. 이어서, 드럼은 섬유가 원주 방향으로 정렬되도록 빠르게 방사된다. 추가의 십자방향 층이 이러한 단계들을 반복함으로써 가해질 수 있다.
도관
또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드는 도관의 형태를 갖는다. 도관의 예시적 도시가 도 4A에 나타나 있으며, 도관의 단면도의 예시적 도시는 도 5A에 나타나 있다. 도관은 이의 길이 및 이의 내경 및 외경에 따라 다양한 크기를 가질 수 있다. 예시적 양태에서, 도관의 내부 공간은 본질적으로 섬유 중합체 스캐폴드가 없다. 이러한 변수는, 예를 들어 다양한 조직 크기 및 적용을 수용하도록 변화될 수 있다. 예시적 양태에서, 도관벽은 정렬된 섬유로 구성된다. 또 다른 예시적 양태에서, 섬유는 세로 방향으로 정렬되거나 원주 방향으로 정렬된다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관은 이은 자리를 갖는다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 이은 자리는 본질적으로 도관의 세로축에 대해 평행하다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관을 이은 자리를 갖지 않는다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관은 본질적으로 도관의 세로축에 대해 평행한 이은 자리를 갖지 않는다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽은 세로 방향으로 정렬된 섬유의 층으로 구성되고, 도관의 외벽은 비정렬된 섬유로 구성된다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관은 이의 세로축에 대해 평행한 이은 자리를 갖지 않으며, 도관의 내벽은 세로 방향으로 정렬된 섬유의 층으로 구성되고, 도관의 외벽은 비정렬된 섬유로 구성된다. 이러한 예에서 정의된 도관은 외피와 같은 임의 배향된 섬유의 존재에 의해 보다 큰 구조적 보전성을 갖도록 디자인된다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽은 비정렬된 임의 배향된 섬유로 구성되고, 도관의 외벽은 세로 방향으로 정렬된 섬유의 층으로 구성된다. 또 다른 예시적 양태에서, 이러한 도관은 이의 세로축에 대해 평행한 이은 자리를 갖지 않는다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽은 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성되고, 도관의 외벽은 원주 방향으로 정렬된 섬유로 구성된다. 또 다른 예시적 양태에서, 이러한 도관은 이의 세로축에 대해 본질적으로 평행한 축을 따라 이은 자리를 갖지 않는다.
예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 1 nm 내지 50,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 1 nm 내지 10,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 1 nm 내지 5,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 1 nm 내지 500 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 1 nm 내지 50 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 1 nm 내지 5 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 10 nm 내지 500 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 100 nm 내지 1,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 5,000 nm 내지 15,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 20,000 nm 내지 50,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 75 nm 내지 600 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내벽과 외벽 사이의 거리는 약 2,000 nm 내지 7,000 nm이다.
예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 1 nm 내지 50,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 1 nm 내지 10,000 nm이다. 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 1 nm 내지 5,000 nm이다. 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 1 nm 내지 500 nm이다. 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 1 nm 내지 50 nm이다. 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 1 nm 내지 5 nm이다. 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 10 nm 내지 500 nm이다. 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 100 nm 내지 1,000 nm이다. 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 5,000 nm 내지 15,000 nm이다. 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 20,000 nm 내지 50,000 nm이다. 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 75 nm 내지 600 nm이다. 예시적 양태에서, 도관의 내경은 약 2,000 nm 내지 7,000 nm이다.
본원에 기술된 도관은 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 예시적 양태에서, 도관은 전기방사되지 않는다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관은 임의의 비배향된 섬유 또는 임의의 비배향된 중합체 스캐폴드로 구성된다.
예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드 시트는 이은 자리를 갖는 도관을 제작하기 위해 회전된다. 먼저, 섬유 중합체 스캐폴드 시트가 전기방사된다. 시트를 포함하는 섬유는 전기방사 동안 정렬될 수 있다. 정렬된 전기방사 섬유를 제조하는 일부 방법은 접지된 수집기 기판으로서 회전 드럼을 사용하거나 또는 본원에 기술된 심축을 사용하는 것을 포함한다. 예시적 양태에서, 심축은 심축 (56A)이다. 시트를 포함하는 섬유는 또한 전기방사 후 기계적 단축 스트레칭에 의해 정렬될 수도 있다. 이어서, 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드는 도관을 형성하도록 심축 주위로 회전된다. 심축은 도관이 고정되기 전 또는 후에 떼어낼 수 있다. 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드의 세로축에 대해 평행한 시트의 2개 말단은 세로 방향으로 정렬된 이은 자리가 있는 도관을 생성하도록 고정된다. 예시적 양태에서, 시트는 심축 주위로 1회 초과로 회전되고, 시트의 하나의 말단은 세로 방향으로 정렬된 이은 자리가 있는 도관을 생성하도록 도관의 일부에 고정된다. 고정은 어닐링 (열), 접착 또는 봉합에 의해 달성된다. 접착제의 예는 용매 또는 생물학적 접착제, 예를 들어 피브린 밀봉제 및 콜라겐 겔을 포함한다.
본 발명에 대한 수개의 양태 (이의 예가 첨부된 도면에서 도시된다)에 대해 상세히 기술될 것이다. 본 발명이 하기 양태와 함께 기술되나, 본 발명을 이들 양태로 제한하고자 하는 것이 아님을 알 수 있을 것이다. 이와는 반대로, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 발명의 취지 및 범위 내에 포함될 수 있는 대체, 변경 및 등가물을 포함하고자 한다.
또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 이은 자리가 없는 도관을 제공한다. 도 1은 이러한 구조물을 제조하기 위한 전기방사 장치 (30)를 나타낸다. 용매에 용해된 중합체를 포함하는 중합체 용액 (38)이 시린지 어셈블리 (36) 내에 포함된다. 시린지 어셈블리 (36)는 컴퓨터 (34)가 압력 또는 유속을 조절함으로써 시린지를 빠져나가는 중합체 용액의 속도를 조절하는 시린지 펌프 어셈블리 (32)의 일부이다. 임의로, 상이한 유속이 선택된 방적돌기에 제공되고 조절될 수 있다. 유속은 중합체 스캐폴드의 목적하는 물리적 특성, 즉 막 두께, 섬유 직경, 세공 크기, 막 밀도 등에 따라 달라질 것이다.
시린지 펌프 어셈블리 (32)는 플랫폼 (44)에 놓인 방적돌기 (42)에 중합체 용액을 공급한다. 방적돌기는 방해 없이 제트 형성 및 운반을 가능하게 하는 팁 기하학을 갖는다. 약 10 내지 약 30 kV 범위의 하전이 와이어 (41A)를 통해 고전압 전원 (48)에 의해 방적돌기에 적용된다.
심축 (56A) (이는 도 3B에서 설명한 바와 같이, (55), (57A) 및 (57B)을 포함한다)은 전기장이 하전된 방적돌기와 심축 (56A) 사이에 발생되도록 방적돌기 (42) 사이에 위치된다. 전기장은 중합체 용액의 제트가 방적돌기로부터 분출되고 심축 (56A)을 향해 분무되도록 하여 마이크론 또는 나노미터 직경의 필라멘트 또는 섬유 (46)을 형성한다. 접지선 (41B) 및 (41C)를 사용하여 드릴 척을 접지시킨다.
심축 (56A)은 모터 (52)에 연결된 제1 드릴 척 (54) (비-전도 베어링 (60)에 부착됨) 및 제2 드릴 척 (54A) (비전도 베어링 (60A)에 부착됨)에 부착된다. 모터 (52)는, 모터가 심축 (56A)을 회전시키는 속도를 조절하는 속도 조절기 (50)에 연결된다. 임의로, 상이한 회전 속도가 제공될 수 있다. 회전 속도는 중합체 스캐폴드의 목적하는 물리적 특징, 즉 막 두께, 섬유 직경, 세공 크기, 막 밀도 등에 따라 변화할 것이다.
또 다른 예시적 양태에서, 본 발명으로 도 2의 전기방사 장치를 통해 제조되는 이은 자리가 없는 도관을 제공한다. 이러한 장치는 플랫폼 (44)을 지탱하는 타워 (40)을 또한 포함한다는 것을 제외하고는 도 1의 장치와 유사하다.
다층의 중합체 스캐폴드를 갖는 도관은 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 예시적 양태에서, 추가의 중합체 스캐폴드 시트는 본원에 기술된 도관의 외부 또는 내부 주위를 감쌀 수 있다. 예시적 양태에서, 이은 자리가 없거나 이은 자리가 있는 세로 방향으로 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드 도관이 제조된다. 이어서, 비정렬된 마이크로/나노섬유의 섬유 중합체 스캐폴드 시트를 세로 방향으로 정렬된 도관 주위에 위치시켜 세로 방향으로 정렬된 섬유 내층 및 비정렬된 섬유 외층을 갖는 2층 도관을 형성한다. 추가의 층 (3, 4, 5, 6개 등)을 갖는 도관이 이러한 방법으로 연장될 수 있다. 봉합제 또는 접착제를 임의로 중합체에 가하여 이러한 구조를 유지시킬 수 있다.
또 다른 예시적 양태에서, 이은 자리가 없거나 이은 자리가 있는 세로 방향으로 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드 도관이 제조된다. 이어서, 원주 방향으로 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드 시트를 세로 방향으로 정렬된 도관 주위에 위치시켜 세로 방향으로 정렬된 섬유 내층 및 원주 방향을 정렬된 섬유 외층을 갖는 2층 도관을 형성한다. 봉합제 또는 접착제를 임의로 이은 자리가 있는 중합체 스캐폴드에 가하여 이러한 구조를 유지시킬 수 있다.
또 다른 예시적 양태에서, 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성된 내벽 및 원주 방향으로 정렬된 섬유로 구성된 외벽을 갖는 이은 자리가 없는 섬유 중합체 스캐폴드 도관이 제조된다. 비-전도 영역을 측면에 배치시킨 2개의 전도 영역을 갖는 본원에 기술된 심축이 전기방사 동안 사용된다. 심축을 느린 속도로 회전시켜 세로 방향으로 정렬된 섬유의 균일한 침착을 가능하게 한다. 이어서, 심축을 고속으로 회전시켜 원주 방향으로 정렬된 섬유의 균일한 침착을 가능하게 한다. 그 결과, 세로 방향으로 정렬된 섬유 내층 및 원주 방향으로 정렬된 섬유 외층을 갖는 이은 자리가 없는 섬유 중합체 스캐폴드 도관이 제조된다.
또 다른 예시적 양태에서, 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성된 내벽 및 비정렬된 섬유로 구성된 외벽을 갖는 이은 자리가 없는 섬유 중합체 스캐폴드 도관이 제조된다. 비-전도 영역을 측면에 배치시킨 2개의 전도 영역을 갖는 본원에 기술된 심축이 전기방사 동안 사용된다. 심축을 느린 속도로 회전시켜 세로 방향으로 정렬된 섬유의 균일한 침착을 가능하게 한다. 이어서, 심축을 침착된 섬유의 세로 방향 및 원주 방향 정렬 모두를 방해하는 중간 속도로 회전시킨다. 그 결과, 세로 방향으로 정렬된 섬유 내층 및 임의 정렬된 섬유 외층을 갖는 이은 자리가 없는 섬유 중합체 스캐폴드 도관이 제조된다.
막대
또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드는 막대 형태를 갖는다. 막대의 예시적 도면이 도 4B에 제공되고, 막대의 단면도에 대한 예시적 도면이 도 5B에 제공된다. 막대는 이의 길이 및 직경에 따라 다양한 크기를 가질 수 있다. 또한, 막대의 밀도에 영향을 미치는 막대 내의 섬유의 수도 조절될 수 있다. 이러한 변수는, 예를 들어 다양한 조직 크기 및 적용에 적합하도록 조절될 수 있다. 예시적 양태에서, 막대는 정렬된 섬유로 구성된다. 또 다른 예시적 양태에서, 섬유는 세로 방향으로 정렬되거나 원주 방향으로 정렬된다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대는 이은 자리를 갖는다. 또 다른 양태에서, 막대의 이은 자리는 막대의 세포축에 대해 본질적으로 평행하다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대는 이은 자리가 없다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대는 도관의 세로축에 대해 본질적으로 평행한 이은 자리가 없다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대는 비정렬된 섬유로 구성된 도관에 의해 가려지는 세로 방향으로 정렬된 섬유의 층을 포함한다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대는 세로축에 대해 평행한 이은 자리가 없으며, 막대는 비정렬된 섬유로 구성된 도관으로 가려지는 세로 방향으로 정렬된 섬유의 층을 포함한다. 이러한 예에서 정의되는 물질은 외피와 같은 임의 배향된 섬유의 존재에 의해 보다 큰 구조적 보전성을 갖도록 디자인된다. 또 다른 예시적 양태에서, 도관은 세로 방향으로 정렬된 섬유의 층으로 구성되는 반면, 막대는 비정렬된 임의 배향된 섬유로 구성된다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대는 이의 세로축에 대해 평행한 이은 자리가 없다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대는 원주 방향으로 정렬된 섬유로 구성된 도관으로 가려진 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성된다. 또 다른 예시적 양태에서, 이러한 막대는 이의 세로축에 대해 평행인 이은 자리가 없다.
또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 1 nm 내지 50,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 1 nm 내지 10,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 1 nm 내지 5,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 1 nm 내지 500 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 1 nm 내지 50 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 1nm 내지 5 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 10 nm 내지 500 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 100 nm 내지 1,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 5,000 nm 내지 15,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 20,000nm 내지 50,000 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 75 nm 내지 600 nm이다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대의 직경은 2,000 nm 내지 7,000 nm이다.
본원에 기술된 막대는 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 예시적 양태에서, 막대는 전기방사되는 것이 아니다. 또 다른 예시적 양태에서, 막대는 임의의 비배향된 섬유이거나 임의의 비배향된 중합체 스캐폴드로 구성된다.
예시적 양태에서, 섬유 중합체 스캐폴드 시트는 이은 자리가 있는 막대를 제조하도록 회전된다. 먼저, 섬유 중합체 스캐폴드 시트가 전기방사된다. 시트를 포함하는 섬유는 전기방사 동안 정렬될 수 있다. 정렬된 전기방사 섬유를 생성하는 일부 방법은 접지된 수집기 기판으로서 회전 드럼을 사용하거나 본원에 기술된 심축을 사용하는 것을 포함한다. 예시적 양태에서, 심축은 심축 (56B)이다. 또한, 시트를 포함하는 섬유는 전기방사 후 기계적 단축 스트레칭에 의해 정렬될 수도 있다. 이어서, 정렬된 섬유 중합체 섬유 중합체 스캐폴드 시트는 막대를 형성하도록 그 자신 위에 회전된다. 이어서, 중합체 스캐폴드 시트의 말단은 막대의 일부에 고정되어 세로 방향으로 정렬된 이은 자리가 있는 막대를 생성한다. 시트는 어닐링 (열), 접착 또는 봉합에 의해 함께 고정될 수 있다. 접착제의 예는 용매 또는 생물학적 접착제, 예를 들어 피브린 밀봉제 및 콜라겐 겔을 포함한다.
본 발명에 대한 수개의 양태 (이의 예가 첨부된 도면에서 도시된다)에 대해 상세히 기술될 것이다. 본 발명이 하기 양태와 함께 기술되나, 본 발명을 이들 양태로 제한하고자 하는 것이 아님을 알 수 있을 것이다. 이와는 반대로, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 발명의 취지 및 범위 내에 포함될 수 있는 대체, 변경 및 등가물을 포함하고자 한다.
또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 이은 자리가 없는 막대를 제공한다. 도 6은 이러한 구조물을 제조하기 위한 전기방사 장치 (80)를 나타낸다. 용매에 용해된 중합체를 포함하는 중합체 용액 (38)이 시린지 어셈블리 (36) 내에 포함된다. 시린지 어셈블리 (36)는 컴퓨터 (34)가 압력 또는 유속을 조절함으로써 시린지를 빠져나가는 중합체 용액의 속도를 조절하는 시린지 펌프 어셈블리 (32)의 일부이다. 임의로, 상이한 유속이 선택된 방적돌기에 제공되고 조절될 수 있다. 유속은 중합체 스캐폴드의 목적하는 물리적 특성, 즉 막 두께, 섬유 직경, 세공 크기, 막 밀도 등에 따라 달라질 것이다.
시린지 펌프 어셈블리 (32)는 플랫폼 (44)에 놓인 방적돌기 (42)에 중합체 용액을 공급한다. 방적돌기는 방해 없이 제트 형성 및 운반을 가능하게 하는 팁 기하학을 갖는다. 약 10 내지 약 30 kV 범위의 하전이 와이어 (41A)를 통해 고전압 전원 (48)에 의해 방적돌기에 적용된다.
심축 (56B) (이는 도 3C에서 설명한 바와 같이, (57A), (57B) 및 (58)을 포함한다)은 방적돌기 (42) 아래에 위치된다. 심축 (56B)은 제1 전기적 전도 영역 (57A) 및 제1 전기적 전도면 (57C), 제2 전기적 전도 영역 (57B) 및 제2 전기적 전도면 (57D)를 지니어, 전기장이 하전된 방적돌기 및 심축 (56B) 사이에 생긴다. 전기장은 중합체 용액의 제트가 방적돌기로부터 분출되고 심축 (56B)을 향해 분무되도록 하여 (58) 내에 마이크론 또는 나노미터 직경의 필라멘트 또는 섬유를 형성한다. 접지선 (41B) 및 (41C)를 사용하여 드릴 척을 접지시킨다.
제1 전기적 전도 영역 (57A)은 제1 드릴 척 (54) (비-전도 베어링 (60)에 부착됨)에 부착되고, 제2 전기적 전도 영역 (57B)는 모터 (52A)에 연결된 제2 드릴 척 (54A) (비-전도 베어링 (60A)에 부착됨)에 부착된다. 모터 (52) 및 (52A)는 모터 (52)는, 모터가 심축 (56B)을 회전시키는 속도를 조절하는 속도 조절기 (50A)에 연결된다. 임의로, 상이한 회전 속도가 제공될 수 있다. 회전 속도는 중합체 스캐폴드의 목적하는 물리적 특징, 즉 막 두께, 섬유 직경, 세공 크기, 막 밀도 등에 따라 변화할 것이다.
또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 도 7의 전기방사 장치를 통해 제조되는이은 자리가 없는 막대를 제공한다. 이러한 장치는 도 6의 장치와 유사하나 플랫폼 (44)를 지탱하는 타워 (40)을 포함한다.
다층의 중합체 스캐폴드를 갖는 막대가 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 예시적 양태에서, 추가의 중합체 스캐폴드 시트가 본원에 기술된 막대의 외부의 주위를 감쌀 수 있다. 예시적 양태에서, 이은 자리가 있거나 없는 세로 방향으로 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드 막대가 제조된다. 이어서, 비정렬된 마이크로/나노섬유의 섬유 중합체 스캐폴드 시트를 세로 방향으로 정렬된 막대 주위에 위치시켜 세로 방향으로 정렬된 섬유 내층 및 비정렬된 섬유 외층을 갖는 2층의 중합체 스캐폴드를 형성한다. 추가의 층 (3, 4, 5, 6개의 층)을 갖는 막대가 이러한 방식으로의 가능한 연장물이다. 이러한 구조를 유지하기 위해 봉합제 또는 접착제를 임의로 중합체에 가할 수 있다. 이러한 다층의 막대 양태 중 일부는 또한 '충전된 도관'으로도 불릴 수 있다.
또 다른 예시적 양태에서, 이은 자리가 있거나 없는 세로 방향으로 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드 막대가 제조된다. 이어서, 원주 방향으로 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드 시트를 세로 방향으로 정렬된 막대 주위에 위치시켜 세로 방향으로 정렬된 섬유 내층 및 원주 방향으로 정렬된 섬유 외층을 갖는 2층 막대를 형성한다. 이러한 구조물을 유지시키기 위해 봉합제 또는 접착제를 이은 자리가 있는 중합체 스캐폴드에 임의로 가할 수 있다.
또 다른 예시적 양태에서, 이은 자리가 없는 섬유 중합체 스캐폴드는 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성된 내부 막대 및 원주 방향으로나 임의적으로 정렬된 섬유로 구성된 외부 도관 또는 슬리브를 갖는다. 이은 자리가 없는 세로 방향으로 정렬된 섬유 중합체 막대 스캐폴드가 본원에 기술된 바와 같이 제조된다. 원주 방향으로 정렬된 섬유의 외부 도관 또는 슬리브를 형성하기 위해, 심축의 회전은 세로 방향으로 정렬된 섬유 중합체 막대 주위에 원주 방향으로 정렬된 섬유의 균일한 침착이 가능하도록 고속으로 증가된다. 달리, 임의 정렬된 섬유의 외부 도관 또는 슬리브를 형성하기 위해, 심축의 회전은 세로 방향으로 정렬된 섬유 중합체 막대에 침착되는 섬유의 세로 방향으로의 정렬 및 원주 방향으로의 정렬을 방지하는 중간 속도로 증가된다. 심축으로부터 스캐폴드 막대를 떼어내면 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성된 내부 막대 및 원주 방향으로 정렬되거나 비정렬된 섬유로 구성된 외부 도관 또는 슬리브를 갖는 이은 자리가 없는 섬유 중합체 스캐폴드가 제조된다.
충전된 도관
예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드는 충전된 도관 형태를 갖는다. 충전된 도관은 하기와 같이 제조된다: (1) 도관은 본원에 기술된 바와 같이 형성되고; (2) 충전된 도관을 위한 충전제 물질은 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성된다. 이러한 충전 물질은 느슨하고 매우 다공성인 물질일 수 있다. 예시적 양태에서, 충전제 물질은 정렬된 섬유의 박막으로서 전기방사된다. 이어서, 이 물질은 도관의 장축에 대해 평행하게 정렬된 섬유의 배향을 갖는 본원에 기술된 도관 내에 직접적으로 삽입된다. 또 다른 예에서, 세로 방향으로 정렬된 섬유의 막대는 본원에 기술된 바와 같이 제조된다. 이어서, 이러한 막대는 (1) 완전히 형성된 도관 내에 직접적으로 삽입되거나 (2) 심축 (섬유 시트는 심축의 주위를 회전한다)으로서 사용된 후 봉합제 또는 접착제로 밀봉되어 충전된 도관을 형성한다.
II . f) 추가 성분 또는 중합체 스캐폴드 성분
II . f1 ) 세포
예시적 양태에서 본원에 기술되는 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드는 세포를 추가로 포함한다. 세포는 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드 표면에 존재하거나 안에 삽입되거나 얽히게 될 수 있다. 예시적 양태에서, 세포는 본 발명의 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드에 공유적으로 부착되거나 비-공유적으로 결합된다. 일부 양태에서, 세포는 새로운 조직의 성장을 촉진시키는데 사용된다. 예시적 양태에서, 세포는 자가 (공여자 및 수령자가 동일한 개체이다), 동종이형 (공여자와 수령자가 다른 종이다) 및 이종 (공여자와 수령자가 다른 종이다) 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 세포는 줄기 세포가 아니다. 예시적 양태에서, 세포는 줄기 세포이다. 예시적 양태에서. 세포는 성체 줄기 세포 및 배아 줄기 세포 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 성체 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC) (골수로부터 유도됨) 또는 성체 줄기 세포 (ADAS)로부터 유도되는 지방세포이다. 또 다른 예시적 양태에서, 줄기 세포는 단능성 (unipotent), 다능성 (multipotent), 다능 (pluripotent) 및 분화전능 (totipotent) 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 세포는 전구 세포이다. 또 다른 예시적 양태에서, 전구 세포는 섬유아세포, 근아세포, 신경 전구 세포, 조혈 전구 세포, 및 내피 전구 세포이다. 또 다른 예시적 양태에서, 세포는 근아세포 및 근육 전구 세포 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 세포는 성체 근육 세포, 근육 전구 세포, 근육 줄기 세포 또는 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 세포는 성체 혈관 세포, 혈관 전구 세포, 혈관 줄기 세포 또는 이의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 세포는 성체 신경 세포, 아교세포, 신경 전구 세포, 아교 전구 세포, 신경 줄기 세포, 신경상피세포 또는 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 세포는 슈반 (Schwann) 세포, 섬유아세포 및 혈관 세포 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 세포는 성체 피부 세포, 피부 전구 세포 및 피부 줄기 세포 중에서 선택되는 일원이다. 최근, 세포 성장, 기능 및 체계화를 이끌기 위한 나노섬유 물질의 실현성이 섬유아세포, 혈관 세포 및 중간엽 줄기 세포에 대해 입증되었다 [Zong, X., Biomacromoleucles 2003, 4, (2), 416-23; Li, D., Adv Mater 2004, 16, (4), 1151-1170; Boland, E.D., Front Biosci 2004, 9, 1422-32; Bhattarai, S.R., Biomaterials 2004, 25, (13), 2592-602; Yoshimoto, H., Biomaterials 2003, 24, (12), 2077-82].
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 세포-삽입된 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드가 3차원 조직의 발달에 사용될 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 섬유아세포-삽입된 중합체 스캐폴드가 근육 조직을 발달시키는데 사용될 수 있으며, 신경 세포-삽입된 중합체 스캐폴드가 신경 조직을 발달시키는데 사용될 수 있으며, 혈관 세포-삽입된 중합체 스캐폴드가 혈관 조직을 발달시키는데 사용될 수 있으며, 척수 세포-삽입된 중합체 스캐폴드가 척수 조직을 발달시키는데 사용될 수 있으며, 피부 세포-삽입된 중합체 스캐폴드가 피부 조직을 발달시키는데 사용될 수 있다.
세포는 전기방사 후 또는 조립 후에 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드에 삽입될 수 있다.
II . f2 ) 생물분자
생물분자 (예: 핵산, 아미노산, 슈가 또는 지질)이 본원에 기술된 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드와 공유적으로 부착되거나 비-공유적으로 결합될 수 있다. 예시적 양태에서, 생물분자는 수용체 분자, 세포외 기질 성분 또는 생화학적 인자 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 생화학적 인자는 성장 인자 및 분화 인자 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 생물분자는 글리코아미노글리칸 및 프로테오글리칸 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 생물분자는 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 이의 배합물 중에서 선택되는 일원이다.
또 다른 예시적 양태에서, (생물분자이거나 아닐 수 있는) 제1 분자가 본 발명의 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드에 공유적으로 부착된다. 이러한 제1 분자는 제2 분자와 상호작용하는데 사용될 수 있다. 예시적 양태에서, 제1 분자는 링커이고, 제2 분자는 수용체 분자, 생화학적 인자, 성장 인자 및 분화인자 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 제1 분자는 헤파린, 헤파란 설페이트, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 예시적 양태에서, 제2 분자는 수용체 분자, 생화학적 인자, 성장 인자 및 분화 인자 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 제1 분자는 링커를 통해 공유적으로 부착되고, 상기 링커는 디-아미노 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 글리콜) 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 헤파린에 결합하지 않는 생물분자에 대해, 중합체 스캐폴드에 대한 직접적 결합 또는 링커 (예: PEG, 아미노-PEG 및 디-아미노-PEG)를 통한 결합이 또한 실행가능하다. 또 다른 예시적 양태에서, 생물분자는 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 비트로넥틴, 피브리노겐, 폴리리신, 기타 세포 부착 촉진 폴리펩타이드 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원인 세포외 기질 성분이다. 또 다른 예시적 양태에서, 상기 성장 인자는 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 뇌-유도된 향신경성 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 전환 성장 인자 베타, 혈관 내피 성장 인자, 표피 성장 인자, 각질형성세포 성장 인자 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 예시적 양태에서, 생물분자는 간질세포 유도된 인자, 소닉 헤지호그, 골 형태형성 단백질, 노치 리간드, Wnt 및 이들의 배합물 중에서 선택되는 일원이다.
본 발명의 중합체 스캐폴드에 공유적으로 부착되는 제1 분자는 신경돌기 성장을 자극하기 위해 생물분자 (예: 성장 인자 및/또는 ECM 성분)과 상호작용하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드는 상처 치유에 사용될 수 있으며, 생물분자는 세포외 기질 성분, 성장 인자 및 분화 인자 중에서 선택되는 일원이다. 상처 치유를 증진시키기 위한 잠재적 인자의 예는 표피 성장 인자 (EGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 및 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF)를 포함한다.
생물분자는 전기방사 후 또는 조립 후에 본 발명의 조성물에 삽입될 수 있다. 이러한 생물분자는 블렌딩에 의해, 직접적 또는 다양한 링커를 통한 공유 부착에 의해, 또는 흡착에 의해 삽입될 수 있다.
II . f3 ) 약제학적으로 허용되는 부형제/약제학적 제형
또한, 약제학적으로 허용되는 부형제가 본 발명의 중합체 스캐폴드를 갖는 조성물에 포함될 수 있다. 예시적 양태에서, 본 발명은 a) 본 발명의 중합체 스캐폴드; 및 b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 제형물인 조성물을 제공한다. 예시적 양태에서, 약제학적 제형물은 약제학적으로 허용되는 부형제가 존재하는 중합체 스캐폴드이다. 예시적 양태에서, 약제학적으로 허용되는 부형제는 불활성 희석제, 과립화제, 붕해제, 결합제, 윤활제 및 시간 지연 물질 중에서 선택되는 일원이다.
본 발명의 약제학적 제형물은 선택된 경로의 투여에 적합한 다양한 형태를 취할 수 있다. 당업자는 본원에 기술된 화합물을 삽입하는 무독성의 약제학적 제형물을 제조하는데 이용될 수 있는 다양한 합성 방법을 알 수 있을 것이다. 당업자는 본 발명의 화합물의 용매화물을 제조하는데 사용될 수 있는 다양한 무독성의 약제학적으로 허용되는 용매, 예를 들어 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 광유, 식물성유 및 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 알 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물은 통상의 무독성인 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하는 투여 단위 제형물로 외과적 절개를 통해, 국소적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있다.
또 다른 예시적 양태에서, 본원에 기술된 조성물 및/또는 중합체 스캐폴드는 키트의 일부이다. 이러한 키트는 본 발명의 방법을 교시하고/하거나 키트의 성분들에 대한 사용을 기술하는 설명서를 포함할 수 있다.
III . 조성물의 용도
또 다른 양상으로, 본 발명의 조성물 (예: 중합체 스캐폴드)는 생물학적 기능을 대체, 재생 또는 증진시키기 위해 피검체에 사용될 수 있다. 예시적 양태에서, 조성물은 피검체의 신경 기능 또는 근육 기능 또는 피부 기능 또는 혈관 기능을 대체, 재생 또는 증진시킨다. 또 다른 양상으로, 본 발명은 (a) 피검체를 치료학적 유효량의 본 발명의 조성물과 상해를 치료하기에 충분하게 접촉시키는 것을 포함하여, 피검체의 상해를 치료하는 방법을 제공한다. 예시적 양태에서, 조성물은 피검체와 상해 부위에서 접촉된다. 또 다른 예시적 양태에서, 상해는 심각한 신경 상해, 손상된 신경 상해, 심각한 근육 상해, 손상된 근육 상해, 심각한 혈관 상해, 손상된 혈관 상해, 피부 상처 및 타박 피부 상해 중에서 선택되는 일원이다. 또 다른 양상으로, 본 발명은 (a) 피검체를 치료학적 유효량의 본 발명의 조성물과 이의 조직 성장을 촉진시키기에 충분하게 접촉시키는 것을 포함하여, 피검체의 조직을 성장시키는 방법을 제공한다. 예시적 양태에서, 조직은 근육 조직, 혈관 조직, 신경 조직 및 피부 조직 중에서 선택되는 일원이다. 조성물은 이들의 효능을 시험하기 위해 시험관 내 또는 생체 내에서 사용될 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 피검체는 동물이다. 또 다른 예시적 양태에서, 동물은 사람, 개, 고양이, 말, 래트 (rat) 및 마우스 (mouse) 중에서 선택되는 일원이다.
하기는 본 발명의 조성물의 이용에 대한 예시이다.
III . a) 신경을 수반하는 이용
예시적 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 심각하거나 손상된 신경을 대체하는데 사용될 수 있다. 하나의 이용이 손상된 말초신경을 재생시키는 것이다. 말초신경 손상은 외상, 자가면역 질환, 당뇨병 등에 의해 발생될 수 있다. 말초신경은 척수로부터 신체 전반에 걸친 다양한 최종 타겟으로 뻗치는 신경 섬유로 구성된다. 말초 신경이 상해되면 신경의 최종 타겟에서의 운동 및 감각 기능의 적어도 일부가 상실된다. 대부분의 심각한 형태의 상해에서, 신경은 완전히 위험에 처하게 되며, 커다란 상해 갭 (gap)이 근위 신경 스텀프와 원위 신경 스텀프 사이에 형성된다. 근위 말단에 있는 신경 섬유는 재생가능하나 수 mm보다 큰 갭에 대해서는 그렇게 효과적으로 재생가능하지 않다. 따라서, 근위 신경 절편으로부터 원위 신경 절편으로 신경 섬유를 재생시키는 것을 효과적으로 유도하는 물질을 사용하여 상해 갭을 메워야 한다.
말초 신경이 손상되어 더 이상 연속적이지 않은 임상적 상황에서, 본원에 기술된 세로 방향으로 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드 중 하나 이상을 사용할 수 있다. 중합체 스캐폴드는 도관, 충전된 도관 또는 막대의 형태일 수 있다. 신경 불연속성을 일으키는 상해는 일반적으로 수족에서 발생한다. 정렬된 섬유 스캐폴드를 이들 영역에 삽입하여 상해 갭을 가로지르는 신경 재생을 증진시키고 수족에 대한 운동 및 감각 기능을 되살릴 수 있다. 스캐폴드는 신경 스텀프 사이의 갭이 직접적인 재부착을 막기에 충분히 큰, 불연속적으로 손상된 신경을 수반하는 모든 상황에서 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 스캐폴드는 신경의 2개 말단을 메우고, 신경 절편에 봉합되며, 근위 신경 절편으로부터 원위 신경 절편으로 신경 섬유를 재생시킨다. 스캐폴드를 구성하는 세로 방향으로 정렬된 섬유는 본질적으로 신경 섬유와 동일한 배향으로 정렬된다. 따라서, 정렬된 스캐폴드 섬유는 상해 갭을 가로질러 신경 섬유를 효과적으로 재생시키는 구체적인 안내 역할을 제공할 수 있다. 세로 방향으로 정렬된 도관 중합체 스캐폴드는 우선적으로 근위 스텀프의 말초를 따라 위치된 신경 섬유의 유도된 성장을 증진시킴으로써 기능을 수행할 수 있다. 막대 형태 및 충전된 도관 형태의 세로 방향으로 정렬된 중합체 스캐폴드는 모든 신경 섬유를 근위 신경 절편으로부터 원위 신경 절편으로 연속적으로 유도할 수 있다. 또한, 중합체 스캐폴드에 신경 섬유 재생을 더욱 향상시키고 유도하기 위한 생물분자, 예를 들어 세포외 기질 단백질, 폴리펩타이드, 성장 인자 및/또는 분화 인자가 추가될 수 있다. 중합체 스캐폴드에 첨가될 수 있는 세포외 기질 단백질은 콜라겐, 라미닌 및 피브로넥틴을 포함한다. 중합체 스캐폴드에 첨가될 수 있는 성장 인자는 염기성 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자 및 혈관 내피 성장 인자를 포함한다. 중합체 스캐폴드에 첨가될 수 있는 폴리펩타이드는 폴리리신, RGD-기초 폴리펩타이드 및 라미닌 유사 폴리펩타이드를 포함한다. 중합체 스캐폴드에 첨가될 수 있는 기타 생물분자는 헤파린 및 헤파란 설페이트 프로테오글리칸을 포함한다. 이들 생물분자는 또한 라미닌, VEGF 및 BFGF를 섬유 중합체 스캐폴드에 비-공유적으로 갇히게 하는데 사용될 수도 있다.
스캐폴드는 환자의 신경 상해에 대한 특정한 요구조건에 부합하는 형태를 취하고 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 도관, 충전된 도관의 내경 및 막대 형태 중합체 스캐폴드의 전체 직경은 1 mm 내지 약 20 mm일 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 직경은 약 2 mm 내지 약 8 mm일 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 직경은 약 5 mm 내지 약 10 mm일 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 직경은 약 2 mm 내지 약 15 mm일 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 직경은 약 12 mm 내지 약 18 mm일 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 직경은 상해된 신경에 부합하는 특정 크기를 갖도록 약 1 mm, 1.5 mm, 2 mm, 2.5 mm, 3 mm, 3.5 mm, 4 mm, 4.5 mm, 5 mm, 5.5 mm, 6 mm, 6.5 mm, 7 mm, 7.5 mm, 8 mm, 8.5 mm, 9 mm, 9.5 mm, 10 mm, 10.5 mm, 11 mm, 11.5 mm, 12 mm, 12.5 mm, 13 mm, 13.5 mm, 14 mm, 14.5 mm, 15 mm, 15.5 mm, 16 mm, 16.5 mm, 17 mm, 17.5 mm, 18 mm, 18.5 mm, 19 mm, 19.5 mm, 20 mm, 21 mm일 있다. 스캐폴드의 길이는 넓은 범위의 상해 갭을 수용하도록 약 1 cm 내지 약 50 cm로 다양할 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 스캐폴드 길이는 약 4 cm 내지 약 15 cm일 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 스캐폴드 길이는 약 14 cm 내지 약 30 cm일 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 스캐폴드 길이는 약 1 cm 내지 약 5 cm일 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 스캐폴드의 길이는 약 2 cm 내지 약 8 cm일 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 스캐폴드 길이는 약 1 cm, 1.5 cm, 2 cm, 2.5 cm, 3 cm, 3.5 cm, 4 cm, 4.5 cm, 5 cm, 5.5 cm, 6 cm, 6.5 cm, 7 cm, 7.5 cm, 8 cm, 8.5 cm, 9 cm, 9.5 cm, 10 cm, 10.5 cm, 11 cm, 11.5 cm, 12 cm, 12.5 cm, 13 cm, 13.5 cm, 14 cm, 14.5 cm, 15 cm, 15.5 cm, 16 cm, 16.5 cm, 17 cm, 17.5 cm, 18 cm, 18.5 cm, 19 cm, 19.5 cm, 20 cm, 20.5 cm일 수 있다. 모든 형태의 세로 방향으로 정렬된 섬유가, 신경 상해에 대해 현재 가장 널리 사용되고는 있으나 완벽한 형태의 처리와는 거리가 먼 신경 자가이식편에 대한 대체물로 사용될 수 있다. 스캐폴드는 또한 통용하는 합성 신경 유도 제품에 의해 보호되는 범위를 넘어 긴 상해 갭을 메우는데 사용될 수도 있다. 또한, 상해 갭은 3 cm를 넘을 수 있다. 예시적 양태에서, 피검체는 긴 상해 갭을 가지며, 막대 형태 중합체 스캐폴드 또는 충전된 도관 중합체 스캐폴드가 긴 상해 갭을 가로질러 신경을 재생시키기 위한 가장 바람직한 스캐폴드 형태일 수 있다.
말초 신경이 손상되었으나 심각하지는 않은 임상적 상황에서, 본원에 기술된 세로 방향으로 정렬된 섬유 스캐폴드는 시트 형태를 취하고 신경 주위에서 랩으로 사용될 수 있으며/있거나 막대 또는 충전된 도관 형태를 취하고 손상된 영역으로 직접적으로 삽입될 수 있다. 세로 방향으로 정렬된 섬유 스캐폴드에는 또한 본원에 기술된 바와 같은 유사한 생물분자가 가해질 수도 있다.
본 발명에서 기술되는 스캐폴드의 또 다른 이용은 손상된 척수를 재생시키는 것이다. 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드가 척수 조직을 메우기 위해 손상된 영역으로 삽입될 수 있다. 정렬된 섬유 중합체 스캐폴드는 척추 신경 섬유의 재생을 향상시키고 이를 지시할 수 있다. 스캐폴드에는 또한 생물분자 및/또는 세포가 가해질 수도 있다. 생물분자는 상술된 세포외 기질 단백질, 폴리펩타이드 성장 인자 및/또는 분화 인자를 포함할 수 있으며, 척수 재생을 개시하고 향상시킬 수 있다. 세포는 신경 줄기 세포, 아교 세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함할 수 있다. 세포는 상실된 뉴런 및 아교 세포를 대체할 수 있고/있거나 척추 신경의 성장을 향상시킬 수 있다.
또 다른 예시적 양태에서, 세로 방향으로 정렬된 중합체 도관 스캐폴드는 상해 갭을 가로질러 신경 재생을 촉진하도록 신경 유도 도관으로서 사용된다.
III . b) 피부를 수반하는 이용
본 발명의 중합체 스캐폴드는 임상적이고 개인적인 상처 보호 및 연조직 재생에 유용할 수 있다. 본 발명의 하나의 양상으로, 중합체 스캐폴드 시트는 외적인 피부 상처를 위한 상처 드레싱 또는 이식편으로서 사용된다. 임상적 세팅에서, 이들 시트는 외상, 회상, 궤양, 찰과상, 열창, 수술 기타으로부터 발생되는 상처를 치료하는데 사용될 수 있다. 외과 의사는 상처 부위를 덮고 보호하기 위해, 상실되거나 손상된 피부 조직을 임시적으로 대체하기 위해, 또한 손상된 부위로 새로운 조직 재생을 유도하고 상처를 치유를 유도하기 위해 이러한 이식편을 사용할수 있다. 임상적 세팅에서, 마이크로/나노섬유 시트는 봉합제, 접착제 또는 위에 놓이는 밴드를 사용하여 상처난 부위에 고정될 수 있다. 이러한 마이크로/나노섬유 상처 드레싱은 상처의 크기와 부합되도록 절단되거나 상처 가장자리와 겹칠 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상으로, 중합체 스캐폴드는 중합체 스캐폴드 밴드를 만들기 위해 시트를 접착제 백킹 (backing)과 조합시킴으로써 개인적/가정적 간호에 맞춰질 수 있다. 접착 섹션은 상처난 부위에 중합체 스캐폴드 시트를 적절히 고정시킬 것이고 섬유가 조직과 함께 분해하거나 녹는 경우에는 제거될 수 있다. 또한, 중합체 스캐폴드 시트는 액체 또는 겔 접착제로 고정될 수도 있다.
본 발명의 또 다른 양상으로, 유체를 흡수하고 큰 상처를 보호하기 위해 커다란 중합체 스캐폴드 시트가 거즈로서 사용될 수 있다. 이러한 중합체 스캐폴드 거즈는 상처난 부위 주위를 감싸거나 테이프로 고정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상으로, 중합체 스캐폴드 시트는 양막 낭의 상처, 위장관 또는 점막의 궤양, 잇몸 손상 또는 퇴축, 체내 수술 절개 또는 생검 등과 같은 체내 연조직 상처를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 중합체 스캐폴드 이식편은 손상된 조직 부위를 채우거나 가릴 위치에 봉합되거나 접착될 수 있다.
중합체 스캐폴드는 상처 치유에 유용한 다수의 특징을 갖는다. 먼저, 나노섬유를 포함하는 본원에 기술된 중합체 스캐폴드는 나노-다공성이고 통기성이다. 이들은 미생물 및 감염성 입자가 가로질러 통과하는 것은 방지하나 자연적 상처 치유에 중요한 공기 흐름 및 습기 침투는 가능하게 한다.
두 번째로, 본 발명의 섬유는 생분해성이므로 일시적인 상처 보호에 이어 새로운 조직의 종국적인 내부성장을 가능하게 한다. 중합체 스캐폴드 성처 드레싱을 위한 물질의 선택은 기계적 강도 및 분해/조직 재생 속도를 포함한 천연 조직 특성과 조화되도록 결정될 수 있다.
세 번째로, 중합체 스캐폴드는 분해 시 방출될 수 있는 다양한 인자가 삽입되거나 이와 결합될 수 있다. 이들 인자는, 이로 제한됨이 없이, 상처 치유에 유익한 것으로 밝혀진, 표피 성장 인자 (EGF), 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 전환 성장 인자-β (TGF-β) 및 메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP)를 포함한다 [Fu, X. et al., Wound Repair Regen, 13(2):122-30 (2005)]. 추가의 상처 치유 인자, 예를 들어 항생제, 살세균제, 살진균제, 은-함유제, 진통제 및 산화질소 방출 인자도 중합체 스캐폴드 상처 드레싱 또는 이식편에 삽입될 수 있다.
네 번째로, 상처 치유를 위한 중합체 스캐폴드 이식편은 보다 신속한 조직 재생 및 보다 자연적인 조직 구조를 위해 세포로 씨딩될 수 있다. 이러한 세포는, 이로 제한됨이 없이, 각질형성세포, 표피 세포, 내피 세포, 중간엽 줄기 세포 및/또는 배아 줄기 세포를 포함할 수 있다.
다섯 번째로, 나노섬유 중합체 스캐폴드의 나노-규모 구조물은 많은 일반 연조직의 세포외 기질 (ECM)의 구조물과 유사하다. 예를 들어, 나노-규모 섬유는 피부 및 다른 조직에서 발견되는 콜라겐 피브릴과 구조적으로 유사하다. 이러한 구조물은 세포가 상처로 이동하는 조직적인 스캐폴드를 제공함으로써 흉터의 형성을 막을 수 있다. 본 발명의 이러한 양상으로, (임의로 배향된 섬유와는 대조되는 것으로서) 중합체 스캐폴드의 정렬은, 흉터 조직이 형성될 때와 같이 세포를 임의 방향으로 정렬시키기 보다는, 세포가 정렬되고 조직화되는데 중요하다. 정렬된 중합체 스캐폴드는 보다 신속한 조직 내성장 및 상처 보호가 가능하도록 상처의 지정된 축에 대해 배향될 수 있다.
또한, 중합체 스캐폴드 정렬은 천연 조직 ECM의 구조물을 긴밀히 조화시키는데 사용될 수 있다. 이는 단일 방향으로의 섬유 정렬, 직각 방향으로의 십자방향 정렬 또는 보다 복잡한 섬유 구조물을 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 예시에서, 중합체 스캐폴드는 각각의 층에 특정한 섬유 배향을 갖는 다층의 섬유를 포함한다. 마찬가지로, 각각의 개별 중합체 스캐폴드 층은 특정 인자 또는 세포 타입, 예를 들어 앞서 열거된 것들을 포함할 수도 있다. 이는 천연 조직 구조물 및 조성물을 긴밀히 조화시킬 수 있는 중합체 스캐폴드의 생성을 가능하게 한다. 예를 들어, 단순한 중합체 스캐폴드 상처 드레싱 또는 이식편은 단층은 정렬된 섬유를 포함할 수 있다. 다른 한편으로, 보다 복잡한 중합체 스캐폴드 피부 이식편은 바닥 시트에는 섬유아세포 상부 시트에는 각질형성세포를 갖는 십자방향 패턴 및 바닥 시트에는 bFGF 상부 시트에는 항생제를 갖는 십자방향 패턴으로 층진 정렬된 섬유의 다수 시트를 포함할 수 있다. 환자의 특정 필요에 따라 이들의 조합도 가능하다.
III . c) 혈관 시스템을 수반하는 이용
본원에 기술된 중합체 스캐폴드는 다양한 손상된, 심각한 또는 변형된 혈관을 대체하거나 우회하는데 사용될 수 있다. 예시적 양태에서, 도관 또는 충전된 도관 중합체 스캐폴드는 관상 동맥 우회 시술에서 사용된다. 또한, 이러한 이식편은 혈관을 중합체 스캐폴드로 완전히 대체시키거나 포장되어 있는 상태와 같은 외피를 생성함으로써 혈관 동맥류를 지탱하고 안정화시키는데 사용될 수 있다 (즉, 복부 대동맥 동맥류는 통상적으로 합성 중합체 대체 이식편, 예를 들어 ePTFE 또는 Dacron을 필요로 한다). 기타 강화 기술은 동맥류 부위 주위로 중합체 스캐폴드 시트를 감싸는 것을 수반한다. 이들의 이용은 낮은 신체 혈관 대체에 한정되지 않고, 예를 들어 내부 목동맥, 후교통 동맥, 후대뇌 동맥 등을 포함한 임의의 국소적 동맥을 수반하는 다른 일반적 부위의 동맥류, 예를 들어 윌리스 서클 (Circle of Willis)을 포함할 수 있다.
예시적 양태에서, 슬리브로 둘러싸이는 중합체 스캐폴드가 혈관을 대체하거나 재생시키기 위해 사용될 수 있다. 슬리브는 중합체 스캐폴드의 기계적 강도, 단단함, 순응 또는 임의의 다른 물리적 또는 화학적 특성을 개선시키기 위해 중합체 스캐폴드를 둘러싸게 할 수 있다. 이러한 슬리브는 나노섬유 중합체 스캐폴드 도관 주위에 놓일 수 있으며, 예를 들어 밑에 놓인 나노섬유는 특정 방향의 정렬을 가질 것이고 슬리브는 동일하거나 상이한 방향의 정렬을 가질 수 있다. 또한, 비정렬되거나 임의로 정렬된 마이크로 또는 나노섬유는 슬리브 물질 또는 밑에 놓인 나노섬유 구조물로서 사용될 수도 있다. 다수의 슬리브가 상이한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 다층 구조물을 제조하는데 사용될 수 있다.
다수 세포 타입 이식편
중합체 스캐폴드의 상이한 영역을 상이한 세포 타입으로 씨딩함으로써 관 모양의 구조물이 제조될 수 있다. 예를 들어, 도 40은 루멘을 라이닝 (lining)하는 세포 타입 1 및 이식편의 중간 부분에 있는 세포 타입 2 및 이식편의 또 다른 영역에 씨딩함으로써 이식편을 싸는데 사용되는 세포 타입 3을 갖는 이식편을 나타낸다.
나노섬유의 관 모양 구조물에 대한 변형
예시적 양태에서, 본 발명은 이식 전 생화학적 또는 세포적 변형을 갖지 않는 혈관 시스템에 사용하기 위한 중합체 스캐폴드를 제공한다. 또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 추가로 혈소판이 나노섬유에 들러붙는 것을 방지하는 비-부착 (non-fouling), 비-혈전형성 브러쉬 (brush) 층을 생성하기 위한 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 유사한 생화학적 변형물을 포함한다. 이러한 부러쉬 층은 혈전형성 감소를 위한 나노섬유 중합체 스캐폴드에 공유적으로 접목될 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드는 추가로 헤파린, 히루딘 또는 이들의 배합물을 포함한다. 헤파린은 혈류 중의 인자 Xa 및 트롬빈을 차단할 수 있는 항-트롬빈 III에 결합할 수 있다. 히루딘은 트롬빈의 억제제이다. 헤파린 및 히루딘은 디-아미노 폴리(에틸렌 글리콜)을 사용하여 중합체 스캐폴드에 공유적으로 접목될 수 있다. 예시적 양태에서, 중합체 스캐폴드는 PLLA 섬유를 포함한다. 피검체의 혈관 시스템과 관련하여 사용되는 본 발명의 중합체 스캐폴드는 혈전을 감소시키고 이식편 개방성 (patency)을 증가시킨다.
또 다른 예시적 양태에서, 혈관 시스템과 관련하여 사용되는 중합체 스캐폴드는 추가로 사람 골수-유도된 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 예시적 양태에서, 중간엽 줄기 세포는 이식하기 적어도 24시간 전에 씨딩될 것이다. 또 다른 예시적 양태에서, 세포는 이식하기 2일 전에 이식편으로 씨딩될 것이다.
탈세포화 - 사람 골수-유도된 중간엽 줄기 세포 또는 임의의 세포 타입은 상술된 바와 같이 씨딩될 것이다. 이식하기 수시간 전, 세포 구조 및 세포 표면을 온전히 남기면서 세포는 사멸돌 것이다.
또 다른 예시적 양태에서, 혈관 시스템과 관련하여 사용되는 중합체 스캐폴드는 추가로 내피 전구 세포를 포함한다. 예시적 양태에서, 내피 전구 세포는 이식하기 2일 전에 이식편으로 씨딩될 것이다. 이러한 내피 세포는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 세포 자체에 의해 분비되는 수개의 인자들을 수반하는 고도로 활성인 세포 막 표면을 통해 혈소판 부착/활성화, 혈전 및 피브린 형성을 방지할 수 있다.
또 다른 예시적 양태에서, 혈관 시스템과 관련하여 사용되는 중합체 스캐폴드는 추가로 사람 배아 줄기 세포-유도된 혈관 전구 세포를 포함한다. 이러한 배아 줄기 세포는 콜라겐 IV 인테그린 시스널화를 통해 혈관 전구 세포 계통으로 분화될 수 있고, 성장 인자 자극 시 내피세포 및 평활근 세포로 완전히 분화될 수 있다.
III . d) 근육의 수반하는 이용
본 발명의 중합체 스캐폴드를 수반하는 근육 이식편은 심한 상해 후 상당한 근육 손실에 기인한 근육 재생을 향상시키기 위해 치료학적으로 근육내에 이식될 수 있다. 성장 인자 및 기타 생물분자가 근육 세포 증식 및 분화뿐만 아니라 혈관화를 자극하기 위해 근육 이식편으로 삽입될 수 있으며, 이는 근육 치유를 촉진시킬 것이다. 성장 인자는 인슐린-형 성장 인자-1 (IGF-1), 염기성 성장 인자 (bFGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 혈소판-유도된 성장 인자 (PDGF)를 포함할 수 있다. 성장 인자는 공유 결합 또는 생리학적 코팅에 의해 이식편에 삽입될 수 이다. 연관된 접근은 이러한 단백질에 대한 유전자를 과발현시키기 위해 세포를 유전학적으로 변형시키는 것을 수반한다.
이식편의 또 다른 치료학적 적용은 특정 유전자의 유전적 변이가 특징적인 근육퇴행위축과 같은 근육 질환을 갖는 동물 또는 사람에 대한 유전적 변형에 대한 것이다. 이러한 타입의 유전자 치료 적용을 위해, 정상 유전자를 갖는 근아세포가 이식편 내에서 근육으로 전달될 수 있다. 달리, 유전자는 플라스미드 DNA의 형태로 스캐폴드에 직접적으로 결합될 수 있다. 신체 내 스캐폴드의 생착 (engraftment)은 정상적 근육 작용의 조직 발달 양상을 돕도록 유전적으로 변형될 수 있다. 유전자 치료 목적으로, 중합체 스캐폴드는 이식된 세포의 생존 및 성장을 위한 매트릭스를 제공하고/하거나 플라스미드 DNA의 방출 및 후속적인 이용을 위한 전달 비히클로서 사용된다.
이식편은 패치 또는 도관의 형태일 수 있다. 양자의 경우에, 섬유 방향은 근육의 방향에 대해 평행하다. 설치류의 경우, 스캐폴드의 물리적 크기는 0.5-5.0 X 0.5-5.0 X 0.1-0.5 cm이다. 사람 이식편의 경우, 스캐폴드의 크기는 1.0-50.0 X 1.0-50.0 X 0.1-5.0 cm이다.
이러한 타입의 치료적 처치에 잘 맞혀진 근육은 정렬된 기하학을 갖고 이식편에 영양을 주도록 혈관계에 근접한 것들이다. 이러한 근육은 이두근, 대퇴사두근, 전경골근 및 비복근을 포함한다.
예시적 양태에서, 근아세포가 삽입된 도관은 골격근을 성장시키는데 사용될 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 중간엽 줄기 세포가 삽입된 도관이 혈관 이식편으로서 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 신경 줄기 세포가 삽입된 도관이 신경 이식편으로서 사용될 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 (i) 중합체에 세포를 씨딩하고; (ii) 심축 주위로 생성물을 회전시켜 중합체에 맞는 관 모양 형태를 형성하며; (iii) 심축을 떼어내는 단계를 포함하여, 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 또 다른 예시적 양태에서, 본 발명은 (iv) 중합체의 제1 부분을 중합체의 제2 부분에 부착시키는 것을 제공한다. 이러한 부착은 어닐링 (열), 접착제 (예: 생물학적 접착제) 또는 봉합제의 사용을 수반할 수 있다.
III . e) 미세패턴화된 중합체 스캐폴드를 갖는 근육 이식편
미세패턴화된 중합체 스캐폴드를 갖는 근육 이식편은 상술된 바와 같은 나노섬유 스캐폴드의 것과 유사하며, 단 미세패턴화된 중합체 스캐폴드는 시트의 형태이다.
본 발명은 하기와 같은 실시예에 의해 더욱 설명된다. 실시예는 본 발명의 범위를 정의하거나 한정하기 위한 것이 아니다.
실시예 1
근아세포 제조
뮤린 C2C12 근아세포 (ATCC, Manassas, VA)를 세포 조직화 및 조립을 조사하는데 사용하였다. 근아세포를 듈베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM), 10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 이루어진 성장 배지에서 배양하였다. 섬유아세포 분화 및 융합을 개시하기 위해, 샘플이 전면성장 (confluent)된 지 24 시간 후, 성장 배지를 DMEM, 5% 말 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 이루어진 분화 배지로 대체하였다. 모든 실험에서, 시간점은 분화 배지에서의 인큐베이션 시간으로 나타내었다.
실시예 2
PLLA 나노섬유 스캐폴드 제조
생분해성 폴리(L-락타이드) (PLLA) (Lactel Absorbable Polymers, Pelham, AL, 1.09 dL/g 고유 점도)를 사용하여 전기방사에 의한 나노섬유 스캐폴드를 제조하였다 [Zong, X., Biomacromolecules, 4(2): 416-23 (2003)]. 간단히 설명하면, PLLA 용액 (10% w/v, 클로로포름 중)을 25 mL/min의 유속으로 전극의 구멍을 빠져나가도록 프로그램된 펌프에 의해 수송하였다. 고압 공급 장치 (Glassman High Voltage Inc., High Bridge, NJ)를 사용하여 20 kV의 전압을 적용하였다. 수집판은 접지되고 스태핑 모터에 의해 조절되는 회전 드럼 상에 놓았다. 나노섬유를 정렬하기 위해서, 전기방사 스캐폴드를 60 ℃에서 200% 공칭변경도로 단축 스트레칭시켰다. 나노섬유 스캐폴드의 두께는 약 150 μm였다. 나노섬유 스캐폴드의 표면을 세포 씨딩 전 2% 젤라틴 또는 피브로넥틴 (5 μg/cm2)으로 코팅하였다. 세포 부착 및 형태에 있어 어떠한 유의한 차이도 젤라틴과 피브로넥틴 코팅 사이에서 검출되었다. 임의로 배향된 스캐폴드는 대조군으로 사용되었다.
전자 주사 현미경 (SEM)을 사용하여 단축 스트레칭 후 나노섬유의 정렬을 시각화하였다. SEM 이미지는 단축 스트레칭으로 정렬된 나노섬유가 제조된다는 것을 보인다 (도 24A-B). 스캐폴드의 평균 나노섬유 직경은 약 500 nm이고 평균 갭 크기는 약 4 ㎛였다.
실시예 3
분화 배지 하에서 나노섬유 스캐폴드 상의 근아세포의 성장/특성화
전면성장 근아세포를 7일까지 분화 배지에서 나노섬유 스캐폴드에서 성장시켰다. 임의 배향된 스캐폴드 및 정렬된 나노섬유 스캐폴드에서의 세포 조직화 및 세포골격 구조를 측정하기 위해, F-액틴, 미오신 중쇄 (MHC) 및 세포 핵의 형광 염색을 수행하였다 (Supporting Information). F-액틴은 플루오레세인 (FITC)-결합된 팔로이딘 (Molecular Probes, Eugene, OR)을 사용하여 염색하였다. MHC는 마우스 항-골격 패스트 (fast) MHC 항체 (Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 염색하였다. 세포 핵은 ToPro 염료 (Molecular Probes)로 염색하였다. 형광 현미경 검사는 Nikon TE300 현미경 및 TCS SL 공초점 현미경을 사용하여 수행하였다.
실시예 4
미세패턴화된 기판의 미세제작
폴리디메틸실록산 (PDMS) 또는 폴리-L-락타이드-코-글리콜라이드-코-ε-카프롤락톤 (PLGC) 중합체로 구성된 미세패턴화된 필름은 문헌 [Thakar, R.G., Biochem Biophys Res Commun, 307(4): 883-90 (2003)]의 공정으로부터 변형된 공정에 의해 실리콘 웨이퍼 인버스 템플레이트로부터 제작하였다. 미세패턴화된 템플레이트를 제조하기 위해, 웨이퍼를 아세톤, 이어 황산 대 과산화수소의 1:1 세척 용액 (Piranha acid)으로 세정하였다. 웨이퍼를 건조시키고, 5분 동안 헥사메틸디실라잔 (HMDS)로 코팅하여 기판에 대한 포토레지스트 부착을 개선시켰다. 먼저, 패턴화된 에멀젼 스트립을 갖는 마스크를 제조하였다. 평행한 스트립은 폭이 10 μm이고, 10 μm 떨어져 있으며, 길이가 4 cm였다. 패턴을 실리콘 웨이퍼에 전달하기 위해 I-라인 (OCG OiR 897-10i, Arch Chemicals, Norwalk, CT) 포토레지스트를 1분 동안 820 RPM으로 웨이퍼 상으로 방사하여, 약 2.8 μm 두께 층의 포토레지스트를 제조하였다. 이어서, 포토레지스트를 KS 얼라이너 (KS Aligner, Karl Suss, MJB3, Germany)를 사용하여 UV 광에 노출시키기 전, 포토레지스트를 경화시키기 위해 웨이퍼를 60초 동안 90 ℃에서 베이킹하였다. 포토레지스트 경화를 돕고 광생성물의 확산을 이끌기 위해 노출 후 베이킹을 120 ℃에서 60초 동안 수행하였다. 노출된 포토레지스트를 포토레지스트 현상제 용액 OPD 4262를 사용하여 60초 동안 현상하였다. 비노출된 포토레지스트를 갖는 웨이퍼를 120 ℃에서 15분 동안 프라이머 오븐에 놓아 나머지 포토레지스트를 경화시켰다. 이 시점에서, 웨이퍼는 PDMS 필름의 제조에 사용될 수 있었다. PLCG 필름의 제작을 위한 템플레이트는 약 2 μm 깊이의 미세홈을 만들기 위해 2 내지 3분 동안 STS 심반응성 이온 에칭기 (STS Deep Reactive Ion Etcher)를 사용하는 추가의 에칭 단계가 필요하였다.
미세패턴화된 PDMS 필름 및 비-패턴화된 PDMS 필름은 제조자 (Sylgard 184, Dow Corning, MI)에 의해 지시되는 바와 같이 제조되었다. 진공 하에 탈기시킨 후, PDMS 15 g을 웨이퍼에 부었다. PDMS를 갖는 웨이퍼를 포토레지스트 스피너에 놓고 30초 동안 100 rpm으로 방사한 후, 2분 동안 200 rpm에서 방사하여 약 350 μm의 균일한 두께를 갖는 PDMS 필름을 형성하였다. 스핀-코팅된 PDMS를 갖는 웨이퍼를 10분 동안 실온에서 유지시키고, 15분 동안 80 ℃의 오븐에 놓아 PDMS를 중합화시켰다. 베이킹 후, PDMS를 실온으로 냉각시키고, 웨이퍼로부터 떼어내었다. 제작 공정 후, PDMS 막을 물에서 음파 파쇄하여 세정하였다. 살균시키고 세포 부착을 증진시키기 위해, 막을 산소 플라즈마로 처리하고, 세포 씨딩 전에 30분 동안 2% 젤라틴으로 코팅하였다.
생분해성 미세패턴화된 필름을 위해, 70:10:20 성분비 (Mn 약 100,000)의 삼 블럭 공중합체 PLGC (Aldrich, St. Louis, MO)를 사용하였다. PLGC 용액은 50 mg/mL의 농도에서 클로로포름 중에 제조하였으며, 용해될 때까지 교반기 (stirplate)에서 흔들었다. 이어서, 용액을 실리콘 몰드에 붓고, 용매를 증발시킨 후, 중합체 박막을 형성하였다. 제작 후, PLGC 필름을 2시간 동안 70% 에탄올에서 살균시킨 후, PBS에서 세정하였다. 세포 씨딩 전에, 필름을 30분 동안 2% 젤라틴으로 코팅하여 세포 부착을 향상시켰다.
실시예 5
전자 주사 현미경 ( SEM )에 의한 조성물의 특성화
세포를 포함하는 조성물을 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 완충액 중의 2% 글루타르알데하이드에서 고정시킴으로써 SEM를 수행하였다. 일련의 에탄올 탈수 후, 샘플을 건조시키고, 이리듐 또는 금:팔라듐(40:60) 입자로 두께 10 내지 15 nm가 되도록 스퍼터 코팅하였다. 샘플을 환경 주사 전자 현미경 (Environmental Scanning Electron Microscope: Philips XL-30) 하에 시각화하였다.
실시예 6
면역형광 염색
샘플을 15분 동안 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고, 10분 동안 0.5% 트리톤 (Triton) X-100에서 침투적이도록 한 후, 30분 동안 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 전처리하였다. F-액틴 어셈블리를 1시간 동안 인큐베이션된 플루오레세인 (FITC)-결합된 팔로이딘 (5 U/mL, Molecular Probes)으로 염색하였다. 미오신 중쇄 염색을 위해, 샘플을 마우스 항-골격 패스트 미오신 중쇄 (87 μg/mL, Sigma)와 인큐베이션한 후, FITC-결합된 당나귀 항-마우스 항체 (6.25 μg/mL, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)와 인큐베이션하였다. 세포 핵을 ToPro (1μM, Molecular Probes)로 염색하고, 니콘 (Nikon TE300) 현미경 또는 레이카 (Leica) TCS SL 공초점 현미경으로 시각화하였다. 공초점 이미지는 3-차원으로 겹쳐 쌓인 이미지의 2차원 프로젝션을 나타낸다.
실시예 7
BrdU 삽입
세포 주기 분석을 위해, 샘플을 성장 배지 중의 브로모데옥시우리딘 (BrdU, 1:1000, Amersham, Piscataway, NJ)으로 2시간 동안 펄스처리하고, 4% 파라포름알데히드에서 고정시킨 후, 포스페이트 완충된 염수 (PBS)에서 세정하였다. 샘플을 30분 동안 50% 메탄올로 전처리하고, 10분 동안 0.5% 트리톤 X-100에서 침투적이도록 한 후, 30분 동안 2N HCl 처리하였다. 이어서, 샘플을 마우스 항-BrdU (2.5 μg/mL, BD Biosciences, Bedford, MA)에 이어 FITC-결합된 당나귀 항-마우스 (6.25 μg/mL) 항체와 인큐베이션하였다. 세포 핵을 프로피듐 요오다이드 (1 μg/mL, Molecular Probes)로 염색하였다.
실시예 8
세포 융합 및 증식 분석
항-골격 미오신 염색의 면역형광 이미지를 5개 이상의 대표적 고배율 (40X) 및 저배율 (10X) 필드 하에 취하였다. SPOT 4.0.5 소프트웨어 (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI)를 사용하여, 정렬된 나노섬유 또는 미세홈의 축에 대한 미오튜브 폭, 길이 및 정렬을 각각 고배율 및 저배율로 정량화하였다. 0°의 최소 미오튜브 정렬 값은 나노섬유의 축으로부터 평행한 정렬을 나타내고, 90°의 최대 정렬 값은 수직 정렬을 나타낸다. 임으로 배향된 나노섬유 스캐폴드 및 비-패턴화된 PDMS 기판에 대한 정렬 분석을 위해, 정렬에 대한 임의의 축을 사용하였다. 또한, 융합된 핵, BrdU-포지티브 세포 및 줄무늬의 미오튜브를 고배율로 정량화하고 평균화하였다. 평균 폭을 정량화하고 평균화하였다. 모든 자료는 평균 ± 표준편차 (n=3)으로 표시되었다. 통계학적 유의성은 2개 그룹에 대한 스튜던트 t-시험에 의해서나 다수 비교를 위한 홀름 조정 (Holm's adjustament for multiple comparisons)을 갖는 분산분석 (analysis of variance: ANOVA)에 의해 계산하였다.
실시예 9
도관
근아세포를 정렬된 나노섬유의 직사각형 시트에서 7일 동안 분화시켰다. 3차원 구조물을 제조하기 위해, 나노섬유 시트를 1 내지 2 mm 직경의 강철 막대 주위로 회전시켰다 (도 27). 관 모양 구조물을 이의 양끝에서 7-0 티크론 (Ticron) 봉합제로 고정시켰다. 이어서, 샘플을 조직학적 분석을 위해 동결절단하였다. 동결절단된 샘플을 통상의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색 및 F-액틴의 면역형광 염색에 의해 분석하였다.
제작된 관 모양 구조물은 직경이 약 2 내지 3 mm이고 세로 방향 길이가 10 mm였다. 이들 구조물의 단면적 육안 형태에 대한 H&E 염색은 이 구조물의 관 모양 구조가 성공적으로 제작될 수 있었음을 입증하였다 (도 28). 비록 보다 많은 세포를 각각의 층의 표면에서 볼 수 있었지만, 뚜렷이 구별되는 자주색 핵을 스캐폴드의 층 전반에 걸쳐 볼 수 있었다. 면역형광학적으로 염색된 F-액틴의 공초점 현미경 검사는 구조물의 다수의 층 내에서 세포 침투를 입증하였다 (도 29). 세포는 신장된 형태를 취하였으며, 나노섬유의 방향을 따라 정렬되었다. 이러한 결과는, 나노섬유 중합체를 사용하는 정렬된 3차원적 골격근의 조작의 실행가능성을 입증한다.
실시예 10
나노섬유 중합체 제조
생분해성 폴리(L-락타이드) (PLLA) (Lactel Absorbable Polymers, Pelham, AL, 1.09 dL/g 고유 점도)를 사용하여 문헌 [Rosen et al., Ann Plast Surg., 25:375-87 (1990)]에 기술된 바와 같이 전기방사하여 나노섬유 스캐폴드를 제조하였다. PLLA 용액 (10% w/v, 클로로포름 중)을 프로그램가능한 펌프를 사용해 고전기장에 있는 접지된 수집판에 수송하여 임의의 나노섬유를 제조하였다. 나노섬유를 정렬시키기 위해, 전기방사된 스캐폴드를 60 ℃에서 200% 응력으로 단축 스트레칭하였다. 나노섬유 스캐폴드의 두께는 약 150 μm였다. 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 단축 스트레칭 후의 나노섬유 정렬을 시각화하였다. SEM 이미지는 단축 스트레칭으로 고도로 정렬된 나노섬유가 제조된다는 것을 보인다 (도 12A-B). 나노섬유 평균 직경은 약 500 nm였다.
화학적으로 변형된 나노섬유에 대해, 하나의 ECM 단백질 (라미닌) 및 하나의 향신경성 인자 (염기성 섬유아세포 인자 또는 bFGF)를 대표 예로써 선택하였다. 라미닌 및 bFGF는 모두 시험관 내에서 신경돌기 연장을 증진시키는 것으로 밝혀졌다 [Manthorpe et al., J Cell Biol., 97:1882-90 (1983); Rydel et al., J Neurosci., 7:3639-53 (1987)]. 또한, 두 단백질은 이들의 헤파린 결합 도메인을 통해 헤파린과 결합한다. 또한, 헤파린은 bFGF가 분해되는 것을 방지하며 bFGF 세포 시그날화 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 [Gospodarowicz et al., J Cell Physiol., 128:475-84 (1986); Saksela et al., J Cell Biol., 107:743-51 (1988); Yayon et al., Cell, 64:841-8 (1994)].
링커 분자로서 디-아미노-폴리(에틸렌 글리콜) (디-NH2-PEG)를 사용함으로써 헤파린 기능화된 (functionalized) 나노섬유를 제조하였다 (도 12C). 먼저, 0.01N NaOH (Sigma, St. Louis, MO)로 스캐폴드를 처리함으로써 PLLA 나노섬유 상의 반응성 카복실산 그룹의 밀도가 증가되었다. 이어서, 제로-길이 크로스 링커 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시설포숙신이미드 (설포-NHS) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 사용하여 PLLA 나노섬유 상의 카복실산 그룹에 Di-NH2-PEG (MW 3400, Sigma)를 공유결합시켰다. 이어서, EDC 및 설포-NHS를 통해 디-NH2-PEG 분자 상의 유리 아민에 헤파린 (Sigma) 분자를 공유적으로 부착시켰다. 10% w/v 글리신 중의 샘플을 포스페이트 완충 염수 (PBS) 용액 중에서 인큐베이션함으로써 나노섬유 스캐폴드 상의 임의 잔류 반응성 부위를 차단시켰다. 이어서, PBS 용액 중의 bFGF (50 ng/cm2, Peprotech, Rocky Hill, NJ)) 및 라미닌 (10 μg/cm2, Sigma)을 나노섬유 스캐폴드와 인큐베이션함으로써 연속적으로 이들을 헤파린에 결합시키고 나노섬유의 표면에 고정시켰다.
bFGF 분자의 헤파린 기능화된 PLLA 나노섬유에 대한 부착을 변형된 ELISA 기술로 입증하였다. bFGF를 고정화시키는 상이한 방식의 효율을 비교하기 위해, 동일한 크기로서, 비처리된 나노섬유 막, 디-NH2-PEG 변형된 나노섬유 막, 헤파린 기능화된 나노섬유 막을 갖는 3개의 나노섬유 스캐폴드를 PBS 중의 bFGF와 인큐베이션하였다. 이어서, 모든 막을 PBS 용액 중의 1% 소 혈청 알부민 (BSA)과 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 HRP-결합된 항-bFGF 마우스 모노클로날 IgG 항체 (R&D Systems, Minneapolis, MN)와 인큐베이션하였다. 막을 철저히 세척하고, 에펜도르프 튜브에 옮긴 후, HRP 기질 용액 (과산화수소 및 크로마겐, 테트라메틸벤지딘)과 인큐베이션하였다. 이어서, 2N 황산을 사용하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 용액의 흡광도를 분광광도계 (450 nm 파장)으로 판독하였다. bFGF 항체의 비특이적 흡착을 네가티브 대조 샘플에 대해 시험하여, 무시할만하다는 것을 밝혀내었다 (자료 제시되지 않음). 그 결과 (도 12D), bFGF 코팅이 헤파린으로 기능화된 나노섬융 대해 상당히 효과적임을 나타낸다. 이들 결과는 PLLA 나노섬유에 대해 사용된 것과 동일한 방식으로 폴리(아크릴산)으로 코팅되고 디-NH2-PEG 및 헤파린과 결합된 조직 배양 폴리스티렌 기판에서 추가로 입증되었다 (FIG. 12E).
P4-P5 래트로부터 수거된 DRG 조직을 사용하여 나노섬유 스캐폴드에서의 신 경돌기 연장을 조사하였다. DRG 조직을 6일 동안 B27 및 0.5 mM L-글루타민 (Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 보충된 신경세포 특이적 (neurobasal) 배지 중에서 하기와 같은 정렬된 PLLA 나노섬유 스캐폴드 및 비정렬된 나노섬유 스캐폴드 상에서 배양하였다: 비처리된 PLLA 나노섬유 스캐폴드, 라미닌 (LAM)으로 기능화된 헤파린 처리된 나노섬유 스캐폴드, 및 라미닌 및 bFGF (LAM+bFGF)로 기능화된 헤파린으로 처리된 나노섬유 스캐폴드. 생체 외 배양 6일 후, 신경돌기 연장을 면역형광 염색으로 분석하였다. 모든 샘플을 먼저 4% 포름알데하이드로 고정시킨 후, 세포 막을 PBS 용액 중의 0.5% 트리톤-X100으로 침투성이 되도록 하였다. 샘플을 염소 폴리클로날 항-뉴로필라멘트-M (NFM) IgG 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)와 인큐베이션한 후, FITC-결합된 당나귀 항-염소 IgG 항체 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)와 인큐베이션하였다. 샘플을 유리 슬라이드에 올리고, 자이스 (Zeiss) 형광 현미경 및 레이카 공초점 형광 현미경을 사용하여 시각화하였다.
DRG 조직의 신경돌기 연장은 비정렬된 비처리의 나노섬유 스캐폴드에서는 관측되지 않았다 (도 13, 비처리). 비정렬된 LAM 나노섬유에서 배양된 DRG 조직으로부터의 신경돌기 연장은 최소였다 (도 13 LAM). 비정렬된 LAM+bFGF 나노섬유에서 배양된 DRG 조직으로부터 연장되는 다양한 신경돌기가 관측되었다 (도 13 LAM+bFGF). 신경돌기는 DRG 조직으로부터 방사형 패션으로 외부로 연장되었으며 균일한 정렬은 결여되었다. DRG 조직으로부터의 신겨돌기 성장은 약 1 mm였다.
비정렬되고 비처리된 나노섬유와는 대조적으로, 비처리되고 정렬된 나노섬유 에서 신경돌기 연장이 관측되었다. 신경돌기는 DRG 조직의 2개의 상이한 영역으로부터 연장되었으며, 나노섬유의 방향으로 정렬되었다. 도 14는 조직의 2개 영역 중 하나로부터 신경돌기의 연장을 보인다. 비처리된 나노섬유에서의 신경돌기의 성장은 약 0.7 mm였다. 이러한 결과는 정렬된 나노섬유가 DRG 조직에 있는 감각 뉴우런으로부터 신경돌기 연장을 유도를 지시한다는 것을 나타낸다. 유사하게, 정렬되었으나 보다 긴 신경돌기가 정렬된 LAM 나노섬유에서 관측되었으며 (도 14 LAM), 이는 ECM 단백질이 정렬된 나노섬유의 연장 유도를 더욱 향상시킬 수 있다는 것을 제시한다. LAM 나노섬유에서의 신경돌기 성장은 약 1.3 mm였다. 가장 길고 가장 조밀한 신경돌기 연장이 정렬된 LAM+bFGF 나노섬유에서 관측되었다 (도 14 LAM+bFGF). LAM+bFGF 성장에 대한 신경돌기 성장은 약 4.8 mm였다. 이러한 결과는 라미닌 및 bFGF로부터의 화학적 단서 (cue) 및 정렬된 나노섬유 기판으로부터의 물리적 단서가 개별적으로나 조합하여 감각 뉴우런으로부터의 신경돌기 연장을 향상시키고 지시한다는 것을 분명히 나타낸다. 고배율 공초점 현미경 검사로, 신경돌기의 연장이 생물활성 나노섬유의 지시를 따르고 임의 정렬된 나노섬유 및 정렬된 나노섬유에 상이한 패턴을 형성하였다는 것을 입증하였다 (도 15).
실시예 11
세로 방향으로 정렬된 중합체 스캐폴드 도관
생분해성 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) (Lactel Absorbable Polymers, Pelham, AL, 0.82 dL/g 고유 점도)를 사용하여 전기방사에 의해 나노섬유 스캐폴드를 제작하였다. PLGA 용액 (20% w/v, HFIP 중)을 1 mL/hour의 유속로 전극의 구 멍을 빠져나가도록 프로그램가능한 시린지 펌프로 수송하였다. 고전압 전원을 사용하여 11 kV의 전압을 적용하였다. 수집기 기판은 이의 장축 주위로 심축을 회전시킬 수 있는 모터에 부착된 접지된 강철 심축이었다. 테플론 테이프로 심축의 섹션 주위를 감싸 비-전도 영역을 만들었다. PLGA 섬유가 전기방사될 때 심축을 저속 (<15 rpm)으로 회전시켰다. 비-전도 테플론 테이프 영역에 의해 분리된 심축의 2개의 섹션 사이에서 제트가 교대하여, 심축의 장축에 평행하게 정렬된 PLGA 섬유를 침착시켰다. 심축의 회전은 심축 주위의 PLGA 섬유의 균일한 보호범위를 가능하게 하였다. 전기방사가 완성된 후, 전기방사 PLGA 섬유 도관의 가장자리를 메스로 무디게 한 후, 도관을 테플론 테이프 및 심축으로부터 떼어내었다.
섬유 정렬을 확인하기 위해, 튜브를 이의 장축을 따라 절단하고, 섬유 형태를 광학 현미경을 사용해 시각화하였다. 대부분의 섬유가 세로 방향으로 (즉, 도관의 장축을 따라) 정렬되었다.
실시예 12
세로 방향으로 정렬된 중합체 스캐폴드 막대
생분해성 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) (Lactel Absorbable Polymers, Pelham, AL, 0.82 dL/g 고유 점도)를 사용하여 전기방사에 의해 나노섬유 스캐폴드를 제작할 수 있다. PLGA 용액 (20% w/v, HFIP 중)을 1 mL/hour의 유속로 전극의 구멍을 빠져나가도록 프로그램가능한 시린지 펌프로 수송할 수 있다. 고전압 전원을 사용하여 11 kV의 전압을 적용할 수 있다. 전기방사 공정으로 막대 형태의 세로 방향으로 정렬된 섬유를 형성하기 위해, 특수화된 수집기 기판을 사용할 수 있 다. 수집기 기판은 중간 (즉, 2 cm)에 에어 갭을 갖는 끝에서 끝까지 정렬된 2개의 접지된 금속 심축으로 구성될 수 있으며, 전극의 배출 구멍 아래 (즉, 15 cm)에 놓일 수 있다. 각각의 심축은 일치된 방식으로 장축 주위로 심축을 회전시킬 수 있는 전기적으로 조절되는 모터에 부착될 수 있다. 전기 방사 동안, 전기방사 중합체 섬유의 균일한 침착을 위해 심축을 저속 (<10 rpm)으로 회전시킬 수 있다. 전기방사 동안, 중합체 용액은 수집기 기판을 향해 진행하는 제트를 형성할 것이다. 이러한 경우, 제트는 2개의 심축의 말단 사이에 있는 에어 갭을 가로질러 갭의 길이를 따라 정렬되고 (심축의 장축과 동일한 배향을 갖는) 섬유를 형성할 것이다. 전기방사가 완성된 후, 전기방사 섬유 물질을 메스로 심축의 가장자리를 따라 절단함으로써 2개의 금속 심축의 말단으로부터 분리시킬 수 있다. 그 결과, 장축을 따라 정렬된 섬유를 갖는 막대 형태의 전기방사 섬유 중합체 스캐폴드가 제조된다.
실시예 13
세로 방향으로 정렬된 충전된 도관 섬유 중합체 스캐폴드
세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성되고 세로 방향으로 정렬된 중합체 섬유로 충전된 도관을 형성하기 위해, 하기 방법이 이용될 수 있다. 먼저, 세로 방향으로 정렬된 섬유를 갖는 유공 도관이 전기방사된다. 내경이 0. 5m인 2 cm 길이의 세로 방향으로 정렬된 충전된 도관을 제조하기 위해, 하기 조건이 이용될 수 있다. 먼저, 세로 방향으로 정렬된 유공 도관이 길이가 적어도 2 cm이고 직경이 0.5 cm인 비-전도 영역을 갖는 심축을 이용하여 본원에서 기술되는 바와 같이 전기방사될 수 있다. 이어서, 세로 방향으로 정렬된 유공 도관을 심축으로부터 떼어내고 크기로 절단할 수 있다. 충전된 물질은 본원에 기술되는 바와 같이 정렬된 중합체 섬유의 고도의 다공성 시트로서 전기방사된다. 정렬된 나노섬유의 시트는 유공 도관의 루멘의 적절한 크기로 형태를 취할 수 있다. 이어서, 정렬된 섬유의 시트는 도관에 삽입되어 장축을 따라 정렬된 중합체 섬유로 충전된 도관 스캐폴드가 제조된다.
충전 물질은 정렬된 섬유로 구성된 말린 (rolled) 시트 또는 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성된 막대로서 제조될 수 있다. 정렬된 섬유로 구성된 말린 시트를 사용하는 충전 물질을 제조하기 위해, 본원에 기술된 방법이 이용될 수 있다. 두께가 50 마이크론인 정렬된 섬유 중합체 막이 전기방사되고, 2 cm x 2 cm 정사각 섹션이 절단될 수 있다. 이어서, 시트는 정렬된 섬유가 말린 시트의 길이를 따르는 방식으로 그 자체로 회전될 수 있다. 시트는 형성된 막대의 직경이 0.5 cm일 때까지 회전될 수 있다. 이어서, 여분의 물질은 절단될 수 있다. 말린 막대 형태의 충전 물질은 겸자로 세로 방향으로 정렬된 유공 도관으로 삽입되어 세로 방향으로 정렬된 충전된 도관을 형성할 수 있다. 충전 물질을 제조하기 위해, 본원에 기술된 방법에 따라 세로 방향으로 정렬된 섬유로 구성된 막대 모양의 섬유 중합체 스캐폴드가 사용될 수 있다. 적절한 크기의 막대를 제조하기 위해, 2개의 수집기 심축은 직경이 0.5 cm이고 적어도 2 cm는 떨어져 적어도 2 cm의 에어 갭을 만들 수 있다. 실시예 12에서와 같이 막대는 전기방사된 후, 메스를 사용하여 심축의 가장자리를 따라 절단함으로써 떼어낼 수 있다. 이어서, 막대 모양의 스캐폴드는 겸자 를 사용하여 유공 도관에 삽입될 수 있다.
실시예 14
PLGA 나노섬유 스캐폴드 제조
생분해성 폴리(락틱-코-글리콜산) ((PLGA) (Lactel Absorbable Polymers, Pelham, AL, 1.09 dL/g 고유 점도)를 사용하여 전기방사에 의해 나노섬유 스캐폴드를 제작하였다. PLGA 용액 (20% w/v, HFIP 중)을 1 mL/hour의 유속로 전극의 구멍을 빠져나가도록 프로그램가능한 시린지 펌프로 수송하였다. 고전압 전원을 사용하여 11 kV의 전압을 적용하였다. 섬유를 접지되고 스텝핑 모터에 의해 조절되는 알루미늄 포일로 덮인 (직경: 10 cm, 길이: 10 cm) 회전 강철 드럼 (도 41 참조)에 침착시켰다. 정렬된 나노섬유에 대해, 수집기 드럼을 400 rpm으로 회전시켰다. 비정렬된 섬유에 대해서는, 수집 드럼을 30 rpm 미만으로 회전시켰다. 직경이 500 nm인 섬유로 구성된 섬유 스캐폴드의 두께가 약 130 μm일 때까지 전기방사가 수행되었다. 드럼으로부터 섬유 중합체 시트를 떼어내기 위해, 중합체 층 및 포일을 드럼의 길이를 따라 절단하고 드럼으로부터 분리시켰다. 이어서, 섬유 중합체 층을 알루미늄 포일로부터 벗겨내어 길이가 약 30 cm이고 폭이 10 cm인 섬유 중합체 시트를 제조하였다.
섬유의 정렬을 위상차 현미경 (Carl Zeiss)를 사용하여 점검하였으며, 섬유 중합체 시트를 주어지는 적용에 맞도록 목적하는 크기로 절단하였다. 상처 치유를 위해, 나노섬유 스캐폴드 조각은 상처의 크기와 일치하거나 상처 가장자리를 넘어 연장되도록 절단될 수 있다. 섬유의 배향은 상처의 지정된 축에 대해 특정한 각으 로 정렬되도록 선택될 수 있다.
실시예 15
십자방향 나노섬유 스캐폴드 제조
십자방향 패턴의 섬유를 갖는 섬유 중합체 스캐폴드가 수개의 방법으로 형성될 수 있다. 하나의 예시로써, 전기방사를 이용하여 회전 드럼에 섬유를 수집하거나 비정렬된 섬유를 스트레칭함으로써 본원에서 전술된 바와 같은 정렬된 섬유 중합체 시트를 제조할 수 있다. 이어서, 이러한 정렬된 중합체 시트는 수집기 드럼으로부터 분리되고, 각각의 시트의 상단에 놓여 각각의 시트의 섬유가 위 및 아래에 있는 시트의 섬유에 대해 직각으로 정렬될 수 있다 (도 38). 추가로, 시트는 기계적 강도 및 안정성을 위해 함께 봉합될 수 있다.
제2 예시에서, 십자방향 패턴은 드럼을 따라 세로 방향 섬유의 전기방사를 위한 중심에 비-전도 섹션을 갖는 전도 드럼을 사용함으로써 형성될 수 있다. 직경이 10 cm이고 길이가 10 cm인 강철 드럼이 모터에 고정될 수 있다. 테플론 테이프가 4 cm의 폭을 커버하도록 드럼 주위에 둘러싸일 수 있다. 십자방향 패턴을 제조하기 위해. 드럼은 먼저 저속 (<30 rpm))으로 회전되어 비-전도 테플론 테이프 영역을 가로질러 세로 방향 축을 따라 정렬된 섬유를 제조할 수 있다. 이어서, 드럼을 빠르게 회전시켜 (>100rpm) 제1 층에 대해 직각으로 정렬된 섬유를 제조할 수 있다. 드럼의 느린 회전과 빠른 회전 사이의 스위칭은 십자방향 패턴을 생성하는 테플론 테이크 영역에 침착되는 일련의 정렬된 섬유 층을 생성할 수 있다. 달리, 비-전도 영역이 본원에서 전술된 심축의 디자인과 유사한 2개의 전도 금속 영역 사 이에 샌드위치되는 드럼이 제작될 수 있다.
제3 예시에서, 십자방향 정렬의 섬유를 갖는 섬유 중합체 스캐폴드가 수집기 기판으로서 회전 드럼을 사용하면서 전기방사될 수 있다. 전기방사 장치는 전기방사된 정렬된 섬유 중합체 시트에 대해 본원에 기술된 바와 같이 조립될 수 있다. 정렬된 섬유의 층이 회전 드럼에 침착된다. 이어서, 섬유의 층이 드럼으로부터 벗겨지고, 90°회전된 후, 드럼 수집기에 다시 놓여질 수 있다. 드럼은 고속으로 (<100 rpm) 다시 회전되어 정렬된 섬유의 침착을 가능하게 할 수 있다. 이러한 공정을 수회 반복하여 임의 지정층의 섬유가 이에 인접한 섬유 층들에 대해 직각으로 정렬되는 십자방향 정렬의 섬유 중합체 스캐폴드 시트를 제조할 수 있다.
실시예 16
마이크로/나노섬유 상처 치유
정렬되거나 비정렬된 섬유를 갖는 PLLA 마이크로/나노섬유 시트가 실시예 10에 기술되어 있는 바와 같이 제조되었다. 인위적 상처 또는 갭 결함을 하기와 같이 이들 섬유 시트 상의 정상의 사람 피부 섬유아세포 (NHDF)의 단층에 만들었다. 먼저, 18 게이지 주사기 바늘을 핸드 바이스 (hand vice)를 이용해 납작하게 하였다. 이어서, 나노섬유 PLLA 메쉬를 1 x 1 cm의 크기로 절단하였다. 납작한 바늘 및 메쉬를 70% 이소프로필 알콜에서 30분 동안 UV 광으로 멸균시키고, 바늘을 섬유 정렬에 대해 목적하는 배향으로 나노섬유를 가로질러 안전하게 놓았다 - 섬유는 상처 축에 대해 평행하거나 수직이거나 비정렬되었다 (도 35). NHDF를 전체 면적에 전면성장이 되도록 씨딩하였으나, 바늘은 세포가 아래쪽으로 결합하는 것을 방지하 였다 (도 35). 세포가 부착된 후, 바늘을 제거하여 상처를 그 자리에 남겼다. 배양물을 세포가 이동하고 상처를 보호하는 것을 가능하게 하는 1 내지 2일 동안 5% CO2로 37 ℃에서 가습된 인큐베이터에 놓았다. 씨딩 전, NHDF를 DiI 세포 트랙커 (1:2000 희석, 10분)로 간단히 염색하여 초기 상처 크기를 관측하고 상처로의 세포 침윤 전개를 모니터링하였다.
마이크로/나노삼유 상의 NHDF를 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100을 사용하여 침투성이 되게 한 후, 1% BSA로 차단하였다. 세포골격 염색을 위해, 샘플을 60분 동안 항-전체 액틴 일차 항체와 인큐베이션한 후, FITC-결합된 항-염소 IgG 이차 항체 (Jackson ImmunoResearch))와 60분 동안 인큐베이션하였다. 세포골격 특징을 이용하여 NHDF 단층의 전체 체계 및 상처 보호범위뿐만 아니라 세포 배향 및 형태를 측정하였다. NHDF 핵을 5분 동안 훽스트 (Hoechst)로 염색하여 세포를 계수하였다. 비정렬된 섬유에서, 섬유 이동 및 상처 보호는 24시간 동안 단지 중간이었으나, 섬유가 상처의 긴 가장자리에 대해 수직으로 배향되는 경우 크게 향상되었다 (도 36). 또한, NHDF는 비정렬된 섬유에서 임의 배향되었으나, 정렬된 섬유에서는 섬유 방향으로 배향되었다.
실시예 17
상처 치유
PLLA 섬유 중합체 스캐폴드 시트를 단지 정렬된 섬유를 사용하는 실시예 16에서 기술된 바와 같이 상처 치유를 위해 만들었다. 세포 씨딩 전, 섬유 중합체 스캐폴드 시트를 실시예 10에 기술된 바와 같이 라미닌 및/또는 bFGF로 기능화시켰다. bFGF는 전술된 바와 같이 중합체 스캐폴드 시트에 고정되거나 매질 중에 가용성 형태로 존재하였다. 다시, 인위적인 상처 또는 갭 결함을 실시예 16에 기술된 바와 같이 이들 섬유 시트 상의 정상의 사람 피부 섬유아세포 (NHDF)의 단층에 만들었다. 모든 샘플에 대한 섬유 정렬은 상처의 장축에 대해 수직이었다. 세포 이동 및 상처 보호를 실시예 16에 기술된 바와 같이 면역염색 및 현미경 검사로 분석하였다. 비처리된 섬유에서의 NHDF는 24시간 후 상처 부위를 완전히 보호하지 못하는 반면, 처리된 섬유 (라미닌 또는 bFGF) 상의 NHDF는 상처로 보다 빠르게 이용하였으며 향상된 상처 보호를 나타내었다 (도 37).
실시예 18
동물에서 나노섬유 상처 치유
정렬된 생분해성 중합체 나노섬유 시트가 실시예 14에 기술된 바와 같이 회전 드럼을 사용하여 제조될 수 있다. 이들 시트는 상처 드레싱으로 사용되어 동물에서 피부 조직 회복을 도울 수 있다. 외과의사에 의해 래트의 등에 완전히 두꺼운 갭 결함을 만들 수 있다. 마이크로/나노섬유 시트를 상처의 크기로 잘라 피부층으로 봉합하여 섬유아세포가 갭으로 이동하는 것을 도울 수 있다. 상처 치유 및 조직 재생은 디지탈 사진촬영, 조직학 및 면역조직화학을 이용해 모니터링될 수 있다.
본원에 기술된 실시예 및 양태는 단지 설명을 위한 것으로서, 다양한 변형 또는 변화가 이에 비추어 제시될 수 있으며 본 발명의 취지 및 권한 및 첨부된 특 허청구범위의 범위 내에서 포함될 수 있다고 믿어진다. 본원에 인용된 모든 공개문, 특허 및 특허원은 모든 점에서 본원에 참조로 삽입된다.

Claims (63)

  1. 제1 섬유 중합체 스캐폴드를 포함하고 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유 또는 섬유들이 정렬되어 있는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 섬유 중합체 스케폴더의 길이가 약 0.01 cm 내지 약 20 cm, 약 0.05 cm 내지 약 5 cm, 약 0.5 cm 내지 약 5 cm, 약 1 cm 내지 약 5 cm, 약 2 cm 내지 약 5 cm, 약 1 cm 내지 약 3 cm, 약 2 cm 내지 약 10 cm, 및 약 5 cm 내지 약 15 cm 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 형태가 시트, 도관, 충전된 도관 및 막대 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 형태가 도관, 충전된 도관 및 막대 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 막태 형태인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 본질적으로 세로 방향 및 원주 방향 중에서 선택되는 일원인 방향으로 정렬되는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 이은 자리를 갖는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 이은 자리가 없는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 통채로 (monolithically) 형성되는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 하나 이상의 섬유가 지방족 폴리에스테르, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리디메틸실록산, 폴리카프롤락톤, 폴리리신, 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 알기네이트, 피브린, 하이알루론산, 프로테오글리칸, 폴리펩타이드 및 이들의 조합 중에서 선택되는 일원인 중합체 또는 서브유닛을 포함하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 지방족 폴리에스테르가 락트산 (D- 또는 L-), 락타이드, 폴리(락트산), 폴리(락타이드) 글리콜산, 폴리(글리콜산), 폴리(글리콜라이드), 글리콜라이드, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(락트산-코-글리콜산) 및 이들의 조합 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 섬유 중 하나 이상이 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA)를 포함하는 조성물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 옥사이드가 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 및 이들의 조합 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 세포를 추가로 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세포가 제1 섬유 중합체 스캐폴드 내에 삽입되거나 표면에 존재하는 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 세포가 줄기 세포 및 전구 세포 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 상기 세포가 성체 혈관 세포, 혈관 전구 세포, 혈관 줄기 세포, 성체 근육 세포, 근육 전구 세포, 근육 줄기 세포, 성체 신경 세포, 신경 전구 세포, 신경 줄기 세포, 슈반 (Schwann) 세포, 섬유아세포, 성체 피부 세포, 피부 전구 세포, 및 피부 줄기 세포 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드에 직접적으로나 링커를 통해 공유적으로 부착되는 분자를 추가로 포함하고, 상기 분자가 세포외 기질 성분, 성장 인자, 분화 인자 및 이들의 조합 중에서 선택되는 일원에 공유적으로나 비공유적으로 부착될 수 있는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 분자가 링커를 통해 공유적으로 부착되고, 상기 링커가 디-아미노 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 글리콜) 및 이들의 조합 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 분자가 헤파린, 헤파란 설페이트, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 이들의 조합 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 상기 세포외 기질 성분이 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 비트로넥틴, 피브리노겐, 폴리리신 및 이들의 조합 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  22. 제18항에 있어서, 상기 성장 인자가 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 뇌-유도된 향신경성 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 전환 성장 인자 베타, 혈관 내피 성장 인자, 표피 성장 인자, 각질형성세포 성장 인자 및 이들의 조합 중에서 선택되는 일원인 조성 물.
  23. 제18항에 있어서, 상기 분화 인자가 간질세포 유도된 인자, 소닉 헤지호그 (sonic hedgehog), 골 형태형성 단백질, 노치 리간드 (notch ligand), Wnt 및 이들의 조합 중에서 선택되는 일원인 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 도관, 충전된 도관 또는 막대 형태이고, 상기 중합체가 이은 자리가 없는 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 중합체를 포함하는 중합체 용액을 회전 심축에 적용시킴으로써 생성되는 조성물.
  26. 제1항에 있어서, 상기 중합체 스캐폴드가 시트, 도관 또는 충전된 도관 형태이고, 하나 이상의 비-전도 영역을 갖는 회전 심축을 포함하는 전기방사 공정으로 생성되는 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 상기 중합체 스캐폴드가 막대 형태이고, 에어 갭을 갖는 회전 심축을 포함하는 전기방사 공정에 의해 생성되는 조성물.
  28. (a) 제1항에 따른 조성물; 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 막대 또는 도관이고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 하나 이상의 섬유가 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA)를 포함하는 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 조성물의 길이가 약 약 0.5 cm 내지 50 cm인 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 제1 섬유 중합체 스캐폴드를 둘러싸는 슬리브를 추가로 포함하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 슬리브가 제2 섬유 중합체 스캐폴드를 포함하고, 상기 제2 섬유 중합체 스캐폴드가 정렬되거나 임의 배향을 갖는 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 제1 말단을 둘러싸는 제1 슬리브 및 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 제2 말단을 둘러싸는 제2 슬리브를 추가로 포함하는 조성물.
  34. (i) 제1항에 따른 조성물을 피검체의 목적하는 부위에 상해를 치료하기에 충분한 양 및 조건 하에 적용시키는 것을 포함하여, 피검체의 상해를 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 상해가 심각한 신경, 손상된 신경, 심각한 근육, 손상된 근육, 심각한 혈관, 손상된 혈관, 피부 손상 및 멍든 피부 상해 중에서 선택되는 일원인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 상해가 심각한 신경 상해를 수반하고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 제1 말단 및 제2 말단을 포함하는 도관, 충전된 도관 또는 막대 형태이고, 상기 심각한 신경 상해가 제1 신경 스텀프 및 제2 신경 스텀프를 포함하며, 상기 적용이
    (ii) 상기 조성물의 제1 말단을 제1 신경 스텀프에 부착시키고;
    (iii) 상기 조성물의 제2 말단을 제2 신경 스텀프에 부착시키는 것을 포함하는 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 상해가 손상된 신경 상해를 수반하고, 상기 적용이
    (ii) 제1항에 따른 조성물을 손상된 신경 상해 주위에 감싸는 것을 포함하고, 상기 조성물이 시트 형태인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 상해가 손상된 신경 상해를 수반하고, 상기 적용이
    (ii) 상기 조성물을 손상된 신경에 삽입하는 것을 포함하고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 막대, 도관 또는 충전된 도관 형태인 방법.
  39. (i) 제1항에 따른 조성물을 피검체의 목적하는 신경 부위에 신경 성장을 향상시키기에 충분한 양 및 조건 하에 적용시키는 것을 포함하여, 피검체의 신경 성장을 향상시키는 방법.
  40. 제35항에 있어서, 상기 상해가 절개된 피부 또는 멍든 피부를 수반하고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 시트 형태이며, 상기 적용이
    (i) 상기 조성물을 절개된 피부에 부착시켜 상해를 치료하는 것을 포함하는 방법.
  41. 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 시트 형태이고,
    (i) 제1항에 따른 조성물을 피검체의 목적하는 피부 부위에 피부 성장을 향상시키기에 충분한 양 및 조건 하에 적용시키는 것을 포함하는, 피검체의 피부 성장을 향상시키는 방법.
  42. 제35항에 있어서, 상기 상해가 심각한 혈관 상해를 수반하고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 제1 말단 및 제2 말단을 포함하는 도관 또는 충전된 도관 형태이고, 상기 심각한 혈관 상해가 제1 혈관 스텀프 및 제2 혈관 스텀프를 포함하며, 상기 적용이
    (ii) 상기 조성물의 제1 말단을 제1 혈관 스텀프에 부착시키고;
    (iii) 상기 조성물의 제2 말단을 제2 혈관 스텀프에 부착시키는 것을 포함하는 방법.
  43. (i) 제1항에 따른 조성물을 피검체의 목적하는 혈관 부위에 혈관 성장을 향상시키기에 충분한 양 및 조건 하에 적용시키는 것을 포함하여, 피검체의 혈관 성장을 향상시키는 방법.
  44. 제35항에 있어서, 상기 상해가 심각한 근육 상해를 수반하고, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 제1 말단 및 제2 말단을 포함하는 도관, 충전된 도관 또는 막대 형태이고, 상기 심각한 근육 상해가 제1 근육 스텀프 및 제2 근육 스텀프를 포함하며, 상기 적용이
    (ii) 상기 조성물의 제1 말단을 제1 근육 스텀프에 부착시키고;
    (iii) 상기 조성물의 제2 말단을 제2 근육 스텀프에 부착시키는 것을 포함하는 방법.
  45. 제35항에 있어서, 상기 상해가 손상된 근육 상해를 수반하고, 상기 적용이
    (ii) 제1항에 따른 조성물을 손상된 근육 상해 주위에 감싸는 것을 포함하며, 상기 조성물이 시트 형태인 방법.
  46. 제35항에 있어서, 상기 상해가 손상된 근육 상해를 수반하고, 상기 적용이
    (ii) 상기 조성물을 손상된 근육에 삽입하는 것을 포함하며, 상기 제1 섬유 중합체 스캐폴드가 막대, 도관 또는 충전된 도관 형태인 방법.
  47. (i) 제1항에 따른 조성물을 피검체의 목적하는 근육 부위에 근육 성장을 향상시키기에 충분한 양 및 조건 하에 적용시키는 것을 포함하여, 피검체의 근육 성장을 향상시키는 방법.
  48. 제1항에 따른 조성물을 제조하는 방법.
  49. (i) 섬유 또는 섬유들을 전기방사 공정에 적용시켜 제1항에 따른 조성물을 제조함을 포함하여, 제1항에 따른 조성물을 제조하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 전기방사 공정이 에어 갭 또는 하나 이상의 비-전도 영역을 갖는 회전 심축을 포함하는 방법.
  51. 제1 전기 전도 영역;
    제2 전기 전도 영역; 및
    제1 전기 전도 영역과 제2 전도 영역 사이에서 연장되는 비-전기 전도 영역을 포함하고,
    비-전기 전도 영역이 제1 섬유 중합체 스캐폴드의 형성을 위한 섬유 중합체를 수령하는 치수 및 배치를 갖는, 전기방사 장치를 위한 심축.
  52. 제51항에 있어서, 상기 비-전기 전도 영역이 심축 주위에 놓인 슬리브인 심축.
  53. 제52항에 있어서, 상기 비-전기 전도 영역이 테이프, 전기 테이프, 테플론 및 플라스틱 중에서 선택되는 일원인 심축.
  54. 제51항에 있어서, 상기 비-전기 전도 영역이 2개의 전도 심축 영역을 서로 연결하는 심축.
  55. 제51항에 있어서, 상기 비-전기 전도 영역이 2개의 전도 심축 영역 사이에서 연장되는 분리된 부분인 심축.
  56. 제52항에 있어서, 상기 비-전기 전도 영역이 테플론 및 플라스틱 중에서 선택되는 일원인 심축.
  57. 제51항에 있어서, 상기 비-전도 전도 영역의 직경이 상기 전기 전도 영역보다 큰 직경 및 작은 직경 중에서 선택되는 일원인 심축.
  58. 제1 전기 전도 영역 및 제2 전기 전도 영역을 포함하고, 제1 전기 영역과 제2 전기 전도 영역 사이에 위치된 에어 갭이 제1 전기 전도 영역과 제2 전기 전도 영역 사이의 비-전도 영역을 형성하는 심축.
  59. 제58항에 있어서,
    제1 전기 전도 부분의 적어도 일부분 위에 위치된 제1 비-전기 전도 슬리브, 및
    제2 전기 전도 부분의 적어도 일부분 위에 위치된 제2 비-전기 전도 슬리브를 추가로 포함하는 심축.
  60. 제51항에 있어서, 전기방사 시스템과 조합된 심축.
  61. 제58항에 있어서, 전기방사 시스템과 조합된 심축.
  62. 비-전도 영역 또는 에어 갭을 갖는 회전 심축을 포함하는 전기방사 시스템.
  63. 제62항에 있어서, 중합체 용액이 방적돌기를 통해 지시되고 상기 심축에 침착되는 전기방사 시스템.
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