KR20140147880A - 마이크로스피어 조성물, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

마이크로스피어 조성물, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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마리 모히이유
반-탄 트란
쟈비에 갸릭
쟝 구단느
마리-끌레르 베니에-쥴리엔느
끌로디아 몽떼로-메네
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인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
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Abstract

세포 운반 마이크로스피어 조성물로서, 상기 마이크로스피어 조성물은 3중블록 코폴리머 매트릭스 A-B-A를 포함하는 마이크로스피어 코어를 포함하고, 상기 A는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA) 또는 폴리락티드(PLA)에서 선택되고, 상기 B는 폴록사머 또는 폴록사민이고, 상기 마이크로스피어 코어는 세포부착코팅에 의해 코팅되고, 상기 세포부착코팅에 결합된 세포단편 또는 전세포를 더 포함하는 것인, 세포 운반 마이크로스피어 조성물; 세포 운반 마이크로스피어 조성물의 제조방법; 및 이의 용도.

Description

마이크로스피어 조성물, 이의 제조방법 및 용도{MICROSPHERE COMPOSITIONS, PREPARATION METHOD AND APPLICATIONS THEREOF}
본 발명은 세포를 운반하는 마이크로스피어(microsphere) 조성물, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
WO03092657은 생체적합성 및 생체분해성 물질에 기반한 마이크로입자에 관한 것이다. 이의 표면은 관심 세포 또는 이의 단편을 포함하고, 마이크로입자의 이식 동안에 상기 세포 또는 이의 환경에 하나 이상의 유효성분의 분자를 더 포함하며, 상기 분자는 지연 및 제어된 방식으로 마이크로입자에 의해 방출된다.
자가 또는 비자가 전구세포 또는 성숙세포를 이식하는 것에 의한 세포요법은 질병에 걸린 기관을 고치는데 있어서 유망한 전략이다. 더욱이, 최근 줄기세포 생물학의 발전은 세포기반 치료요법에 대한 더한 흥미를 불러일으켰다. 다수의 팀이 손상된 조직을 회복시키기 위해 배아줄기세포, 성체줄기세포, 조직유래 줄기세포를 사용하였고, 더욱 최근에는 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 사용하였다. 이와 같은 맥락에서, 성체줄기세포 및 특히 다능간엽간질세포(multipotent mesenchymal stromal cell)라고도 불리는 간엽줄기세포(MSC)는 이들의 안정성, 다른 조직으로부터의 이들의 상대적 접근성 및 자가이식을 수행할 수 있는 가능성에 기인하여 조직공학을 위한 매력적인 세포 공급원으로 떠오르고 있다. 실제로, 상기 줄기세포는 분화하려는 이들의 고유 성질에 기인하여 근골격 조직공학 및 재생의 응용예에서 성공적으로 사용되어왔다. 또한, 이들은 특정 조건에서 뉴런유사세포 또는 내피유사세포와 같은 다른 세포계보로 분화할 수 있다. 더욱이, 간엽줄기세포는 손상된 조직으로 이동할 수 있고, 이들의 회복 특성은 이들의 면역중재작용을 포함하여 파라크린 메카니즘에 의해 조절될 수 있다는 것이 알려져있다. 그러나, 이식 후에 대부분의 세포는 사멸하거나, 또는 사전에 분화된 표현형으로 유도된 경우 상기 유도된 표현형을 유지하지 않는다. 결과적으로, 적은 세포 수 및 이의 거동의 원하지 않은 변화에 기인하여, 조직회복공정은 효율적이지 않으며, 상기 세포는 숙주환경(host environment)을 올바르게 통합시키지 않는다. 치료요법에서의 효율적인 사용을 위해, 세포의 생착은 개선되어야 할 필요가 있는데, 특히 이식 후에 세포의 단기 및 장기 생존 및 기능 상태에 대해 그러하다.
성장인자 및 분화인자는 세포의 생존 및 분화를 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 주변 환경에 영향을 줄 수 있으며, 이에 따라 이식물이 더 잘 통합되도록 할 수 있다. 다양한 성장인자, 사이토카인 또는 모르포겐(morphogen)이 MSC의 분화를 지휘하기 위해 널리 사용되어 왔다. 그러나, 상기 인자의 투여는 이들의 짧은 반감기, 다면발현현상 및 생물학적 장벽에 대한 이들의 제한된 투과성에 기인하여 여전히 기술상의 도전과제로 남아있다. 따라서, 예를 들어 단백질을 보호하고, 제어 및 지속된 방출을 가능하기 위해 나노 또는 마이크로디바이스와 같은 전달 담체를 사용하는 것이 이제 중대한 결정사항이다.
사이토카인에 부가하여, 세포외 매트릭스(ECM)의 조성 및 미세환경의 3차원성을 포함한 다수의 파라미터가 인간 간엽줄기세포의 생존 및 분화에 강한 영향을 미친다는 것이 알려졌다. 이와 같은 측면에서, ECM를 제공하는 스캐폴드(scaffold)가 예를 들어 뇌 뉴런 회복을 위해 개발되었다(Delcroix et al Biomaterials 2011).
이와 같은 맥락에서, 매력적인 전략은 줄기세포를 전달하는 약학적으로 활성인 이식가능한 소형 스캐폴드 내에 상기 연관된 파라미터를 제공하여, 생체 내 세포에 적합한 미세환경을 제공함으로써 이식된 줄기세포 생착를 자극하는 것이다.
본 발명자는 바람직하게는 활성 분자를 지속적으로 방출하도록 조작된 생체적합성 및 생체분해성 마이크로스피어이고, 이송된 세포를 위한 3차원 구조를 공급하는 세포외 매트릭스 분자 또는 세포부착 분자의 세포부착 표면을 나타내는 약학적으로 활성인 마이크로담체(코팅된 마이크로스피어)에 대한 조사를 수행하였다. 소형 마이크로담체에 결합된 상기 파라미터는 이송된 조직 및 주변 조직에 작용한다. 세포 및 단백질을 전달하는 상기 고유의 단순한 장치 개념의 증거가 다양한 세포부착 표면(라미닌, 피브로넥틴, 폴리-D-리신) 및/또는 성장인자(NGF, GDNF, NT-3)를 갖는 코팅된 마이크로스피어에 결합된 신경 세포주, 신경 전구체 및 성체줄기세포를 사용한 신경 장애의 치료를 위한 신경 보호 및 조직 회복에 대해 처음으로 입증되었다(Tatard et al 2004, Tatard et al 2007, Delcroix et al 2011, Garbayo et al 2011). 더욱이, 연골 회복을 위해 효과적인 지지체를 제공하기 위한 목적으로, 인간 간엽줄기세포에 연관된 전환성장인자 3(TGF-β3)을 방출하는 약학적으로 활성인 마이크로담체가 시험관 내 및 생체 내에서 이들의 콘드로겐 분화를 유도하는 것으로 나타났다[Bouffi C, et al. The role of pharmacologically active microcarriers releasing TGF-β3 in cartilage formation in vivo by mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31:6485-931]. 그러나, 상기 폴리(D,L 락티드-코-글리콜리드)(PLGA)의 약학적으로 활성인 마이크로담체는 방출 기간 동안의 단백질-폴리머 상호작용 때문에 낮고 불완전하게 TGF-β3을 방출하였고(30일에 25%의 생체활성 단백질), 이는 단백질을 불안정하게 한다. 생리학적 수준에서 고활성의 치료 단백질을 정밀하게 전달시키기 위해, 낮은 캡슐화 적재량에서의 작업의 필요성에 의해 상호작용이 증대된다. 이와 같은 문제점을 회피하기 위해, 친수성 분절 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이 PLGA와 같은 소수성 폴리에스테르에 도입되어, 3중블록 코폴리머 마이크로스피어를 형성하였다. PEG 분절의 존재는 물의 흡수를 증가시키고, 이에 따라 더 높은 단백질의 방출을 일으킨다(TRAN et al. European Journal of Pharmaceutical Sciences 45 (2012) 128-137).
본 발명의 목적은 기존의 제품 및 방법의 단점을 제거하거나, 적어도 실질적으로 완화시키는 것이다.
본 발명자는 이제 특정 3중블록 코폴리머에 기반한 코팅된 마이크로스피어 조성물에 의해 운반되는 전세포 또는 세포단편의 수가 상당하게 증가하였음을 발견하였다. 또한, 특정 3중블록 코폴리머를 사용하는 것은 전세포의 수를 증가시킨다. 더욱이, 코팅의 성질이 코팅된 마이크로스피어 조성물에 의해 운반되는 전세포 또는 세포단편의 수를 증가시킬 수 있고, 세포 분화에 영향을 줄 수 있다. 또한, 특정 3중블록 코폴리머는 유효성분, 바람직하게는 단백질을 포매할 수 있고, 높은 유효성분을 방출하는 놀라운 특성을 갖는 서방형 매트릭스 조성물을 제공한다. 이에 따라서, 상기 매트릭스 조성물에 연결된 관심대상인 전세포 또는 이의 단편이 유효성분과 상호작용하여, 더 뛰어난 전세포 또는 단편의 효율이 획득된다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포를 운반하는 마이크로스피어 조성물로서, 상기 마이크로스피어 조성물은 3중블록 코폴리머 매트릭스 A-B-A를 포함하는 마이크로스피어 코어를 포함하고, 상기 A는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA) 또는 폴리락티드(PLA)에서 선택되고, 상기 B는 폴록사머 또는 폴록사민에서 선택되고, 상기 마이크로스피어 코어는 세포부착코팅에 의해 코팅되고, 상기 세포부착코팅에 결합된 세포단편 또는 전세포를 더 포함하는 것인, 세포 운반 마이크로스피어 조성물이다.
바람직한 3중블록 코폴리머 매트릭스는 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)- 폴록사머 - 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) - 폴록사민 - 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드), 및 폴리(락티드) - 폴록사머 - 폴리(락티드), 특히 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) - 폴록사머 - 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)이다.
마이크로스피어는 마이크로미터 범위, 통상적으로 1　㎛ 내지 1000　㎛, 바람직하게는 5　㎛ 내지 500 ㎛, 특히 10　㎛ 내지 250 ㎛, 특히 25　㎛ 내지　150 ㎛, 더욱 특히 50 ㎛ 내지 80 ㎛의 직경을 갖는 소형은 구형에 가까운 입자이다.
A-B-A 코폴리머, 더욱 특히 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) - 폴록사머 - 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)는 3중블록 코폴리머이다.
바람직한 첫번째 블럭은 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)이다.
바람직한 두번째 블럭은 폴록사머 또는 폴록사민, 바람직하게는 폴록사머이다. 폴록사머는 그 자체로 비이온성 3중블록 코폴리머이다. 1,000 내지 3,500 g/mol, 바람직하게는 1,000 내지 2,000 g/mol의 폴리옥시프로필렌 질량, 및 40 내지 90%, 바람직하게는 80 내지 85%의 폴리옥시에틸렌 함량을 갖는 폴록사머, 더욱 특히 폴록사머 188이 바람직하다. 폴록사머 188은 8,400의 평균 분자량, 및 약 80 중량%의 옥시에틸렌을 갖는다.
3중블록 코폴리머의 혼합물이 사용될 수 있다.
PLGA-폴록사민-PLGA 3중블록은 단일 폴록사민 분자에 결합된 4개의 PLGA 분자를 갖는 코폴리머 블록의 구조를 가질 수 있다.
3중블록 코폴리머 내의 폴록사머 또는 폴록사민의 비율은 0.4 내지 40%(w/w), 바람직하게는 8 내지 20%(w/w)이다.
2,000 내지 20,000 g/mol, 바람직하게는 2,000 내지 15,000 g/mol, 더욱 바람직하게는 7,000 내지 10,000 g/mol의 폴록사머 분자량 및 0.4 내지 50%, 바람직하게는 8 내지 20%, 더욱 바람직하게는 9 내지 12%의 폴록사머 함량을 갖는 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) - 폴록사머 - 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) 3중블록 코폴리머가 특히 바람직하다.
본 발명의 세포 운반 마이크로스피어 조성물은 관심 세포를 운반하는데 유용하다. 상기 세포, 즉 세포단편 또는 바람직하게는 전세포, 더욱 바람직하게는 기능성 전세포는 세포부착 표면 코팅을 통해 마이크로스피어와 상호작용한다.
본 발명에 따르면, 전세포 또는 세포단편은 간접적으로 상기 마이크로스피어 조성물에 결합된다. 본 발명에서 "세포부착 표면 코팅"은 세포부착을 강화하는 세포외 매트릭스 분자 또는 세포부착 분자, 또는 상기 분자의 단편을 포함하거나 이로 구성되는 표면을 의미한다. 또한, 상기 세포부착 표면 코팅은 세포 기능, 특히 증식 또는 생존, 또는 더욱 특히 분화에 변화를 줄 수 있다. 마이크로스피어 조성물은 이와 같은 목적을 위해 폴리-D-리신(PDL), 폴리-L-리신, 아르기닌-글리신-아스파르트산 트리펩티드(RGD), 폴리오르니틴, 폴리에틸렌아민, 피브로넥틴-유사 화합물과 같은 다른 합성 분자, 또는 세포외 매트릭스 분자(피브로넥틴 (FN), 라미닌, 콜라겐) 또는 세포부착 분자(N-CAM, 셀렉틴), 또는 세포외 매트릭스 분자 또는 세포부착 분자의 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 포함한 세포부착 또는 세포기능을 강화하는 화합물에 의해, 완전히 또는 부분적으로 코팅되거나 다른 방식에 의해 획득된 세포부착 표면을 나타낸다. 단일 화합물 또는 이와 같은 화합물의 혼합물이 사용될 수 있다. 피브로넥틴-유사 화합물은 예를 들어 SIGMA에 의해 상용된다.
세포는 바람직하게는 피브로넥틴 및 폴리-D-리신을, 바람직하게는 60-40 비율로 포함하는 코팅에 의해 마이크로스피어를 운반하는 세포의 표면에 결합된다.
마이크로스피어에 따른 전세포 또는 세포단편의 결합 메카니즘은 다른 성질을 가질 수 있다. 세포부착은 분자간의 힘, 예를 들어 이온의 힘(예를 들어, 양이온성 폴리-D-리신), 반데르발스력 또는 수소결합에 의해 달성될 수 있다. 세포부착은 특히 종래의 리간드-수용체 결합에 따라 세포 표면에 존재하는 수용체(세포 표면 상의 인테그린 및 예를 들어 세포부착코팅에 존재하는 FN 또는 라미닌과 같은 세포외 매트릭스 분자 또는 세포 표면 상의 세포부착 분자(N-CAM) 및 세포부착코팅 상에 존재하는 N-CAM)를 통해 달성될 수 있다.
세포, 바람직하게는 인간 세포는 예를 들어 성체자가세포, 태아세포, 변형된 세포주, 줄기세포, 다능 또는 만능세포, 재프로그램된 세포일 수 있다. 상기 세포는 재생의학에서 다양한 질병에 사용될 수 있다.
이는 예를 들어 당뇨의 치료를 위한 랑게르한스섬 및 간세포의 이식의 경우이다.
신경이식의 경우, 세포는 도파민을 분비하고 NGF의 영향에 의해 교감 뉴런-유사로 분화할 수 있는 PC12 세포주일 수 있다. 세포의 다른 예는 간, 심근, 중추신경계의 회복을 위한 이식, 랑게르한스섬, 골수세포, 성체세포, 태아세포, 재프로그램된 세포, 변형되거나 변형되지 않은 세포주, 줄기세포, 유전자 조작된 세포, 복제가 결함된 재조합 바이러스를 생성하는 세포, 간세포, 섬세포, 신경세포, 근육세포, 조혈세포, 골세포의 이식에 사용되는 세포를 포함한다.
다른 적합한 세포는 전이유전자를 포함하는 세포와 같이 생체 내 유전자 전달을 위한 세포, 주변의 숙주 수페롤 감염시킬 복제가 결함된 재조합 바이러스를 생성하는 세포이다.
"세포단편"은 전세포의 약학적으로 활성인 부분을 의미한다. 약학적으로 활성인 세포단편은 전세포로부터 예를 들어 세포막을 분열시켜 세포의 내용물을 방출시키는 초음파분해 또는 효소기반의 분열에 의해 획득될 수 있다. 종래의 시험이 원하는 약학적 효과가 유지되는지 여부를 분석할 수 있게 한다. 동일한 마이크로스피어가 전세포 및 세포단편을 포함할 수 있다.
통상의 기술자는 본 명세서에서 "하나(a)"라는 용어가 "하나 이상" 또는 "하나 또는 복수"를 의미하는 경우를 용이하게 이해할 수 있다. 예를 들어, 마이크로스피어 코어가 세포부착코팅에 의해 코팅된다고 기재되어 있는 경우 "하나 이상의 세포부착코팅"을 의미하거나, 또는 본 발명의 마이크로스피어 조성물이 마이크로스피어 내부에 유효성분을 포함한다고 기재되어 있는 경우 "하나 이상의 유효성분"을 의미하는 것이다.
바람직한 본 발명의 세포 운반 마이크로스피어 조성물은 상기 마이크로스피어에 포매된 유효성분을 포함한다. 상기 유효성분은 코폴리머의 매트릭스에 포매된다. 따라서, 유효성분의 용해는 물이 충전된 기공 또는 코폴리머를 통한 확산에 의해, 또는 캡슐화 코폴리머의 용해에 의해 수행되어야 한다. 코어는 높은 유효성분 방출량의 놀라운 특성을 갖는 서방형 매트릭스 조성물을 제공한다.
또한, 유효성분(들)은 마이크로스피어의 표면에 존재할 수 있다.
유효성분(바람직하게는, 단백질)은 세포의 분화 및 시험관 내 또는 생체 증식을 제어하거나, 이들의 조직 환경을 조절(면역거부현상의 방지, 혈관형성의 촉진)할 수 있는 가능성을 제공한다. 또한, 유효성분은 세포단편의 효과를 제어할 수 있는 가능성을 제공한다.
관심 세포를 운반하는 서방형 마이크로스피어 조성물의 경우, 유효성분은 바람직하게는 세포 또는 이들이 효과를 조절하는 활성제이다. 상기한 바와 같이, 조절은 바람직하게는 증식 또는 분화, 또는 상기 세포의 조직 환경의 변형이다.
따라서, 유효성분, 바람직하게는 단백질은 유리하게는 사이토카인, 바람직하게는 인터루킨과 같은 면역조절제, 또는 성장인자, 바람직하게는 뉴로트로핀과 같이 시간에 따른 세포의 기능을 연장시키기 위해 상기 세포의 생존에 기여하는 인자, 전환성장인자를 포함하는 골형성단백질 확장된 패밀리, 또는 모르포겐과 같이 단백질 성질 또는 레티노산과 같이 비단백질 성질의 세포의 분화를 유도하는 인자이다.
반대로, 유효성분은 Fas 리간드와 같이 세포에 수송되고 이의 사멸 및 처분을 프로그래밍하는 독성 분자일 수 있다.
따라서, 단백질 유효성분은 유리하게는 효소, 성장인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 항체 단편, 응고인자, 또는 세포 또는 이들의 조직 환경에 대한 이의 작용이 알려진 다른 단밸질이다.
단백질 유효성분은 더욱 특히 세포 분화에 영향을 주는 성장인자, 사이토카인 또는 면역조절인자이며, NGF, BNDF, NT-3 등과 같은 뉴로트로핀, TGFfis GDNF 패밀리, FGF EGF, PDGF, IL-1, IL-2와 같은 인터루킨, 키모카인, 레티노산, 에리스로포이에틴 등 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것들을 포함한다.
"단백질" 유효성분이라는 용어는 폴리펩티드 및 올리고펩티드 유효성분을 포함한다.
바람직한 유효성분은 세포의 생존, 기능을 촉진하거나, 줄기세포의 특정 표현형으로의 분화를 지휘한다.
또한, 이들은 면역 반응 및 이식 거부를 감소시키거나, 혈관형성을 증가시켜 통합을 촉진함으로써 조직 환경을 변화시킬 수 있다.
또한, 본 조성물에 사용되는 유효성분은 성장인자와 같이 상기 성분에 반응하는 프로모터의 제어하에 있는 유전자 조작된 세포에 존재하는 유전자의 발현을 제어하기 위해 사용될 수 있다.
단백질 유효성분은 바람직하게는 나노입자로서 사용될 수 있다. 이들은 특히 나노침전에 의해 획득될 수 있다.
비단백질 성질의 더욱 전통적인 유효성분은 예를 들어 항산화 분자(비타민, 플라보노이드), 화학요법용 약물(5-FU, BCNU, 도세탁셀, 파클리탁셀 등), (5-요오도-2'-디옥시우리딘(Idurd 등)과 같은 방사선증감 약물을 포함한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기한 바와 같은 세포 운반 마이크로스피어 조성물의 제조방법으로서, 상기 제조방법은 전세포 또는 세포단편을 포함하는 세포 운반 마이크로스피어 조성물을 획득하기 위해 하기 단계를 포함한다:
- 3중블록 코폴리머 매트릭스 A-B-A를 포함하는 마이크로스피어 코어를 제공하는 단계, 여기서 상기 A는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA) 또는 폴리락티드(PLA)에서 선택되고, 상기 B는 폴록사머 또는 폴록사민임;
- 세포부착 화합물에 의해 상기 마이크로스피어를 완전히 또는 부분적으로 코팅하는 단계; 및
- 전세포 또는 세포단편을 세포부착 표면을 나타내는 마이크로스피어와 접촉시키는 단계.
본 발명을 실시하기 위한 바람직한 조건에서, 예를 들어 폴리리신과 같은 합성 부착 펩티드, 또는 RGD와 같은 RGD-유사 펩티드, 또는 IKVAV과 같은 세포외 매트릭스 분자 또는 KHIFSDDSSE와 같은 세포부착 분자의 펩티드를 마이크로스피어의 표면에 접목시킴으로써, 폴리머성 매트릭스의 화학적 표면 개질에 의해 세포부착 표면이 획득된다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 3중블록 코폴리머에 포매된 유효성분, 바람직하게는 단백질을 더 포함하는 상기한 바와 같은 세포 운반 마이크로스피어 조성물의 제조방법이고, 상기 제조방법은 하기 단계를 포함한다:
- 폴리머의 용매, 바람직하게는 유기 용매 중의 A-B-A(바람직하게는, 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)-폴록사머-폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)) 3중블록 코폴리머 용액을 제공하는 단계;
- 유효성분(바람직하게는, 단백질)을 제공하는 단계;
- 상기 유효성분을 상기 A-B-A 3중블록 코폴리머 용액에 첨가하고, 상기 유효성분을 유화 또는 현탁, 단백질의 경우에는 바람직하게는 현탁시키는 단계;
- 상기 A-B-A 3중블록 코폴리머 용액을 계면활성제를 포함하는 액상에 유화시키는 단계;
- 폴리머의 용매를 제거하여, 유효성분이 포매된 매트릭스를 형성하는 마이크로스피어를 획득하는 단계;
- 상기 마이크로스피어를 분리시키는 단계;
- 상기 마이크로스피어를 세포부탁 화합물에 의해 완전히 또는 부분적으로 코팅하는 단계; 및
- 전세포 또는 세포단편을 세포부착 표면을 나타내는 마이크로스피어와 접촉시켜, 전세포 또는 세포단편을 포함하는 세포 운반 서방형 마이크로스피어 조성물을 획득하는 단계.
상기 본 발명의 방법을 실시하기 위한 다른 바람직한 조건에서, 상기 코팅 단계는 코팅의 세포부착 화합물을 현탁된 마이크로스피어와 적절한 비율로 혼합함으로써 수행될 수 있다. 코팅은 바람직하게는 부착 화합물을 마이크로스피어에 흡착시킴으로써 획득된다.
상기 본 발명의 방법을 실시하기 위한 또다른 바람직한 조건에서, 상기 부착 단계는 세포 현탁액을 코팅된 마이크로스피어 현탄액과 적절한 비율로 혼합시킴으로써 수행될 수 있다.
이에 따라, 코팅된 A-B-A(바람직하게는 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)-폴록사머-폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)) 매트릭스에 포매된 유효성분, 바람직하게는 단백질을 포함하고, 전세포 또는 세포단편을 더 포함하는 서방형 마이크로스피어 조성물이 획득된다.
마이크로스피어는 세포부착 또는 세포기능(예를 들어, 생존) 또는 이들 모두를 강화하는 화합물에 의해 완전히 코팅되거나 또는 부분적으로 코팅되거나, 또는 다른 방식에 의해 획득된 세포부착 표면을 나타낸다.
용매는 주사가능한 용매인 3중블록 코폴리머의 임의의 적합한 용매, 바람직하게는 유기 용매, 특히 염화 메틸렌 및 아세톤 또는 글리코퓨롤의 혼합물일 수 있다.
단백질성 유효성분은 바람직하게는 나노침전에 의해 사전에 획득된다. 따라서, 코폴리머과 단백질 사이의 상호작용이 감소된다. 단백질은 알부민과 같은 첨가제에 의해 안정화될 필요가 없다.
유기 용매의 제거는 예를 들어 추출 매질, 바람직하게는 물을 첨가함으로써 수행된다.
이에 따라 획득된 마이크로스피어는 바람직하게는 여과와 같은 물리적 분리에 분리된다.
더욱이, 분리된 마이크로스피어는 바람직하게는 동결건조된다.
사용되는 특정 3중블록 코폴리머 때문에, 본 발명에 따른 하나 이상의 유효성분을 포함하는 세포 운반 마이크로스피어 조성물은 유리한 특성을 갖는다.
사용되는 특정 3중블록 코폴리머는 조성물에 하기와 같은 흥미로운 양의 전세포 또는 세포단편을 제공한다.
또한, 특정 3중블록 코폴리머의 사용은 전세포의 수를 증가시킨다.
더욱이, 코팅의 성질은 코팅된 마이크로스피어 조성물에 의해 운반되는 전세포 또는 세포단편의 수를 증가시킬 수 있고, 세포 분화에 영향을 줄 수 있다.
또한, 특정 3중블록 코폴리머는 유효성분, 바람직하게는 단백질을 포매할 수 있고, 제어된 방출 프로파일 및 추가적으로 높은 유효성분 방출의 놀라운 특성을 갖는 서방형 매트릭스 조성물을 제공한다. 이에 따라, 상기 매트릭스 조성물에 연결된 관심 전세포 또는 이의 단편은 유효성분과 상호작용할 수 있고, 이에 따라 전세포 또는 단편의 더 뛰어난 효능이 획득된다.
마이크로스피어의 3중블록 코폴리머는 생체적합성이고, 인체에 재흡수될 수 있다.
상기 세포 운반 마이크로스피어 조성물은 조성물의 제조를 위해 사용될 수 있고, 여기서 상기 마이크로스피어는 이들의 표면에 관심 전세포 또는 이의 단편이 제공되고, 선택적으로 상기 세포 또는 이들의 환경에 대해 활성인 하나 이상의 성분 및/또는 지속 및 제어되는 방출에 따라 마이크로입자로부터 방출되는 유효성분을 더 포함한다.
이것이 본 발명의 다른 목적이 인체 또는 동물체의 치료를 위한 방법에 사용하기 위한, 관심 전세포 또는 이의 단편이 제공되는 상기 코팅된 세포 운반 마이크로스피어 조성물인 것의 이유이다.
본 발명의 다른 목적은 인체 또는 동물체의 치료를 위한 방법에 사용하기 위한, 코팅된 세포 운반 마이크로스피어 조성물로서, 상기 마이크로스피어는 이의 표면에 관심 전세포 또는 이의 단편이 제공되고, 상기한 바와 같이 상기 전세포 또는 단편 또는 이들의 환경에 대해 활성인 성분을 더 포함한다.
더욱 구체적으로는, 본 발명의 다른 목적은 세포 운반 마이크로스피어 조성물로서, 상기 마이크로스피어는 이들의 표면에 관심 전세포 또는 이의 단편이 제공되고 상기한 바와 같이 상기 전세포 또는 단편에 대해 활성인 성분을 더 포함하며, 퇴행성 질병, 바람직하게는 신경퇴행성 질병(파키슨, 헌팅턴, 알츠하이머 등), 척수 손상, 골관절 질병(골관절염, 외상후 골관절염), 허혈성 질병(뇌허혈, 발기부전, 요실금, 말초수족허혈), 신부전의 치료를 위해 사용하기 위한 것인 세포 운반 마이크로스피어 조성물이다.
이들의 치료적 사용의 측면에서, 상기 조성물은 바람직하게는 약학 조성물로 제형화된다.
따라서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 선택적으로 다른 치료성분 및/또는 예방성분과 함께 본 발명의 세포 운반 마이크로스피어 조성물을 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
일반적으로는, 본 발명의 세포 운반 마이크로스피어 조성물은 유사한 용도로 사용되는 제제를 위한 허용되는 임의의 투여 방식에 의해 치료학적으로 유효량으로 투여될 것이다. 적합한 투여량의 범위는 치료될 질병의 중도, 대상체의 나이 및 상대적 건강상태, 사용되는 유효성분 또는 세포 또는 단편의 효능, 투여의 경로 및 형태, 및 투여가 행해지는 지침에 따른다. 이와 같은 질병을 치료하는 통상의 기술 중 하나가 과도한 실험 없이 개인적인 지식 및 본 출원의 기재내용에 의지하여 특정 질병을 위한 본 발명의 화합물의 치료학적 유효량을 확인할 수 있을 것이다.
본 발명의 세포 운반 마이크로스피어 조성물은 보통 비경구 투여에 적합한 것들을 포함하는 약학 제형으로서 투여될 것이다.
본 발명의 세포 운반 마이크로스피어 조성물은 하나 이상의 종래의 애쥬번트, 담체 또는 희석액과 함께 약학 조성물 및 단위 투여의 형태로 놓일 수 있다. 약학 조성물 및 단위 투여 형태는 추가적인 활성 화합물 또는 성분과 함께 또는 이들 없이 종래의 성분을 종래의 비율로 포함할 수 있고, 단위 투여 형태는 사용하는 것으로 의도된 일일 투여 범위에 따라 임의의 적합한 유효량의 유효성분을 포함할 수 있다.
세포 운반 마이크로스피어 조성물은 비경구투여를 위한 살균주사제의 형태로 이용될 수 있다.
비경구 또는 국소 투여(예를 들어, 주사, 바람직하게는 볼루스(bolus) 주사 또는 정위(stereotaxic) 주사)를 위해, 본 발명의 세포 운반 마이크로스피어 조성물은 제형화될 수 있고, 제형화제 또는 첨가제와 함께 또는 이들 없이 앰플, 병, 사전충전된 주사기의 소용량 주입제에서 단위 투여 형태로, 또는 다중 투여 용기로 제공될 수 있다.
조성물은 유성 또는 수성 전달체 중의 현탁액과 같은 형태를 가질 수 있다. 비수성 또는 유성 희석액, 용매 또는 전달체의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유(예를 들어, 올리브유) 및 주사가능한 유기 에스테르(예를 들어, 에틸 올레이트)가 포함되고, 방부제, 습윤제, 유화제 또는 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형화게를 포함할 수 있다. 선택적으로는, 세포 운반 마이크로스피어 조성물은 적합한 전달체, 예를 들어 살균된 발열물질-미함유 물에 의해 사용 전에 구성되는 살균된 고체의 무균성 분리 또는 용액으로부터의 동결건조에 의해 획득된 분말 형태일 수 있다.
상기한 세포 운반 마이크로스피어 조성물을 실시하기 위한 바람직한 조건은 상기한 본 발명의 다른 목적, 특히 세포가 제공되는 세포 운반 마이크로스피어 조성물, 상기한 방법 및 약학 제형에도 적용된다. 예를 들어, 모든 경우에 사용되는 유효성분은 바람직하게는 단백질이다.
도 1은 코팅을 갖는 미적재된 마이크로스피어를 나타낸다.
도 2는 광학 현미경(A) 및 주사 전자 현미경(B)을 사용하여 분석된 미적재된 코팅된 마이크로스피어(제조 10)의 표면에 대한 세포부착을 나타낸다.
도 3은 PLGA에 비교한 3중블록 코폴리머(폴리머성 필름) 상의 피브로넥틴 세포부착 표면의 반정량적 형광 강도를 나타낸다.
도 4는 배양 4시간 후에 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어, PLGA 또는 PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어(피브로넥틴/PDL 세포부착 표면을 갖는 마이크로스피어)에 부착된 hMSC의 수를 나타내는 그래프이다.
도 5는 시간의 함수로서 PLGA 또는 PLGA-P188-PLGA에 의해 제형화된 코팅된 마이크로스피어 상의 hMSC의 수를 나타낸다.
도 6은 7일의 간격을 두고 (A) 마이크로스피어로부터의 시험관 내 리소자임 방출량, (B) 500 ㎕의 Tris-HCl 0.05 M의 방출 배지 버퍼액의 pH의 결과를 나타낸다.
도 7은 PLGA + P188 1:10, PLGA-P188-PLGA + P188 1:10, PLGA-P188-PLGA + P188 1:20 마이크로스피어로부터 생체활성 리소자임의 누적된 방출량 대 시간을 나타내는 그래프이다.
도 8은 PLGA + P188 1:10, PLGA-P188-PLGA + P188 1:10 또는 PLGA-P188-PLGA + P188 1:20으로 구성되는 마이크로스피어로부터 총 및 생체활성 TGF-beta3의 누적된 방출량을 나타내는 그래프이다.
도 9는 TGFb3을 방출하거나 방출하지 않는 PLGA 코팅된 마이크로스피어 또는 PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어에 의해 시험관 내 배양된 hMSC의 콘드로겐 분화를 나타낸다. 연골세포 마커(A), 지방형성 마커(B) 및 골형성 마커(C)의 발현.
도 10은 hMSC가 미적재된 코팅된 마이크로스피어(A,D), TGFb3-코팅된 마이크로스피어 PLGA(B, E) 및 TGFb3 코팅된 마이크로스피어 PLGA-P188-PLGA(C, F)에 의해 마이크로펠릿에서 28일 동안 배양된 경우, 콜라겐 II(A, B, C) 및 아그레칸(D,E,F), 연골 세포외 매트릭스의 성분의 면역염색을 나타내는 사진이다.
본 발명의 범위는 하기의 실시예를 참조하면 더욱 잘 이해될 것이며, 이의 목적은 본 발명의 이점을 설명하는 것이다.
제조 1: PLGA - P188 - PLGA , PLA - P188 - PLA , 및 PLGA - 폴록사민 - PLGA 코폴리머의 제조
3중블록 코폴리머 PLGA-P188-PLGA(ABA 코폴리머)가 폴록사머 188을 개시제로, 그리고 옥토산 주석 [Sn(Oct)2]을 촉매로 사용하여 DL-락티드 및 글리콜리드의 고리-열림 중합에 의해 제조되었다.
하기 표 1에 따라, 다양한 정밀한 양의 폴록사머 188(1, 2, 3) 또는 폴록사민(4) 및 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA)(1,2,4) 또는 PLA(3)가 옥토산 주석 [Sn(Oct)2]과 함께 혼합되고 100mL의 둥근 바닥 플라스크에 도입되었다.
코폴리머 합성을 위해 사용된 구성성분
폴리머 1 2 3 4 5 6 7 8 9
폴록사머 188 5g 4.8 g 2.4g 0 3.47 g 5.92 g 0 0 0
폴록사민 Tetronic 1107 0 0 0 2.1g 0 0 2.1 g 3.16 g 5.45 g
락티드
글리콜리드		 26.4g
21.2g		 25g
20g		 22.6g
0g		 12.7g
10.2g		 9.15 g
7.37 g		 7.8 g
6.28 g		 12.7 g
10.2 g		 9.33 g
7.51 g		 8.06 g
6.49 g
옥토산 주석 48 mg 46mg 23 mg 23mg 33 mg 57 mg 23 mg 34 mg 23 mg
상기 표 1의 혼합물은 수분 및 산소를 제거하기 위해, 140℃로 가열 및 15번의 진공-질소 퍼지(purge) 주기에 의해 탈기된다. 플라스크는 그 후 0℃에서 냉각되고, 10-3 mbar의 동적 감압(dynamic reduced pressure)에서 밀폐되었다. 중합은 일정한 교반하에서 140℃에서 진행되도록 하였다. 5일 후, 생성물이 500 mL의 염화 메틸렌에 용해함으로써 회수되었고, 그 후 동일한 부피의 에탄올을 첨가함으로써 침전되었다.
마지막으로, 3중블록 코폴리머를 여과, 차가운 에탄올에 의해 세척, 및 감압하의 45℃에서 중량이 일정해질 때까지 하룻밤 동안 건조되었다.
분석
PLGA-P188-PLGA 및 다른 코폴리머가 1H NMR 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 특성화되었다. PLGA 블록의 분자량이 1H NMR 스펙트럼에서 3.6ppm에서 PEG 유닛 및 4.76ppm에서 PLGA 블록의 공명의 통합비를 사용함으로써 측정되었다. 코폴리머의 분자량이 Plgel 5㎛ 혼합-C(60cm) 컬럼이 설치된 Waters Inc. 장비 및 1mL.min-1의 DMF에 의해 용출되는 Waters 410 굴절 검출기를 사용함으로써 SEC에 의해 측정되었다. 통상적으로, 샘플이 10mg/mL의 DMF에 용해되고, 20㎕의 코폴리머 용액이 삽입되기에 앞서 Millipore Corporation의 PTFE 필터 Millex® FH(기공 크기: 0.45㎛)에서 여과되었다. Mn 및 Mw는 폴리(스티렌) 기준에 대한 눈금에 따라 표현된다.
결과
1H NMR에 의해 계산
코드명 실제 분자량
폴록사머 분절 Mn
(kDa) 		PLGA 또는 PLA 분절 Mn
(kDa)		 총 Mn
(kDa)
PLGA-P188-PLGA
(폴리머 1)		 8.4 40.7 89.8
PLA-P188-PLA
(폴리머 3)		 8.4 32.7 73.7
PLGA-P188-PLGA
(폴리머 5)		 8.4 17.3 43
PLGA-P188-PLGA
(폴리머 6)		 8.4 9.8 28
PLGA-T1107-PLGA
(폴리머 7)		 15 30.0 135
PLGA-T1107-PLGA
(폴리머 8)		 15 17.3 84.2
PLGA-T1107-PLGA
(폴리머 9)		 15 6.7 41.8
크기 배제 크로마토그래피에 의해 계산
코드명 실제 분자량
총 Mn(kDa) 총 Mw(kDa) Ip
PLGA-P188-PLGA
(코폴리머 1)		 60.6 96.7 1.6
PLA-P188-PLA
(코폴리머 3)		 40.24 60.1 1.5
PLGA-P188-PLGA
(코폴리머 5)		 51.8 73.0 1.41
PLGA-P188-PLGA
(코폴리머 6)		 41.4 56.7 1.37
PLGA-T1107-PLGA
(코폴리머 7)		 47.0 67.7 1.44
PLGA-T1107-PLGA
(코폴리머 8)		 48.4 65.3 1.35
PLGA-T1107-PLGA
(코폴리머 9)		 59.6 71.5 1.2
참고용으로 사용된 폴리머는 Phusis(Saint-Ismier, France)에 의해 제공되는 비캡핑된(말단에 자유 카르복시산기) PLGA 37.5/25(Mn 14,000 Da), 및 Institut des biomoleules Max Mousseron, CNRS UMR 5247, Montpellier, F-34093 France에 의해 제공되는 PLGA-PEG-PLGA(PLGA 분절에 대해 45,300의 Mn, PEG 분절에 대해 4,000의 Mn)이다.
제조 2: 폴록사머 188에 의해 커플링된 나노침전된 리소자임의 제조(1-10의 비율)
단백질 나노입자의 제조를 위한 일반적인 절차:
[Bouffi C et al. http://www.sciencedirect.com/science/article/ pii/S0142961210013487 - bib55: The role of pharmacologically active microcarriers releasing TGF-β3 in cartilage formation in vivo by mesenchymal stem cell. Biomaterials. 2010;31:6485-93] 및 [Giteau A et al. Reversible protein precipitation to ensure stability during encapsulation within PLGA microspheres. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2008;70:127-36]에 개시된 공정을 사용하여 단밸질이 나노침전되었다.
0.3 M의 NaCl 중에 900 ㎍의 리소자임 및 9 mg의 폴록사머 188을 포함하는 45 ㎕의 용액이 글리코퓨롤(1.04 g)에 첨가되어 실온의 현탁액 1 mL를 형성하였다. 복합 입자가 원심분리(10,000g, 30 min, 4℃) 및 상청액의 제거에 의해 회수되었다.
100 mg의 마이크로스피어 배치를 제조하기 위해, 600 ㎍의 리소자임 및 6 mg의 폴록사머 188이 사용되었다.
제조 3: 폴록사머 188에 의해 커플링된 나노침전된 리소자임의 제조(3A 1-10의 비율; 3B 1-20의 비율).
150 ㎍의 리소자임 및 리소자임-첨가제의 비율에 따라 다양한 양(1-10 또는 1-20에 대해 각각 1.5 mg 또는 3 mg의 P188)의 폴록사머 188을 포함하는 10 ㎕의 NaCl 0.3M 용액이 1.1 g의 글리코퓨롤에 첨가되었다. 복합 입자가 원심분리(10,000g, 30 min, 4℃) 및 상청액의 제거에 의해 회수되었다.
제조 4: 폴록사머 188에 의해 커플링된 나노침전된 TGF -β3의 제조(4A: 1-10의 비율; 4B: 1-20의 비율).
일반적인 절차가 동결건조된 TGF-β3에 맞춰 조정되었다.
TGF-β3-폴록사머 188의 비율에 따라 다앙한 양(1-10 및 1-20에 대해 각각 0.5 또는 1mg의 P188)의 폴록사머 188(P188, Lutrol® F68, BASF, Levallois-Perret, France)을 포함하는 10　㎕의 TRIS-HCl 0.75M, NaCl 2M (pH = 7.4) 용액이 1.077g의 저온의 글리코퓨롤(4℃)(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)에 첨가되었다. 복합 입자가 원심분리(10,000g, 30 min, 4℃) 및 상청액의 제거에 의해 회수되었다.
제조 5: 폴록사머 188과 커플링된 나노침전된 인간 혈청 알부민( HSA )의 제조(5A: 1-10의 비율 ; 5B: 1-20의 비율).
1-10 또는 1-20의 단백질-폴록사머 188 비율을 갖는 나노침전된 HSA가 상기한 바와 같이 제조 4와 유사한 방식으로 제조되었다(Delcroix et al. Biomaterials 2011). 750 ㎍의 HSA 및 HSA-첨가제 비율에 따라 다양한 양(1-10 또는 1-20의 비에 대해 각각 7.5 mg 또는 15 mg의 P188)의 폴록사머 188을 포함하는 10 ㎕의 NaCl 0.3 M이 1.1 g의 글리코퓨롤에 첨가되었다. 복합 입자가 원심분리(10,000g, 30 min, 4℃) 및 상청액의 제거에 의해 회수되었다.
제조 6: 폴록사머 188 나노입자와 커플링된 인간 혈청 알부민( HSA )의 제조(6A: 1-10의 비율 ; 6B: 1-20의 비율).
1-10 또는 1-20의 단백질-폴록사머 188 비율을 갖는 나노침전된 HSA가 상기한 바와 같이 제조 5와 같은 방식으로 제조되었다(Delcroix et al. Biomaterials 2011). 250 ㎍의 HSA 및 HSA-첨가제 비율에 따라 다양한 양(1-10 또는 1-20의 비율에 대해 각각 2.5 또는 5mg의 P188)의 폴록사머 188을 포함하는 10 ㎕의 NaCl 0.3 M이 1.1 g의 글리코퓨롤에 첨가되었다. 복합 입자가 원심분리(10,000g, 30 min, 4℃) 및 상청액의 제거에 의해 회수되었다.
제조 7: 인간 간엽줄기세포(MSC)의 제조
환자의 승낙을 받아 고관절 교체 수술을 받은 환자의 골수천자액(bone marrow aspirate)으로부터 인간 MSC 배양체를 [Bouffi et al Biomaterials 2010]에 개시된 바에 따라 제조하였다. 요약하면, 세포 현탁액이 10%의 태야소혈청(FBS)(Hyclone,ThermoFisherScientific), 2mM의 글루타민, 100U/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신(Lonza) 및 1ng/ml의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)(R&DSystems,Lille,France)가 보충된 완전한 α-최소필수배지(a-minimum essential medium: αMEM)(Lonza,Levallois-Perret,France)에서 플레이팅되었다. MSC는 CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대해 양성, 및 CD14, CD34 및 CD45에 대해 음성인 것으로 나타났고, 계대 3과 계대 4 사이에서 사용되었다.
제조 8: 폴리머 필름
코폴리머 1 및 PLGA의 폴리머 필름이 용매 캐스팅(casting)에 의해 제조되었고; 10mg의 코폴리머(코폴리머 1 또는 PLGA)가 DMSO에 용해되고, 유리 접시에 붓고, 그 후 공기 건조되었다. 코폴리머 1의 필름 및 PLGA의 필름이 획득되었다.
제조 9: 참조용 마이크로스피어
리소자임이 없는 참조용 마이크로스피어가 하기 제조 12의 방법에 따라 제조되었고, 미적재-MS로 명명되었다. 본 경우, 유기 용액은 2 mL의 유기 용매(3:1 염화메틸렌/아세톤) 및 150 mg의 코폴리머를 포함하였다.
제조 10: 코팅된 마이크로스피어의 제조
미적재 마이크로스피어를 획득하기 위해, 폴리머 마이크로스피어(제조 9 또는 제조 13)가 피브로넥틴(FN)(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) 및 폴리-D-리신(PDL)(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)에 의해 코팅되었다.
코팅용액은 듀벨코의 인산완충식염수(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline: DPBS)(LONZA, Levallois-Perret, France) 중에 제조되었다. 코팅 분자(15㎍/mL)의 농도는 6㎍/mL의 FN 및 9㎍/mL의 PDL(FN:PDL의 60:40 비율에 대응함)이었다.
5　mg의 마이크로스피어가 DPBS에 재현탁되었고, 마이크로스피어가 완전히 분산될 때까지 초음파 처리되었다. FN 및 PDL 세포부착 분자를 포함하는 용액이 마이크로스피어 현탁액(최종 부피: 10　mL)에 혼합되었고, 1시간 30분 동안 37　℃에서 15　rpm 회전하여 놓였다. 코팅 후, 코팅된 마이크로스피어가 살균된 증류수에 의해 3번 세척되었고, 동결건조, 및 마지막으로 장기 저장을 위해 -20　℃에 보관되었다. 튜브의 벽에서 생성물이 손실되는 것을 방지하기 위해, 모든 튜브에는 Sigmacote®(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)가 덮였다.
제조 11: 코폴리머 1, 코폴리머 3 및 PLGA 마이크로스피어( 마이크로스피어 배치 150 mg ), 및 코폴리머 5, 코폴리머 6, 코폴리머 7, 코폴리머 8, 코폴리머 9 ( 마이크로 스피어 배치 100 mg )에 포매된 리소자임 / 폴록사머 188 입자의 제조.
마이크로스피어에 단백질 유효성분을 포매시키는 일반적인 절차:
단백질 유효성분의 캡슐화가 [TRAN et al. Protein-loaded PLGA-PEG-PLGA microspheres: A tool for cell therapy, European Journal of Pharmaceutical Sciences 45 (2012) 128-137]에 개시된 바와 같이 수행되었다.
제조 2의 폴록사머 188 나노입자에 의해 커플링된 리소자임(1-10의 비율)이 제조 1의 150mg의 코폴리머 1 또는 3 또는 PLGA(참조용 폴리머)를 포함하는 유기 용액(2mL; 3:1 염화 메틸렌:아세톤)에 조심스럽게 분산되었다(배치 100mg : 100mg의 제조 1의 코폴리머 5, 6, 7, 8 또는 9를 포함하는 1.34mL의 3:1 염화 메틸렌:아세톤). 상기 유기 현탁액이 실온에서 유지되고 1분 동안 550rpm으로 기계적으로 교반되는 폴리(비닐 알코올) 수용액(90mL, 4% w/v) 또는 (배치 100mg:60mL, 4% w/v)에서 유화되었다(Heidolph RZR 2041, Merck Eurolab, Paris, France). 100mL의 탈이온수를 첨가하고 10분 동안 교반한 후, 500mL의 탈이온수(배치 100mg: 각각 66mL 및 334mL의 탈이온수)가 제조된 o/w 유화액에 첨가되었고, 20분 동안 300rpm으로 교반되어 유기 용매를 추출하였다. 현탁액은 125㎛의 스테인리스 메쉬를 통과시켜 걸려졌고, 폴리프로필렌 37㎛ 필터를 통해 걸러 회수되었다. 마이크로스피어가 500mL의 탈이온수에 의해 세척되었고, 그 후 -20℃에서 저장하기 전에 동결건조되었다.
단백질 적재량은 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어, PLA-P188-PLA 마이크로스피어, PLGA-T1107-PLGA 마이크로스피어 또는 PLGA 마이크로스피어의 mg 당 6㎍의 리소자임(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)이었다.
분석
- 획득된 마이크로스피어의 평균 부피 직경 및 크기 분포는 Multisizer™ Coulter Counter(Beckman Coulter, Roissy, France)를 사용하여 평가되었다.
- 시차주사 열량측정(DSC)이 Mettler Toledo Star System(Mettler-Toledo, Viroflay, France)에 의해 수행되었다. 샘플(10 mg)이 밀폐된 알루미늄 도가니에 놓였고, 이들은 먼저 25에서 80 ℃로 가열되었고, 그 후 50 내지 100℃의 범위를 포함하는 서모그램이 10 ℃ min-1의 가열 속도로 기록되었다. 폴리머의 Tg가 DSC 기법에 의해 측정되었다.
리소자임/폴록사머 188(1:10) 적재된 마이크로스피어의 특성화
폴리머 Tg (℃) 평균 크기 ± SD(㎛) 캡슐화 수율(%)
PLGA(참조용)
제조 1의 말미 참조		 26 51±28 60±7
PLGA-P188-PLGA
(코폴리머 1)		 17 63±23 64±5
PLA-P188-PLA
(코폴리머 3)		 29 67±23 66±5
배치 100 mg
PLGA-P188-PLGA
(코폴리머 5)		 13 80±21 90
PLGA-P188-PLGA
(코폴리머 6)		 2 85±23 85
PLGA-T1107-PLGA
(코폴리머 7)		 39 70±20 80
PLGA-T1107-PLGA
(코폴리머 8)		 -1 84±20 -
PLGA-T1107-PLGA
(코폴리머 9)		 -10 87±17 42
제조 12: PLGA - P188 - PLGA 마이크로스피어 ( 코폴리머 2) 및 PLGA( 마이크로스피어 배치 150 mg )에 포매된 리소자임 / 폴록사머 188 입자의 제조.
제조 3 및 제조 5의 나노침전된 단백질이 원심분리에 의해 수확되었고, 150 mg의 코폴리머를 포함하는 유기 용액(2 mL; 3:1 염화 메틸렌/아세톤)에 분산되었다. 상기 유기 용액은 1℃로 유지되고, 1분 동안 기계적으로 교반된(550 rpm) 폴리-(비닐 알코올) 수용액(90 mL, 4%w/v)에 유화되었다(Heidolph RZR 2041, Merck Eurolab, Paris, France). 100 mL의 탈이온수를 첨가하고 10분 동안 교반한 후, 제조된 o/w 유화액이 탈이온수(500 mL)에 첨가되고, 추가적으로 20분 동안 550 rpm으로 교반하여 유기 용매를 추출하였다. 마지막으로, 형성된 마이크로입자가 5㎛ 필터(HVLP형, Millipore SA, Guyancourt, France) 상에서 여과, 500 mL의 탈이온수에 의해 세척, 및 +4℃에서 저장하기 전에 동결건조되었다.
제조 13: PLGA - P188 - PLGA 마이크로스피어( 코폴리머 2 및 PLGA )( 마이크로스 피어 배치 50 mg )에서 TGF -β3/ 폴록사머 188 및 HSA / 폴록사머 188 입자의 마이크로캡슐화.
TGF-β3/폴록사머 188 입자 및 HSA/폴록사머 188 입자를 PLGA-P188-PLGA 및 PLGA 마이크로스피어에 포매시키기 위한 절차는 제조 12와 동일하였고, 이 경우에 마이크로스피어 배치는 50mg이다.
TGF-β3 및 HSA는 각각 제조 4 및 제조 6에 기재된 공정을 사용하여 개별적으로 나노침전되었다.
나노침전된 TGF-β3 및 HSA는 원심분리에 의해 수확되었고, 폴리(비닐알코올)(Mowiol® 4-88, Kuraray Specialities Europe, Frankfurt, Germany) 수용액(30　ml, 4% w/v, 1℃)에 유화되고 1분 동안 550　rpm으로 교반된(Heidolph, RZR 2041, Merck Eurolab, Paris, France) 유기상(3:1 염화 메틸렌:아세톤 용액에 용해된 670　㎕의 50　mg PLGA-P188-PLGA(폴리머 2) 또는 PLGA)에 분산되었다. 33　ml의 탈이온수를 첨가하고 10분 동안 교반한 후, 유화액이 167　mL의 탈이온수에 첨가되었고, 20분 동안 교반되어 유기 용매를 추출하였다. 마지막으로, 마이크로스피어가 0.45　㎛ 필터(HVLP형, Millipore SA, Guyancourt, France) 상에서 여과, 세척 및 동결건조되었다.
단백질 적재량은 PLGA-P188-PLGA 및 PLGA 마이크로스피어의 mg 당 5　㎍의 인간 혈청 알부민(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)과 함께 1　㎍의 TGF-β3(Peprotech, Paris, France)이었다.
실시예 1: 결합된 인간 간엽줄기세포를 갖는 FN 및 PDL 코팅된 미적재된 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어의 제조
단계 1: FN 및 PDL 코팅된 마이크로스피어의 제조
PLGA-P188-PLGA(코폴리머 2) 마이크로스피어가 피브로넥틴(FN)(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) 및 폴리-D-리신(PDL)(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)(제조 10)에 의해 코팅되었다.
코팅용액은 듀벨코의 인산완충식염수 중에 제조되었다. 코팅 분자(15㎍/mL)의 농도는 6㎍/mL의 FN 및 9㎍/mL의 PDL(FN:PDL의 60:40 비율에 대응함)이었다.
5　mg의 PLGA-P188-PLGA(코폴리머 2) 마이크로스피어가 DPBS에 재현탁되었고, 마이크로스피어가 완전히 분산될 때까지 초음파 처리되었다. FN 및 PDL 코팅 분자를 포함하는 용액이 마이크로스피어 현탁액(최종 부피: 10　mL)에 혼합되었고, 1시간 30분 동안 37　℃에서 15　rpm이 회전하여 놓였다. 코팅 후, 코팅된 마이크로스피어가 살균된 증류수에 의해 3번 세척되었고, 동결건조, 및 마지막으로 장기 저장을 위해 -20　℃에 보관되었다. 튜브의 벽에서 생성물이 손실되는 것을 방지하기 위해, 모든 튜브에는 Sigmacote®(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)가 덮였다.
항피브로넥틴 항체를 사용한 면역형광염색이 마이크로스피어의 FN 코팅을 나타낸다. 본 실시예의 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어의 간섭 노마르스키(Nomarsky) 현미경, 및 노마르스키 및 형광 이미지의 중첩. 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 코팅은 만족스러우며, FN은 코팅된 마이크로스피어의 표면 전부를 덮는다.
단계 2: 결합된 인간 간엽줄기세포를 갖는 FN 및 PDL 코팅된 마이크로스피어 의 제조
제조 7의 간엽줄기세포가 PBS에 의해 세척, 0.16% 트립신(Sigma), 0.02% EDTA(Lonza) 용액에 의해 탈착, 및 10분 동안 1400 rpm으로 펠릿화되었다.
세포 펠릿이 3% FBS가 보충된 배지에 재현탁되었다. 0.75　mg의 제조 10의 동결건조된 FN 및 PDL 코팅된 마이크로스피어 조성물이 α-MEM 배지, 3% FBS를 포함하는 코팅된 에펜도르프(Eppendorf) 튜브에서 15분 동안 재현탁되었다. 세포 현탁액(0.25　x 106 세포/0.5　mg의 마이크로스피어 조성물)을 첨가하기 전에, 단계 1의 FN 및 PDL 코팅된 마이크로스피어 조성물의 현탁액이 초음파 처리 및 잠시 와류교반(vortex)되었다. 그 후, 혼합물은 1.9　cm2의 Costar 초저클러스터 플레이트(#3473, Corning, Avon, France)에 조심스럽게 붓고, 플레이팅되었다. 플레이트는 4시간 동안 37℃에서 배양되어, FN 및 PDL 코팅된 마이크로스피어 표면에 세포가 부착되게 하였다. 이와 같은 마이크로스피어 조성물/세포 응집체 또는 복합체의 현탁 배양체를 회수, α-MEM에 의해 세척, 및 2분 동안 200　g에서 원심분리에 의해 펠릿화되었다.
샘플이 상기한 바와 같이 주사 전자 현미경 분석을 위해 제조되었다[Tatard et al 2007 Biomaterials)]. 간략하게, 미적재된 코팅된 마이크로스피어(제조 10)이 PBS에서 세척, 글루타르알데히드 1% 및 오스뮴 1%에 의해 고정, 및 그 후 알코올에 의해 탈수되었다. 그 후, 이들은 헥사메틸디실라잔에 침지하고, 투꺼운 탄소층을 덮고, 마지막으로 관찰되었다.
미적재된 코팅된 마이크로스피어(제조 10)의 표면에 대한 세포부착이 광학 현미경(A) 및 주사 전자 현미경(B)을 사용하여 분석되었다. 획득된 사진은 도 2에 나타낸다.
도 2는 광학 현미경에 의해 hMSC/미적재된 코팅된 마이크로스피어(PLGA-P188-PLGA)를 나타낸다. 상기 세포는 주사 전자 현미경에 의해 관찰된 바와 같이 코팅된 마이크로스피어와 함께 3D 복합체를 형성하였다.
실시예 2: 결합된 인간 간엽줄기세포와 함께 포매된 TGF -β3/ HSA 를 포함하는 FN 및 PDL 코팅된 마이크로스피어의 제조
단계 1: FN 및 PDL 코팅된 마이크로스피어의 제조
제조 13의 마이크로스피어의 코팅이 실시예 1의 단계 1에 기재된 바와 같은 방식으로 수행되었다. 동일한 결과가 획득되었다.
단계 2: 인간 간엽줄기세포를 갖는 FN 및 PDL 코팅된 마이크로스피어의 제조.
세포가 실시예 1의 단계 2에 기재된 것과 완전히 동일한 방식에 의해 상기 마이크로스피어에 결합되었다. 동일한 결과가 획득되었다.
3중블록 코폴리머 6 내지 9를 사용하여, 결합된 인간 간엽줄기세포를 갖는 3중블록 코폴리머 마이크로스피어, 및 결합된 인간 간엽줄기세포를 갖는 대응하는 마이크로스피어의 유사한 제제가 제조되었다.
분석 방법 및 결과
1- 폴리머성 필름 상의 세포부착코팅
폴리머의 필름(제조 8)이 37 ℃에서 1.5 h 동안 10 ㎍/mL의 FN 용액에서 배양되었다. 코팅된 폴리머 필름이 PBS에 의해 3번 세척되었다.
FN 코팅이 면역형광법에 의해 측정되었다. 간략하게, 4% BSA를 포함하는 PBS 용액에 의한 포화 단계가 실온에서 60분 동안 수행되었다. 폴리머 필름이 PBS에 의해 3번 세척되었고, 그 후 단클론 마우스 항인간 피브로넥틴 항체(1:100)에 의해 4℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 박편이 그 후 PBS에 의해 세척 및 60분 동안 비오티닐화 말 항마우스 IgG 항체(1:200)에 배양, PBS에서 세척, 및 40분 동안 스트렙타비딘-형광프로브 547(1:500)에 의해 배양되었다. 또한, 이소타입 대조군이 수행되었다.
도 3은 PLGA와 비교한 3중블록 코폴리머(폴리머성 필름) 상의 피브로넥틴 세포부착 표면의 반정량적 형광 강도를 나타낸다.
높은 형광 강도가 연구되는 폴리머 필름상의 높은 피브로넥틴 흡착 및 이에 따른 뛰어난 피브로넥틴 코팅을 시사한다. 형광 강도는 PLGA와 비교하여 PLGA-P188-PLGA 코폴리머 상에서 더 높고, 이는 피브로넥틴에 의한 더 뛰어난 코팅을 의미한다.
2. 미적재된 마이크로스피어의 코팅의 분석
마이크로스피어의 제타 전위가 Malvern Zetasizer®(Nano Series DTS 1060, Malvern Instruments S.A., Worcestershire, UK)를 사용하여 측정되었다. 제타 전위의 측정은 스몰루초프스키의 방정식을 사용하여 전기영동 이동도의 값을 ζ-전위로 전환함으로써 마이크로스피어 현탁액(NaCl 1mM 중에 0.3mg/mL)에서 수행되었다. 결과는 평균값 ± 표준편차로 나타낸다.
PLGA 및 PLGA-폴록사머-PLGA 마이크로스피어는 FN 세포부착 표면을 가지고는 양의 제타 전위 값을 나타내었고, 이는 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어에 대해서 -8.1±2.3mV에서 +7.9±0.8mV로 전개되었다. 이와 같은 결과는 마이크로스피어가 잘 코팅되었고, 양전하의 세포부착 표면이 세포의 부착을 촉진하기 때문에 상기 코팅이 세포부착에 대해 만족스럽다는 것을 나타낸다.
3. 세포-미적재된 코팅된 마이크로스피어 복합체( 실시예 1, 폴리머 2, 폴리 머 참조군) 및 세포- 마이크로스피어 복합체(제조 9 + 제조 7, 폴리머 2)의 형성
hMSC가 PBS에 의해 세척, 0.16% 트립신 0.02% EDTA 용액(Lonza, Levallois-Perret, France)에 의해 탈착, 및 10분 동안 1400 rpm으로 펠릿화되었다. 세포 펠릿이 3% FBS가 보충된 배지에 재현탁되었다. 0.75　mg의 동결건조된 마이크로스피어(제조 9 또는 10)가 α-MEM 배지, 3% FBS를 포함하는 코팅된 에펜도르프 튜브(Sigmacote, Sigma)에서 15분 동안 재현탁되었다. 코팅된 마이크로스피어 현탁액이 세포 현탁액(0.25　x 106 세포/0.5　mg의 코팅된 마이크로스피어)의 첨가 전에 초음파 처리 및 잠시 와류교반되었다. 그 후, 혼합물을 1.9　cm2의 Costar 초저클러스터 플레이트(#3473, Corning, Avon, France)에 조심스럽게 붓고, 플레이팅하였다.
세포 부착이 생존 세포의 수를 나타내는 Cyquant 어세이에 의해 4시간 후에 추산되었다.
결과는 도 4에 나타난다: 4시간 후의 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어(제조 9, 폴리머 2), PLGA의 미적재된 코팅된 마이크로스피어(제조 10, 폴리머 참조군) 및 PLGA-P188-PLGA의 미적재된 코팅된 마이크로스피어(제조 10, 폴리머 2) 상의 세포 부착.
코팅은 세포부착을 증가시키며, 세포부착은 미적재된 코팅된 마이크로스피어에 대해 총 세포의 118%이고, 이와 비교하여 미코팅된 동일한 마이크로스피어에 대해서는 86%이다. 더욱이, 세포 부착은 참조용 폴리머 PLGA와 비교하여 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어에 의한 경우에 각각 120% 및 97% 더 뛰어나다.
4. 미적재된 코팅된 마이크로스피어 상에서 세포 증식/생존(제조 10)
hMSC가 PBS에 의해 세척, 0.16% 트립신 0.02% EDTA 용액(Lonza, Levallois-Perret, France)에 의해 탈착, 및 10분 동안 1400 rpm으로 펠릿화되었다. 세포 펠릿이 3% FBS가 보충된 배지에 재현탁되었다. 0.75　mg의 동결건조된 코팅된 마이크로스피어가 α-MEM 배지, 3% FBS를 포함하는 코팅된 에펜도르프 튜브(Sigmacote® Sigma)에 15분 동안 재현탁되었다. 코팅된 마이크로스피어 현탁액이 세포 현탁액(0.25　x 106 세포/0.5　mg의 코팅된 마이크로스피어)을 첨가하기 전에 초음파 처리 및 잠시 와류교반되었다. 그 후, 혼합물을 1.9　cm2의 Costar 초저클러스터 플레이트(#3473, Corning, Avon, France)에 조심스럽게 붓고, 플레이팅하였다. 상기 현탁 배양체가 시간이 흐름에 따라 유지되었고, 세포 생존율이 다양한 시간 간격(24시, 48시 및 7일)에서 계산되었고, 코팅된 마이크로스피어에 부착된 생존 세포가 제조사의 지침에 따라 Cyquant 세포 증식 어세이®(Invitrogen, France)를 사용하여 정량되었다. 결과는 도 5에 나타난다. 별표 **는 유의적인 차이(p<0.01), n=3을 시사한다.
세포 부착 24시간, 48시간 및 7일 후에, 세포/코팅된 마이크로스피어 복합체가 유지되었고, 후속 조치를 거치는 동안 사멸한 세포가 관찰되지 않았다. 7일의 세포 배양 후, hMSC만이 증식하지 않았고, 반면에 2종류의 코팅된 마이크로스피어를 갖는 복합체를 형성하는 것들은 증식하였으며, 이에 따라 세포의 수가 유의적으로 증가하였다. 또한, 증식 어세이는 세포의 수가 hMSC가 미적재된 PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어에 의해 배양되는 경우에 특히 증가하였음을 나타내었다.
따라서, 코팅된 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어 상의 세포의 수는 제7일에 유의적으로 증가하였고, 이는 상기 코팅된 마이크로스피어가 시간의 흐름에 따른 세포 증식 및/또는 생존을 촉진하였음을 시사한다.
5. 캡슐화된 활성 리소자임의 양 및 활성 리소자임 방출의 시험관내 평가(제조 11)
캡슐화 공정 동안에 생물학적 활성의 손실을 검출하기 위해, 실시예 1의 마이크로스피어로부터 추출된 활성 단백질의 양이 DMSO에 마이크로스피어를 용해시킨 후에 측정되었다.
리소자임 적재된 마이크로스피어(10 mg, 3 배치)가 5 mL의 PTFE 튜브 내의 0.9 mL의 DMSO에 용해되었다. 1시간 후, 3 mL의 0.01 M HCl이 첨가되었다. 용액을 추가적인 1시간 동안 유지되도록 놔두었다.
[A Aubert-Pouessel et al. in vitro delivery system for assessing the biological integrity of protein upon release from PLGA microspheres. Pharm Res. 2002;19:1046-51]에 개시된 바와 같이 M. 리소데익티쿠스(M. lysodeikticus) 박테리아 세포 현탁액에서의 혼탁도 변화를 측정함으로써, 활성 리소자임의 양이 측정된다. 백 마이크로리터의 리소자임 용액이 2.9 mL의 TRIS-HCl(0.01 M, pH 7.4) 버퍼액 중의 0.015% w/v M. 리소데익티쿠스 현탁액에 첨가되었다. 배양(37℃, 4시간) 후, 흡광도가 450 nm에서 측정되었다. 표준 곡선의 도움으로 활성 단백질의 양이 계산되었다.
캡슐화 수율의 결과가 표 4에 보고된다. 캡슐화 수율은 폴리머에 따라 60 내지 66%이고, 이는 단백질이 폴리머 매트릭스 내에 적절하게 포매되었음을 의미한다.
단백질 시험관 내 방출
a) 리소자임-제조 11
마이크로스피어(제조 11)로부터 리소자임의 시험관 내 방출 프로파일이 0.1%w/v BSA 및 0.09%w/v NaCl를 포함하는 pH 7.4의 0.05M TRIS-HCl 버퍼 500㎕를 10mg의 마이크로스피어에 원심분리 튜브에서 첨가함으로써 측정되었다. 튜브를 다고, 진동 수조(37℃, 125rpm)에서 배양하였다. 특정된 간격에서, 튜브가 5분 동안 2,800g에서 원심분리되어, 상청액을 수집하여, PH 및 리소자임과 폴록사머의 방출을 분석하였다. 상기 상청액은 그 후 새로운 버퍼로 대체되었다.
도 6은 7일의 간격을 두고 (A) 마이크로스피어로부터의 시험관 내 리소자임 방출량, (B) 방출 배지 버퍼, 500 ㎕의 Tris-HCl 0.05 M의 pH의 결과를 나타낸다.
PLGA-PEG-PLGA 코폴리머(참조용 폴리머)에 대해서 38%인 것에 반하여, 45%의 캡슐화 리소자임이 마이크로스피어로부터 방출된다. 그러나, PLA-P188-PLA(폴리머 3)의 마이크로스피어로부터의 리소자임 대부분이 처음 15일 동안에 방출되었다. PLGA-P188-PLGA에 대해, 60%의 리소자임이 처음 22일 동안 연속적인 방출 프로파일에 의해 방출되었다.
방출 배지의 pH 변화가 도 6B에 나타낸다. PLGA, PLGA-PEG-PLGA 및 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어의 배지 방출에서 관찰된 산성 pH와 달리, PLA-P188-PLA 마이크로스피어의 방출 배지는 PLA의 느린 저하에 의해 항상 안정적이다. 또한, PLGA-PEG-PLGA 및 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어의 pH 프로파일은 유사하다. 실내 및 실외 마이크로스피어 간의 교환 및 폴리머 저하율은 마이크로스피어의 종류 둘 모두에 대해 가까울 수 있다.
이와 같은 결과는 단백질 방출의 퍼센트를 증가시키는 데에 있어서 PLGA-P188-PLGA 및 PLA-P188-PLA의 이점을 분명하게 보여준다.
6. 캡슐화 활성 리소자임의 양 및 활성 리소자임 방출의 시험관 내 평가(제조 12)
제조 12:
튜브가 진동 수조 (37　℃, 125　rpm)에서 배양되었다. 정해진 시간 간격에서, 튜브가 5분 동안 2,800g에서 원심분리되었다. 200　㎕의 상청액이 분석을 위해 수집되었고, 새로운 버퍼(250㎕)에 의해 대체되었다. 생물학적으로 활성인 방출된 리소자임의 퍼센트가 제5 항목에서 개시된 효소어세이에 의해 측정되었다.
결과는 도 7에 나타나고, 이는 마이크로스피어의 생체활성 리소자임의 누적된 방출량을 나타낸다. PLGA + P188 1:10, PLGA-P188-PLGA + P188 1:10 PLGA-P188-PLGA + P188 1:20이 37℃에서 30일 동안 TRIS-HCL에서 배양되었고, 배지 내의 다양한 시점에 방출된 리소자임이 바이오어세이에 의해 측정되었다. 오류 막대 각각은 각 제형에 대해 n=3의 평균 퍼센트 누적값의 ± 표준 편차를 나타낸다.
생체활성 리소자임의 방출 프로파일에 대한 리소자임에 의한 나노침전 단계에 연관된 P188 첨가제의 양 및 폴리머 매트릭스(PLGA 또는 PLGA-P188-PLGA)의 영향이 도 7에서 평가 및 보고되었다.
i) 폴리머 매트릭스가 1:10의 고정된 단백질-P188 비율에 의해 나노침전 단계를 위해 개질되었다. 이와 같은 조건에서, PLGA-P188-PLGA가 매트릭스로서 사용되는 경우, MS로부터 리소자임의 방출은 유의적으로 증가하였다. 제30일에, PLGA 기반의 MS에 대해 17%인 것과 비교하여 캡슐화 리소자임의 51%가 방출되었다. 실제로, 제3일에 리소자임의 12%가 PLGA MS로부터 방출되었고, 그 후 낮은 방출이 상기 초기 버스트(burst) 후에 관찰되었다(제30일에 12%에서 17%까지). 반면에, PLGA-P188-PLGA를 매트릭스로 사용하는 경우, 방출이 덜 표명되었고, 제0일 내지 제15일에 더욱 지속적인 방출이 관찰되었으며, 제30일에는 51%의 단백질이 방출되었다.
따라서, PLGA-P188-PLGA 3중블록 코폴리머를 사용하는 것이 PLGA 조성물과 비교하여 리소자임의 방출을 유의적으로 증가시킨다.
ii) 다양한 비율의 폴록사머가 그 후 폴리머 매트릭스로 선택된 PLGA-폴록사머-PLGA에 의해 시험되었다.
결과: 단백질/폴록사머의 비율이 1:20인 경우, 생물학적으로 활성인 방출된 단백질이 강화되었다. 도 7에서 관찰되는 바와 같이, 리소자임 방출은 제20일에 단백질/폴록사머의 비율 1:10(상기한 바와 같음)인 경우에 51%에서 단백질-폴록사머의 비율이 1:20인 경우에 71%로 증가하였다.
따라서, 더 낮은 단백질/ 폴록사머의 비율을 사용하는 것이 더 높은 비율과 비교하여 리소자임의 방출을 유의적으로 증가시킨다.
더욱이, 도 7과 도 6 사이의 비교가 0.6% 또는 0.1 %의 적재된 단백질 퍼센트 및 둘 모두에 대해 1/10의 단백질/폴록사머의 비율에서 폴리머 1 및 폴리머 2(PLGA-P188-PLAGA)에 의해 제조된 마이크로스피어에 의하면 방출 프로파일이 상당히 유사하다는 것을 보여준다. 첫번째 경우에는 단백질 중 55%가 제22일에 방출되고, 두번째 경우에는 51%가 제22일에 방출된다. 따라서, 개별적으로 나노침전되고 캡슐화 단계 동안에 치료용 단백질과 함께 혼합된 알부민과 같은 담체 단백질의 공캡슐화에 의해 치료용 단백질의 적재량을 상당히 감소시킬 수 있다. 이와 같은 결과는 고비용의 활성 약학 성분, 특히 치료용 단백질에 대해서 특히 흥미롭다.
7. 마이크로스피어 및 코팅된 마이크로스피어 내의 총 TGF 베타 3의 평가. 미코팅된 및 코팅된 마이크로스피어로부터의 총 및 생체활성 TGF 베타 3 방출 프로파일.
캡슐화 공정 동안의 생물학적 활성의 손실을 검출하기 위해, 실시예 3의 마이크로스피어로부터 방출된 활성 단백질의 양이 마이크로스피어를 DMSO에 용해시킨 후(5 mg/1 mL DMSO)에 1시간 동안 측정되었다(Bouffi 2010, §212)(3개의 배치). 상기 시간 후, 샘플이 원심분리되었고, 잔여 DMSO가 증발되었다. 캡슐화 단백질(예를 들어, TGF-β3)이 특정 ELISA 키트(R&DSystems, Lille, France)를 사용하여 측정되었다.
TGF-β3의 캡슐화 수율은 PLGA 마이크로스피어에서 116 ± 22%이고, PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어에서 89 ± 12%이었다. 3중블록 코폴리머의 더 높은 친수성이 캡슐화 수율을 약간 감소시킨다. 그러나, 캡슐화 수율은 만족스러우며, TGF-β3 적재된 마이크로스피어가 코팅된 마이크로스피어를 제조하기 위해 사용될 수 있다,
마이크로스피어로부터 TGF -β3의 시험관 내 방출
PLGA + P188 1:10, PLGA-P188-PLGA + P188 1:10 또는 PLGA-P188-PLGA + P188 1:20(제조 13)으로 구성되는 마이크로스피어가 PBS 1% BSA에서 배양되었고, 배지에서 다양한 시점에 방출된 TGF-β3이 ELISA(Duoset ELISA human TGF-β3 (R&D Systems, Lille, France) 또는 하기의 바이오어세이에 의해 시험되었다.
마이크로스피어로부터 방출된 TGF-β3의 생물학적 활성을 분석하기 위해, [Tesseur et al., Highly sensitive and specific bioassay for measuring bioactive TGF-beta. BMC Cell Biol. 2006;7:15]에 의해 전에 개발된 바이오어세이가 수행되었다.
바이오어세이는 분비형 알칼리성 포스파타테(SEAP) 리포터 유전자에 커플링된 TGF-β 반응성 Smad 결합요소로 구성되는 리포터 플라스미드에 의해 안정적으로 형질감염된 TGFβ1-/- 마우스(MFB-F11)로부터 분리된 마우스 섬유아세포의 사용에 의존한다. MFB-F11 섬유아세포를 평평한 바닥의 96-웰 배양 플레이트(Nunc® Dutscher, France)에 3 x 104 세포/웰로 심는다. 하룻밤 동안의 배양후, 세포가 인산완충식염수(PBS)에 의해 2번 세척되고, 100U/mL의 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신(Lonza, Levallois-Perret,France)이 보충된 50㎕의 무혈청 DMEM에서 배양되었다.
2시간 후, 샘플을 포함하는 50 ㎕의 TGF-β3이 추가적인 24시간 동안 첨가되었다. 정해진 양의 표준 TGF-β3의 계열희석액이 표준 곡선을 결정하기 위해 다른 웰에 첨가되었다. SEAP 활성이 50㎕의 배양 상청액에서 제조사의 지침에 따라 SEAP Reporter Gene Assay 화학발광키트(Roche,Meylan,France)를 사용하여 측정되었다. 화학발광이 마이크로 플레이트 발광계(Ascent FL, Thermo Fisher Scientific, Cergy-Pontoise, France)를 사용하여 검출되었고, 결과가 Fluoroscan을 위한 Ascent 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, Cergy-Pontoise, France)에 의해 분석되었다.
도 8은 마이크로스피어로부터의 총 및 생체활성 TGF-β3의 누적된 방출량을 나타낸다. (A) ELISA 및 바이오어세이에 의해 평가된 PLGA + P188 1:10, PLGA-P188-PLGA + P188 1:10, PLGA-P188-PLGA + P188 1:20(제조 13)로부터 TGFB3의 방출 프로파일. (B) PLGA-P188-PLGA(P188 1:20) 마이크로스피어로부터의 방출 대 TGF 베타 3이 적재된 코팅된 마이크로스피어의 비교. 오류 막대 각각은 각 제형에 대해 n=3의 평균 퍼센트 누적값의 ± 표준 편차를 나타낸다.
다수의 마이크로스피어이 시험되었다: 1:10(w/w)의 TGF-β3:P188 비율로 TGF-β3에 의해 나노침전된 P188을 캡슐화하는 PLGA 마이크로스피어, PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어 + P188 1:10, 및 PLGA-P188-PLGA 마이크로스피어 + P188 1:20 (도 8A). ELISA 어레이 또는 바이오어세이에 의해 측정되는 경우 마이크로스피어로부터 방출된 유사한 양의 TGF-β3이 검출되었고, 이는 방출된 TGF-β3이 생체활성을 갖는다는 것을 시사한다. 생체활성 TGF-β3의 방출 프로파일은 더 높은 초기 방출값(제0일부터 제7일), 및 그 후 제30일까지 느린 방출 단계를 갖는 제형 각각에 대해 유사하다(도 8A).
상기 결과는 ELISA에 의해 측정되는 경우의 TGB3 방출 프로파일이 바이오어세이에 의해 측정된 것에 대응한다는 것을 보여준다. 따라서, 다양한 제제 모두로부터 방출된 TGFB3은 생물학적으로 활성인 것으로 보인다.
리소자임에 대해 관찰된 바와 같이, PLGA 마이크로스피어로부터 TGF-β3의 방출은 낮았고, 제30일에 TGF-β3 중 25%가 방출되었으며, 이는 매트릭스로의 방출동안에 단백질의 저하를 시사한다.
1:10의 단백질/P188 비율의 PLGA-P188-PLGA를 사용하는 것은 제0일부터 제3일까지 TGF-β3 중 40%에 이르는 더욱 확연한 방출, 및 그 후 제3일부터 제30일까지의 약한 방출(10%)을 가능하게 한다.
따라서, PLGA-P188-PLGA 3중블록 코폴리머를 사용하는 것은 PLGA 조성물과 비교하여 리소자임의 방출을 유의적으로 증가시킨다.
동일한 매트릭스 폴리머(PLGA-P188-PLGA)에 의해 1:20의 단백질/P188 비율에서 생체활성 TGF-β3 중 74%가 방출되었고, 그 중 60%는 제6일, 14%는 제6일과 제30일 사이에 방출되었다.
생체활성 TGF-β3 대 총 방출된 TGF-β3의 비율의 평균값은 PLGA 제형에 대해 약 56 ± 8.9%이었고, 반면에 for PLGA-P188-PLGA + P188 1:20 제형에 대해서는 96 ± 12.5%이었으며, 이는 후자의 제형에 의한 더욱 효과적인 단백질 보호를 시사한다.
따라서, 더 낮은 단백질/P188 비율을 사용하는 것이 더 높은 비율과 비교하여 TGF-β3의 방출을 유의적으로 증가시킨다.
미코팅된 마이크로스피어 및 FN- 마이크로스피어로부터의 TGF-β3 방출 간의 비교가 단백질 방출에 대한 코팅의 영향을 평가하기 위해 수행되었다(도 8B).
TGFB3 코팅된 마이크로스피어(제조 13 + 제조 10)로부터의 방출은 미코팅된 마이크로스피어(제조 13)와 비교하여 더욱 지속적이다는 것이 나타났고(본 발명의 마이크로스피어에 대해 제3일에 32%의 방출 대 미코팅된 마이크로스피어로부터 55%의 방출), 이는 마이크로스피어로부터 단백질의 방출에 있어서 코팅 단계 및 세포부착 표면(피브로넥틴 + 폴리 D_리신)의 영향을 시사한다(도 8B).
8. 콘드로겐 분화
PLGA 또는 PLGA-P188-PLGA 매트릭스(폴리머 2)를 갖는 TGFB3을 방출하는 코팅된 마이크로스피어(제조 13 + 제조 10) 및 미적재된 코팅된 마이크로스피어(제조 10)에 의한 hMSC의 콘드로겐 분화가 마이크로펠릿에서 28일 배양체에 의해 유도되었다. PLGA 또는 PLGA-P188-PLGA 매트릭스(폴리머 2)를 갖는 TGFB를 방출하는 코팅된 마이크로스피어(제조 11) 및 미적재된 코팅된 마이크로스피어(제조 10)에 의한 hMSC의 배양이 원뿔 튜브의 마이크로펠릿에서 수행되었다. 요약하면, MSC(2.5 x 105 세포) 및 0.5mg의 코팅된 마이크로스피어가 15 mL의 원뿔 튜브에서 원심분리에 의해 펠릿화되었고, 콘드로겐 배지에서 배양되었다. 상기 배지는 0.1 mM의 덱사메사손, 0.17mM의 아스코르브산 및 1%의 인슐린 트렌스퍼린 셀렌산(ITS) 보충제(Lonza)가 보충된 DMEM으로 구성되었다. MSC의 표준 연골형성이 10ng/mL의 TGF-B3이 보충된 콘드로겐 배지에서 펠릿의 배양체에 의해 유도되었다. 이는 마이크로펠릿에서 배양체에 의한 시험관 내 콘드로겐 분화에 대한 금 표준(gold standard)이기 때문에, 비교로서 이용되었다.
분석: 정량적 qPCR
마이크로펠릿에서 21일의 배양 후, PLGA 또는 PLGA-P188-PLGA 매트릭스를 갖는 TGFβ3을 방출하는 코팅된 마이크로스피어 및 미적재된 코팅된 마이크로스피어를 갖는 hMSC가 PBS에서 세척되고, 용균 버퍼에 기계적으로 해리되었다. 그 후, 세포 제제부터의 총 RNA가 제조사의 권장사항에 따라 추출되었다. 세포가 게놈 DNA의 흔적을 제거하기 위한 DNAse에 의한 처리 후에 버퍼 및 RNA를 포함하는 1%의 β-메르캅토에탄올에서 용균되었다(Total RNA isolation Nucleospin® RNA II, Macherey Nagel, Hoerdt, France). 제1가단 cDNA 합성은 제조사의 지침에 따라 SuperScriptTM II 역전사효소(Invitrogen)에 의해 수행되었다. 제1가닥 cDNA 합성 후, cDNA는 정제되고(Qiaquick PCR purification kit, Qiagen, Courtaboeuf, France), 50 ㎕의 RNAse 미함유수(Gibco)에서 용출되었다. cDNA(3.125 ng)가 10 ㎕의 최종 부피로 iQ SYBR Green Supermix(Biorad) 및 프라이머 믹스(0.2 mM)와 함께 혼합되었다. 증폭이 3분 동안 95 ℃에서의 첫번째 변성 단계, 및 10초 동안 95 ℃, 15초 동안 55 ℃ 및 15초 동안 72 ℃의 주기 40번에 의해 Chromo4 서모사이클러(Biorad)에서 수행되었다. 증폭 후, 생성물의 용융 곡선이 목표의 유전자에 대한 프라이머의 특이성을 결정하였다. 각 cDNA에 대해 2번의 측정으로부터 평균 주기 역가(Ct)가 획득되었다. 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제(Gapdh, NM_002046), 베타 2 마이크로글로불린 전구체(B2M, NM_004048), 베타 액틴(Actb, NM_001101) 및 열충격 90 kD 단백질 1 베타(Hspcb, NM_007355)의 다수의 하우스키핑 유전자가 정규화를 위해 시험되었다. GeNorm® 프리웨어(http://medgen.ugent.be/ ejvdesomp/genorm/)가 Gapdh, Hprt1 & Hspcb가 3개의 가장 안정적인 하우스키핑 유전자임을 확정하기 위해 사용되었다. 상대적 전사량(Q)은 델타 cT법[Q = E(모든 샘플에서의 Ct 분-샘플의 Ct)]에 의해 측정되었고, 여기서 E는 프라이머 효율에 연관된다( 프라이머 효율= 100%이면, E = 2). 상대적 양(Q)이 Vandesompele et al . [29]에 개시된 다중정규화법을 사용하여 정규화되었다.
도 9는 TGFb3을 방출하거나 방출하지 않는 PLGA 코팅된 마이크로스피어 또는 PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어에 의해 시험관 내 배양된 hMSC의 콘드로겐 분화를 나타낸다. 연골세포 마커(A), 지방형성 마커(B) 및 골형성 마커(C)의 발현.
콘드로겐 분화에 대한 금본위와 비교하여, TGF-β3를 방출하는 코팅된 마이크로스피어에 의해 배양된 MSC에 의해, 시험된 콘드로겐 마커 모두(콜라겐 II B 변이체, 링크, 아그레칸, COMP)의 증가된 발현이 RT-qPCR 분석에 의해 시험관 내에서 관찰되었다(도 9). 더욱이, hMSC가 PLGA-P1288-PLGA 매트릭스로 구성되는 신규의 제형과 연관되는 경우, 콜라겐 2 및 COMP의 발현에 있어서 유의적인 상향조절이 일어나는, 두 개의 코팅된 마이크로스피어 사이의 차이가 관찰될 수 있었다(TGF-β3 PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어 각각에 비교하여, TGF-β3 PLGA 코팅된 마이크로스피어에 대해 35 내지 59배 증가된 콜라겐 2의 발현). 중요하게는, 세포가 미적재된 PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어에 의해 배양되는 경우, 콘드로겐 마커가 검출되지 않았다. 이와 같은 결과는 FN-코팅된 마이크로스피어에 의한 TGF-β3의 지속적인 방출에 의해 콘드로겐 분화가 유도되었음을 시사한다. 본 연구에서 D0의 비처리된 세포와 비교하여 조건이 어떠하던지 골형성 마커 AP 및 오스테오칼신이 낮은 수준으로 발현되었음을 주의하여야 한다(도 9). 흥미롭게는, 모든 다른 조건에서, 처리되지 않은 세포(D0)와 비교하여, 미적재된 FN PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어를 제외하고는 지방형성 마커는 하향조절되었다(도 9). 이는 효율적이고 특이적인 콘드로겐 분화에 있어서 방출된 성장인자의 중요성, 및 매크릭스 특성의 영향을 강하게 시사한다.
분석: 조직학 및 면역조직화학
마이크로펠릿에서의 배양 21일 후, TGFB를 방출하는 코팅된 마이크로스피어 및 미적재된 코팅된 마이크로스피어를 갖는 hMSC가 4%의 파라포름알데히드에서 24시간 동안 고정, PBS에서 세척, 및 통상의 조직학적 분석을 위해 가공되었다. 파라핀-포매된 샘플 박편(5 mm)이 에탄올 및 자일렌의 구배를 통해 재수화, 및 헤마톡실린-에오신에 의해 염색되었다.
멱역조직화학적 분석이 제조사의 지침에 따라 Ultravision 검출 시스템 항 다원자가 HRP/DAB 키트(LabVision,Microm,Francheville, France)를 사용하여 수행되었다.
II형 콜라겐 및 아그레칸 면역염색을 위해, TGF-β3을 방출하는 코팅된 마이크로스피어 및 미적재된 코팅된 마이크로스피어를 갖는 hMSC의 마이크로펠릿이 우선 에피토프 회수를 위해 히알루로니다아제 0.1%(Sigma) 에 의해 1시간 동안 37℃에서 배양되었다. 항아그레칸 다클론성 토끼 항체(1:50;Millipore,Molsheim, France) 또는 항 II형 콜라겐 단클론성 마우스 항체(1:50;Interchim)와 같은 주요 항체들이 TGF-β3을 방출하는 코팅된 마이크로스피어 및 미적재된 코팅된 마이크로스피어를 갖는 hMSC의 마이크로펠릿에 의해 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 그 후, 이들은 마지막으로 Mayer의 헤마톡실린(LabVision)에 의해 대비염색, 및 Eukitt(Sigma)를 장착하였다. 면역양성 세포외 매트릭스가 갈색 염색을 나타내었다.
hMSC가 TGF-β3 PLGA 코팅된 마이크로스피어(A,D), TGF-β3 PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어(B,E), 및 미적재된 PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어(C,F)를 갖는 마이크로펠릿에서 배양되었다. 이에 따라 형성된 복합체가 면역 염색이 되도록 파라핀 절편에 포매되었다.
A, B 및 C는 콜라겐 II에 대한 면역염색을 나타내고, D, E, F는 아그레칸에 대한 면역염색이다.
결과는 도 10에 나타나고, 이는 연골 ECM 분자의 발현을 나타낸다.
II형 콜라겐에 대해 특이적인 면역조직화학 염색(도 10의 A, B, C)은 특히 hMSC가 TGFB3을 방출하는 FN-PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어에 연관되는 경우에(도 10의 C), 고르게 분포된 경우에도 강한 염색을 나타내었다. 염색 강도는 FN에 대해서는 더 약했다.
미적재된 PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어에 대해서는, 특이적 II형 콜라겐 발현이 발견되지 않았으며, PLGA 코팅된 마이크로스피어가 발견되었다. 반면, 세포가 미적재된 PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어와 연관되는 경우, 아그레칸 염색이 발견될 수 있었다(hMSC에서 기초적 수준의 상기 단백질의 발현과 일치)(도 10의 D). 그러나, 상기 염색은 세포가 TGF-β3을 방출하는 코팅된 마이크로스피어에 의해 배양되는 경우에 더 강했다(도 10의 E, F).
이와 같은 결과는 TGFB3을 방출하는 코팅된 마이크로스피어가 연골 ECM 분자를 분비하는 hMSC의 콘드로겐 분화를 유도함을 입증한다. 더욱이, TGFB3을 방출하는 FN-PLGA-P188-PLGA 코팅된 마이크로스피어는 아마도 증가된 방출 프로파일 때문에 세포의 콘드로겐 분화를 더욱 잘 촉진한다.

Claims (13)

  1. 세포 운반 마이크로스피어 조성물에 있어서,
    상기 마이크로스피어 조성물은 3중블록 코폴리머 매트릭스 A-B-A를 포함하는 마이크로스피어 코어를 포함하고,
    상기 A는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA) 또는 폴리락티드(PLA) 중에서 선택되고, 상기 B는 폴록사머 또는 폴록사민이고,
    상기 마이크로스피어 코어는 세포부착코팅에 의해 코팅되고, 상기 세포부착코팅에 결합된 세포단편 또는 전세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 운반 마이크로스피어 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 A는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA)인 것을 특징으로 하는, 세포 운반 마이크로스피어 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 B는 폴록사머인 것을 특징으로 하는, 세포 운반 마이크로스피어 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 3중블록 코폴리머의 폴록사머 또는 폴록사민의 비율은 2 내지 40%(w/w)인 것을 특징으로 하는, 세포 운반 마이크로스피어 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    전세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 운반 마이크로스피어 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로스피어 내에 포매된 유효성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 운반 마이크로스피어 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유효성분은 단백질인 것을 특징으로 하는, 세포 운반 마이크로스피어 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포부착코팅은 피브로넥틴 및 폴리-D-리신을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 운반 마이크로스피어 조성물.
  9. 하기 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 세포 운반 마이크로스피어 조성물의 제조방법:
    - 3중블록 코폴리머 매트릭스 A-B-A를 포함하는 마이크로스피어 코어를 제공하는 단계, 여기서 상기 A는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA) 또는 폴리락티드(PLA) 중에서 선택되고, 상기 B는 폴록사머 또는 폴록사민임;
    - 세포부착 화합물에 의해 상기 마이크로스피어를 완전히 또는 부분적으로 코팅하는 단계; 및
    - 세포부착 표면을 나타내는 마이크로스피어와 전세포 또는 세포단편을 접촉시켜, 전세포 또는 세포단편을 포함하는 세포 운반 마이크로스피어 조성물을 획득하는 단계.
  10. 하기 단계를 포함하는, 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 세포 운반 마이크로스피어 조성물의 제조방법:
    - 폴리머의 용매, 바람직하게는 유기 용매 중의 A-B-A(바람직하게는, 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)-폴록사머-폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드)) 3중블록 코폴리머 용액을 제공하는 단계;
    - 유효성분(바람직하게는, 단백질)을 제공하는 단계;
    - 상기 유효성분을 상기 A-B-A 3중블록 코폴리머 용액에 첨가하고, 유화 또는 현탁시키고, 유효성분이 단백질인 경우에는 바람직하게는 현탁시키는 단계;
    - 상기 A-B-A 3중블록 코폴리머 용액을 계면활성제를 함유하는 액상에서 유화시키는 단계;
    - 폴리머의 용매를 제거하여, 유효성분이 포매된 매트릭스를 형성하는 마이크로스피어를 획득하는 단계;
    - 상기 마이크로스피어를 분리시키는 단계;
    - 세포부착 화합물에 의해 상기 마이크로스피어를 완전히 또는 부분적으로 코팅하는 단계; 및
    - 세포부착 표면을 나타내는 마이크로스피어와 전세포 또는 세포단편을 접촉시켜, 전세포 또는 세포단편을 포함하는 세포 운반 서방형 마이크로스피어 조성물을 획득하는 단계.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    인체 또는 동물체의 치료에 사용하기 위한, 세포 운반 마이크로스피어 조성물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    퇴행성 질병의 치료에 사용하기 위한, 퇴행성 질병의 치료에 대해 활성인 전세포 또는 세포단편을 포함하는, 세포 운반 마이크로스피어 조성물.
  13. 약학적으로 허용가능한 담체 및 선택적으로 다른 치료용 성분 및/또는 예방용 성분과 함께, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 세포 운반 마이크로스피어 조성물을 포함하는 약학 조성물.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017217813A1 (ko) * 2016-06-16 2017-12-21 주식회사 엘지화학 양친성 고분자
WO2017217817A1 (ko) * 2016-06-16 2017-12-21 주식회사 엘지화학 양친성 트리블록 고분자
KR20170142121A (ko) * 2016-06-16 2017-12-27 주식회사 엘지화학 양친성 고분자
KR20180123655A (ko) 2018-11-09 2018-11-19 고려대학교 산학협력단 연부조직 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어 및 이의 제조방법
KR20200059681A (ko) * 2018-11-21 2020-05-29 영남대학교 산학협력단 세포외 기질 성분을 포함하는 줄기세포의 배양 및 이식용 지지체 및 이의 용도

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2778680T3 (es) * 2014-03-25 2020-08-11 Hoffmann La Roche Procedimientos de preparación de un poloxámero para su uso en medio de cultivo celular
CN111184915B (zh) * 2018-11-14 2022-03-18 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 用于血管网络发生的工程化人工结构体及构建方法与应用
WO2020165379A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Plga-based microspheres, preparation methods and uses thereof
CN111870739A (zh) * 2020-06-12 2020-11-03 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司 一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法及应用
CN115025723A (zh) * 2022-05-10 2022-09-09 吉林大学 经神经生长因子及多巴胺改良的peg-plga微球

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005510521A (ja) * 2001-11-12 2005-04-21 アルカーメス コントロールド セラピューティクス，インコーポレイテッド 生体適合性ポリマーブレンドおよびその使用
FR2839260B1 (fr) 2002-05-03 2005-02-25 Inst Nat Sante Rech Med Microparticules a base d'un materiau bicompatible et biodegradable, supportant des cellules et des substances biologiquement actives
AU2007211018B2 (en) * 2006-01-27 2013-09-05 The Regents Of The University Of California Biomimetic scaffolds
CN101522177A (zh) * 2006-10-06 2009-09-02 巴克斯特国际公司 包含表面改性微粒的微囊及其制备和使用方法
MX2009003661A (es) * 2006-10-06 2009-04-22 Baxter Int Microcapsulas que contienen microparticulas modificadas en la superficie y metodos para formar y utilizar las mismas.

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017217813A1 (ko) * 2016-06-16 2017-12-21 주식회사 엘지화학 양친성 고분자
WO2017217817A1 (ko) * 2016-06-16 2017-12-21 주식회사 엘지화학 양친성 트리블록 고분자
KR20170142121A (ko) * 2016-06-16 2017-12-27 주식회사 엘지화학 양친성 고분자
US11034786B2 (en) 2016-06-16 2021-06-15 Lg Chem, Ltd. Amphiphilic triblock polymer
KR20180123655A (ko) 2018-11-09 2018-11-19 고려대학교 산학협력단 연부조직 질환의 예방 또는 치료용 다공성 고분자 마이크로스피어 및 이의 제조방법
KR20200059681A (ko) * 2018-11-21 2020-05-29 영남대학교 산학협력단 세포외 기질 성분을 포함하는 줄기세포의 배양 및 이식용 지지체 및 이의 용도

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