JP2015511622A - ミクロスフィア組成物、その調製方法及び用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞運搬ミクロスフィア組成物、その調製方法及びそれらの用途に関する。
国際公開第03092657号は、生体適合性かつ生体分解性の材料に基づく微粒子に関する。その表面は関心対象の細胞又はそのフラグメントを含み、前記細胞又は微粒子の埋め込み時のそれらの環境に対して有効な少なくとも1つの活性物質の分子であって、コントロールされた持続的な方法で微粒子によって放出される分子をさらに含む。
今回、本出願人は、特定のトリブロックコポリマーを基礎としたコーティングされたミクロスフィア組成物によって運搬される全細胞又は細胞フラグメントの数が大幅に増加したことを発見した。加えて、特定のトリブロックコポリマーの使用は、全細胞の数を増加させる。さらに、コーティングの性質は、コーティングされたミクロスフィア組成物によって運搬される全細胞又は細胞フラグメントの数を増加させ、細胞分化に影響を与え得る。加えて、特定のトリブロックコポリマーは、有効成分、好ましくはタンパク質を埋め込むことができ、顕著な有効成分高放出特性を有する持続放出マトリックス組成物を提供する。従って、前記マトリックス組成物に連結された関心対象の全細胞又はそのフラグメントは有効成分と相互作用し得るので、より優れた有効性の全細胞又はフラグメントが得られる。
従って、本出願の主題は、トリブロックコポリマーマトリックスA−B−A(ここで、Aは、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)又はポリラクチド(PLA)から選択され、Bは、ポロキサマー又はポロキサミンである)を含むミクロスフィアコアを含む細胞運搬ミクロスフィア組成物であって、該ミクロスフィアコアが細胞接着コーティングでコーティングされており、該細胞接着コーティングに結合した全細胞又は細胞フラグメントをさらに含む細胞運搬ミクロスフィア組成物である。
ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)−ポロキサマー−ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)、
ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)−ポロキサミン−ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)
及びポリ(ラクチド)−ポロキサマー−ポリ(ラクチド)、特にポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)−ポロキサマー−ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)
である。
又は多能性(pluripotent)細胞、再プログラム化細胞であり得る。これらの細胞は、再生医療における様々な疾患に使用され得る。
− トリブロックコポリマーマトリックスA−B−A(ここで、Aは、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)又はポリラクチド(PLA)から選択され、Bは、ポロキサマー又はポロキサミンである)を含むミクロスフィアコアを提供すること
− 該ミクロスフィアを細胞接着化合物で完全に又は部分的にコーティングすること、及び
− 全細胞又は細胞フラグメントを含む細胞運搬ミクロスフィア組成物を得るために、全細胞又は細胞フラグメントを、細胞接着表面を提示するミクロスフィアと接触させること
からなる工程を含む方法である。
− A−B−A(好ましくは、ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)−ポロキサマー−ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド))トリブロックコポリマーのポリマー溶媒(好ましくは、有機溶媒)溶液を提供すること、
− 有効成分(好ましくは、タンパク質)を提供すること、
− 該有効成分を該A−B−Aトリブロックコポリマー溶液に追加し、乳化又は懸濁すること(好ましくは、タンパク質の場合には該有効成分を懸濁すること)、
− 界面活性剤を含有する水相中で、該A−B−Aトリブロックコポリマー溶液を乳化すること、
− 該ポリマー溶媒を除去し、それにより、該有効成分が埋め込まれたマトリックスを形成するミクロスフィアを得ること、
− 該ミクロスフィアを単離すること、
− このようにして得られたミクロスフィアを細胞接着化合物で完全に又は部分的にコーティングすること、及び
− 全細胞又は細胞フラグメントを含む持続放出ミクロスフィア組成物を得るために、全細胞又は細胞フラグメントを、細胞接着表面を提示するミクロスフィアと接触させること
からなる工程を含む方法である。
開始剤としてポロキサマー188及び触媒としてオクタン酸第一スズ[Sn(Oct)2]を使用して、DL−ラクチドとグリコリドとの開環重合によって、トリブロックコポリマーPLGA−P188−PLGA(A−B−Aコポリマー)を調製した。
1H NMR及びサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって、PLGA−P188−PLGA及び他のコポリマーを特性決定した。1H NMRスペクトルにおけるPEG単位(3.6ppm)及びPLGAブロック(4.76ppm)の共鳴の積分比を使用することによって、PLGAブロックの分子量を決定した。固定相としてPlgel 5μm mixed-C (60cm)カラム及びWaters 410屈折率検出器を備えるWaters Inc.装置を使用し、1mL/分のDMFで溶出するSECによって、コポリマーの分子量を決定した。典型的には、試料を10mg/mLでDMFに溶解し、Millipore Corporation製のPTFE filter Millex(登録商標)-FH(孔径0.45μm)でろ過してから、20μLのコポリマー溶液を注入した。ポリ(スチレン)標準に対するキャリブレーションに従って、Mn及びMwを表した。
1H NMRによる計算
タンパク質ナノ粒子の一般的な調製手順:
Bouffi C et al. http://www.sciencedirect.com/science/article/ pii/S0142961210013487 - bib55: The role of pharmacologically active microcarriers releasing TGF-β3 in cartilage formation in vivo by mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31:6485-93及びGiteau A et al. Reversible protein precipitation to ensure stability during encapsulation within PLGA microspheres. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2008;70:127-36によって以前に記載されている方法を使用して、タンパク質をナノ析出した:
150μgのリゾチームと、リゾチーム添加比に応じた様々な量のポロキサマー188(それぞれ1−10又は1−20比について、1.5mg又は3mgのP188)とを含有する10μLのNaCl 0.3M溶液を1.1gのグリコフロールに追加した。遠心分離(10,000g、30分間、4℃)及び上清の除去によって、複合粒子を回収する。
一般的な手順を凍結乾燥TGF−β3に合わせた。
調製4と同様の方法で、及び以前に記載されているように(Delcroix et al. Biomaterials 2011)、1−10又は1−20のタンパク質−ポロキサマー188比いずれかのナノ析出HSAを生産した。750μgのHSAと、HSA添加比に応じた様々な量のポロキサマー188(それぞれ1−10又は1−20比について、7.5mg又は15mgのP188)とを含有する10μLのNaCl 0.3Mを1.1gのグリコフロールに追加した。遠心分離(10,000g、30分間、4℃)及び上清の除去によって、複合粒子を回収する。
調製5と同様の方法で、及び以前に記載されているように(Delcroix et al. Biomaterials 2011)、1−10又は1−20のタンパク質−ポロキサマー188比いずれかのナノ析出HSAを生産した。250μgのHSAと、HSA添加比に応じた様々な量のポロキサマー188(それぞれ1−10又は1−20比について、2.5又は5mgのP188)とを含有する10μLのNaCl 0.3Mを1.1gのグリコフロールに追加した。遠心分離(10,000g、30分間、4℃)及び上清の除去によって、複合粒子を回収する。
以前に記載されているように[Bouffi et al Biomaterials 2010]、インフォームドコンセントの後、股関節置換手術を受けた患者由来の骨髄穿刺液から、ヒトMSC培養物を樹立した。簡潔に言えば、10%ウシ胎児血清(FBS)(Hyclone, ThermoFisherScientific)、2mMグルタミン、100U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン(Lonza)及び1ng/mlヒト塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)(R&DSystems, Lille, France)を補充した完全α−最小必須培地(αMEM)(Lonza, Levallois-Perret, France)に、細胞懸濁液をプレートした。MSCは、CD44、CD73、CD90及びCD105について陽性であり、CD14、CD34及びCD45について陰性であることが示され、第3継代〜第4継代を使用した。
溶媒キャスティングによって、コポリマー1及びPLGAのポリマーフィルムを調製した;10mgのコポリマー(コポリマー1又はPLGA)をDMSOに溶解し、ガラス皿に注ぎ、続いて空気乾燥した。コポリマー1のフィルム及びPLGAのフィルムを得た。
下記調製12の方法に従って、リゾチームを含まない参照ミクロスフィアを生産し、非ローディングMSと命名した。この場合、有機溶液は、2mLの有機溶媒(3:1塩化メチレン/アセトン)及び150mgのコポリマーを含有していた。
非ローディングミクロスフィアを得るために、ポリマーミクロスフィア(調製9又は調製13)を、フィブロネクチン(FN)(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)及びポリ−D−リシン(PDL)(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)でコーティングした。
タンパク質有効成分をミクロスフィア中に埋め込むための一般的な手順:
TRAN et al. Protein-loaded PLGA-PEG-PLGA microspheres: A tool for cell therapy, European Journal of Pharmaceutical Sciences 45 (2012) 128-137によって記載されているように、タンパク質有効成分のカプセル化を実施した。
− Multisizer(商標)コールターカウンター(Beckman Coulter, Roissy, France)を使用して、得られたミクロスフィアの平均体積径及びサイズ分布を評価した。
調製3及び5のナノ析出タンパク質を遠心分離によって回収し、150mgのコポリマーを含有する有機溶液(2mL;3:1塩化メチレン/アセトン)に分散させた。有機溶液をポリ−(ビニルアルコール)水溶液(90mL、4%w/v)中で乳化し、1℃で維持し、1分間機械撹拌した(550rpm)(Heidolph RZR 2041, Merck Eurolab, Paris, France)。100mLの脱イオン水を追加して10分間撹拌した後、得られたo/wエマルジョンを脱イオン水(500mL)に追加し、550rpmでさらに20分間撹拌して、有機溶媒を抽出した。最後に、形成された微粒子を5μmフィルタ(HVLP型、Millipore SA, Guyancourt, France)でろ過し、500mLの脱イオン水で洗浄し、凍結乾燥してから+4℃で保存した。
TGF−β3/ポロキサマー188粒子及びHSA/ポロキサマー188粒子をPLGA−P188−PLGA及びPLGAミクロスフィア中に埋め込むための手順は調製12と同じであったが、この場合のミクロスフィアバッチは50mgである。
工程1:FN及びPDLコーティングミクロスフィアの調製
PLGA−P188−PLGA(コポリマー2)ミクロスフィアを、フィブロネクチン(FN)(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)及びポリ−D−リシン(PDL)(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France)(調製10)でコーティングした。
調製7のヒト間葉系幹細胞をPBSで洗浄し、0.16%トリプシン(Sigma)、0.02%EDTA(Lonza)溶液で剥がし、1400rpmで10分間ペレット化した。
工程1:FN及びPDLコーティングミクロスフィアの調製
実施例1の工程1に記載されているのと同じ方法で、調製13のミクロスフィアのコーティングを実施した。同じ結果が得られた。
実施例1の工程2に記載されているのと全く同じ方法で、細胞をこれらのミクロスフィアに結合させた。同じ結果が得られた。
1−ポリマーフィルム上への細胞接着コーティング
10μg/mLのFN溶液中で、ポリマーフィルム(調製8)を37℃で1.5時間インキュベーションした。コーティングポリマーフィルムをPBSで3回洗浄した。
Malvern Zetasizer(登録商標)(Nano Series DTS 1060, Malvern Instruments S.A., Worcestershire, UK)を使用して、ミクロスフィアのゼータ電位を決定した。Smoluchowskiの式を使用して電気泳動移動度の値をζ電位に変換することによって、ミクロスフィア懸濁液(NaCl 1mM中、0.3mg/mL)で、ゼータ電位の測定を達成した。結果は、平均±標準偏差として示す。
hMSCをPBSで洗浄し、0.16%トリプシン0.02%EDTA溶液(Lonza, Levallois-Perret, France)で剥がし、1400rpmで10分間ペレット化した。3%FBSを補充した培養培地に細胞ペレットを再懸濁した。α−MEM培地、3%FBSを含有するコーティングされたエッペンドルフチューブ(Sigmacote, Sigma)に、0.75mgの凍結乾燥ミクロスフィア(調製9又は10)を15分間再懸濁した。コーティングミクロスフィア懸濁液を超音波処理し、簡単にボルテックスしてから、細胞懸濁液(細胞0.25×106個/0.5mgコーティングミクロスフィア)を追加した。次いで、混合物を穏やかに流し、1.9 cm2Costar ultra-low cluster plate (#3473, Corning, Avon, France)にプレートした。
hMSCをPBSで洗浄し、0.16%トリプシン0.02%EDTA溶液(Lonza, Levallois-Perret, France)で剥がし、1400rpmで10分間ペレット化した。3%FBSを補充した培養培地に細胞ペレットを再懸濁した。α−MEM培地、3%FBSを有する、コーティングされたエッペンドルフチューブ(Sigmacote(登録商標), Sigma)中で、0.75mgの凍結乾燥コーティングミクロスフィアを15分間再懸濁した。コーティングミクロスフィア懸濁液を超音波処理し、簡単にボルテックスしてから、細胞懸濁液(細胞0.25×106個/0.5mgコーティングミクロスフィア)を追加した。次いで、混合物を穏やかに流し、1.9 cm2Costar ultra-low cluster plate (#3473, Corning, Avon, France)にプレートした。この懸濁培養液を経時的に維持し、様々な時間間隔(24時間、48時間及び7日間)で細胞生存率を評価し、製造業者のガイドラインに従ってCyquant細胞増殖アッセイ(登録商標)(Invitrogen, France)を使用して、コーティングミクロスフィアに接着した生細胞を定量した。結果を図5に示す。星印**は、有意差(p<0.01)、n=3を示す。
カプセル化工程における生物学的活性の喪失を検出するために、実施例1のミクロスフィアから抽出した活性タンパク質の量を、ミクロスフィアをDMSOに溶解した後に決定した。
a)リゾチーム−調製11
0.1%w/v BSA及び0.09%w/v NaClを含有する500μLの0.05M TRIS−HCl緩衝液(pH7.4)を10mgのミクロスフィアに追加して遠心分離チューブに入れることによって、ミクロスフィア(調製11)からのリゾチームのin vitro放出プロファイルを決定した。チューブを密閉し、振盪水浴(37℃、125rpm)中でインキュベーションした。決められた間隔で、チューブを2,800gで5分間遠心分離して、上清を回収し、pH並びにリゾチーム及びポロキサマーの放出を分析した。次いで、上清を新たな緩衝液に交換した。
調製12:
チューブを振盪水浴(37℃、125rpm)中でインキュベーションした。決められた時間間隔で、チューブを2,800gで5分間遠心分離した。200μLの上清を分析用に回収し、新たな緩衝液(250μl)に交換した。セクション5に記載されている酵素アッセイによって、放出された生物学的活性リゾチームの割合を測定した。
PLGA+P188 1:10、PLGA−P188−PLGA+P188 1:10、PLGA−P188−PLGA+P188 1:20(調製13)のいずれかから構成されるミクロスフィアをPBS 1%BSA中でインキュベーションし、ELISA(Duoset ELISA human TGF-β3 (R&D Systems, Lille, France)又は下記バイオアッセイによって、異なる時点で放出された培地中のTGF−β3を試験した。
TGF−β3でナノ析出したP188をカプセル化するPLGAミクロスフィア(1:10のTGF−β3:P188比(w/w))、PLGA−P188−PLGAミクロスフィア+P188 1:10及びPLGA−P188−PLGAミクロスフィア+P188 1:20(図8A)。ELISAアレイによって又はバイオアッセイによって測定した場合、ミクロスフィアから放出された同程度の量のTGF−β3が検出されたが、このことは、放出されたTGF−β3が生物活性であったことを示している。生物活性TGF−β3の放出プロファイルは各製剤について類似しており、初期放出がより高く(0日目〜7日目)、その後は30日目まで徐放期であった(図8A)。
PLGA又はPLGA−P188−PLGAマトリックス(ポリマー2)を有する非ローディングコーティングミクロスフィア(調製10)及びTGFB3放出コーティングミクロスフィア(調製13+調製10)のhMSCの軟骨細胞分化を、28日間のマイクロペレット培養によって誘導した。PLGA又はPLGA−P188−PLGAマトリックス(ポリマー2)を有する非ローディングコーティングミクロスフィア(調製10)及びTGFB放出コーティングミクロスフィア(調製11)のhMSCの培養を、コニカルチューブ中、マイクロペレットで実施した。簡潔に言えば、MSC(細胞2.5×105個)及び0.5mgのコーティングミクロスフィアを、15mLコニカルチューブ中で遠心分離によってペレット化し、軟骨形成培地で培養した。この培地は、0.1mMデキサメタゾン、0.17mMアスコルビン酸及び1%インスリントランスフェリンセレン酸(ITS)サプリメント(Lonza)を補充したDMEMから構成されていた。10ng/mL TGF−B3を補充した軟骨形成培地中でペレット培養によって、MSCの標準的な軟骨形成を誘導した。これは、マイクロペレット培養によるin vitro軟骨細胞分化のゴールドスタンダードであるので、比較としての役割を果たした。
マイクロペレット培養の21日後に、PLGA又はPLGA−P188−PLGAマトリックスを有する非ローディングコーティングミクロスフィア及びTGFβ3放出コーティングミクロスフィアのhMSCをPBSで洗浄し、溶解緩衝液で機械的に剥がした。次いで、製造業者の推奨に従って、細胞調製物からの全RNAを抽出した。1%β−メルカプトエタノールを含有する緩衝液に細胞を溶解し、DNAse処理して微量のゲノムDNAを除去してからRNAを抽出した(Total RNA isolation Nucleospin(登録商標)RNA II, Macherey Nagel, Hoerdt, France)。製造業者の説明書に従ってSuperScript(商標)II Reverse Transcriptase (Invitrogen)を用いて、第1鎖cDNA合成を実施した。第1鎖cDNA合成の後、cDNAを精製し(Qiaquick PCR purification kit, Qiagen, Courtaboeuf, France)、50μLのRNaseフリー水(Gibco)中に溶出した。cDNA(3.125ng)を、iQ SYBR Green Supermix (Biorad)及びプライマーミックス(0.2mM)と最終容量10μLで混合した。最初の変性工程を95℃で3分間とし、95℃で10秒間、55℃で15秒間及び72℃で15秒間を40サイクルとして、Chromo4 thermocycler (Biorad)で増幅を行った。増幅後、産物の融解曲線により、ターゲット遺伝子に対するプライマーの特異性を決定した。各cDNAについて2回の測定から、平均サイクル閾値(Ct)を求めた。いくつかのハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(Gapdh、NM_002046)、β2ミクログロブリン前駆体(B2M、NM_004048)、βアクチン(Actb、NM_001101)、及び熱ショック90kDタンパク質1β(Hspcb、NM_007355)を標準化のために試験した。Gapdh、Hprt1及びHspcbが3つの最も安定なハウスキーピング遺伝子であったことを決定するために、GeNorm(登録商標)フリーウェア(http://medgen.ugent.be/ ejvdesomp/genorm/)を使用した。デルタcT法[Q=E(全試験試料のCt min−当該試料のCt)](ここで、Eはプライマー効率に関するものである(プライマー効率=100%の場合、E=2))によって、相対転写量(Q)を決定した。Vandesompele et al. [29]に記載されている多標準化法を使用して、相対量(Q)を標準化した。
マイクロペレット培養の21日後、非ローディングコーティングミクロスフィア及びTGFB放出コーティングミクロスフィアのhMSCを4%パラホルムアルデヒドで24時間固定し、PBSで洗浄し、ルーチンな組織学のために処理した。パラフィン包埋試料切片(5mm)をエタノール及びキシレンの勾配によって再水和し、ヘマトキシリン−エオシンで染色した。
Claims (13)
- トリブロックコポリマーマトリックスA−B−A(ここで、Aは、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)又はポリラクチド(PLA)から選択され、Bは、ポロキサマー又はポロキサミンである)を有するミクロスフィアコアを含む細胞運搬ミクロスフィア組成物であって、該ミクロスフィアコアが細胞接着コーティングでコーティングされており、該細胞接着コーティングに結合した全細胞又は細胞フラグメントをさらに含む、細胞運搬ミクロスフィア組成物。
- Aがポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)である、請求項1に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
- Bがポロキサマーである、請求項1又は2に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
- トリブロックコポリマー中のポロキサマー又はポロキサミンの割合が2〜40重量%である、請求項1又は2に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
- 全細胞を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
- ミクロスフィア内に埋め込まれた有効成分をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
- 有効成分がタンパク質である、請求項6に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
- 細胞接着コーティングがフィブロネクチン及びポリ−D−リシンを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
- 請求項1〜5及び8のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物を調製するための方法であって、
− トリブロックコポリマーマトリックスA−B−A(ここで、Aは、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)又はポリラクチド(PLA)から選択され、Bは、ポロキサマー又はポロキサミンである)を有するミクロスフィアコアを提供すること、
− 該ミクロスフィアを細胞接着化合物で完全に又は部分的にコーティングすること、及び
− 全細胞又は細胞フラグメントを含む細胞運搬ミクロスフィア組成物を得るために、全細胞又は細胞フラグメントを、細胞接着表面を提示するミクロスフィアと接触させること
からなる工程を含む、方法。 - 請求項6、7及び8のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物を調製するための方法であって、
− A−B−A(好ましくは、ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド)−ポロキサマー−ポリ(D,L−ラクチド−コ−グリコリド))トリブロックコポリマーのポリマー溶媒(好ましくは、有機溶媒)溶液を提供すること、
− 有効成分(好ましくは、タンパク質)を提供すること、
− 該有効成分を該A−B−Aトリブロックコポリマー溶液に追加し、乳化又は懸濁すること(好ましくは、タンパク質の場合には該有効成分を懸濁すること)、
− 界面活性剤を含有する水相中で、該A−B−Aトリブロックコポリマー溶液を乳化すること、
− 該ポリマー溶媒を除去し、それにより、該有効成分が埋め込まれたマトリックスを形成するミクロスフィアを得ること、
− 該ミクロスフィアを単離すること、
− このようにして得られたミクロスフィアを細胞接着化合物で完全に又は部分的にコーティングすること、及び
− 全細胞又は細胞フラグメントを含む細胞運搬持続放出ミクロスフィア組成物を得るために、全細胞又は細胞フラグメントを、細胞接着表面を提示するミクロスフィアと接触させること
からなる工程を含む、方法。 - ヒト又は動物の体の治療処置方法に使用するための、請求項1〜8のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
- 変性疾患の治療処置方法に使用するための、変性疾患を処置するのに有効な全細胞又は細胞フラグメントを含む請求項1〜8のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の細胞運搬ミクロスフィア組成物を、薬学的に許容しうる担体並びに場合により他の治療及び/又は予防成分と共に含む、医薬組成物。
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