JP5000439B2 - 細胞培養用担体 - Google Patents
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Description
ただし、測定試料は、減圧乾燥機{120℃、0.1kPa以下}で1時間乾燥したものを用いる。
(保水量)=(g2)−1.0
(2)特開昭55−133413号公報等に記載の水溶液重合(断熱重合、薄膜重合又は噴霧重合等)により得られる架橋ポリアクリル酸(塩)。
(3)特公昭54−30710号公報、特開昭56−26909号公報又は特開平11−5808号公報等に記載の逆相懸濁重合により得られる架橋ポリアクリル酸(塩)。
(4)特開昭52−14689号公報又は特開昭52−27455号公報等に記載のビニルエステルと不飽和カルボン酸又はその誘導体との共重合体のケン化物。
(5)特開昭58−2312号公報又は特開昭61−36309号公報等に記載のアクリル酸(塩)とスルホ(スルホネート)基含有モノマーとの共重合体。
(6)米国特許第4389513号等に記載のイソブチレン−無水マレイン酸共重合架橋体のケン化物。
(7)特開昭46−43995号公報等に記載のデンプン−アクリロニトリル共重合体の加水分解物。
(8)米国特許第4650716号等に記載の架橋カルボキシメチルセルロース。
(9)高分子ゲルの最新動向(シーエムシー出版、2004年発行)等に記載のポリアルキレン(エチレン、プロピレン等)グリコール架橋体。
(10)高分子ゲルの最新動向(シーエムシー出版、2004年発行)等に記載のポリビニルアルコール架橋体。
(11)特開2003−48997号公報に記載のデンプン放射線架橋体。
(12)特開平9−85080号公報に記載のカルボキシル基含有架橋セルロース。
(13)特開平10−251402号公報に記載のポリアミノ酸放射線架橋体。
(14)特開2002−179770号公報に記載の架橋ポリアスパラギン酸。
(15)特開2001−120992号公報に記載の多糖類の多価金属イオン架橋体。
(16)特開2001−2935号公報、特開2003−052742号公報、特開2003−082250号公報、特開2003−165883号公報、特開2003−176421号公報、特開2003−183528号公報、特開2003−192732号公報、特開2003−225565号公報、特開2003−238696号公報、特開2003−335970号公報、特開2004−091673号公報、特開2004−121400号公報、特開2004−123835号公報、特開2005−075982号公報、特開2005−095759号公報、特開2005−097569号公報、特開2005−186015号公報、特開2005−186016号公報、特開2005−247931号公報等に記載された高性能吸水性樹脂。
(17) 特開昭64−43188号公報、特開昭58−36630号公報、特開平8−73691号公報、特開平9−316271号公報等に記載のポリビニルアルコール系ポリマー。
(18)特許第2812863号公報に記載のポリアクリルアミド系ポリマー。
(19)特開平9−51794号公報に記載の親水性ウレタン樹脂系ポリマー。
アクリル酸塩及びメタクリル酸塩としては、アクリル酸又はメタクリル酸のアルカリ金属(リチウム、カリウム及びナトリウム等)塩及び多価金属{アルカリ土類金属(マグネシウム及びカルシウム等)、ホウ素属金属(アルミニウム、ガリウム及びインジウム等)、及び遷移金属(チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、ジルコニウム、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、銀、カドミウム、オスミウム、及び白金等)}塩及びアンモニウム塩等が用いられる。
なお、膨潤粒子の体積平均粒子径は、1重量部の測定試料を生理食塩水(0.9重量%)100重量部中に、25℃で60分間浸漬させることにより調製される膨潤粒子を、JIS Z8825−1:2001に準拠して、レーザー式粒度分布測定装置(例えば、堀場製作所製LA−920、分散媒:生理食塩水、測定温度:25℃)により測定できる。
多価金属イオン(B)としては、アルカリ土類金属(マグネシウム及びカルシウム等)、ホウ素属金属(アルミニウム、ガリウム及びインジウム等)及び遷移金属(チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛、ジルコニウム、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、銀、カドミウム、オスミウム及び白金等)が挙げられる。これらのうち、細胞毒性の観点から、マグネシウム、カルシウム、バリウム、マンガン、鉄、銅及び亜鉛が好ましく、さらに好ましくはマグネシウム、カルシウム及び鉄、特に好ましくはマグネシウム及びカルシウムである。
本発明の細胞培養用担体に含まれる多価金属イオンは、1種類であっても、2種類以上であってもよい。
ただし、測定試料は、減圧乾燥機{120℃、0.1kPa以下}で1時間乾燥したものを用いる。
金属化合物としては、水に接触すると金属イオンに解離できるものであれば制限がなく、たとえば、金属水酸化物、金属塩{ハロゲン化金属塩、炭酸金属塩、炭酸水素金属塩、リン酸金属塩、硝酸金属塩、硫酸金属塩、脂肪酸金属塩、有機スルホン酸金属塩及び有機リン酸金属塩等}及び金属単体が含まれる。
多価金属イオンを含む水溶液としては、金属化合物の水溶液等が挙げられる。
多価金属イオンを含む水溶液の濃度としては、吸水性樹脂(A)と混合したとき、多価金属イオン(B)の含有量が上記の範囲となれば制限ないが、0.01〜1000{好ましくは0.1〜230}mmoml/L程度である。
浸漬する温度にも制限がなく、5〜50{好ましくは20〜30}℃程度である。
粉体混合の際、吸水性樹脂(A)は、水を含む水膨潤ゲルであってもよく、乾燥した粒子でもよい。
粉体混合の際、金属化合物の大きさは、水と接触したときに金属イオンに解離できれば制限はないが、混合しやすさ及び均一性等の観点から、0.1〜5000{好ましくは1〜200}μm程度である。
(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(20)〜(22)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Gly Ala Gly Tyr)c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(23)〜(25)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Gly Val Gly Tyr)d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(26)〜(28)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Gly Tyr Gly Val)e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(29)〜(31)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
{Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala}g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(32)〜(34)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Val Pro Gly Val)h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(35)〜(38)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly)i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(39)〜(41)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Ala)j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(42)〜(44)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Gly Ala)k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(45)〜(47)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Val Gly Val Pro)m配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(48)〜(50)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Pro Pro)n配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(51)〜(53)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gly)o配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(54)〜(56)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln)p配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(57)〜(59)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Ser Pro)q配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(60)〜(62)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(1)最小アミノ酸配列(X)がArg Gly Asp配列(x1)の場合
Arg Gly Asp配列(x1)の13個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9配列(21)(y1)の12個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約11万のポリペプチド{「プロネクチンF」、プロネクチンは三洋化成工業(株)の登録商標(日本及び米国)である。三洋化成工業(株)製<以下同じ>};(x1)の5個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3配列(20)(y2)の5個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約2万のポリペプチド(「プロネクチンF2」);(x1)の3個と(Gly Val Pro Gly Val)2 Gly Gly (Gly Ala Gly Ala Gly Ser)3配列(38)(y3)の3個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約1万のポリペプチド(「プロネクチンF3」)等。
プロネクチンF、プロネクチンF2又はプロネクチンF3のArg Gly Asp配列(x1)をIle Lys Val Ala Val配列(7)(x2)に変更した「プロネクチンL」、「プロネクチンL2」、又は「プロネクチンL3」等。
プロネクチンF、プロネクチンF2又はプロネクチンF3のArg Gly Asp配列(x1)をTyr Ile Gly Ser Arg配列(x3)に変更した「プロネクチンY」、「プロネクチンY2」、又は「プロネクチンY3」等。
カルボジイミド化合物としては、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド及び1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。
カルボニルジイミダゾール化合物としては、N,N’−カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。
これらの溶媒の中で、無機塩、酸及び/又は塩基を含有する水溶液、並びに水が好ましく、さらに好ましくは無機塩、酸及び/又は塩基を含有する水溶液、並びにイオン交換蒸留水、特に好ましくは無機塩、酸及び/又は塩基を含有する水溶液である。
なお、測定試料は、減圧乾燥機{120℃、0.1kPa以下}で1時間乾燥したものを用いる。
本発明の細胞培養用担体を生理食塩水で膨潤させて得た膨潤粒子の体積平均粒子径(μm)は、細胞増殖性等の観点から、10〜2000が好ましく、さらに好ましくは25〜1000、特に好ましくは50〜500、最も好ましくは100〜300である。
血清を添加する場合、これらのうち、ヒト血清、ウシ血清、及びウマ血清が好ましい。また、動物血清の由来は、成体由来の血清、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清等が挙げられる。血清を添加する場合、これらのうち、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清が好ましく、さらに好ましくは新生由来の血清、及び胎児由来の血清、特に好ましくは胎児由来の血清である。血清を添加する場合、さらに血清は、非働化処理や、抗体の除去処理等を行ってもよい。
また、培地に投入する細胞培養用担体の乾燥重量(g)は、培養する細胞の種類等によって適宜決定できるが、培地1L当たり、0.005〜800が好ましく、さらに好ましくは0.02〜200、特に好ましくは0.1〜40である。
<製造例1>
<吸水性樹脂(A−1)の調製>
攪拌機、モノマー供給管、窒素ガス導入管、温度計、還流冷却器を備えた重合反応容器にシクロヘキサン624部、重合分散剤としてソルビタンモノステアレート3.1部を仕込み、窒素バブリングを30分以上行って、溶存空気を追い出し75℃まで昇温した。
次に共沸脱水によって160部の水を抜き出した後、含水ゲルポリマーを取り出し、更に120℃で2時間乾燥して、乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を得た。
乾燥架橋ポリアクリル酸ナトリウム塩を、目開きが63μmのふるい及び53μmのふるい(JIS Z8801−1:2000)により分級して、粒子径53〜63μmの粒子を得た。
<吸水性樹脂(A−2)の調製>
架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を「5.72部」から「0.014部」に変更したこと以外、製造例1と同様にして、吸水性樹脂(A−2)を得た。吸水性樹脂(A−2)の保水量は30g/gであった。
<吸水性樹脂(A−3)の調製>
架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を「5.72部」から「0.9部」に変更したこと以外、製造例1と同様にして、吸水性樹脂(A−3)を得た。吸水性樹脂(A−3)の保水量は21g/gであった。
<吸水性樹脂(A−4)の調製>
架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を「5.72部」から「0.9部」に変更したこと、及び「目開きが63μmのふるい及び53μmのふるい」を「目開きが32μmのふるい及び45μmのふるい」に変更したこと以外、製造例1と同様にして、吸水性樹脂(A−4)を得た。吸水性樹脂(A−4)の保水量は21g/gであった。
<吸水性樹脂(A−5)の調製>
架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を「5.72部」から「0.9部」に変更したこと、及び「目開きが63μmのふるい及び53μmのふるい」を「目開きが90μmのふるい及び125μmのふるい」に変更したこと以外、製造例1と同様にして、吸水性樹脂(A−5)を得た。吸水性樹脂(A−5)の保水量は21g/gであった。
<吸水性樹脂(A−6)の調製>
架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を「5.72部」から「0.0111部」に変更したこと以外、製造例1と同様にして、吸水性樹脂(A−6)を得た。吸水性樹脂(A−6)の保水量は33g/gであった。
<吸水性樹脂(A−7)の調製>
架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を「5.72部」から「4.52部」に変更したこと以外、製造例1と同様にして、吸水性樹脂(A−7)を得た。吸水性樹脂(A−7)の保水量は13g/gであった。
<人工ポリペプチド(P1)の調製>
特表平3−502935号公報中の実施例記載の方法に準じて、Arg Gly Asp配列の13個と(Gly Ala Gly Ala Gly Ser)9配列(21)の12個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約11万のペプチド「プロネクチンF」を製造し、人工ポリペプチド(P1)とした。
吸水性樹脂(A−1)の1gに、塩化ナトリウムを0.85%で含有する0.02M,pH7.2のリン酸緩衝液(以下、PBS)の50mLを加え、30分間放置して、吸水性樹脂(A−1)を膨潤させ、アスピレーターで余分なPBSを吸引除去した後、水溶性カルボジイミド(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド ハイドロクロライド、(株)同仁化学研究所製)を60mMの濃度で含むPBS溶液の40mLを加え、ポリフッ化エチレン樹脂製攪拌羽で攪拌し、2時間反応させて、変性吸水性樹脂を得た。なお、2時間反応後、反応溶液を吸引除去し、PBSの40mLを添加、吸引除去する洗浄操作を5回行った。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−2)」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−2)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−2)を得た。この担体(E−2)には、2mmol/gのカルシウムイオンと2mg/g人工ポリペプチドが含まれ、保水量は30g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径200μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−3)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「硫酸マグネシウムを5g/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−3)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−3)を得た。この担体(E−3)には、2mmol/gのマグネシウムイオンと2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は20g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径180μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−3)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを2.5g/L、硫酸マグネシウムを0.8g/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−3)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−4)を得た。この担体(E−4)には、2mmol/gのカルシウムイオンと1mmol/gのマグネシウムイオンと2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は19g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径180μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−3)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを150mg/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−3)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−5)を得た。この担体(E−5)には、0.2mmol/gのカルシウムイオンと2mmol/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は21g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径185μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−3)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを400mg/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−3)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−6)を得た。この担体(E−6)には、0.5mmol/gのカルシウムイオンと2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は21g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径185μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−3)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを10g/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−3)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−7)を得た。この担体(E−7)には、5mmol/gのカルシウムイオンと2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は19g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径180μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−3)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを25g/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−3)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−8)を得た。この担体(E−8)には、10mmol/gのカルシウムイオンと2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は15g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径165μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−4)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを2.5g/L、硫酸マグネシウムを0.8g/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−4)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−9)を得た。この担体(E−9)には、2mmol/gのカルシウムイオンと1mmol/gのマグネシウムイオンと2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は19g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径100μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−5)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを2.5g/L、硫酸マグネシウムを0.8g/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−5)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−10)を得た。この担体(E−10)には、2mmol/gのカルシウムイオンと1mmol/gのマグネシウムイオンと2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は19g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径300μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−3)」に変更したこと、「水溶性カルボジイミドを60mMの濃度で含むPBS溶液」を「水溶性カルボジイミドを2mMの濃度で含むPBS溶液」に変更したこと、「人工ポリペプチド(P1)を600μg/mLの濃度で含むPBS溶液」を「人工ポリペプチド(P1)を20μg/mLの濃度で含むPBS溶液」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを2.5g/L、硫酸マグネシウムを0.8g/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−6)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−11)を得た。この担体(E−11)には、2mmol/gのカルシウムイオンと1mmol/gのマグネシウムイオンと500ng/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は19g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径180μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−3)」に変更したこと、「水溶性カルボジイミドを60mMの濃度で含むPBS溶液」を「水溶性カルボジイミドを150mMの濃度で含むPBS溶液」に変更したこと、「人工ポリペプチド(P1)を600μg/mLの濃度で含むPBS溶液」を「人工ポリペプチド(P1)を2000μg/mLの濃度で含むPBS溶液」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを2.5g/L、硫酸マグネシウムを0.8g/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−7)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−12)を得た。この担体(E−12)には、2mmol/gのカルシウムイオンと1mmol/gのマグネシウムイオンと5mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は19g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径180μmであった。
「28%水酸化ナトリウム水溶液207部」を「48%水酸化ナトリウム水溶液152部及び38%水酸化カルシウム55部」に変更したこと、及び架橋性単量体{エチレングリコールジグリシジルエーテル}の使用量を「6.32部」から「0.9部」に変更したこと以外、製造例1と同様にして、吸水性樹脂(A−8)を得た。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−2)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを150mg/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−2)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−14)を得た。この担体(E−14)には、0.2mmol/gのカルシウムイオンと2mmol/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は30g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径200μmであった。
「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを400mg/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−1)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−15)を得た。この担体(E−15)には、0.5mmol/gのカルシウムイオンと2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は10g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径150μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−6)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを15mg/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを10g/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−9)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−16)を得た。この担体(E−16)には、5mmol/gのカルシウムイオンと2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は30g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径200μmであった。
「吸水性樹脂(A−1)」を「吸水性樹脂(A−7)」に変更したこと、及び「塩化カルシウムを2.5g/Lの濃度で含む水溶液」を「塩化カルシウムを25g/Lの濃度で含む水溶液」に変更したこと以外、実施例1と同様にして、人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−10)を調製し、本発明の細胞培養用担体(E−17)を得た。この担体(E−17)には、10mmol/gのカルシウムイオンと2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は10g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径150μmであった。
実施例1で調製した人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−1)を比較用の細胞培養用担体(HE−1)とした。この担体(HE−1)には、2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は10g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径は150μmであった。
実施例2で調製した人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−2)を比較用の細胞培養用担体(HE−2)とした。この担体(HE−2)には、2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は30g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径は200μmであった。
実施例9で調製した人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−4)を比較用の細胞培養用担体(HE−3)とした。この担体(HE−3)には、2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は20g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径は100μmであった。
実施例10で調製した人工ポリペプチド結合吸水性樹脂(D−5)を比較用の細胞培養用担体(HE−4)とした。この担体(HE−4)には、2mg/gの人工ポリペプチドが含まれ、保水量は20g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径は300μmであった。
非特許文献1に記載された「動物由来のコラーゲンを有するデキストランビーズ」{商品名Cytodex-3、アマシャム・バイオサイエンス社製}を比較用の細胞培養用担体(HE−5)とした。この担体(HE−5)の保水量は15g/gであった。また、膨潤粒子の体積平均粒子径は175μmであった。
評価試料{細胞培養用担体}を生理食塩水で膨潤させた後、150Gで90秒間遠心脱水し余剰水を取り除いて膨潤担体を調製した。
スピンナーフラスコに膨潤担体4gを投入し、生理食塩水を100mL/フラスコで加え、オートクレーブ滅菌(121℃、20分間)した後、生理食塩水をアスピレータで吸引除去し、無血清培地(商品名:VP−SFM、インビトロジェン(株)製)に抗菌剤(商品名:PSA、カスケード社製)を0.2%で含有させた培地を50mL/フラスコで添加し、1時間放置した。スピナーフラスコから培地を吸引除去し、再度、同じ培地を100mL/フラスコで添加し、スピンナーフラスコを37℃、二酸化炭素ガス濃度5容量%のCO2インキュベーターの中に2時間放置した後、予めプレ培養していたVERO細胞(大日本住友製薬(株)製)を細胞濃度が20万個/mLになるように培地に播種した。引き続き、37℃、二酸化炭素ガス濃度5容量%のCO2インキュベーターの中で、30rpmの攪拌をしながら、7日間の培養を行った。なお、培養4日目、5日目及び6日目に培地の半分を新しい培地と交換した。培養7日目にサンプリングし、単位体積当たりの細胞核数をクリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法により計数し、培地中の細胞濃度(万個/mL)を測定し、結果を表1に示した。
研究開発用としては、分化機能等の細胞機能評価用細胞の培養、動物実験(毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等)の代替用細胞の培養、遺伝子や蛋白質導入用細胞の培養等に利用できる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産用細胞の培養に利用できる。これらのうち、ワクチンの生産用細胞の培養に好適である。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の細胞培養に利用できる。
Claims (5)
- 2〜50g/gの保水量を持つ吸水性樹脂(A)と、多価金属イオン(B)とを含有し、多価金属イオン(B)の含有量が吸水性樹脂(A)1g当たり0.2〜10mmol/gであることを特徴とする細胞培養用担体。
- さらに、細胞接着性最小アミノ酸配列(X)を1分子中に少なくとも1個有する人工ペプチド(P)を含有する請求項1に記載の細胞培養用担体。
- 吸水性樹脂(A)が架橋ポリ(メタ)アクリル酸である請求項1又は2に記載の細胞培養用担体。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養用担体を用いて、細胞を培養する工程を含む有用物質の生産方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養用担体を用いて、細胞を培養する工程を含む組織又は臓器の生産方法。
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