CN113144290A - 一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法 - Google Patents

一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113144290A
CN113144290A CN202010941204.0A CN202010941204A CN113144290A CN 113144290 A CN113144290 A CN 113144290A CN 202010941204 A CN202010941204 A CN 202010941204A CN 113144290 A CN113144290 A CN 113144290A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dopa
orthopedic
coating
bone
dbco
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010941204.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113144290B (zh
Inventor
施勤
潘国庆
周熙超
赵环
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Suzhou University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Suzhou University filed Critical First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority to CN202010941204.0A priority Critical patent/CN113144290B/zh
Publication of CN113144290A publication Critical patent/CN113144290A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113144290B publication Critical patent/CN113144290B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/426—Immunomodulating agents, i.e. cytokines, interleukins, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/606—Coatings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/18—Modification of implant surfaces in order to improve biocompatibility, cell growth, fixation of biomolecules, e.g. plasma treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法，该涂层由骨形态发生蛋白2的活性肽通过媒介附着于骨科材料表面，其中，所述骨形态发生蛋白2活性肽的氨基酸序列为KIPKASSVPTELSAISTLYL，所述媒介为包含多个3,4‑二羟基苯丙氨酸DOPA的多肽序列。该涂层制备步骤简单易行，无需大型设备，反应平稳，不污染环境。通过实验结果得出，本发明制备方法制得的材料表面涂层与传统的材料表面改性方法制得的涂层相比，具有促进成骨和免疫调节的功能，为骨科材料能进一步应用于创伤和组织工程支架等领域提供了新的途径。

Description

一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法。
背景技术
随着患有骨与关节疾病和损伤的病人数呈逐年上升的趋势，对骨科植入物的需求也越来越大。在临床上，现有植入物的促骨形成性能仍不能令人满意，而且植入物颗粒（如钛或陶瓷颗粒）被体内巨噬细胞吞噬后，会促进巨噬细胞向M1型极化，引起一系列炎性介质的释放影响成骨细胞骨形成和促进破骨细胞骨吸收，继而影响植入物的稳定性。
骨形态发生蛋白-2（BMP-2）是临床常用的诱导成骨的因子，能激活间充质干细胞（MSCs）向软骨、成骨细胞方向分化。天然的BMP-2蛋白不仅数量有限，获取困难，价格昂贵，难以大规模生产。另外BMP蛋白在生物环境中早期呈爆发式的释放，随后浓度很快下降至治疗水平以下，难以持续发挥作用。生物合成的BMP活性多肽具有与 BMP-2 蛋白一样的受体结合能力和成骨特性，且生物活性更强、副作用小、与材料复合过程中稳定性更好。有研究发现与BMP-2同为BMP家族的BMP-7的表达与M2巨噬细胞分化相关并且具有支持作用，提示BMPs蛋白可能也具有免疫调节的功能。
在自然界中，贻贝可以紧密地粘附于各种表面，这与贻贝类的足腺细胞分泌的一种含有大量贻贝足丝蛋白的黏附蛋白相关。贻贝黏附蛋白中富含多种儿茶酚氨基酸（3,4-二羟基-L-苯丙氨酸，DOPA），由于儿茶酚氨基酸与底物容易形成共价结合和非共价结合，配合各种儿茶酚基团之间的相互作用（席夫碱或者迈克尔加成作用等），使得海洋贻贝类生物能够在潮湿环境中吸附于几乎所有的固态物体的表面，这得到了研究人员的极大兴趣。
对植入物进行表面改性是最常用的增强材料生物相容性和生物活性的方法。目前，人们已经采用各种物理和化学的方法来对钛植入物表面进行改性处理，通过改变钛表面氧化钛膜的结构、化学成份以及通过引入表面生物分子等可赋予钛基金属材料生物活性，从而在体内实现材料与硬组织间的生物活性结合。目前物理技术类的改性方法需要用到多种复杂的技术手段，如：热喷涂、脉冲激光、离子溅射、喷砂、电化学法和离子注入法等。通过这种表面物理性能的方式条件钛材料表面的生物功能需要大量的优化实验和复杂设施。相比而言，通过表面引入生物活性分子的方式则更为直接。 一些具有生物活性的分子，如：多肽、蛋白、生长因子甚至无机离子（Ca2+）都可以通过物理吸附或者共价接入的方式改性医用钛基生物材料。但是当前的物理吸附方式会造成严重的分子泄露，而化学方式则需要复杂的化学手段和非生物兼容的化学分子来作为活性分子的桥接。因此这一类方法的普遍适用性和实用性大打折扣。本发明研发了一种操作简单、效果稳定、适用各种固态骨科材料且具有促成骨和免疫调节效果的材料表面涂层新方法，具有极大的实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层，该涂层由骨形态发生蛋白2的活性肽通过媒介附着于骨科材料表面，其中，所述骨形态发生蛋白2活性肽的氨基酸序列为KIPKASSVPTELSAISTLYL，所述媒介为包含多个3,4-二羟基苯丙氨酸DOPA的多肽。
进一步的，包含多个3,4-二羟基苯丙氨酸的多肽序列组成为DBCO-DOPA（（Ac-(DOPA)-G-(DOPA)-K(PEG5-Azido)- (DOPA)-G-(DOPA)）。
本发明所述骨科材料表面涂层的制备方法，包括以下步骤：
（1）骨科材料表面预处理；
（2）将预处理后的骨科材料浸泡于媒介溶液中，使得媒介吸附于骨科材料表面，然后用去离子水冲洗，去除表面多余的媒介溶液；
（3）将步骤（2）清洗后的骨科材料浸泡于骨形态发生蛋白2活性肽溶液中，使得骨形态发生蛋白2活性肽通过点击化学与媒介相连接并负载于骨科材料上，最后用去离子水将材料表面冲洗干净，烘干后即制得骨科材料表面涂层。
进一步的，所述媒介溶液的浓度为0.01-0.1mg/mL。
进一步的，所述骨形态发生蛋白2活性肽溶液的浓度为0.1-1mg/mL。
进一步的，所述步骤（2）和步骤（3）的浸泡时间为12-36h。
有益效果：本发明提供了一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法，本发明利用含有大量儿茶酚基团的DOPA设计并合成了负载媒介DBCO-DOPA多肽，利用儿茶酚基团黏附作用，在各种骨科材料表面形成黏附层，其后进一步通过点击化学吸附BMP2活性肽定植，在骨科材料表面制得涂层。本发明的制备步骤简单易行，无需大型设备，反应平稳，不污染环境。通过实验结果得出，本发明制备方法制得的材料表面涂层与传统的材料表面改性方法相比，具有促进成骨和免疫调节的功能，为骨科材料能进一步应用于创伤和组织工程支架等领域提供了新的途径。
附图说明
图1 为DOPA氨基酸和DBCO-DOPA多肽的分子结构图。
图2 为不同固态材料使用DBCO-DOPA多肽修饰后材料表面上的C1s、N1s 和O1s的XPS分析图，A为TCPS材料表面原子组成图，B为Glass材料表面原子组成图，C为不锈钢材料表面原子组成图，D为Ti材料表面原子组成图，E为PEEK材料表面原子组成图。
图3 为不同固态材料DBCO-DOPA多肽表面改性前后的表征图，A为未涂布和DBCO-DOPA多肽涂布的不同固态材料表面的SEM图；B为未涂布和DBCO-DOPA多肽涂布的不同固态材料表面的AFM图。
图4 为DBCO-DOPA多肽表面涂层对不同固态材料表面亲水性的影响图，A为不同材料表面DBCO-DOPA多肽涂布前后的水接触角测量图（n≥3，*p<0.05，**p<0.01，及***p<0.001）；B为通过表面上相应的水滴剖面计算表面改性后的TCPs组平均静态水接触角结果图；C为Glass组平均静态水接触角结果图；D为不锈钢组平均静态水接触角结果图；E为Ti组平均静态水接触角结果图；F为PEEK组平均静态水接触角结果图。
图5 为BMP2p活性肽改善钛颗粒预处理引起的人脐带间充质干细胞 （UMSCs）细胞系成骨分化能力减弱结果图，A为BMP2p活性肽分子结构示意图；B为BMP2p活性肽促进钛颗粒预处理后UMSCs细胞系成骨分化早期ALP活性和中晚期钙结节形成结果图；C为不同处理条件下UMSCs细胞的ALP活性统计图；D为不同处理条件下UMSCs细胞于450nm波长下的OD值图。
图6 为BMP2p活性肽促进钛颗粒刺激的巨噬细胞M1、M2极化结果图，A为流式细胞术分析图，B为M1和M2极化结果图，结果显示与钛颗粒处理组相比，钛颗粒加入BMP2p活性肽组CD11b+CD206+的细胞比例增多，CD11b+CD86+的细胞比例下降，（n=3，*：P<0.05，**：P<0.01）。
图7 为BMP2p活性肽促进钛颗粒刺激的巨噬细胞表达M1、M2极化特异性基因表达结果图，A为M1极化特异性基因表达结果图，B为M2极化特异性基因表达结果图；结果显示与钛颗粒处理组相比，钛颗粒加入BMP-2多肽组巨噬细胞M1极化的特异性基因 TNF-α、iNOS、IL-6相对mRNA表达下降，M2极化的特异性基因 TNF-β、Arg、IL-10的相对表达水平增高，（n=3，*：P<0.05, **：P<0.01）。
图8 为不同表面涂层修饰后PEEK材料表面改性结果图，A为不同表面涂层修饰后PEEK材料的SEM表面图；B为不同表面修饰后PEEK材料表面粗糙度的AFM检测图；C为不同表面涂层修饰后 PEEK材料上的C1s、N1s 和O1s的XPS分析图，测定样品的原子表面组成（XPS全谱和N1s谱）；D为不同表面修饰后PEEK材料上水接触角测量及统计分析图，（n ≥ 3, **，与PBS组相比p < 0.01；***，p < 0.001）。
图9 为BMP2p-DBCO-DOPA表面涂层修饰后促进大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）成骨向分化结果图。A为不同表面修饰后PEEK材料上成骨诱导培养rBMSCs 7天后行ALP染色大体观（上）和镜下观（下）的结果图；B为ALP活性检测统计柱状图；C为不同表面涂层修饰后PEEK材料上成骨诱导培养rBMSCs 14天后行茜素红染色大体观（上）和镜下观（下）的结果图；D为茜素红染色强度统计分析图，（n ≥ 3, ***，与PBS组相比p < 0.001）。
图10 为不同表面修饰后PEEK材料的体内促成骨能力结果图，A为大鼠颅骨缺损手术示意图；B为术后8周取大鼠颅骨组织，树脂包埋硬组织切片后HE染色显微镜下照片；C为术后8周取大鼠颅骨组织，Micro-Ct扫描，三维重建图；D为骨缺损区域新生骨量分析图；E：骨缺损区域新生骨骨密度分析图；其中图中标注的C代表未添加PEEK材料组，P代表PBS-PEEK组；D代表DBCO-DOPA-PEEK组；DB代表BMP2p-DBCO-DOPA- PEEK组（***，与PBS组相比p <0.001）。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 粘附于多种固态材料表面的贻贝衍生生物活性肽（DBCO-DOPA多肽）的制备
基于标准的芴甲氧羰酰（Fluorenylmethyl，Fmoc）的固相肽合成策略，使用丙酮化物保护的Fmoc-DOPA（丙酮）-OH将DOPA单位引入序列，最终得到的多肽用乙酰基封端在N端，得到含有四个DOPA氨基酸的肽链单体组成的聚合体DBCO-DOPA（（Ac-(DOPA)-G-(DOPA)-K(PEG5-Azido)- (DOPA)-G-(DOPA)）（图1），简称DBCO-DOPA多肽。
将合成的DBCO-DOPA多肽按1mg/10μL溶解于二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），进行实验时使用无菌去离子水稀释为0.01mg/mL。
选择不同的固体材料作为DBCO-DOPA多肽的粘附对象，包括不锈钢片（StainlessSteel，SS）、钛片（Ti）、聚苯乙烯片（TCPs）、玻璃片（Glass）和聚醚醚酮（PEEK）五种材料，在材料表面进行DBCO-DOPA多肽的表面改性，以证实DBCO-DOPA多肽在这些材料表面的附着性能，并改变其相关表面性质。
所有材料分为DBCO-DOPA多肽涂布实验组和非涂布对照实验组，实验组材料在4℃下置于6孔板中浸泡在0.01mg/mL的DBCO-DOPA多肽溶液24小时，对照组在4℃下置于6孔板中浸泡于无菌去离子水中24小时。两组材料24小时后使用去离子水冲洗三遍后进行进一步表面性能检测。
通过扫描电子显微镜、原子力学显微镜、水接触角、X射线正电子能谱等测定方法对各种改性材料进行了结构表征与性能研究。图2为不同固态材料使用DBCO-DOPA多肽修饰后材料表面上的C1s、N1s 和O1s的XPS分析图，其中2A为TCPS材料表面原子组成图，2B为Glass材料表面原子组成图，2C为不锈钢材料表面原子组成图，2D为Ti材料表面原子组成图，2E为PEEK材料表面原子组成图，从图中结果表明DBCO-DOPA多肽成功固定在各种材料表面，且明显增加了材料的表面粗糙度，改善了材料的亲水性（图3-4）。
实施例2 骨形态发生蛋白2活性肽（简称BMP2p活性肽）在促成骨和免疫调节中的作用
生物合成BMP2p活性肽，其序列为KIPKASSVPTELSAISTLYL，BMP2p活性肽分子式如图5A所示。
首先研究了BMP2p活性肽对经钛颗粒预处理后的间充质干细胞成骨分化的影响。用钛颗粒预处理UMSCs细胞，具体步骤如下：将UMSCs细胞以每孔1×105个细胞的密度接种6孔板，在铺满底面30％面积的情况下，更换含有浓度为0.1mg/mL的钛颗粒完全培养基。每两天更换不含钛颗粒的完全培养基，直到6天后，使用胰酶消化细胞和钛颗粒。将混合液以300r/min差速离心2min，可以看到钛颗粒沉降在底部，吸取上清，避免吸到颗粒，并重复上述步骤。将最后得到的上清液1200r/min离心3min，可以看到沉淀中大部分是白色的细胞，含有少量钛颗粒。将得到的细胞继续接种到细胞皿中培养，用于后续成骨诱导实验。将收集的正常和钛颗粒预处理两种UMSCs细胞接种12孔板，在成骨培养基中培养7天后，对细胞进行ALP染色，成骨诱导21天后行茜素红染色。结果显示（图5）与正常UMSCs细胞相比，经钛颗粒预处理的UMSCs细胞的成骨能力明显减弱，BMP2p活性肽能显著改善这种影响。
接着研究了BMP2p活性肽对巨噬细胞极化的影响。将小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞以1×106细胞/孔的密度接在6孔板中培养，6h后更换0.1mg/mL的钛颗粒培养基和具有或不具有100ng/mL BMP2p活性肽的培养基，并设立对照组。1天后，使用Trizol试剂提取总RNA并通过PCR测定巨噬细胞极化的特异性基因。3天后进行流式细胞分析，具体步骤如下：胰蛋白酶消化细胞，离心机1000 r/min，离心5 min，弃上清后立即置于冰上。将1×105个细胞以200μl PBS（含2％胎牛血清）重悬后放入1个EP管，并用对应的荧光抗体（CD11b、CD86、CD206，其中M1为CD11b+CD86+，M2为CD11b+CD206+）孵育30min。洗涤后，上机检测。流式检测我们发现Ti组CD11b+CD86+分子表达略高于RAW组，BMP2p组CD11b+CD206+分子表达略高于RAW组（图6）。从PCR检测中我们看到Ti组M1极化特异性基因的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）, 肿瘤坏死因子-α(TNF-α), 白细胞介素-6(IL-6)致炎基因表达明显上升，Ti+BMP组明显下降，有显著性的差异。在抑制炎症基因表达方面，BMP组白细胞介素-10(IL-10)，肿瘤坏死因子-β(TNF-β)， 精氨酸酶（Arg）表达上升，Ti组则会抑制M2 抗炎基因表达（图7）。以上结果表明钛颗粒能诱导巨噬细胞产生炎症因子，BMP2p活性肽可以促进Raw264.7细胞向M2方向极化，并抑制M1炎症基因的表达。体外实验研究表明，BMP2p活性肽除能促进成骨之外，还能够促进巨噬细胞向具有抗炎作用的M2型巨噬细胞极化，通过免疫调节间接缓解钛颗粒导致的间充质干细胞成骨分化能力降低。
实施例3 BMP2p活性肽通过点击化学作用定植于涂布有DBCO-DOPA多肽的PEEK材料表面并发挥促成骨和免疫调节的功能
熔铸成型的医用级PEEK圆片直径15.5mm，在进行DBCO-DOPA多肽涂层表面改性之前，全部材料先由丙酮浸泡24小时过夜。次日将其先室温下丙酮浸泡10min，超声波浴3min，然后按照无水乙醇浸泡10min风干后超声波浴3min处理，共清洗3遍后置于10cm培养皿。最后各样品在真空条件下经过等离子体清洗2min/次，清洗2次，以促进表面的枝接能力。射频调节为40%最大功率，80W，内部压力99.3KPa。
材料在检测前用无菌去离子水冲洗三遍，分为三组，分别为PBS-PEEK组：PBS浸泡24小时；DBCO-DOPA-PEEK组：0.01mg/mL DBCO-DOPA多肽浸泡24小时；BMP2p活性多肽组：BMP2p-DBCO-DOPA-PEEK组：0.01mg/mL DBCO-DOPA多肽提前一天预浸泡24小时，无菌去离子水冲洗三遍后使用0.1mg/mL BMP2p活性肽浸泡24小时。
首先采用扫描电子显微镜、原子力学显微镜、水接触角、X射线正电子能谱等测定方法对改性PEEK材料进行了结构表征与性能研究，结果表明（图8）DBCO-DOPA多肽与BMP2p活性肽均成功固定在PEEK材料表面，且明显增加了PEEK材料的表面粗糙度，改善了材料的亲水性。
体外实验部分我们将rBMSCs细胞接种于表面改性或普通PEEK材料上，成骨诱导培养基培养后进行ALP染色和ALP活性检测、茜素红染色，提取细胞RNA进行qRT-PCR检测成骨相关基因表达水平。结果表明（图9），rBMSCs可以正常在三组PEEK材料上生长和成骨向分化。与PBS-PEEK组相比，成骨诱导7天时BMP2p-DBCO-DOPA- PEEK组ALP染色阳性和ALP活性均明显增高；成骨诱导14天时，BMP2p-DBCO-DOPA- PEEK组茜素红染色阳性率明显高于其他三组材料。qRT-PCR结果显示，成骨诱导6天后，BMP2p-DBCO-DOPA- PEEK材料上的rBMSCs成骨相关基因COL1A1、BMP-2和β-catenin的表达水平均较其他三组明显上调。
体内实验部分我们构建了大鼠颅骨极限大小骨缺损（5mm）模型并植入不同PEEK材料，术后8周收集大鼠颅骨样本，通过Micro-CT和组织学观察修复效果。结果显示（图10），与未加植入材料的空白组和PBS-PEEK材料组相比，DBCO-DOPA-PEEK植入材料组的骨缺损区域骨密度（BMD）和新生骨体积分数（BV/TV）略有提升，但无统计学差异，而BMP2p-DBCO-DOPA-PEEK材料植入组则显著增高。各组颅骨组织硬组织包埋、切片后行H&E染色，结果与Micro-CT结果一致，BMP2p-DBCO- DOPA- PEEK材料植入组具有较好的促骨形成效果和骨结合效果。因此，采用贻贝类仿生肽DBCO-DOPA多肽可以简便、快速和高效的对PEEK材料进行表面改性，而通过化学点击技术进一步负载BMP2p活性肽能更有效地提高骨科植入PEEK材料的生物相容性与生物功能性。
综上所述，本发明公开了DBCO-DOPA多肽在骨科材料表面改性中的应用，提供了一种BMP2p-DBCO-DOPA的材料表面涂层制备方法，该方法操作步骤简单易行，无需大型设备，反应平稳，不污染环境，在临床治疗上有很高的应用前景和实用价值。按照本发明制备方法制得的材料表面涂层与传统的材料表面改性方法相比，同时具有促进成骨和免疫调节的功能，为骨科材料能进一步应用于创伤和组织工程支架等领域提供了可能。
序列表
<110> 苏州大学附属第一医院
<120> 一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法
<140> 2020109412040
<141> 2021-05-31
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 2
Lys Ile Pro Lys Ala Ser Ser Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser
1 5 10 15
Thr Leu Tyr Leu
20

Claims (6)

1.一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层，其特征在于，该涂层由骨形态发生蛋白2的活性肽通过媒介附着于骨科材料表面，其中，所述骨形态发生蛋白2活性肽的氨基酸序列为KIPKASSVPTELSAISTLYL，所述媒介为包含多个3,4-二羟基苯丙氨酸DOPA的多肽。
2. 根据权利要求1所述的一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层，其特征在于，包含多个3,4-二羟基苯丙氨酸的多肽序列组成为DBCO-DOPA（（Ac-(DOPA)-G-(DOPA)-K(PEG5-Azido)- (DOPA)-G-(DOPA)）。
3.权利要求1或2所述骨科材料表面涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）骨科材料表面预处理；
（2）将预处理后的骨科材料浸泡于媒介溶液中，使得媒介吸附于骨科材料表面，然后用去离子水冲洗，去除表面多余的媒介溶液；
（3）将步骤（2）清洗后的骨科材料浸泡于骨形态发生蛋白2活性肽溶液中，使得骨形态发生蛋白2活性肽通过点击化学与媒介相连接并负载于骨科材料上，最后用去离子水将材料表面冲洗干净，烘干后即制得骨科材料表面涂层。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述媒介溶液的浓度为0.01-0.1mg/mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述骨形态发生蛋白2活性肽溶液的浓度为0.1-1mg/mL。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（3）的浸泡时间为12-36h。
CN202010941204.0A 2020-09-09 2020-09-09 一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法 Active CN113144290B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010941204.0A CN113144290B (zh) 2020-09-09 2020-09-09 一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010941204.0A CN113144290B (zh) 2020-09-09 2020-09-09 一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113144290A true CN113144290A (zh) 2021-07-23
CN113144290B CN113144290B (zh) 2022-08-23

Family

ID=76882199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010941204.0A Active CN113144290B (zh) 2020-09-09 2020-09-09 一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113144290B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113368305A (zh) * 2021-05-21 2021-09-10 上海市伤骨科研究所 一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101273057A (zh) * 2005-10-27 2008-09-24 华中科技大学同济医学院附属协和医院 骨形态发生蛋白2活性肽及制备方法和应用
KR20120049419A (ko) * 2010-11-01 2012-05-17 아주대학교산학협력단 폴리페놀산화효소를 이용한 생리활성 물질의 표면 고정화 방법
WO2013183048A1 (en) * 2012-06-03 2013-12-12 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Functionalized titanium binding peptides and implants coated with same
CN104225675A (zh) * 2014-08-12 2014-12-24 西南交通大学 一种具有一氧化氮(no)催化活性的材料的制备方法
CN105949322A (zh) * 2016-05-12 2016-09-21 苏州大学附属第医院 一种适用于“一步法”改性医用钛基材料的生物模拟活性肽
CN109400676A (zh) * 2018-10-23 2019-03-01 苏州大学附属第医院 （dopa）4-g5-rgds活性肽及其应用
CN109735819A (zh) * 2019-03-14 2019-05-10 西南交通大学 具有NO催化释放与EPCs捕获功能的生物材料及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101273057A (zh) * 2005-10-27 2008-09-24 华中科技大学同济医学院附属协和医院 骨形态发生蛋白2活性肽及制备方法和应用
KR20120049419A (ko) * 2010-11-01 2012-05-17 아주대학교산학협력단 폴리페놀산화효소를 이용한 생리활성 물질의 표면 고정화 방법
WO2013183048A1 (en) * 2012-06-03 2013-12-12 Ben-Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Functionalized titanium binding peptides and implants coated with same
CN104225675A (zh) * 2014-08-12 2014-12-24 西南交通大学 一种具有一氧化氮(no)催化活性的材料的制备方法
CN105949322A (zh) * 2016-05-12 2016-09-21 苏州大学附属第医院 一种适用于“一步法”改性医用钛基材料的生物模拟活性肽
CN109400676A (zh) * 2018-10-23 2019-03-01 苏州大学附属第医院 （dopa）4-g5-rgds活性肽及其应用
CN109735819A (zh) * 2019-03-14 2019-05-10 西南交通大学 具有NO催化释放与EPCs捕获功能的生物材料及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ATSUHIRO SAITO ET AL: "Activation of osteo-progenitor cells by a novel synthetic peptide derived from the bone morphogenetic protein-2 knuckle epitope", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 *
HUAN ZHAO ET AL: "Bioclickable Mussel-Derived Peptides With Immunoregulation for Osseointegration of PEEK", 《FRONTIERS IN BIOENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY》 *
刘勇等: "聚乳酸-多巴胺-骨形成发生蛋白-2控释支架的构建及成骨研究", 《中华试验外科杂志》 *
施勤: "可自主结合转化生长因子β1聚乙二醇水凝胶的制备及其生物相容性", 《中国组织工程研究》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113368305A (zh) * 2021-05-21 2021-09-10 上海市伤骨科研究所 一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用
CN113368305B (zh) * 2021-05-21 2022-04-26 上海市伤骨科研究所 一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113144290B (zh) 2022-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. Triple-functional polyetheretherketone surface with enhanced bacteriostasis and anti-inflammatory and osseointegrative properties for implant application
Zhou et al. Improving osteogenesis of three-dimensional porous scaffold based on mineralized recombinant human-like collagen via mussel-inspired polydopamine and effective immobilization of BMP-2-derived peptide
Hélary et al. A new approach to graft bioactive polymer on titanium implants: Improvement of MG 63 cell differentiation onto this coating
Dee et al. Conditions which promote mineralization at the bone-implant interface: a model in vitro study
Ho et al. Preparation and characterization of RGD-immobilized chitosan scaffolds
Minoura et al. Attachment and growth of cultured fibroblast cells on silk protein matrices
US7753955B2 (en) Methods and composition for soft tissue feature reconstruction
KR101461159B1 (ko) 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물
CN113750290A (zh) 聚醚醚酮复合植入物及其制备方法和应用
JP2011125351A (ja) 細胞培養のための表面
CN114989475B (zh) 一种生物功能化表面改性的聚醚醚酮材料的制备方法和产品应用
JP2007508816A (ja) 細胞培養および組織培養プラットフォームのための組成物および方法
CN111936560A (zh) 用于刺激神经再生、骨生成和血管生成的水凝胶
CN113144290B (zh) 一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法
Gomes et al. A novel BSA immobilizing manner on modified titanium surface ameliorates osteoblast performance
Chen et al. Biocompatible octacalcium phosphate/sodium alginate/silk fibroin composite scaffolds for bone regeneration
Zhao et al. Construction of multifunctional coating with cationic amino acid-coupled peptides for osseointegration of implants
CN116920173B (zh) 一种牙科种植体PDA-D-amino-TNT复合涂层及制备方法
Zhou et al. Surface functionalization of titanium with BMP-7/RGD/hyaluronic acid for promoting osteoblast functions
EP3027234B1 (en) Osteoinductive materials
Ao et al. The synergistic effect of type I collagen and hyaluronic acid on the biological properties of Col/HA-multilayer-modified titanium coatings: an in vitro and in vivo study
JPWO2009038180A1 (ja) 医療用組織結合性材料
KR100879704B1 (ko) 골유착 및 골형성을 증진시키는 올리고펩타이드
Alasvand et al. Cellular response to alumina
Sun et al. Studies on surface properties and cell adhesion properties of BSA modified DBM scaffold

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant