KR100879704B1

KR100879704B1 - 골유착 및 골형성을 증진시키는 올리고펩타이드

Info

Publication number: KR100879704B1
Application number: KR1020080054730A
Authority: KR
Inventors: 강은정; 엄태관; 김재호; 이정근
Original assignee: 오스템임플란트 주식회사
Priority date: 2008-06-11
Filing date: 2008-06-11
Publication date: 2009-01-22
Also published as: CN101743014A; WO2009151288A2; WO2009151288A3

Abstract

본 발명은 골유착 및 골형성을 증진시키는 올리고펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (C 또는 K)-(I, K 또는 P)-(I, P 또는 K)-(K 또는 P)-(K, P 또는 S)-(P 또는 S)-(A 또는 S)-(A, P 또는 S)-(A, P 또는 T)-(E, P 또는 T)-(E, L 또는 T)-(E, L 또는 S)-(A, L 또는 S)-(A, I 또는 S)-(A, I 또는 S)-(I, M 또는 S)-(L, M 또는 S)-(C, L 또는 M)의 일반구조식을 갖는 생체활성물질인 올리고펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 올리고펩타이드는 골충진제 대체 효과, 수직 치료 효과 및 수평 치료 효과를 나타내어 이를 이용한 임플란트는 임플란트 표면에 박막 처리된 올리고펩타이드의 지속적인 작용으로 인한 조골세포의 유인, 기능 증가를 유발시킴으로써 초기 골유착 기간 단축, 저골질 환자의 시술 성공률 증대, 골량이 부족한 경우 골충진제 없이 골형성 가능, 시술 비용 절감을 가져올 수 있다.

올리고펩타이드, 골충진제, 임플란트, 골유착

Description

골유착 및 골형성을 증진시키는 올리고펩타이드{Oligopeptide for enhancing osteointegration and bone formation}

본 발명은 골유착 및 골형성을 증진시키는 올리고펩타이드에 관한 것이다.

본 발명은 일반적인 임플란트에서 골유착 및 골형성 증진을 목적으로 사용되는 올리고펩타이드에 관한 것인데, 본 명세서에서는 치과용 임플란트에 적용되는 올리고펩타이드를 중심으로 설명한다.

1. 임플란트 부품ㆍ소재의 형상 및 명칭

치과 임플란트의 형상은 도 1과 같으며, 명칭은 결손된 치아 부위에서 인공치근의 역할을 하는 고정체(implant 또는 fixture라 함), 고정체와 외관(crown)을 연결시켜주는 지대주(abutment), 그리고 인공치아(crown)로 구분된다. 임플란트는 지대주와 연결되는 연결부와 치조골과 직접 접촉하는 임플란트 표면으로 크게 구성된다. 치과 임플란트에서는 표면이 골유착 기간과 향후 기능을 좌우하므로 매우 중요하다.

2. 임플란트 부품ㆍ소재의 기능

치과 임플란트는 치아가 결손된 부위에 주변 치아를 손상시키지 않고 티타늄(titanium) 인공치근을 치조골에 이식하여 본래 치아와 같은 감각이나 기능을 수행하는 부품을 말한다. 치과 임플란트는 치조골에 매식된 후 일정기간이 지나면 치조골과 골유착이 되고, 골유착 후에는 지대주를 연결한 후 인공치아(crown)를 연결하게 된다. 인공치아를 임플란트에 연결시킨 후에는 일반적으로 정상적인 기능(저작)을 하게 되며, 골유착 후에는 15-20년을 사용하게 되므로 골유착이 반영구적으로 유지되어야 한다. 이를 위한 사전 피로수명시험 조건은 250 N 하중으로 500만 사이클이 주로 적용된다.

치과 임플란트의 중요 성능지표 중의 하나는 골유착 기간을 단축시키는 것이다. 즉, 짧은 기간 내에 골유착이 되지 않을 경우에는 치료기간이 길어짐에 따라 치과 임플란트의 시장을 형성하는 것이 어렵고, 향후 임플란트의 정상적인 저작기능이 원활하지 못하므로 초기 골유착 기간을 단축시키는 것이 절대적으로 요구되고 있다.

조골세포의 증식과 분화를 촉진시키는 TGF-β(transforming growth factor-β), IGF-1(Insulin-like growth factor-1) 등의 성장인자(growth factor) 또는 BMP(bone morphogenetic protein) 같은 생리활성물질을 임플란트 식립시 임플란트 표면에 직접 도포하거나 수술 부위 주변에 유포시키는 방법이 사용되고 있다. 그러나 식립 시술 전에 생체물질을 임플란트 표면에 도포하는 방법은 과량이 요구되고 식립시 효과적으로 잔류하지 못하므로 적용이 어렵고 또한 시술 부위에 생체물 질을 도포하는 것은 도포된 영역이 극히 제한적이기 때문에 임플란트 표면 전역에서 효과적인 골재생과 골유착이 이루어지지 않을 뿐만 아니라 시술비용이 가중되는 단점이 있다. 더욱이 시술의 표준화가 이루어지지 않아 시술방법과 환자의 관리가 효율적이지 못하여 표준화된 시술 방법으로 채택되는 것은 어려운 실정이다.

3. 임플란트 기술 동향

치과 임플란트의 기술로는 설계(design)기술과 표면개질기술로 크게 구분된다. 표면개질의 기술은 초기 골유착 기간을 결정하고 임플란트의 수명을 결정하는 중요한 요소이며, 기술의 발전에 따라 1～4세대로 구분된다.

1세대 임플란트는 1965년에 스웨덴의 Branemark이 개발한 기계가공 임플란트이다. 1세대 임플란트는 골유착기간이 4～8개월이 요구됨에 따라, 다양한 문제가 제기되어 골유착 기간 단축을 목적으로 임플란트의 표면적을 넓히는 2세대 임플란트가 개발되었다. 2세대 임플란트의 표면개질 방법으로는 산처리, 샌드 블라스팅(sand blasting), 샌드 블라스팅 후 산처리, 소결(sintering) 등이 개발되었으며, 2세대 임플란트의 골유착기간은 3～6개월로 단축되었다. 3세대 임플란트로는 HA(hydroxylapatite) 코팅, 양극산화, 불소첨가표면, 친수성을 향상시킨 표면 등이 있다. HA 코팅의 경우 개발 시기적으로는 2세대에 포함되지만 기술적인 진보의 분류로는 3세대에 해당되며, 양극산화는 표면을 다공화하고 산화층을 두껍게 형성하여 골유착을 증진시킨 것이다. 불소첨가표면은 스웨덴 ASTRA사에서 개발한 것으로 임플란트 표면에 불소를 첨가하여 골유착을 증진시킨 것이며, 친수성을 향상 시킨 표면은 스위스 ITI사에서 개발한 것으로 표면에너지 강화 및 친수성을 증대시켜 골유착 기간을 단축시킨 것이다. 3세대의 임플란트는 골형성 물질, 즉 불소, 칼슘, 인을 첨가하는 방법과 표면을 다공성(porus)으로 하고 두터운 산화층을 형성시키는 방식을 이용하여 골유착 기간을 2～4개월로 단축시켰다. 그러나 결손된 치아를 회복시키는데 있어 기존의 치료 방법에 비하여 3세대의 임플란트의 경우도 치료기간이 3개월 이상이 소요되는 한계점이 있으며, 전반적인 성공률이 2세대의 임플란트 보다 다소 향상되었으나 치조골질이 나쁠 경우 성공률이 아직도 낮아 고령 환자 등 치조골질이 나쁜 경우에는 제한적으로 사용되고 있는 실정이다. 즉, 3세대의 표면개질기술로는 골유착 기간을 3개월 이내로 단축하기에 한계가 있으므로 제4세대의 임플란트의 개발이 절실히 요구되고 있다(표 1, 치과용 임플란트 표면처리의 종류 및 특징).

표면처리의 변화	표면처리의 종류	골유착 기간(개월)	특 징
1세대	기계가공(machined)법	4～8	초창기의 임플란트로서 기계가공으로만 처리됨
2세대	blasting, etching을 통한 표면적 증대 법	3～6	기계가공 임플란트에 표면 거칠기만을 부여하여 골융합 증진
3세대	HA coating, Osseospeed, SLActive, Anodizing 법	2～4	화학적으로 표면처리 하여 골유착 증진
4세대	생체물질 코팅	1.5～2	생화학적으로 표면처리 하여 골유착 증진 및 골질이 나쁜 경우에도 임플란트시술 성공률 증대

골형성 기전을 규명하기 위한 다양한 연구가 수행되면서 TGF군에 속하는 BMP계열의 단백질이 치조골 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. BMP에 관한 첫 번째 연구결과 발표 후 많은 연구자들이 동물을 대상으로 많은 실험을 진행하였으며 동물뿐만 아니라 인간의 경우 뼈를 재생하고 뼈의 조직 강화를 유도할 수 있다는 결과가 발표되었다. 그러나 BMP를 직접적으로 대상체에 투여하였을 경우 수분 내에 사라지며 체내에 존재하는 효소에 의해서 빠른 시간 안에 분해되어 기능이 상실되는 것을 확인되었다. 결과적으로 새로운 뼈의 형성을 효과적으로 유도하기 위하여서는 임플란트 시술시 단시간 내에 상당히 높은 농도의 BMP를 투여하여야 함을 의미한다. 즉 골형성을 촉진시키기 위하여 BMP를 적용할 경우, 안정성, 약물동력학 그리고 비용적인 측면에서 많은 문제에 직면하게 된다.

단백질은 수백～수천개의 아미노산으로 구성되어 있는데 이러한 단백질의 구조 및 기능에 대한 연구가 진행되면서 단백질을 구성하고 있는 전체 아미노산 서열 중에 활성부위(active site)가 존재하고 있음이 발견되었고 나아가 이를 토대로 목적 단백질과 동일한 기능을 수행할 수 있는 최소한의 아미노산 서열이 단백질의 기능을 모방하는 기술에 대한 연구가 진행되고 있다.

또한 최근에는 펩타이드 합성기(peptide synthesizer)를 이용하여 원하는 아미노산 서열을 단시간에 제작할 수 있는 기술이 개발되었다. 일반적으로 재조합단백질은 목적 단백질을 생산하는 유전자를 미생물 또는 동물세포의 유전자에 도입시켜 대량 배양 후 정제과정을 통해 얻어진다. 목적 단백질을 생산하는 유전자를 도입시키기 위하여 주로 바이러스 벡터, 세포-매개(cell-mediate) 그리고 비바이러스 벡터인 플라스미드, 리포펙션(lipofection) 등을 이용하고 있으며 바이러스 벡터를 이용한 부분에서는 많은 성과물들이 나오고 있는 실정이지만 안정성과 세포성 면역반응 및 체액성 면역반응에서는 이식유전자(transgenic) 발현정도가 주목할 정도로 줄어드는 단점을 보이고 있다.

반면 펩타이드 합성기(peptide synthesizer)를 이용한 올리고펩타이드 생산은 일련의 유전자 조작이 불필요하며 천연 단백질(native protein)의 전체 아미노산(whole amino acid) 서열이 아닌 일부 서열, 특히 단백질의 기능 발휘에 핵심적인 서열이 되는 올리고펩타이드를 개발하고 생산하는데 매우 효과적인 방법이다. 합성 종결 후 올리고펩타이드를 정제하기 위하여 HPLC를 수행하며 이는 유전자 조작에 의한 목적산물의 정제 단계에 비해 훨씬 단순하고 고순도로의 정제가 용이한 방법이다. 또한 합성기를 사용하면 목적에 따라 올리고펩타이드의 아미노산 서열 중 일부 아미노산의 변형(예: 아세틸화, 아미드화, 인산화 등)이 가능하므로 천연 단백질의 아미노산 서열의 구조와 부분적으로 다른 올리고펩타이드를 인위적으로 변형시켜서 제작이 가능한 장점을 가진다. 특히 아미노산 서열이 단백질에 비해 아주 짧은 서열인 경우, 합성기를 사용한 유기합성법은 유전자재조합으로 목적 물질을 생산하는 안정적인 세포주를 개발(PCR, 유전자 클로닝, 클론의 스크리닝 등등)하고 대량 배양시켜 목적 물질을 분리 정제하는 과정과 비교하여 개발에 소요되는 시간 및 경비를 단축시킬 수 있다.

최근 골형성에 관여하는 BMP 및 세포외 기질(extracellular matrix)의 전체 아미노산 서열 중에서 핵심적인 역할을 하는 아미노산 서열을 찾으려는 시도가 활발히 진행 중이며 이들 아미노산 서열을 합성기를 사용하여 제작하고 그 유효성을 분석하는 연구가 진행되고 있다.

또한, 최근에는 골유착 및 골형성을 증진시키는 단백질이나 올리고펩타이드와 같은 생체활성물질을 임플란트 표면에 적용하고자 하는 연구가 다양하게 진행되고 있다.

이와 같은 올리고펩타이드와 같은 생체활성물질의 개발과 임플란트 표면에 올리고펩타이드를 도입시키는 것과 관련하여 다음과 같은 특허들이 출원되고 있다.

한국특허출원공개번호 2006-0110190(생체활성물질이 코팅된 치과용 임플란트와 그 코팅 방법)은 치과용 임플란트의 외주면상에 활성막을 형성하고 그 활성막상에 중간반응기층을 적층한 뒤 그 중간반응기층상에 매트릭스물질과 생체활성물질을 화학적 공유결합으로 코팅하거나 생체활성물질이 결합된 고분자물질을 코팅함으로써 멸균과정 후에도 생체활성이 그대로 유지된다. 이는 유통과 보관이 용이할 뿐만 아니라 치과용 임플란트와 생체활성물질간에 충분한 접착력을 확보함으로써 치과용 임플란트 시술시 골유착기간을 단축시킬 수 있는 치과용 임플란트와 그 코팅방법을 개시하고 있다.

한국특허출원공개번호 2006-0110189(치과용 임플란트 표면처리용 올리고펩타이드)에는 공중합폴리머에 펩타이드를 결합시킨 것으로 치과용 임플란트 표면에 직접 처리되어 골성장을 증진하여 골유착기간을 단축할 수 있는 올리고펩타이드, 특히 R1-(A-B-C)n-R2-(A-B-C)m-L 구조식을 가진 것으로 상기 식에서 R1은 H, 아미노산잔기, 지방산잔기 혹은 생분해 특성을 가진 공중합 폴리머 주쇄이고, R2는 스페이서이며, L은 링크기인 것을 특징으로 펩타이드가 기재되어 있다.

한국특허출원공개번호 2006-0101019(등록번호 0676945, 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 코팅된 골이식재 및 조직공학용 지지체)은 세포부착 유도 펩타이드 및/또는 조직성장인자 유래 펩타이드가 표면에 코팅된 골이식재 및 조직공학용 지지체에 관한 것으로서, 특히 골형성 단백질(BMP-2, 4, 6) 유래의 펩타이드를 개시하고 있다. 한국특허출원공개번호 2006-0082060(등록번호 0630903, 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 코팅된 차폐막 및 임플란트)는 가교제가 결합된 표면에 세포부착유도 펩타이드 또는 조직성장인자 유래 펩타이드가 코팅된 차폐막 및 임플란트에 관한 것으로서 골형성 단백질(BMP-2) 유래의 펩타이드를 개시하고 있다.

하지만 상기 문헌들에 기재된 펩타이드는 아직 초기 골유착 기간의 획기적인 단축 및 특히 저골질 환자의 시술 성공율 등의 관점에서 개선이 필요한 상태이다.

이에 본 발명자들은 최소한의 아미노산 서열 조합으로 골유착을 증진시키는 천연 단백질의 효과에 준하거나 또는 그 이상의 효과를 가지는 새로운 아미노산 서열을 설계하고 이들 물질에 대한 유효성을 분석하고 가장 성능이 우수한 올리고펩타이드를 선별하여 임플란트 표면에 적용하고자 노력하던 중, 특정 서열의 올리고펩타이드가 초기 골유착 및 골형성을 증진시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 조골세포 증식과 분화를 증진하고 골형성을 증진시키는 대표적인 단백질인 BMP-2와 비교하여 동등 또는 그 이상의 효과를 가지고 생리활성물 질의 안정성 측면에서도 매우 월등한 올리고펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 올리고펩타이드를 치과용 임플란트 표면에 화학적으로 도입시킴으로써 초기 골유착을 증진시켜 임플란트 시술기간을 단축시키고 특히 저골질 및 골량이 부족한 환자에 대한 시술 성공률을 증대시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 올리고펩타이드를 저비용으로 임플란트 표면 전역에 균일하게 도입함으로서 BMP와 유사한 효율의 골 재생과 골유착 특성을 가지나 무기 코팅재료와 동일한 정도의 안정성을 가져 제조, 유통, 저장상의 추가 비용 부담이 적은 임플란트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반구조식을 가진 올리고펩타이드; (C 또는 K)-(I, K 또는 P)-(I, P 또는 K)-(K 또는 P)-(K, P 또는 S)-(P 또는 S)-(A 또는 S)-(A, P 또는 S)-(A, P 또는 T)-(E, P 또는 T)-(E, L 또는 T)-(E, L 또는 S)-(A, L 또는 S)-(A, I 또는 S)-(A, I 또는 S)-(I, M 또는 S)-(L, M 또는 S)-(C, L 또는 M)-의 구조를 특징으로 하는 골유착 및 골형성을 증진시키는 올리고펩타이드를 제공한다.

본 발명은 일반적인 임플란트에 적용가능한 올리고펩타이드에 관한 것인데, 본 명세서에서는 치과용 임플란트에 적용하는 올리고펩타이드를 중심으로 설명한다.

또한, 상기 치과 임플란트에 적용가능한 올리고펩타이드에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 임플란트 표면의 티타늄(Ti)과 안정한 상태로 도입되도록 하기 위하여 한쪽 말단에 -SH기를 가지는 아미노산 잔기를 추가할 수 있다. 구체적으로 (C, L 또는 Y)_n 구조의 잔기를 가지고, n은 1 또는 2인 것을 특징으로 하는 펩타이드가 보다 바람직하고, 더욱 바람직하게는 시스테인이다.

또한, 상기 올리고펩타이드는 올리고펩타이드간의 거리를 조골세포의 크기에 따라 제어하고, 상대적 배향을 조절할 수 있도록 담체(matrix)를 함께 도입하는 것이 바람직하다. 또한, 임플란트의 재질인 티타늄 표면에 링커가 전처리되어 있고, 상기 올리고펩타이드는 링커(linker)의 기능기와 결합을 위하여, N 또는 C 말단에 -SH기를 가지는 아미노산, 바람직하게는 시스테인 잔기가 도입된다

예컨대, 링커와 관련하여 본 발명의 올리고펩타이드는 각각 그 올리고펩타이드의 N말단에 자유 아미노기 또는 시스테인을 지니고 있어서 링커에 의한 임플란트로의 도입이 용이하다. 또한, 본 발명에서는 상기 올리고펩타이드가 임플란트 표면의 티타늄(Ti)과 안정한 상태로 도입되도록 하기 위하여 임플란트 표면에 silane-linker-peptide의 연결 관계로 도입되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 치과 임플란트에 적용가능한 올리고펩타이드에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 PEP111(서열번호 1), PEP121(서열번호 2), PEP131(서열번호 3), PEP112(서열번호 4), PEP122(서열번호 5), PEP132(서열번호 6) 및 PEP133(서열번호 7)로 이루어진 군중에서 선택된 올리고펩타이드인 것이 바람직하고, PEP111, PEP112 및 PEP122로 이루어진 군중에서 선택된 올리고펩타이드인 것이 보다 바람직하고, PEP111 또는 PEP122인 것이 더더욱 바람직하며, PEP111인 것이 가장 바람직하다.

골유착 및 골형성을 증진시키는 올리고펩타이드 서열을 선정(screening)하기 위하여 합성기(peptide synthesizer)를 사용하여 올리고펩타이드를 제작할 경우 합성에 소요되는 시간이 짧으므로 유효성 있는 올리고펩타이드 서열의 선정에 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다.

본 발명에 따른 올리고펩타이드는 이 기술분야에서 당업자들에게 알려진 방법에 따라 쉽게 합성이 가능하다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 올리고펩타이드는 (주)펩트론에 의뢰, 합성하였다.

올리고펩타이드는 천연 단백질 또는 재조합 단백질과 비교하여 구조적으로 우수한 안정성을 가지므로 멸균 및 보관에 대한 안전성을 확보할 수 있을 것으로 판단된다. 따라서, 골유착을 증진시키는 천연 단백질의 활성과 동등 내지 그 이상의 효과를 가지는 본 발명의 올리고펩타이드는 임플란트 표면에 적용시킬 경우 조골세포의 초기 부착, 증식 및 분화에 중요한 역할을 수행하게 될 것이며 최종적으로 골유착 기간을 획기적으로 단축시키고 특히 현재까지 임플란트 시술이 어려운 저골질 환자를 대상으로 시술 영역을 확대시키는데 대단히 유용할 것으로 예측한 다.

또한 본 발명은 상기 올리고펩타이드를 차폐막 및 임플란트의 표면에 적용시킬 경우, 표면에 단위면적당 0.1～5.0 mg이 도입되도록 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 올리고펩타이드는 10～21개의 아미노산 함량을 지니며 이들은 임플란트의 표면단위 면적당 0.1～3.0 mg 적용이 적당하다.

본 발명에 따른 올리고펩타이드는 종래에 공지된 방법(예컨대 상기 언급한 관련 특허출원) 또는 본 발명의 방법에 따라 임플란트 표면에 적용할 수 있다. 이때, 매트릭스나 링커의 사용이 가능하다. 상기 종래 출원에는 임플란트 표면의 개질방법, 가교제의 이용방법, 매트릭스의 이용방법, silane-linker-peptide 연결 방법, 올리고펩타이드의 코팅방법 등이 기재되어 있다.

본 발명에 사용된 바람직한 올리고펩타이드 서열의 구성은 다음과 같다.

서열번호 1 : R1-CKIPKPSSAPTELSAISMLYL-R2

서열번호 2 : R1-CIPKPSSAPTELSAISMLYL-R2

서열번호 3 : R1-CPKPSSAPTELSAISMLL-R2

서열번호 4 : R1-KIPKPSSAPTELSAISMLYLC-R2

서열번호 5 : R1-KIPKPSSAPTELSAISMLYC-R2

서열번호 6 : R1-KIPKPSSAPTELSAISMLC-R2

서열번호 7 : R1-KIPKPSSAPTELSAISMC-R2

이때, N 또는 C 말단에 시스테인(cysteine) 잔기를 도입함으로써 Ti 표면에 전처리되어 있는 링커기와 용이하게 결합할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 상기 1문자 코드는 이 기술분야에서 통용되는 문자코드이며, 그 내용은 아래와 같다.

single-letter code	abbreviation	full name
A	Ala	Alanine
R	Arg	Alginine
N	Asn	Asparagine
D	Asp	Aspartic acid
C	Cys	Cysteine
Q	Gln	Glutamine
E	Glu	Glutamic acid
G	Gly	Glycine
H	His	Histidine
I	Ile	Isoleucine
L	Leu	Leucine
K	Lys	Lysine
M	Met	Methionine
F	Phe	Phenylalanine
P	Pro	Proline
S	Ser	Serine
T	Thr	Threonine
W	Trp	Tryptophan
Y	Tyr	Thyrosine
V	Val	Valine

본 발명의 올리고펩타이드는 골충진제 대체 효과, 수직 방향으로의 골형성이 증진되는 수직 치료 효과 및 수평 방향으로의 골형성이 증진되는 수평 치료 효과를 나타낸다. 이를 이용한 임플란트는 임플란트 표면에 박막 처리된 올리고펩타이드의 지속적인 작용으로 인한 조골세포의 유인, 기능 증가를 유발시킴으로써 초기 골유착 기간 단축, 저골질 환자의 시술 성공률 증대, 골량이 부족한 경우 골충진제 없이 골형성 가능, 시술 비용 절감을 가져올 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

< 실시예 1> TiO ₂ 산화막 및 기판 제작

본 발명자들은 본원발명에 앞서 이미 양극산화법에 의한 TiO₂ 산화막 개발을 완료하여 양극산화에 의한 표면처리 제품(GSII CellNest)을 완성하였다. 종래 이와 동일한 방법은 Straumann 社의 표면처리방법이 알려져 있다.

구체적으로, 양극산화법(anodic oxidation)은 전기화학적으로 티타늄(titanium) 표면에 산화피막을 형성시키는 것으로 티타늄의 표면에 미세기공 형태의 산화막을 형성시켜 porous한 분화구 모양의 기공을 가지는 Ra 0.8～1.2의 표 면거칠기 및 표면적을 증대시켰다. 산화층의 두께를 2～8 ㎛로 조절함으로써 티타늄의 금속이온 방출을 억제하고 부식저항을 증가시켜 안전성을 부여하였다. 본 실시예에서 TiO ₂ 산화막은 이와 같은 양극산화법에 의하여 표면처리 제품(GSII CellNest)을 사용하였다.

< 실시예 2> 골유착 및 골형성을 증진시키는 올리고펩타이드의 설계 및 제작

본 발명자들은 BMP-2(Bone morphogenetic protein), 피브로넥틴(fibronectine), 비토로넥틴(vitronectine)의 전체 아미노산 서열(whole amino acid sequence)중에서 골아세포(osteoblast)의 증식 및 분화에 핵심적인 역할을 하는 아미노산 서열 중에서 이들 서열의 일부를 변형(modification)시켜 합성기(peptide synthesizer)를 이용하여 올리고펩타이드를 제작하였다. 합성이 종결된 반응물은 HPLC를 수행하여 목적 산물(올리고펩타이드)을 95% 이상의 순도로 정제하였으며 정제된 물질에 대해 NMR로 분자량을 확인하였다.

<2-1> 후보 물질의 설계

골형성에 관여하는 성장인자(growth factor), 세포외 기질(extracellular matrix) 등과 같은 단백질 중에서 특히 골아세포의 초기 부착, 증식 및 분화에 관여하는 물질을 조사하고 이들 단백질의 전체 아미노산 서열 중에서 핵심적인 역할을 하는 서열을 분석하였다. BMP-2(Bone morphogenetic protein-2)의 경우, 골형 성세포인 골아세포의 특이적 결합부위(specific binding site)가 존재하며 ECM의 경우 일부 서열이 세포부착에 관여한다는 점에 착안하여 이들 서열을 토대로 재조합 올리고펩타이드를 설계하여 골아세포가 실제 단백질처럼 올리고펩타이드 서열을 인식하고 부착, 증식 및 분화를 유도할 수 있도록 아미노산 서열을 설계하였다. 제작된 올리고펩타이드에 대한 세포유효성 평가는 실시예 3에 기술하였다.

<2-2> 올리고펩타이드의 제작

올리고펩타이드의 제작은 (주)펩트론에 의뢰하였으며 펩타이드의 합성은 Fmoc/tBu 방법에 의하며, 합성 종결 후 HPLC를 수행하여 95% 이상의 순도로 정제하였다. 최종 정제된 물질의 분자량은 NMR로 확인하였다.

구체적으로, 선정된 올리고펩타이드 서열은 다음과 같다.

1. PEP111(서열번호 1) : R1-CKIPKPSSAPTELSAISMLYL-R2

2. PEP122(서열번호 5) : R1-KIPKPSSAPTELSAISMLYC-R2

아래에서는 상기 펩타이드들에 대하여 활성의 우수성을 측정하였다.

< 실시예 3> 올리고펩타이드 물질의 세포유효성 평가 1 : in - vitro test

올리고펩타이드 말단에 코팅을 위한 시스테인 잔기를 도입하여 제작된 물질에 대한 유효성을 분석하기 위하여 세포배양 플레이트에 상에서 골아세 포(osteoblast-like cell line MG63)의 분화능에 기초하여 세포유효성 평가를 실시하였다.

<3-1> 올리고펩타이드 처리 방법

1uM (in D.W.) 농도의 올리고펩타이드 용액을 세포배양 플레이트 (24 well culture plate)에 1ml씩 가하여 37℃, CO₂ incubator에서 3시간 경과 후, 올리고펩타이드 용액을 제거하고 세포배양 플레이트를 PBS 용액으로 1회 세척한 후 클린벤치 안에서 자연건조 시켰다.

<3-2> 세포부착능 평가

올리고펩타이드 및 양성대조군인 BMP-2 가 코팅된 세포배양용 플레이트(24 well culture plate)에 MG63을 1×10⁵ cells씩 분주하여 37℃, CO₂ incubator에서 2시간 동안 세포를 부착시켰다. 세포 부착은 10% fetal bovine serum을 제외한 DMEM 배지(serum free media)를 사용하였다. 2시간 후 부착되지 않은 세포를 PBS buffer(pH 7.2)로 제거하고 10% formaldehyde(in PBS buffer, pH 7.2) 용액을 1ml 가하여 세포를 고정시켰다. 각 culture plate에 부착된 세포를 정량하기 위하여 0.04% cresyl violet(in 20% methanol)을 각 well당 300μl 가한 후 실온에서 30분간 반응시켜 각 well에 부착된 세포의 nucleic acid를 염색시켰다. D.W.로 3회 disc를 세척함으로써 반응하지 않은 염색액을 제거시킨 후 0.1M citric acid(in 50% ethanol) 300μl 가하여 nucleic acid와 결합된 염색액을 용출시켜 부착 정도를 측정하였다. (도 2)

<3-3> 증식능 평가

올리고펩타이드 및 양성대조군인 BMP-2 가 코팅된 세포배양용 플레이트(24 well culture plate)에 MG63 1×10⁵ cells씩 분주하여 37℃, CO₂ incubator에서 2시간 동안 세포를 부착시켰다. 세포 부착은 10% fetal bovine serum을 제외한 DMEM 배지(serum free media)를 사용하였다. 2시간 후 부착되지 않은 세포를 PBS buffer(pH 7.2)로 제거하고 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM 배지를 가한 후 37℃, CO₂ incubator에 5일간 배양하였다. 배양 2일마다 fresh media로 교체하였으며 배양 1, 3, 5일째 CellTiter 96^TM Aquous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit를 사용(Promega Co. USA)하여 증식 정도를 비교하였다. (도 3)

<3-4> 분화능 평가

골형성세포의 분화 초기 마커인 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 비교하여 올리고펩타이드가 골형성세포의 분화에 미치는 영향을 관찰하였다. 골형성세포의 분화능을 비교하기 올리고펩타이드 및 양성대조군인 BMP-2 가 코팅된 세포배양용 플레이트(24 well culture plate)에 MG63을 well당 1×10⁵ cells씩 분주하여 37℃, CO₂ 배양기에 배양하였다. 배양 2일마다 신선한 media로 교체하였으며 배양 3일째, 8일째 ALP 활성을 비교하였다. (도 4)

< 실시예 4> 올리고펩타이드 물질의 유효성 평가 2 : in - vivo test

임플란트 표면에 올리고펩타이드를 물리적으로 흡착시키는 방법(dip&dry)으로 동물실험을 수행하였다. 샘플을 제작하기 위하여 100uM 농도의 올리고펩타이드 용액 200㎕에 임플란트 1개씩 담그고 이를 37℃, 배양기에 3시간 처리하였다. 반응 종료 후 남아있는 반응액은 클린벤치 안에서 임플란트 표면에 골고루 도포한 후 자연 건조시켰다.

비코팅된 고정체(uncoated fixture), BMP-2 코팅된 고정체(dip&dry)를 대조군으로 올리고펩타이드 물질에 의한 골형성능을 비교하였다.

<4-1> bone defect model 의 형성 : 모식도

Bone defect 모델의 개요도는 도 5와 같다.

<4-2> micro - pig 하악 결손 모델에서의 골형성능 비교

Mini pig 8마리 양쪽 하악골의 치아를 발치한 후 3 개월간 치료시켰다. 치료된 피질골 부위에 인위적으로 동일한 골결손부를 형성시키고 올리고펩타이드(PEP111, PEP122)가 코팅된 임플란트(dip & dry)와 대조군을 식립하고 2, 4주 후 생검을 통하여 BA (bone area ratio)를 측정하여 골형성능을 비교하였다.

구체적으로, 도 6과 같이 bone defect 모델에서 비처리, BMP-2 처리된 군을 음성, 양성 대조군으로 하여 올리고펩타이드 처리군에 대한 골재생 유도능을 분석한 결과, 2, 4주째 음성대조군인 비처리 군과 비교하여 올리고펩타이드가 처리된 군에서 골형성능이 현저하게 향상되었음을 관찰하였다. (도 6 및 도 7)

즉, PEP111 올리고펩타이드 물질에 의한 골재생 효과가 우수함을 보여주는 결과이다.

< 실시예 5> 타 group 연구와의 비교

기존에 잘 알려진 올리고펩타이드 서열인 RGD 대비 PEP111의 세포유효성을 비교 분석하기 위하여 세포부착능 (cell adhesion assay) 및 분화능을 비교평가 하였다. 분석 방법은 앞선 실시예 3 방법과 동일하게 수행되었다. 특히 분화능의 지표가 되는 APL activity에서는 RGD 서열보다 PEP111 서열이 우수함을 확인할 수 있었다.(도 8)

도 1은 치과 임플란트의 형상 및 각 부분의 명칭을 나타낸 것이고,

도 2는 올리고펩타이드 물질에 대한 세포부착능 (cell adhesion assay)을 비교한 그래프이고,

도 3은 올리고펩타이드 물질에 대한 증식능 (MTS assay)를 비교한 그래프이고,

도 4는 올리고펩타이드 물질에 대한 분화능 (ALP assay)을 비교한 그래프이고,

도 5는 골손상 모델 (Bone defect model) 모식도이고,

도 6은 골손상 모델 (Bone defect model)에서 2, 4주째 골형성능을 비교한 그래프이고,

도 7은 골손상 모델 (Bone defect model)에서 BMP-2 코팅된 고정체(dip&dry) 및 올리고펩타이드 물질 (dip&dry) 처리군의 2주째 조직 시편 그림이고,

도 8은 기존의 RGD 서열과 대비한 본 발명의 올리고펩타이드 (PEP111)의 분화능 (ALP assay)을 비교한 그래프이다.

<110> A, b <120> Synthetic Peptide for Dental Implant Reducing Bone Adhering Period <130> c <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP111 <220> <221> ACT_SITE <222> (21) <400> 1 Cys Lys Ile Pro Lys Pro Ser Ser Ala Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile 1 5 10 15 Ser Met Leu Tyr Leu 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP121 <220> <221> ACT_SITE <222> (20) <400> 2 Cys Ile Pro Lys Pro Ser Ser Ala Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser 1 5 10 15 Met Leu Tyr Leu 20 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP131 <220> <221> ACT_SITE <222> (18) <400> 3 Cys Pro Lys Pro Ser Ser Ala Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met 1 5 10 15 Leu Leu <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP112 <220> <221> ACT_SITE <222> (21) <400> 4 Lys Ile Pro Lys Pro Ser Ser Ala Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser 1 5 10 15 Met Leu Tyr Leu Cys 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP122 <220> <221> ACT_SITE <222> (20) <400> 5 Lys Ile Pro Lys Pro Ser Ser Ala Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser 1 5 10 15 Met Leu Tyr Cys 20 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP132 <220> <221> ACT_SITE <222> (19) <400> 6 Lys Ile Pro Lys Pro Ser Ser Ala Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser 1 5 10 15 Met Leu Cys <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEP133 <220> <221> ACT_SITE <222> (18) <400> 7 Lys Ile Pro Lys Pro Ser Ser Ala Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser 1 5 10 15 Met Cys

Claims

삭제
삭제
삭제
서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 생체 내에서 사용되기 위한 올리고 펩타이드.
제4항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드가 서열번호 1의 PEP111임을 특징으로 하는, 올리고 펩타이드.
제4항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드가 서열번호 5의 PEP122임을 특징으로 하는, 올리고 펩타이드.
제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 -SH 기를 가지는 아미노산 서열인 (C, L 또는 Y)n 구조의 잔기를 추가적으로 가지고, n은 1 또는 2인 것을 특징으로 하는 골유착 및 골형성을 증진시키는 올리고 펩타이드.
제7항에 있어서, 상기 올리고 펩타이드의 C-말단에 시스테인이 추가되는 것을 특징으로 하는 올리고 펩타이드.