KR100757241B1 - 골조직 형성 증진 펩타이드가 함유된 골이식재 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 골형성 증진을 위한 생리활성 펩타이드와 그 펩타이드를 함유하는 치과용 및 정형외과용 골이식재에 관한 것으로, 보다 구체적으로 골형성단백질 및/또는 세포외 기질에서 유래된 펩타이드의 N-말단에 CEEEEEEEGG가 부가된 펩타이드를 그 내부에 함유하는 골이식재에 관한 것이다.
본 발명의 골이식재에 함유된 골조직 형성 증진 펩타이드는 재생에 관련된 세포의 이행, 증식 및 분화를 촉진하여 최종적으로 조직재생력을 극대화시킬 수 있으며, 분자량이 적어 체내에 적용시 면역반응의 위험이 적고, 체내에서 안정한 형태로 존재할 수 있어 약효의 지속화가 가능하여 치과용 또는 정형외과용의 골조직 재생 수술시 용이하여 수술 편의성이 우수하며 또한 높은 치료효과를 기대할 수 있다.
골형성 단백질, 세포외기질, 펩타이드, 골이식재, 골재생력

Description

골조직 형성 증진 펩타이드가 함유된 골이식재{Bone Graft Containing Osteogenesis Enhancing Peptides}
도 1은 실시예 1 및 실시예 2에 의해 제조된 펩타이드 함유 골이식재에 대한 세포 부착양상을 나타낸 공초점 주사형광현미경 사진으로서, 도 1a는 펩타이드가 포함되지 않은 골이식재에 대한 세포 부착양상을 나타낸 것이고, 도 1b는 골형성 단백질 유래 펩타이드가 포함된 골이식재에 대한 세포 부착양상을 나타낸 것이며, 도 1c는 세포외 기질 유래 펩타이드를 함유한 골이식재에 대한 세포 부착양상을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1 및 실시예 2에 의해 제조된 펩타이드 함유 골이식재에 C2C12를 칼세인(calcein)이 포함된 경조직 형성 배지에서 14일 동안 배양하고 칼슘의 침착 정도를 공초점 주사 형광현미경으로 관찰한 사진으로서, 도 2a는 펩타이드가 포함되지 않은 골이식재에 대한 석회화 정도를 나타낸 것이고, 도 2b는 골형성단백질 유래 펩타이드가 포함된 골이식재에 대한 석회화 정도를 나타낸 것이며, 도 2c는 세포외 기질 유래 펩타이드를 함유한 골이식재에 대한 석회화 정도를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1 및 실시예 2에 의해 제조된 펩타이드 함유 골이식재를 가토 의 두개골 결손부에 이식한 후 골재생 효과를 나타낸 것으로서, 도 3a는 펩타이드가 함유되지 않은 골이식재를 나타낸 것이고, 도 3b 및 3c는 골형성 단백질 및 세포외 기질 유래 펩타이드를 함유한 골이식재를 나타낸 것이다.
본 발명은 골형성 증진을 위한 생리활성 펩타이드를 내부에 함유하는 골이식재에 관한 것으로, 보다 구체적으로 골형성 단백질(bone morphogenetic protein) 및/또는 세포외 기질(extracellular matrix)에서 유래된 생리활성 펩타이드의 N-말단에 CEEEEEEEGG가 부가된 펩타이드를 그 내부에 함유하는 골이식재에 관한 것이다.
구강악안면 영역 및 정형외과 영역에서는 감염, 노화에 따른 기능 퇴화, 외상, 낭종, 종양 등 다양한 원인에 의해 골결손부가 발생하고 있다. 이러한 골결손부의 심미적, 기능적 회복, 안정 및 치유를 증진시키기 위해 골이식술이 다양한 방법으로 시도되어 왔다. 골이식의 목적은 골의 생역학적 역할을 유지하게 하는 골의 형태학적, 생리학적 기능을 복원시키는데 있으므로, 골이식재료는 즉시 사용이 가능하고, 면역반응을 일으키지 않으며, 빠른 골생성 및 재혈관화를 촉진하고 골의 지지와 연속성을 유지하는 등의 기본적인 조건을 만족시킬 수 있어야 한다. 특히 골재생에서 임플란트와 같이 병용하여 활용되는 사례가 대부분인데 이와 관련해서는 골유착을 증진시키면서 식립체의 안정성을 제공할 수 있는 적절한 생활력이 있는 이식재가 이상적이라고 할 수 있다.
최근까지 이러한 골재생 이식술에 있어 가장 빈번하게 활용되는 이식재는 자가골, 동종골, 이종골, 합성 골이식 재료가 있는데 자가골은 골채취를 위한 이차적인 수술 필요 등 수득이 어려운 단점이 있고 동종골의 경우 질환의 전염가능성 등의 어려움으로 이종골, 합성골이 많이 활용되고 있다. 예로, 소뼈를 여러 단계로 처리하여 골이식재로 생산한 제품이 여러 종류 시판되고 있으며 합성에 의해 수산화인회석 결정분말을 골이식재로 생산하는 제품도 시판되고 있다. 이중 국내 골이식재 시장에서 가장 많은 부분을 차지하는 것이 소뼈에서 유래되어 생산한 이종골이식재이며, Bio-Oss (Geistlich Sohne사, 스위스)가 50%이상을 차지하고 있고, Capset (Lifecore, 미국), Bio-Gen (BioTek, 이탈리아)이 그 다음이며 국내 생산품으로 BBP（오스코텍, 한국) 등이 골이식재의 시장을 형성하고 있다.
그러나, 이러한 기존 제품은 자체가 골전도성을 가지는 매개체로서의 역할은 할 수 있어도 치료기간의 단축을 위해 필수적인 초기 골형성을 위한 골유도력은 지니고 있지 않아 수술후 상당기간 후에 골형성을 기할 수 있는 제한점을 지니고 있었다. 이러한 단점을 보완하기 위해 골이식재의 술식과 함께 세포외 기질 단백질, 조직성장인자나 골형성 단백질과 같은 화학 주성을 지니는 생리활성 물질이 실험실적으로 활용이 되어 빠른 골형성력을 제공하였으나, 이는 상대적으로 고가이고 또한 단백질에 의한 면역반응이나 단백질의 짧은 체내 반감기, 체내 적용시 전신혈로 노출되어 국소에서 유효한 농도를 유지하기 어려웠던 단점 및 부작용 등이 제기되어 이를 극복할 수 있는 신기술이 필요한 상황이다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 골형성 단백질의 활성부위 및/또는 세포외 기질에서 유래된 펩타이드의 N-말단에 CEEEEEEEGG가 부가된 펩타이드를 그 내부에 함유하는 골이식재가 재생에 관련된 세포의 골조직으로의 분화속도를 증가시키고, 최종적으로 조직재생력을 극대화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 분자량이 적어 체내에 적용시 면역반응의 위험이 적고, 체내에서 안정한 형태로 존재할 수 있어 약효의 효과를 지속시킬 수 있는 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 골조직 재생을 촉진하기 위해 골형성 단백질 및/또는 세포외기질 유래 펩타이드의 N-말단에 CEEEEEEEGG가 부가된 펩타이드를 그 내부에 함유하는 치과용 및 정형외과용 골이식재를 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 1 내지 35의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 서열; 및 (b) 서열번호 1 내지 35의 아미노산 서열에서 선택된 어느 2개가 연결된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 아미노 산 서열의 N-말단에 서열번호 36의 아미노산 서열이 부가되어 있는 펩타이드가 그 내부에 함유되어 있는 골이식재를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 골이식재는 상기 펩타이드 용액에 골이식재를 침적시켜 수득되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 골이식재로는 당해 분야에서 사용하는 모든 종류 및 형태의 골이식재를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 자가골, 소뼈 및 돼지뼈에서 기인한 생물유래 골미네랄 분말 및 다공성 블록, 합성 수산화아파타이트 분말 및 다공성 블록, 트리칼슘인산 분말 및 다공성 블록, 모노칼슘인산 분말 및 다공성 블럭, 이산화 규소 (실리카) 또는 실리카와 고분자의 혼합체로 이루어진 골충진 이식재 등이 있다.
이하, 본 발명에 따른 골형성 단백질 및/또는 세포외 기질 유래 펩타이드를 함유하는 골이식재에 대하여 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명에 따르는 펩타이드를 개발하기 위하여, 골형성 단백질 및 세포외 기질에서 활성부위의 아미노산 배열을 분리추출하고, 추출 후에 화학적 수식을 거쳐 활성구조를 유지하도록 한다. 상기 펩타이드는 골형성 단백질 유래 및/또는 세포외기질 유래 펩타이드의 N-말단에 서열번호 36의 아미노산 서열(시스테인, 7개의 글루타민산 및 2개의 글리신으로 구성된 CEEEEEEEGGG)이 화학적으로 부가되어 있으므로, 골이식재를 구성하는 칼슘에 대한 친화력을 증가시켜 골이식재 내의 함유량을 증가시킨다.
이때, 상기 골형성 단백질 유래 및/또는 세포외 기질 유래 펩타이드는 바람 직하게는 서열번호 1 내지 35의 아미노산 서열 중 어느 하나 또는 그 이상이 연결되어 합성된 것일 수 있으며, 또는 서열번호 1 내지 35의 아미노산 서열 중 선택된 어느 2개가 연결되어 합성된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 골형성 단백질 유래 펩타이드는 (a) 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)-2, 4 및 6의 아미노산 서열 중 각각 2-18위치의 아미노산 서열[BMP-2의 경우 (서열번호1), BMP-4의 경우(서열번호 2) 및 BMP-6의 경우 (서열번호 3)] BMP-2의 16-34위치의 아미노산 서열 (서열번호 4), 47-71위치의 아미노산 서열 (서열번호 5), 73-92위치의 아미노산 서열 (서열번호 6), 88-105위치의 아미노산 서열 (서열번호 7), 83-302위치의 아미노산 서열 (서열번호 8), 335-353위치의 아미노산 서열 (서열번호 9) 및 370-390위치의 아미노산 서열 (서열번호 10); BMP-4의 74-93위치의 아미노산 서열 (서열번호 11), 293-313위치의 아미노산 서열 (서열번호 12), 360-379위치의 아미노산서열 (서열번호 13) 및 382-402위치의 아미노산서열 (서열번호 14) BMP-6의 91-110위치의 아미노산서열 (서열번호 15), 397-418위치의 아미노산서열 (서열번호 16), 472-490위치의 아미노산서열 (서열번호 17) 및 487-510위치의 아미노산서열 (서열번호 18) 및 BMP-7의 98-117위치의 아미노산서열 (서열번호 19), 320-340위치의 아미노산 서열 (서열번호 20), 390-409위치의 아미노산 서열 (서열번호 21) 및 405-423위치의 아미노산 서열 (서열번호 22); 중 어느 하나의 아미노산 서열을 필수적으로 함유하도록 한다.
또한, 세포외 기질 유래 펩타이드의 경우 (b) bone sialoprotein II(BSP II)의 62-69위치의 아미노산 서열 (서열번호 23), 139-148위치의 아미노산 서열 (서열 번호 24), 259-277위치의 아미노산 서열 (서열번호 25), 199-204위치의 아미노산 서열 (서열번호 26), 151-158위치의 아미노산 서열 (서열번호 27), 275-291위치의 아미노산 서열 (서열번호 28), 20-28위치의 아미노산 (서열번호 29), 65-90위치의 아미노산 서열 (서열번호 30), 150-170위치의 아미노산 (서열번호 31) 및 280-290위치의 아미노산 서열 (서열번호 32);
(c) bone sialoprotein I(BSP I, osteopontin)의 149-169 위치의 아미노산 서열 YGLRSKS (서열번호 33), KKFRRPDIQYPDAT (서열번호 34), YGLRSKSKKFRRPDIQYPDAT (서열번호 35) 중 어느 하나의 아미노산 서열을 필수적으로 함유하도록 한다.
상기 제조된 펩타이드는 골이식재를 펩타이드 용액에 침적시켜서 골이식재의 내부에 펩타이드를 물리적으로 함유시킴으로써 본 발명에 따른 골형성 단백질 및/또는 세포외 기질 유래 펩타이드를 함유하는 골이식재를 완성한다.
본 발명에 따른, 상기 펩타이드는 골형성 단백질 또는 세포외 기질 자체보다 분자량이 작으므로 체내 효소반응에 민감하지 않고, 체내 면역원성도 낮고, 안정성이 높으므로 취급이 용이하므로 펩타이드를 조직 재생용 골이식재에 함유시켜 술식에 이용하는 경우, 원하는 농도의 활성 펩타이드가 국소에서 존재하면서 활성을 나타내어 치료효과를 증가할 수 있어 골조직 및 치주조직 재생 치료에 적합한 특징을 갖는다.
또한, 상기 펩타이드는 골이식재에 단위무게당(1g) 10-100mg이 함유되도록 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 펩타이드는 서열번호 1과 2를 사용 하여, 이 펩타이드는 골이식재의 단위무게당 20-80mg을 함유시킨다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 소뼈 유래 골미네랄 입자에 골형성 단백질 유래 펩타이드의 함유
본 실시예에서 사용한 골형성 단백질 유래 펩타이드는 골형성 단백질 (BMP-2)의 활성 도메인을 함유하는 펩타이드인 서열번호 4의 아미노산서열 N-말단부위에 서열번호 36을 부가하여 화학적으로 합성된 펩타이드를 사용하였다. 소뼈 유래 골미네랄 입자를 에탄올로 감압세척 후 100℃, 진공오븐에서 20시간 정치하여 표면의 불순물을 제거하였다. 상기 제조된 펩타이드 80 mg을 3차 증류수 1 mL에 용해한 후, 소뼈 유래 미네랄 1 g에 가하고 24시간 동안 침적시킨 후, 건조하였다.
실시예 2: 합성 수산화 아파타이트 및 트리칼슘인산에 골형성 단백질 유래 펩타이드의 함유
합성수산화 아파타이트 및 트리칼슘인산 골이식재 분말을 에탄올 감압 세척한 후 100℃, 진공오븐에서 20시간 정치하여 표면의 불순물을 제거하였다. 상기 실시예 1과 동일한 펩타이드 80 mg을 3차증류수 1 mL에 용해한 후, 합성 수산화 아파 타이트 및 트리칼슘인산 1 g에 가하고 24시간 동안 침적시킨 후, 건조하였다.
실시예 3: 소뼈유래 골미네랄 입자에 세포외 기질 유래 펩타이드의 함유
본 실시예에서 사용한 세포외 기질 유래 펩타이드는 bone sialoprotein II의 석회화유도 활성 도메인구조를 포함하는 펩타이드인 서열번호 25의 펩타이드와 세포부착기능부위를 포함하는 펩타이드인 서열번호 27의 펩타이드를 화학적으로 합성하고, 상기 합성된 펩타이드의 N-말단부위에 서열번호 36을 부가하여 화학적으로 합성된 펩타이드를 사용하였다. 소뼈 유래 골미네랄 입자를 에탄올로 감압세척 후 100℃, 진공오븐에서 20시간 정치하여 표면의 불순물을 제거하였다.상기 제조된 펩타이드 80 mg을 3차증류수 1 mL에 용해한 후, 소뼈 유래 미네랄 1 g에 가하고 24시간 동안 침적시킨 후, 건조하였다.
실시예 4: 합성 수산화 아파타이트 및 트리칼슘인산에 세포외 기질 유래 펩타이드의 함유
합성수산화 아파타이트 및 트리칼슘인산 골이식재 분말을 에탄올 감압 세척한 후 100℃, 진공오븐에서 20시간 정치하여 표면의 불순물을 제거하였다. 상기 실시예 3과 동일한 펩타이드 80 mg을 3차 증류수 1 mL에 용해한 후, 합성 수산화 아파타이트 및 트리칼슘인산 1 g에 가하고 24시간 동안 침적시킨 후, 건조하였다.
실험예 1: 본 발명에 따른 펩타이드가 포함된 골이식재에 의한 세포부착력
실시예 1에서 제조된 펩타이드와 실시예 3에서 제조된 합성 펩타이드를 함유하는 각각의 골이식재에 골아세포(Human osteosarcoma cell, 한국세포주은행, KCLB No. 21543)를 접종한 후 각각 2시간 동안 배양하였다. 골아세포가 배양된 골이식재를 2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 고정된 골이식재를 1% 트리톤 엑스 100 (triton X-100)으로 처리한 수 DAPI로 부착된 세포핵을 염색하였다. 골이식재에 부착된 세포를 공초점 주사형광 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)으로 관찰하였다 (도 1).
도 1에서 (a)는 펩타이드가 포함되지 않은 골이식재에 대한 세포 부착양상을 나타낸 것이고, (b)는 골형성 단백질 유래 펩타이드, (c)는 세포외 기질 유래 펩타이드가 포함된 골이식재에 대한 세포 부착양상을 나타낸 것이다. 세포부착 결과, 펩타이드가 포함되지 않은 골이식재(a)보다 서열번호 4의 펩타이드가 포함된 골이식재(b)와 서열번호 25와 27의 펩타이드가 포함된 골이식재(c)에서 염색된 세포핵이 더 많이 관찰되어 세포가 안정적으로 부착되어 있음을 관찰할 수 있었다 (원형표시부분).
실험예 2: 본 발명에 따른 펩타이드가 포함된 골이식재에 의한 석회화
실시예 1에서 제조된 펩타이드와 실시예 3에서 제조된 합성 펩타이드를 함유한 각각의 골이식재에 중배엽기원 줄기세포 C2C12(America Type Culture Collection, CRL-1772)를 칼세인(1 ㎍/㎖, 칼슘염색 형광물질)이 포함된 경조직 형성 배지에서 14일 동안 배양하였다. 배양된 골아세포를 2% 글루타르알데히 드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 고정된 골이식재를 1% 트리톤 엑스 100 (triton X-100)으로 처리한 후 팔로이딘 용액을 첨가하여 부착된 세포질을 염색하였다. 염색 후 세척하여 시편을 고정한 후 세포외 기질에 침착된 칼슘을 고정된 골이식재 표면에서 공초점 주사형광 현미경 (Confocal Laser Scanning Microscope)으로 관찰하였다(도 2).
도 2에서 (a)는 펩타이드가 포함되지 않은 골이식재에 대한 석회화 정도를 나타낸 것이고, (b)는 골형성 단백질 유래 펩타이드, (c)는 세포외 기질 펩타이드가 포함된 골이식재에 대한 석회화 정도를 나타낸 것이다. 펩타이드가 포함되지 않은 골이식재 (a)보다 서열번호 4의 펩타이드가 포함된 골이식재 (b)와 서열번호 25와 27의 펩타이드를 함유한 골이식재 (c)에 더 많은 칼슘의 형광이 나타난 것으로 보아, 골형성 단백질 및 세포외 기질 유래 펩타이드가 세포의 석회화를 촉진하는 것을 알 수 있었다.
실험예 3: 본 발명에 따른 펩타이드가 포함된 골이식재에 의한 토끼 두개골 재생효과
실시예 1에서 제조된 펩타이드와 실시예 3에서 제조된 합성 펩타이드를 함유한 골이식재를 토끼의 두개골 원형골결손부에서 이식하여 골재생력을 확인하였다. 마취시킨 토끼(Newzealand White rabbit, 종명: cuniculus)의 두개골부위에 직경 8㎜의 원형골결손부를 형성시키고, 상기 골결손부에 골이식재 및 펩타이드가 포함된 골이식재를 결손부당 50 mg씩 이식하고, 골막과 피부를 이중봉합하였다. 이식 2주 후에 동물을 희생시키고, 채취한 표본은 포르말린 용액에 넣어 고정시킨 후 조직을 포매하여 두께 20 ㎛의 시편으로 제작하였다. 제작된 시편은 염기성 푹신과 톨루이딘 블루로 염색하여 비탈회 표본을 제작하였다. 제작된 표본은 광학현미경으로 관찰하여 사진 촬영을 실시하였다.
도 3은 골형성 단백질 및 세포외 기질 유래 펩타이드가 포함된 골이식재에 의한 골재생효과를 나타낸 것으로, 펩타이드를 함유하지 않은 골이식재 (a)에 비하여, 본 발명에 따른 골형성 단백질 및 세포외 기질 유래 펩타이드를 함유한 골이식재를 토끼의 두개부 결손에 적용한 경우, 2주 이내에도 현저한 골재생력을 보이는 것을 확인할 수 있었다 (도 3b, c).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
본 발명은 골조직 재생을 촉진하기 위해 골형성 단백질 및/또는 세포외기질 유래 펩타이드의 N-말단에 CEEEEEEEGG가 부가된 펩타이드를 그 내부에 함유하는 치과용 및 정형외과용의 골이식재를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 골형성 단백질 및/또는 세포외 기질 유래 펩타이드의 N-말단에 CEEEEEEEGG가 부가된 펩타이드를 함유한 골이식재는 재생에 관련된 세포의 골조직으로의 분화속도를 증가시키고, 최종적으로 조직재생력을 극대화시킬 수 있다. 또한 상기 펩타이드는 분자량이 적어 체내에 적용시 면역반응의 위험이 적고, 체내에서 안정한 형태로 존재할 수 있어 약효의 지속화가 가능하여, 치주조직, 치조골재생 및 기타 골조직 재생 수술시 용이하여 수술 편의성이 우수하며 또한 높은 치료효과를 기대할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

  1. 다음으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열의 N-말단에 서열번호 36의 아미노산 서열이 부가되어 있는 펩타이드가 그 내부에 함유되어 있는 골이식재:
    (a) 서열번호 1 내지 35의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 서열; 및
    (b) 서열번호 1 내지 35의 아미노산 서열에서 선택된 어느 2개가 연결된 아미노산 서열.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 용액에 골이식재를 침적시켜 수득되는 것을 특징으로 하는 골이식재.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 골이식재는 생물유래 골미네랄의 분말 및 다공성 블록, 합성 수산화아파타이트의 분말 및 다공성 블록, 트리칼슘인산의 분말 및 다공성 블록, 모노칼슘인산의 분말 및 다공성 블럭, 이산화 규소 (실리카)로 이루어진 골이식재, 실리카와 고분자의 혼합체로 이루어진 골충진 이식재로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골이식재.
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