JP5616973B2

JP5616973B2 - 造骨細胞の分化能を高めるオリゴペプチド

Info

Publication number: JP5616973B2
Application number: JP2012543002A
Authority: JP
Inventors: チョンカン，ウン; グァンオム，テ; オクチェ，ギュ
Original assignee: Osstem Implant Co Ltd
Current assignee: Osstem Implant Co Ltd
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2014-10-29
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: JP2013512949A; CN102770446A; WO2011105648A1; US20120316118A1; EP2540739A1; EP2540739A4; CN102770446B; US8853164B2; EP2540739B1

Description

本発明は、造骨細胞の分化能を画期的に高めるオリゴペプチドに関するものである。特に本発明は、歯科用インプラントにおいて、骨癒着及び骨形成促進を目的に用いられるオリゴペプチドに関するものである。

歯科インプラントの重要性能指標の一つは、骨癒着期間を短縮することである。即ち、短期間内に骨癒着しない場合治療期間が長くなり、初期骨癒着の失敗によってインプラント施術の成功率が低くなる。従って、骨癒着及び骨形成の性能を高めることが必須的に要求されている。
造骨細胞の増殖と分化を促進するTGF-β(transforming growth factor-β)、IGF-1(Insulin-like growth factor-1)などの成長因子(growth factor)又はBMP(bone morphogenetic protein)などの生理活性物質をインプラント植立時インプラントの表面に直接塗布したり手術部位周辺に流布したりする方法が用いられている。しかし、施術前に生体物質をインプラント表面に塗布する方法は、過剰量を要求するし、植立時効果的に残留しないためその適用が難しく、また施術部位に生体物質を塗布することは塗布領域が極めて限定的である。そのためインプラント表面全域で骨再生と骨癒着が効果的に行われないだけでなく、施術費用が増える短所もある。更に、施術が標準化されていないため施術方法と患者の管理が非効率であり、標準化した施術方法として採択することも困難な状況である。

BMPsは細胞膜にあるBMP受容体(BMP receptors、BMPRs)と結合し、細胞内シグナル伝達を開始し歯造骨形成に重要な役割をする。これらの受容体は、TGF-β膜貫通セリン／トレオニンキナーゼ受容体ファミリー(transmembrane serine-threonine kinase receptor family)であり、効率的なリガンド結合による細胞内シグナル伝達は、I型受容体とII型受容体が異型受容体複合体(heteromeric receptor complex)を形成し、II型受容体からI型受容体に交差リン酸化(cross-phosphorylation)が行われ、これがSmadカスケード(cascade)を活性化させ、目的遺伝子の蛋白質発現が行われる。BMP受容体として、現在まで３種類のI型受容体(ActR-I、BMPR-IA、BMPR-IB)と３種類のII型受容体(ActR-II、ActR-IIB、BMPR-II)が発見された。BMPR-IA又はBMPR-IBと結合したBMPR-IIに全てのTGF-βスーパーファミリー(superfamily)のBMPsが結合することと知られており、ActR-II、ActR-IIB及びActRIはBMP-4と結合しないためBMPR-IA又はBMPR-IBとBMPR-IIがBMP-特異的受容体(BMP-specific receptor)と考えられている。従って、細胞膜に存在するBMP-特異的受容体と、より高親和性のオリゴペプチド配列を開発することで、造骨細胞の増殖と分化をもっと効果的に誘導することができる。

一方、造骨細胞の分化と増殖を促進するために、BMP由来ペプチドの開発とインプラント表面にBMP由来ペプチドを導入することに関連して以下の特許が出願された。
下記特許文献１ (歯科用インプラント表面処理用のオリゴペプチド)には、R1-(A-B-C)n-R2-(A-B-C)m-L構造式(ここで、R1はH、アミノ酸残基、脂肪酸残基又は生分解特性を有する共重合ポリマーの主鎖、R2はスペーサー、Lは連結基である)を有する、歯科用インプラント表面に直接処理され骨成長を促進し骨癒着期間を短縮することのできるオリゴペプチドが記載されている。

下記特許文献２ (登録番号0676945、表面に骨組織形成促進ペプチドをコーティングした骨移植材及び組織工学用支持体)には、細胞附着誘導ペプチド及び/又は組織成長因子由来のペプチドを表面にコーティングした骨移植材及び組織工学用支持体に関するもので、特に骨形成蛋白質(BMP-2、4、6)由来のペプチドが開示されている。下記特許文献３ (登録番号0630903、表面に骨組織形成促進ペプチドをコーティングした遮蔽膜及びインプラント)には、架橋剤が結合された表面に細胞附着誘導ペプチド又は組織成長因子由来ペプチドをコーティングした遮蔽膜及びインプラントに関するもので、骨形成蛋白質(BMP-2)由来のペプチドが開示されている。

しかし、前記文献で記載されたペプチドは、依然として初期骨癒着期間の画期的な短縮には至っていない。
また、韓国特許出願2008-0054730号には、初期骨癒着期間を短縮し骨形成を促進する特定配列のオリゴペプチド(最も好ましいペプチドとして、R1-CKIPKPSSAPTELSAISMLYL-R2(以下、'PEP111')が開示されている(本出願で言及された前記の全ての特許文献は、参照によりその全てが本出願に含まれる)。

しかし、前記特許出願に記載されているオリゴペプチドは、BMP-特異的受容体に対する結合特異性が非常に低いためその骨癒着及び骨形成能はあまり満足できるレベルではなく、従って、BMP-特異的受容体(例：BMPR-IA及びBMPR-II)に対する結合特異性が高く初期骨癒着及び骨形成能に優れたオリゴペプチドの開発が依然として要求されている。

韓国特許出願公開番号2006-0110189号明細書韓国特許出願公開番号2006-0101019号明細書韓国特許出願公開番号2006-0082060号明細書

そして、本発明は先行特許の韓国特許出願2008-0054730号のオリゴヌクレオチドのBMP-特異的受容体に対する低結合特異性を改善するため案出されたもので、特にBMPR-IA及びBMPR-IIのBMP-特異的受容体に対する反応特異性が非常に高いオリゴペプチドを開発することを技術的課題とする。
また、本発明の目的は、BMP-特異的受容体に対する反応特異性が非常に高いオリゴペプチドを開発することで、造骨細胞増殖と分化度及び石灰化度が改善され骨形成度を高める、新たなオリゴペプチドを提供することである。

また、本発明の他の目的は、本発明のオリゴペプチドを歯科用インプラント表面に化学的に導入することで、初期骨癒着を促進しインプラント施術期間を短縮する方法を提供することである。

前記の目的を達成するため鋭意実験を重ねた結果、本発明者は、特定配列のオリゴペプチドがBMP-特異的受容体に対して反応性が顕著に高いため、造骨細胞の分化能及び石灰化能を促進することを発見し、本発明を完成した。
特に本発明は、上記特許文献４の代表的オリゴペプチドであるPEP111において、特定位置のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することで、BMP-特異的受容体に対する反応性を顕著に改善することができた。

本発明のオリゴペプチドは、下記配列番号１ないし７のアミノ酸配列からなる群より一つ以上選択することを特徴とし、生体内で、好ましくは骨癒着期間を短縮するインプラントコーティング用として使用される。
配列番号 1：PEP7 KIPKPSSVPTELSAISMLYL
配列番号 2：PEP71 IPKPSSVPTELSAISMLYL
配列番号 3：PEP72 PKPSSVPTELSAISMLYL
配列番号 4：PEP73 KPSSVPTELSAISMLYL
配列番号 5：PEP74 KIPKPSSVPTELSAISMLY
配列番号 6：PEP75 KIPKPSSVPTELSAISML
配列番号 7：PEP76 KIPKPSSVPTELSAISM
また、本発明のオリゴペプチドは、インプラント、特に歯科用インプラントに適用ができ、PEP7(配列番号１)、PEP71(配列番号２)、PEP72(配列番号３)、PEP73(配列番号４)、PEP74(配列番号５)、PEP75(配列番号６)及び、PEP76(配列番号７)からなる群より選ばれるオリゴペプチドであり、より好ましくはPEP7、PEP71及びPEP74からなる群より選ばれるオリゴペプチドで、更により好ましくはPEP7又はPEP71であり、PEP7であることが最も好ましい。

本発明のオリゴペプチドは、オリゴペプチド間の距離を造骨細胞の大きさに応じて制御し、相対的配向の調節ができるために担体(matrix)を共に導入することが好ましい。また、インプラント材質のチタン表面にリンカーが前処理されていて、前記オリゴペプチドはリンカー(linker)の官能基との結合のため、N又はC末端に-SH基を有するアミノ酸、好ましくはシステイン残基を導入することができる。

例えば、リンカーにおいて、本発明のオリゴペプチドは、各々そのオリゴペプチドのN-末端にシステインを有し、リンカーによるインプラントへの導入が容易である。また、本発明において、前記オリゴペプチドがインプラント表面のチタン(Ti)と安定状態で導入されるために、インプラント表面にシランリンカーペプチド(silane-linker-peptide)の連結関係で導入されることが好ましい。

また、本発明のオリゴペプチドのN-末端をアセチル化(acetylation)、及び/又はC-末端をアミド化(amidation)することで、物質の安定性を向上することができる。
本発明のオリゴペプチドは、この技術分野の当業者たちに知られている製造方法により容易に合成できる。
本発明のオリゴペプチドは、従来のPEP111に比べてBMP-特異的受容体に対する反応性が顕著に改善されたことで、インプラント表面に適用する場合造骨細胞の初期附着、増殖及び分化に重要な役割をすることになり、最終的に骨癒着期間を画期的に短縮し、特に現在までインプラント施術が難しかった低骨質患者を対象として施術領域を拡大することに非常に有用であると予測される。

また、本発明は、前記オリゴペプチドを遮蔽膜及びインプラント表面に適用する場合、表面の単位面積当０．１~５．０mgを導入することが好ましく、より好ましくはオリゴペプチドに１０〜２１個のアミノ酸が含まれ、これらをインプラント表面の単位面積当０．１〜３．０mg適用することが適当である。
本発明のオリゴペプチドは、従来の公知方法(例えば、前記の関連特許出願)または本発明の方法により、インプラント表面に適用できる。この際、担体やリンカーの使用が可能である。前記従来の出願には、インプラント表面の改質方法、架橋剤の利用方法、担体の利用方法、シランリンカーペプチド(silane-linker-peptide)連結方法、オリゴペプチドのコーティング方法などが記載されている。

本発明の前記１文字コードはこの技術分野で通用する文字コードであり、その内容は下記の通りである。

本発明のオリゴペプチドは、BMP-特異的受容体に対する反応特異性が非常に高い物質であるため、造骨細胞分化度及び石灰化度が高くなり、骨充填剤を使用しなくても骨形成効果が得られる。本発明を利用したインプラントは、インプラント表面に薄膜処理したオリゴペプチドの持続的作用による造骨細胞の誘引、機能増加を誘発することで、初期骨癒着期間の短縮、低骨質患者の施術成功率の向上、骨量の足りない場合骨充填剤なしに骨形成可能、施術費用低減などの効果がもたらされる。

オリゴペプチド物質に対するBMP特異受容体(BMPR-1A、BMP-II)に対する結合能を示すグラフである。図１において、白棒はBMPR-1Aに対する結合能、黒棒はBMPR-IIに対する結合能を表す。オリゴペプチド物質に対する造骨細胞の初期細胞分化能の指標であるアルカリホスファターゼ活性度(Alkaline phosphatase activity)を比較したグラフである。オリゴペプチド物質に対する造骨細胞の後期細胞分化能の指標であるオステオカルシン生成能(osteocalcin production)を比較したグラフである。オリゴペプチド物質に対する造骨細胞の後期細胞分化能の指標であるオステオポンチン生成能(osteopontin production)を比較したグラフである。オリゴペプチド物質に対する造骨細胞の骨分化による細胞外基質の石灰化能(Mineralization)を図示した図面である。

以下、本発明を下記実施例によりもっと詳しく説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するだけで、本発明が下記実施例により限定されることではなく、本発明の技術的思想を超えない範囲で置換及び均等な他実施例に変更できることは、本発明に属する技術分野で通常の知識を有した者において明らかである。
<実施例 1> オリゴペプチドの作製
オリゴペプチドの合成はFmoc/tBu方法により行い、合成終了後HPLCを行って95％以上の純度で精製した。最終精製物質の分子量はNMRにより確認した。

具体的に、選ばれたオリゴペプチド配列は以下の通りである。
配列番号１：PEP7 KIPKPSSVPTELSAISMLYL
配列番号２：PEP71 IPKPSSVPTELSAISMLYL
配列番号３：PEP72 PKPSSVPTELSAISMLYL
配列番号４：PEP73 KPSSVPTELSAISMLYL
配列番号５：PEP74 KIPKPSSVPTELSAISMLY
配列番号６：PEP75 KIPKPSSVPTELSAISML
配列番号７：PEP76 KIPKPSSVPTELSAISM
以下で、前記ペプチド中、配列番号１であるPEP7に対して活性の優秀性を測定した。
実験例１. BMP特異受容体結合能(BMP specific binding assay)の評価
PEP7(1mg/well)をELISA用Plateに入れ４℃、１２時間PEP7をコーティングした後、BMPR-1A又はBMPR-II(1mg/well)を入れて常温で２時間反応を施し、PEP7-BMP受容体に結合させた。BMP受容体(0.5mg BMPR-1A、BMPR-11)を認識する１次抗体を入れ常温で１時間反応した後、２次抗体(BMPR-1A-又はBMPRII-Fc Ab-HRP)を入れて常温で１時間反応させた。ABTSを入れて常温で３０分反応後、５９５nmで吸光度を測定した(図１参照)。図１において、PEP111(A)はPEP111の９番目アミノ酸がalanineである場合、PEP111(P)はアラニン(alanine)をプロリン(proline)に置換、PEP111(T)はアラニン(alanine)をトレオニン(threonine)に置換した配列である。実験結果、本発明のオリゴペプチドにおいて、BMP特異受容体結合能がPEP111に比べ約23％高かった。この結果で、本発明のオリゴペプチドはPEP111に比べて、BMP特異受容体結合能が非常に優れていることを確認した。
実験例２. 初期細胞分化能の評価
造骨細胞の初期分化マーカーであるALP(alkaline phosphatase)活性を比較し、オリゴペプチドが造骨細胞に分化に及ぼす影響を観察した。造骨細胞の分化能を比較するため、MG63を24ウエルプレート(well plate)に1x10⁵セル(cells)ずつ分株し１日間培養した後、分化用培地に本発明のオリゴペプチドであるPEP7、陽性対照群であるBMP-2、及びPEP111を各々処理し、37℃、CO₂培養器で培養した。培地は２日ごとに取り換え、培養３日目、８日目にALP活性を測定した(図２参照)。この実験で、本発明のオリゴペプチドは、従来のPEP111に比べて、約２０％高いALP活性を示し、本発明で造骨細胞の分化能が顕著に改善されたことを確認した。
実験例３及び４. 後期細胞分化能の評価
造骨細胞の分化後期マーカーであるオステオカルシン(osteocalcin)とオステオポンチン(osteopontin)の生成量を比較し、本発明のオリゴペプチドPEP７が造骨細胞に及ぼす影響を観察した。培養条件は前記と同様で、培養１４日目の培養液を回収し、培養液内に存在するオステオカルチン(osteocalcin)とオステオポンチン(osteopontin)の量をhuman ELISA kitを用いて測定した(図３及び図４参照)。この実験で、本発明のオリゴペプチドは、従来のPEP111に比べて、オステオカルチン(osteocalcin)の生成量が約１４％、オステオポンチン(osteopontin)の生成量が約２１％改善され、後期細胞分化能において本発明のオリゴペプチドがPEP111に比べ非常に高いことを確認した。
実験例５. 石灰化能の評価
オリゴペプチドによる造骨細胞の骨分化が順調に行われたかを確認するため、細胞外基質の石灰化程度を観察した。培養条件は前記と同様で、培養１４日目、２１日目にアリザリンレッド(Alizarin red) S染色法により石灰化程度を比較評価した(図５参照)。実験結果、培養１４日目で本発明のオリゴペプチドの石灰化能は、PEP111に比べ約１９％高かった。これで、本発明のオリゴペプチドによる骨分化において、改善された様態で行われたことが確認できる。

前述の通り、本発明のオリゴペプチドは、BMP-特異的受容体に対す反応性が従来のPEP111より非常に高いオリゴペプチドであり、造骨細胞分化度と石灰化度が増加し、これにより骨充填剤代替効果及び骨形成効果が向上すると予想される。
本発明のオリゴペプチドは、BMP特異受容体に対する優秀な結合能を有するため、造骨細胞の分化を増大させる。従って、本発明のオリゴペプチドをインプラント表面に薄膜コティングする場合、初期骨癒着期間の短縮、骨質の悪い患者の施術成功率向上、及び骨量が足りない場合骨充填剤なしに骨形成が可能である。

Claims

配列番号１ないし７のアミノ酸配列からなる群より一つ以上選ばれることを特徴とする、生体内で使用するための、オリゴペプチド。
前記オリゴペプチドは、配列番号１のPEP7であることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチド。
前記オリゴペプチドのN-又はC-末端にシステインが付加されていることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチド。
前記オリゴペプチドのN-末端は、アセチル化されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のオリゴペプチド。
前記オリゴペプチドのC-末端は、アミド化されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のオリゴペプチド。
前記オリゴペプチドのN-末端はアセチル化され、C-末端はアミド化されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のオリゴペプチド。