CN102770446B - 改善成骨细胞分化的寡肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适用于牙种植体的寡肽，其选自由PEP7(SEQ ID No.1)、PEP71(SEQ ID No.2)、EPP72(SEQ ID No.3)、PEP73(SEQ ID No.4)、PEP74(SEQ ID No.5)、PEP75(SEQ ID No.6)和PEP76(SEQ ID No.7)组成的群组。本发明的寡肽对于BMP特异性受体具有极高反应性，由此增加成骨细胞分化和钙化程度，以便能显示出改善的骨整合和骨生成。

Description

改善成骨细胞分化的寡肽
技术领域
本发明涉及具有改善的成骨细胞分化能力的寡肽，更具体说来，涉及用于增进牙种植体中的骨整合和骨生成的寡肽。
背景技术
牙种植体需要缩短骨整合的诱导期。也就是说，如果不能在短时间内连续实现骨整合，那么治疗期将变长，而且种植手术的成功率会因初始骨整合失败而下降。因此，绝对需要增强骨整合和骨生成能力。
为此，已经开发出一种在种植程序期间于种植体表面上直接涂布例如转化生长因子-β(TGF-β，transforming growth factor-β)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1，Insulin-like growth factor-1)等生长因子或例如骨形态生成蛋白(BMP，bone morphogenetic protein)等生理活性物质来促进成骨细胞增殖和分化，或在检测部位周围涂敷所述因子或物质的方法。然而，在种植手术之前将生理活性物质涂布于种植体表面上会带来几个问题，即，需要大量此类活性物质，而且这些活性物质无法有效保留在种植部位处，因此其应用范围非常有限。此外，活性物质的涂布是在极其有限的区域进行，因此无法在种植体整个表面上实现有效骨生成和骨整合，并且使种植手术的成本增加。另外，此类种植手术尚未标准化，且无法有效管理患者，由此很难用作种植手术的标准化方法。
BMP与细胞表面上的BMP受体(BMP receptor，BMPR)相互作用以起始细胞内信号转导，并在牙槽骨的形成中起到重要作用。BMP受体属于TGF-β跨膜丝氨酸-苏氨酸激酶受体家族。通过配体结合有效进行细胞内信号转导是通过以下步骤实现：在I型受体与II型受体之间形成杂聚受体复合物；诱导II型受体交叉磷酸化形成I型受体；活化Smad信号传导级联；随后表达目标蛋白。BMP受体包含3类I型受体(ActR-I、BMPR-IA、BMPR-IB)和3类II型受体(ActR-II、ActR-IIB、BMPR-II)。据报导，TGF-β超家族的所有BMP都与BMPR-II相互作用，结合于BMPR-IA或BMPR-IB，而ActR-II、ActR-IIB和ActR-I不与BMP-4相互作用。这些事实表明，BMPR-IA或BMPR-IB和BMPR-II都是BMP特异性受体。因此，开发对于细胞表面上存在的BMP特异性受体具有较高结合亲和力的寡核苷酸序列可进一步有效诱导成骨细胞分化。
而且，有数篇专利文献涉及刺激成骨细胞分化和增殖的BMP源性肽的开发以及种植体表面中BMP源性肽的引入。
韩国专利公开案第2006-0110189号，标题为“用于处理牙种植体表面的合成肽(Synthetic peptides for treatment ofdental implant surface)”，揭示了由式R1-(A-B-C)n-R2-(A-B-C)m-L表示的寡肽(其中R1是H、氨基酸残基、脂肪酸残基或生物可降解聚合物主链，R2是间隔子，且L是连接子)。可通过在牙种植体的表面上直接处理所述寡肽来促进骨生长并缩短骨整合的诱导期。
韩国专利公开案第2006-0101019号(专利第0676945号)，标题为“表面上固定有增进骨生成的肽的骨移植物和支架材料(Bone graft and scaffoldingmaterials immobilized with osteogenesis enhancing peptides on the surface)”，涉及表面涂布有细胞粘附诱导性肽和/或组织生长因子源性肽的骨移植物和支架材料。具体说来，所述专利揭示骨生成蛋白(BMP-2、4、6)源性肽。韩国专利公开案第2006-0082060号(专利第0630903号)，标题为“表面上固定增进骨生成的肽的膜和种植体(Membrane and implant immobilizedosteogenic enhancing peptides on the surface)”，涉及一种在结合交联剂的表面上涂布有细胞粘附诱导性肽或组织生长因子源性肽的膜和种植体。所述专利揭示骨生成蛋白(BMP-2)源性肽。
然而，所述专利文献中揭示的寡肽仍无法明显缩短初始骨整合的诱导期。
此外，韩国专利申请案第2008-0054730号揭示具有特定序列的寡肽(一种关键肽R1-CKIPKPSSAPTELSAISMLYL-R2，称为′PEP111′)，这些寡肽可缩短初始骨整合的诱导期并促进骨生成(本文提到的所有专利都以全文引用的方式并入本文中)。
然而，所述专利申请案中揭示的寡肽对BMP特异性受体显示出极低的结合亲和力，因此，其骨整合和骨生成能力不能令人满意。因此，需要开发对BMP特异性受体(例如BMPR-IA和BMPR-II)具有高结合亲和力、从而显示优良的初始骨整合和骨生成能力的寡肽。
发明内容
技术问题
因此，本发明一个目的是提供对BMP特异性受体BMPR-IA和BMPR-II具有极高反应性的寡肽，其可改善韩国专利申请案第2008-0054730号中揭示的寡核苷酸对BMP特异性受体的低结合亲和力。
本发明另一目的是通过开发对BMP特异性受体具有极高反应性的寡肽提供能够改善成骨细胞分化和钙化并增加骨生成的新型寡肽。
本发明又一目的是提供一种通过用化学方式将本发明寡肽引入牙种植体表面中来改善初始骨整合，从而缩短种植手术周期的方法。
技术解决方法
本发明的发明人已尽力克服上文现有技术中提到的问题，并且发现具有某一氨基酸序列的寡肽对BMP特异性受体显示出明显较高的反应性，由此改善成骨细胞的分化和钙化能力。
本发明寡肽通过用另一氨基酸替代韩国专利申请案第2008-0054730号中揭示的代表性寡肽PEP111的某一位置处的氨基酸，而具有明显改善的针对BMP特异性受体的反应性。
本发明寡肽以具有选自由SEQ ID No.1到7表示的氨基酸序列组成的群组的氨基酸序列为特征，并且可用作体内种植体涂布剂，用以缩短骨整合的诱导期。
SEQ ID No.1：PEP7     KIPKPSSVPTELSAISMLYL
SEQ ID No.2：PEP71    IPKPSSVPTELSAISMLYL
SEQ ID No.3：PEP72    PKPSSVPTELSAISMLYL
SEQ ID No.4：PEP73    KPSSVPTELSAISMLYL
SEQ ID No.5：PEP74    KIPKPS SVPTELSAISMLY
SEQ ID No.6：PEP75    KIPKPSSVPTELSAISML
SEQ ID No.7：PEP76    KIPKPSSVPTELSAISM
此外，本发明寡肽适用于种植体，尤其牙种植体，并且优选选自由PEP7(SEQ ID No.1)、PEP71(SEQ ID No.2)、PEP72(SEQ ID No.3)、PEP73(SEQ ID No.4)、PEP74(SEQ ID No.5)、PEP75(SEQ ID No.6)和PEP76(SEQ ID No.7)组成的群组，更优选选自由PEP7、PEP71和PEP74组成的群组，更优选为PEP7或PEP71，且最优选为PEP7。
优选将基质引入本发明寡肽中，以便能根据成骨细胞的大小控制寡肽之间的距离，并调节其相对取向。此外，种植体的钛表面可用连接子预处理，并且可将含有-SH基团的氨基酸(例如半胱氨酸)引入本发明寡肽的N末端或C末端中，以结合所述连接子的官能团。
举例来说，结合连接子，本发明寡肽在N末端含有半胱氨酸以便借助于连接子与半胱氨酸之间的相互作用容易地被引入种植体中。另外，为了将本发明寡肽稳定地引入种植体的钛(Ti)表面中，优选利用硅烷-连接子-肽的连接关系将这些寡肽引入种植体表面中。
此外，有可能通过本发明寡肽的N末端乙酰基化和/或C末端酰胺化来改善所述寡肽的稳定性。
本发明寡肽可根据所属领域技术人员众所周知的常规方法容易地合成。
与现有技术寡肽PEP111相比较，本发明寡肽显示出显著改善的针对BMP特异性受体的反应性，由此在成骨细胞分化和增殖方面起到重要作用，并且在施用于种植体表面时明显缩短骨整合的诱导期。具体说来，预计本发明寡肽特别适用于加宽骨质量较差患者的种植手术范围。
此外，在将本发明寡肽施用于屏障膜和种植体表面的情形中，引入的寡肽的浓度优选在每单位面积0.1毫克到5.0毫克的范围内。更优选本发明寡肽具有10到21个氨基酸的含量，并且以在每单位面积0.1毫克到3.0毫克范围内的浓度引入种植体表面中。
本发明寡肽可根据此项技术中众所周知的常规方法(例如上述相关专利申请案中揭示的方法)或本发明方法施用于种植体的表面。此处，可使用基质或连接子。上述相关专利申请案揭示了使种植体表面改性的方法、使用交联剂的方法、使用基质的方法、制备硅烷-连接子-肽的方法、涂布寡肽的方法等。
本发明中所用每一种氨基酸的单字母代码均是此项技术中目前所用的字母代码，概述于下表中。
  单字母代码   缩写   全名
  A   Ala   丙氨酸
  R   Arg   精氨酸
  N   Asn   天冬酰胺
  D   Asp   天冬氨酸
  C   Cys   半胱氨酸
  Q   Gln   谷氨酰胺
  E   Glu   谷氨酸
  G   Gly   甘氨酸
  H   His   组氨酸
  I   Ile   异亮氨酸
  L   Leu   亮氨酸
  K   Lys   赖氨酸
  M   Met   甲硫氨酸
  F   Phe   苯丙氨酸
  P   Pro   脯氨酸
  S   Ser   丝氨酸
  T   Thr   苏氨酸
  W   Trp   色氨酸
  Y   Tyr   酪氨酸
  V   Val   缬氨酸
有益作用
本发明寡肽对BMP特异性受体显示出极高反应性，由此增加其成骨细胞分化和钙化能力，以便获得有效的骨生成作用，而无需使用骨填充物。使用本发明寡肽的种植体可因种植体表面上经过处理的薄膜形式寡肽的连续作用而募集并活化成骨细胞，且因此，预期其可缩短初始骨整合的诱导期；增加骨质量较差患者种植手术的成功概率；甚至在骨量较低的情况下不使用骨填充物也可诱导骨生成；并降低种植手术的成本。
附图说明
图1是显示寡肽对BMP特异性受体(BMPR-1A(白色条形)和BMP-II(黑色条形))的结合亲和力的图。
图2是显示作为成骨细胞初始细胞分化能力标记物的寡肽的碱性磷酸酶活性的图。
图3是显示作为成骨细胞后期细胞分化能力标记物的寡肽的骨钙素产生能力的图。
图4是显示作为成骨细胞后期细胞分化能力标记物的寡肽的骨桥蛋白产生能力的图。
图5是显示由本发明寡肽诱导骨生成分化所引起的细胞外基质钙化能力的图。
具体实施方式
下文将利用以下实例进一步说明本发明。应了解，这些实例只是出于说明的目的提供。因此，本发明不受下文所述说明性实例的限制，而是由上文所含权利要求书界定。所属领域技术人员显而易见，可在不偏离本发明精神和范围的情况下，进行许多改变和修改。
<实例1>寡肽的制备
根据Fmoc/tBu方法合成寡肽，并在合成完成后进行HPLC。因此，纯化得到纯度为95％或95％以上的寡肽，并借助NMR检查其分子量。
具体说来，由此选择的寡肽序列如下。
SEQ ID No.1：PEP7     KIPKPSSVPTELSAISMLYL
SEQ ID No.2：PEP71    IPKPSSVPTELSAISMLYL
SEQ ID No.3：PEP72    PKPSSVPTELSAISMLYL
SEQ ID No.4：PEP73    KPSSVPTELSAISMLYL
SEQ ID No.5：PEP74    KIPKPS SVPTELSAISMLY
SEQ ID No.6：PEP75    KIPKPSSVPTELSAISML
SEQ ID No.7：PEP76    KIPKPSSVPTELSAISM
在这些寡肽中，使用SEQ ID No.1的PEP7进行以下实验。
测试实例1.BMP特异性结合分析
将PEP7(1毫克/孔)添加到ELISA板中，并在4℃下培育12小时。将PEP7涂布到板上，随后向其中添加BMPR-1A或BMPR-II(1毫克/孔)，并在室温下反应2小时，得到PEP7-BMP受体复合物。将BMP受体(0.5毫克BMPR-1A、BMPR-11)特异性一次抗体添加到复合物中，并在室温下反应1小时。随后将二次抗体(BMPR-1A-或BMPRII-Fc Ab-HRP)添加到所得混合物中，并在室温下反应1小时。将ABTS添加到所得混合物中并在室温下反应30分钟后，在595纳米下测量所得混合物的吸光度(图1，其中PEP111(A)是指第9位氨基酸是丙氨酸的序列；PEP111(P)是指丙氨酸被脯氨酸替代的序列；且PEP111(T)是指丙氨酸被苏氨酸替代的序列)。因此，已经发现本发明寡肽显示的对BMP特异性受体的结合亲和力比PEP111高约23％。这些结果证实，与PEP111相比较，本发明寡肽(PEP7)对于BMP特异性受体展现极为优良的结合亲和力。
测试实例2.初始细胞分化能力分析
通过比较作为成骨细胞初始分化标记物的本发明寡肽的碱性磷酸酶(ALP，alkaline phosphatase)活性，检查本发明寡肽对成骨细胞分化的影响。为了比较成骨细胞的分化能力，将浓度为1×105个细胞的MG63细胞分配到24孔板中，并培育1天。随后，用分别含有本发明寡肽PEP7以及阳性对照物BMP-2和PEP111的分化培养基处理细胞，并在含CO2的37℃恒温箱中培育。所述培养基间隔2天用新鲜培养基替换，并在培养后第3天和第8天测量ALP活性(图2)。实验发现，本发明的寡肽PEP7显示的ALP活性比PEP111高20％，这表明成骨细胞分化能力明显改善。
测试实例3、4.后期细胞分化能力分析
通过比较作为成骨细胞后期分化标记物的本发明寡肽(PEP7)的骨钙素和骨桥蛋白的产生量，检查本发明寡肽对成骨细胞分化的影响。根据与上文所述相同的条件进行培养。第14天，采集培养物溶液，并使用人ELISA试剂盒测量其中存在的骨钙素和骨桥蛋白的量(图3和图4)。实验发现，本发明寡肽(PEP7)产生的骨钙素程度比PEP111高约14％或14％以上，且产生的骨桥蛋白的程度比PEP111高约21％或21％以上，表明本发明寡肽可明显增加后期细胞分化能力。
测试实例5.钙化能力分析
为了检查本发明寡肽是否能成功诱导骨生成分化，观察细胞外基质钙化情况。根据与上文所述相同的条件进行培养。第14天和第21天，采集培养物溶液，并进行茜素红(Alizarin red)S染色(图5)。因此，实验发现在第14天，本发明寡肽(PEP7)显示的钙化能力比PEP111高约19％，表明本发明寡肽可改善骨生成分化。
如先前所述，与现有技术寡肽PEP111相比较，本发明寡肽对BMP特异性受体显示出极高的反应性，由此增加其成骨细胞分化和钙化能力。因此，本发明寡肽可改善骨填充物的替代作用和骨生成作用。
本发明寡肽对BMP特异性受体具有优良的结合亲和力，由此促进成骨细胞分化。因此，将本发明寡肽以薄膜形式涂布于种植体表面上，由此缩短初始骨整合的诱导期；增加骨质量较差患者种植手术的成功概率；并且甚至在骨量较低的情况下不使用骨填充物也能诱导骨生成。

Claims (6)

1.一种适于体内使用的寡肽，其由一个或一个以上选自由SEQ ID No.1到SEQ ID No.7组成的群组的氨基酸序列所组成。
2.根据权利要求1所述的寡肽，其特征在于，所述寡肽是由SEQ ID No.1表示的PEP7。
3.根据权利要求1所述的寡肽，其特征在于，半胱氨酸被添加到所述寡肽的N末端或C末端。
4.根据权利要求1或2所述的寡肽，所述寡肽的N末端乙酰基化。
5.根据权利要求1或2所述的寡肽，所述寡肽的C末端酰胺化。
6.根据权利要求1或2所述的寡肽，所述寡肽的N末端乙酰基化以及所述寡肽的C末端酰胺化。
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