CN101585865A - 促进目标分析物附着的ifbm’s - Google Patents

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保罗·T·汉密尔顿
马克·W·格林斯塔夫
丹尼尔·J·凯南
戴尔·J·克里斯滕森
小韦恩·Fl·拜耶
罗宾·海德·德鲁勒
雷·爱德华·本森
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Abstract

本发明提供一种改进的医疗植入物表面涂层。涂层包括至少一种界面生物材料(IFBM)，界面生物材料包括至少一个结合植入物或植入物相关材料表面的结合单元(“植入物单元”)和至少一个结合目标分析物或设计为具有预期效果的结合单元(“分析物单元”)组成。单元间通过接头连接。在一些实施例中，IFBM涂层可起到促进目标分析物识别和附着在器件表面的作用。IFBM涂层改善了移植的医疗器件的性能，例如，促进植入物的骨整合。

Description

促进目标分析物附着的IFBM’S
技术领域
本发明提供了用促进目标分析物特异性识别和附着到器件表面的界面生物材料包覆医疗器件表面的材料和方法。
背景技术
矫形植入物用于各种关节置换和促进人类和动物的骨骼恢复。根据医药行业分析，美国现在每年在病人中实施超过800,000例髋关节和膝关节置换，另外，还有几十万病人在所经历的外科手术中用到矫形植入物，例如，治疗各种骨折或减轻严重背痛的矫形植入物。
对于所有这些措施，需要有一种可控的、直接的、快速的治疗方法。进行关节置换的患者一般经历无并发症的痊愈和功能的恢复。很不幸，并发症的比例很高，包括“晚期损坏”。人类全关节置换术的外科修正比例在10％到20％之间(Malchau等，(2002)“全髋关节置换预后：瑞典国家髋关节成形术记录中修正和再修正的结果更新和危险率分析”，1979-2000”，美国整形外科学会第69届年会科学展览，达拉斯，德克萨斯，2002年2月13-17日；Fitzpatrick等，(1998)Health Technol.Assess.2：1-64；Mahomed等，(2003)J.Bone Joint Surg.Am.85-A：27-32))。大多数的修正手术是由于植入物-骨骼接合面的损坏而必须做的。
矫形植入物是由相对惰性的材料(“异质成形的”材料)制成的，代表性的材料有金属的、陶瓷的、或塑料的材料。以前改善矫形移植手术结果的方法主要集中在植入物表面的物理变化，使其增强骨骼形成。这些方法包括利用具有多孔金属表面的植入物促进骨骼向内生长以及用羟磷灰石等离子体喷涂植入物。应用牙科植入物的方法也包括对局部增强的钛表面的利用，其表面粗糙度是通过一些方法如吹砂、酸蚀、或氧化处理而实现的。虽然这些技术已经对矫形移植手术的结果有所改善，但还存在着相当大的进一步的改善空间。
已知对异质成形的材料的组织反应受到材料表面的细胞粘着的影响，已有大量研究致力于提高对异质成形的材料的细胞粘着。已知体内细胞之间的细胞粘着主要由细胞外基质中的短的、暴露于细胞表面受体的蛋白质结构域单元调控(LeBaron&Athanasiou(2000)Tissue Eng.6：85-103；Yamada(1997)MatrixBiol.16：137-141)。值得注意的是，已经发现一些被称作整联蛋白的受体与植入物表面的细胞粘着有关。已经证明整联蛋白和它们的目标配体不但可以刺激骨形成，而且可以刺激成骨细胞粘着和增殖(例如，可参见Kantlehner等，(2000)ChemBioChem 1：107-114；Sarmento等，(2004)J.Biomed.Mater.Res.69A：351-358；Hayashibara等，(2004)J.Bone Mineral Res.19：455-462)。整联蛋白对于植入物粘附到靶细胞可能是有用的，并有可能以这种方式促进植入物整合到相邻的骨骼中。
其它的研究表明，生长因子和细胞因子的局部表达可以增强组织在异质成形的植入物表面的反应。例如，Cole等((1997)Clin.Orthop.345：219-228)已经证明生长因子可以促进植入物的整合到相邻的骨骼中(“骨整合”)并提高植入物表面附近的骨形成速度。也可参见美国专利第5,344,654号。刺激新的骨骼产生的生长因子(“骨诱导蛋白”)包括、但是不限于，血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子1和2(IGF-1和IGF-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)，以及相关家族成员。
最有效的骨诱导蛋白是骨形态发生蛋白(BMPs)。总的说来，BMPs是共有一组保守半胱氨酸残基和高水平序列同一性的TGF-β超家族的成员。已经鉴定出超过15种不同的BMPs，并且大多数的BMPs刺激导致新的骨形成的级联事件(参见美国专利Nos.5,013,649；5,635,373；5,652,118；和5,714,589；也可见以下综述：Reddi和Cunningham(1993)J.Bone Miner.Res.8Supp.2：S499-S502；Issack and DiCesare(2003)Am.J.Orthop.32：429-436；和Sykaras&Opperman(2003)J.Oral Sci.45：57-73))。这些导致新的骨形成的级联事件包括间质干细胞的迁移，骨诱导基质的沉积，骨祖细胞的增殖，以及祖细胞分化为造骨细胞。已经有很多研究致力于利用植入物表面或附近的BMPs以促进植入物的骨整合(例如，参见Friedlander等，(2001)J.Bone Joint Surg.Am.83-A Suppl.1(Pt.2)：S151-58；Einhorn(2003)J.Bone Joint Surg.Am.85-A Suppl.3：82-88；Burkus等，(2002)J.Spinal Disord.Tech.15(5)：337-49)。然而，还存在一个未解决的问题，就是把有活性的BMP或其它活性生物分子移植或固定到植入物的表面。
人们已经证明，BMPs的递呈是在植入物器件附近产生符合要求的骨形成的关健。基于骨形成的自然过程，人们已经制作出了促进移植的方法模型。在人类骨骼中，胶原蛋白既可作为骨形成的支架，又可作为BMPs的天然的载体。去矿化骨骼已经成功地用作骨移植材料；去矿化骨的主要组分是胶原蛋白和BMPs(参见美国专利No.5,236,456)。已有许多基质系统被开发出来，目的是使在基质降解时，可以稳定地释放生长因子及其他生理活性物质分子以促使骨形成。从聚合基质中释放BMP的效率取决于基质的特征，例如BMP与基质的亲合性、再吸收率、密度、以及孔径大小。用于这种基质系统的材料包括那些在体内容易水解变成惰性单体的有机聚合物。这样的有机聚合物包括聚交酯、聚乙交酯、聚酐，以及聚原酸酯(参见美国专利Nos.4,563,489；5,629,009；以及4,526,909)。其它记载的可用于含BMP基质的材料包括聚交酯和聚乙交酯的共聚物、藻朊酸盐、聚(乙二醇)、聚氧化乙烯氧化物、聚羧乙烯，聚氧化乙烯氧化物、聚羧乙烯以及聚(乙烯醇)(参见美国专利No.5,597,897)。天然基质蛋白也已经用于向骨骼区域输送BMPs；这些天然蛋白包括胶原蛋白、氨基多糖，以及透明质酸，它们在体内发生酶促消化(参见美国专利Nos.4,394,320；4,472,840；5,366,509；5,606,019；5,645,591；以及5,683,459)。
人们发现，即使利用聚合基质保留修复部位的BMP，但由于生长因子从基质中快速扩散，需要超过生理水平的BMP水平以促进愈合。例如，利用一种胶原蛋白海绵输送系统，两天后加入到海绵里的BMP只保留了50％(Geiger等，(2003)Adv.Drug Del.Rev.55：1613-1629)。为了在必要的时段内维持BMP的生理水平，需要很高的BMPs的起始剂量，这使得BMP疗法更加昂贵，并且可能导致不良副作用，例如异位的骨形成或变态反应，或形成中和抗体。
类似的问题在其它的植入物中也同样存在，比如肌腱和韧带置换物、皮肤置换物、血管置换物、心脏起搏器、人工心脏瓣膜、乳房填充物、阴茎埋入物、斯坦特固定模、导尿管、分流器、神经生长导向体、眼内透镜、伤口敷料，以及组织封闭剂。对于矫形植入物来说，涉及这些植入物的手术经常发生类似创口愈合缓慢，以及植入物不恰当地整合到周围组织中等问题。
因此，需要开发一种有成本效益的方法，用于将活性生物分子移植到植入物表面或与植入物结合以促进手术后的愈合，以及促进植入物如期望的那样整合到周围组织，例如相邻的骨骼里。
发明内容
本发明提供一种改进的医疗植入物表面涂层。涂层包括至少一种界面生物材料(IFBM)，界面生物材料包括至少一个结合植入物或植入物相关材料表面的结合单元(“植入物单元”)和至少一个结合目标分析物或设计为具有预期效果的结合单元(“分析物单元”)。单元间通过接头连接。在一些实施例中，IFBM涂层可起到促进目标分析物识别和附着在器件表面的作用。IFBM涂层通过促进植入物的骨整合而改善移植的医疗器件的性能、促进愈合、和/或减少移植部位发炎。
附图说明
图1显示展示典型的钛结合多肽的噬菌体与钛珠结合的比较(参见实施例1)。图中显示了对于不同的噬菌体(横轴)与钛珠结合的检测信号(纵轴)。
图2显示带有C-末端生物素残基的肽与钛结合的对比(参见实施例1)。图中表现了吸光度(纵轴)与肽浓度(μM，横轴)的关系。
图3显示两种肽与钛结合的对比(参见实施例2)。图中表现了A405nm信号(纵轴)与肽浓度的关系(μM，横轴)。图中自上而下的线分别连接肽AFF6007和AFF6010的数据点。
图4显示各种肽与BMP-2结合的对比(参见实施例3)。图中表现了各种肽(标记在横轴上)的信号(AP率)。
图5显示BMP在IFBMs与胶原海绵的结合中的效果(参见实施例4)。图中表现了信号(纵轴)与BMP的nM浓度(横轴)的关系。
图6A，6B，6C，和6D显示实施例4中所述的实验结果，证明BMP通过IFBM结合到胶原上既取决于加入海绵中的BMP的量，也取决于IFBM呈递的量。图中表现了吸光度(纵轴)与BMP浓度(横轴)的关系。
图7显示结合BMP-2并且包含基元1的选自表3和4的所有肽序列的分析结果(参见实施例3)。该图表现了在多肽序列分析中对于每个所分析的位置每个氨基酸在该位置上出现的次数；例如，位置1上“G2”表示在该位置甘氨酸出现了2次。
图8显示经设计的寡核苷酸盒，其表达一种多肽(SEQ ID NO：74)，该多肽中含有核心结合基元1a，多肽中还包含在序列的其它位置鉴定出的共有残基(参见实施例3)。图中所示的核苷酸序列也出现在SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76中。
图9显示利用常规ELISA评价BMP与多肽结合的相对亲合力的结果(参见实施例3)。表示在纵轴上的ELISA信号(A405nm读数)与横轴上的噬菌体微升数有关。在对应于0.10微升噬菌体的数据点，图中自上而下的线条分别连接以下数据点：APO2-61，APO2-40，APO2-41，APO2-26，APO2-35，APO2-59，APO2-44，mAEK，以及无噬菌体对照。
图10显示选自表3和5的结合BMP-2并且包含基元2的所有多肽序列分析结果。图中显示在肽序列分析中，各氨基酸在每个所研究的位置出现的次数；例如，位置1上“G7”意思指甘氨酸在那个位置出现七次。图中还显示了从选自表3和7的包含基元2(SEQ ID NO：93)的多肽序列对比而衍生的共有序列。该序列表现了经所有多肽对比后在每个位置占优势的氨基酸。在所研究的序列中，最保守的氨基酸形成一个核心结合基元，命名为“Motif2a”(SEQ ID NO：94)。
图11显示从另一种检测BMP-结合活性的方法中得到的有代表性的结果，在该方法中结合发生在液相中(参见实施例3)。405nm的吸光度(纵轴)显示为随BMP的皮摩尔数(横轴)而变化。该结果用于计算每种BMP-结合多肽与BMP-2的亲合力(参见表6)。在对应于一皮摩尔BMP的数据点，图中自上而下的线条分别连接以下数据点：2006，2007，2008，2009，2011，以及2012。
图12显示在一项试验中检验几种多肽结合BMP-2，BMP-4，以及BMP-7的能力的结果(参见实施例3)。多肽2007和2011首次鉴定为BMP-2结合多肽，而多肽9001首次鉴定为与无关目标结合。
具体实施方式
发明详述
本发明提供一种改进的涂层，它用于医疗器件表面，促进多肽，蛋白质，药物或细胞对器件的附着。涂层是一种包括相结合的多个结合单元的界面生物材料(IFBM)。IFBM包括至少一个与植入物或植入物相关材料表面结合的结合单元(“植入物单元”)和至少一个与目标分析物结合或具有预期效果的结合单元(“分析物单元”)。示范性的结合单元包括，例如，在序列表(SEQ ID NOs：1-74和77-96)中所提供的多肽序列。单元间通过接头连接。在一些实施例中，IFBM的结合单元非共价结合到植入物表面。同样，在一些实施例中，分析物单元非共价地结合到目标分析物上。在一个实施例中，植入物单元和分析物单元包括两个独立的多肽分子，使得植入物单元与植入物材料结合，而分析物单元特异地与一种生长因子或细胞结合。在一些实施例中，植入物单元和分析物单元通过一个中间的高分子连接。典型地，这些结合单元分别非共价结合植入物材料或目标分析物。在分析物单元不是与目标分析物结合而是具有一种预期效果的例子中，分析物单元可以，例如，通过向移植部位募集细胞而模拟生长因子的作用。IFBM选择方法和结构可参见美国专利申请第10/300,694号的记载，其于2002年11月20日申请，2003年10月2日公布，公布号20030185870，本文引入作为参考。
“特异地结合”或“特异的结合”指的是植入物单元或分析物单元与选择的植入物材料或选择的分析物结合。在一些实施例中，特异地结合一种植入物材料或分析物的单元，与材料或分析物的结合，至少相当于该单元与一种适当的对照物结合的10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％，300％，400％，500％，或更高百分比。对照物例如，一种用于植入物的不同材料，一种不用于植入物的材料，或者一种特定用于某一目的的蛋白质，如牛血清白蛋白。“分析物”指的是在植入手术后改善植入物骨整合，或者促进或加速周围组织愈合的任何物质或分子的某部分。作为分析物单元结合对象的适当的分析物包括、但不限于：生长因子，例如骨形态发生蛋白(BMPs，例如，BMP-7和BMP-2)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子-β(TGF-β)，胰岛素生长因子-1(IGF-1)，胰岛素生长因子-2(IGF-2)，成纤维细胞生长因子(FGF)，神经生长因子(NGF)，和胎盘生长因子。适当的分析物也包括可达到本发明目的的激素、酶、细胞因子，及其它生理活性物质或分子的某部分；也就是说，在植入手术后促进植入物的骨整合和/或改善周围的组织愈合。适当的分析物也包括细胞，例如，成骨细胞，软骨细胞，干细胞，祖细胞，血小板，以及其它在骨整合和愈合中起作用的细胞。在一些实施例中，分析物单元可以包括结合细胞或通过与细胞或受体结合而具有生物活性的多肽序列，例如，多肽序列RGD，YIGSR，和IKVAV，本领域中已知其具有特定的生物学活性。例如，可参见Hersel等，(2003)Biomaterials 24：4385-4415；Grant等，(1990)Ann.N.Y.Acad.Sci.588：61-72；Hosokawa等，(1999)Dev.Growth Differ.41：207-216。在一些实施例中，分析物单元包括结合BMP-2和/或摹拟BMP-2效果的多肽序列，例如示范性的序列SEQ ID NOs：11-28，44-74，或77-94。与细胞结合的分析物单元可以包括一种多肽，该多肽包含一个可与多种不同类型的细胞结合的通用细胞附着序列，或者它可以包括一种多肽，该多肽与特定类型的细胞结合，如成骨细胞、软骨细胞、骨祖细胞，或干细胞。
术语“植入物”泛指一种被引入到人体或动物体内的结构物，用于恢复受损伤组织的功能或者提供一种新的功能。植入物器件可以如本发明所公开的那样，用结合剂能够特异结合的任何生物相容性材料制造。典型的植入物包括但不限于：髋内假体、人造关节、颌或面部植入物、腱和韧带置换物、皮肤置换物、骨骼置换物和人造接骨螺钉、骨移植器件、血管修复体、心脏起搏器、人造心脏瓣膜、乳房填充物、阴茎植入物、斯坦特固定模、导液管、分流器、神经生长导向体、眼内透镜、伤口敷料，以及组织封闭剂。植入物由本领域公知的各种材料组成，包括但不限于：聚合物或聚合物的混合物，例如包括，聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚酐、聚原酸酯、聚苯乙烯聚碳酸酯、尼龙、PVC、胶原(包括，例如，经处理的胶原，如交联的胶原)、氨基多糖、透明质酸、藻朊酸盐、蚕丝、纤维蛋白、纤维素，以及橡胶；塑料，例如聚乙烯(包括，例如，高密度聚乙烯(HDPE))，PEEK(聚醚醚酮)，以及聚四氟乙烯；金属，例如钛、钛合金、不锈钢、以及钴铬铸造合金；金属氧化物；非金属氧化物；硅树脂；生物活性玻璃；陶瓷材料，例如，氧化铝、氧化锆，以及磷酸钙；其它的适当材料，例如去矿化骨基质；以及它们的混合物。本发明中使用的术语“聚合物”指的是任何庞大的天然的以及合成的高分子量化合物，由高达上百万的重复连接的单位组成，每个单位是一个相对简单的分子。本发明中使用的术语“植入物”包括与植入物相关联的植入物相关材料，它与植入物一起被引入到人体或动物体中。
在本发明的一个实施例中，IFBM产生一个结合界面，介导生长因子附着到植入物表面。在一些实施例中，根据本发明的方法制备的植入物在植入物表面附着有生长因子；生长因子从植入物位点向外扩散的速率依赖于分析物单元对所述生长因子的亲合力而变化，因此植入物可制备成具有不同的生长因子渗透速率。在涉及生长因子附着到植入物表面的实施例中，生长因子具有积极效果，例如，加速愈合过程、减少愈合所需要的生长因子数量，以及将生长因子超生理剂量引起的副作用最小化。生长因子具有特定的重要性，或者作为分析物单元，或者作为与分析物单元结合的因子，它包括，例如，BMP-2，BMP-7，PDGF，FGF，以及TGFβ。
因此，本发明提供制备一种植入物的方法，该植入物通过手术置入病人体内，其中该器件表面包覆至少包括一种IFBM的涂层。在一些实施例中，该方法包括以下步骤：(a)将一种IFBM涂层包覆于植入物表面，其中IFBM包括一个与植入物特异性结合的植入物单元和一个与生长因子特异结合的分析物单元；(b)通过浸渍、喷雾，或刷涂含有生长因子的溶液，将生长因子涂于植入物表面；(c)利用本领域技术人员所公知的适当的手术方法将植入物放置到患者体内。
换言之，一种包覆植入物表面、使得该植入物器件促进生长因子附着的方法包括以下步骤：(a)在植入物表面涂上IFBM涂层，其中该IFBM包括一个特异结合植入物的植入物单元和一个在移植部位特异结合生长因子的分析物单元；以及(b)把植入物置入患者体内的移植部位；由此宿主内生成的生长因子通过IFBM与植入物结合。植入物位点递呈的生长因子提高增强邻近的组织愈合和植入物整合到邻近的组织里。
在本发明的一个实施例中，IFBM介导细胞附着到植入物表面。通过增强细胞粘着和组织整合，本发明的IFBMs可以加速愈合和改善植入物器件的功能。因此，根据本发明，一种制备通过手术置入患者体内的植入物的方法包括：(a)将IFBM包覆于植入物表面，其中IFBM包括至少一个特异结合植入物的植入物单元和至少一个特异结合至少一种类型细胞的分析物单元；以及(b)把植入物置入患者的移植部位，凭此，细胞与植入物表面的IFBM涂层结合。
在一些实施例中，一种制备植入物的方法包括：(a)将IFBM涂到植入物表面，其中IFBM包括至少一个特异地结合植入物的植入物单元和至少一个特异结合至少一种类型细胞的分析物单元；以及(b)将细胞涂布到植入物表面，例如，通过将植入物浸渍在包含该细胞的溶液中或在植入物表面刷涂包含该细胞的溶液。然后，可以将该植入物置入患者体内(也即，人类患者或患病的动物体内)。本发明中所使用的“患者”指的是人类或者动物患者。
在本发明的另一个实施例中，一种植入物表面包覆有超过一种IFBM，目的是提供一种多功能的涂层。例如，一种植入物涂层可以包括具有结合一种细胞的分析物单元的第一种IFBM，以及具有结合一种生长因子的分析物单元的第二种IFBM。包括这些IFBMs的涂层可使细胞和生长因子两者都结合到植入物表面。在一些实施例中，涂层中的这些IFBMs相互混合，使得结合的生长因子与结合的细胞紧密的接近。在一个实施例中，涂层包括一种与间质干细胞结合的IFBM和一种与生长因子BMP-2结合的IFBM；BMP-2将会引发干细胞分化成成骨细胞。在其它的实施例中，植入物涂层可以包括至少两种不同的IFBMs的混合物，这些IFBMs的植入物单元和/或其分析物单元不同。在另一个实施例中，涂层包括一种多功能的IFBM，其具有两个分析物单元，其中一种与细胞结合，另一种与生长因子结合。
结合单元(也即，植入物单元和/或分析物单元)可以是多肽、抗体或抗体片段、多核苷酸、寡核苷酸、包括任何这些物质的复合物，或不同的分子和/或化合物。多肽的结合单元可以如待审美国专利申请第10/300,694号中所述，该专利于2002年11月20日申请，2003年10月2日公布，公开号20030185870。在一些实施例中，结合单元可以通过筛选与包括生物相容性材料(即，“生物材料”)，例如钛、不锈钢、钴-铬合金、聚氨基甲酸酯、聚乙烯或硅树脂的材料相结合的噬菌体展示文库而鉴别出来。
在本发明的一些实施例中，分析物单元是一种生物活性肽或与生物活性肽结合。如本领域公知，生物活性肽可以是保持天然蛋白质生物效应的天然蛋白质片段。例如，TP508是一种衍生自凝血酶的合成多肽，相当于人凝血酶氨基酸183-200，并且已被证实可加速骨折愈合(例如，参见Wang等，(2002)TransORS 27：234)。人们认为，TP508是通过该多肽内部的RGD序列介导的，RGD序列与存在于细胞表面的整合素结合(例如，参见Tsopanoglou等，(2004)Thromb Haemost.92(4)：846-57)。同样，P-15是一种I型胶原的15氨基酸多肽，相当于胶原的细胞结合结构域(例如，参见Yang等，(2004)Tissue Eng.10(7-8)：1148-59)。P-15被证实可增强新骨形成(例如，参见Scarano等，(2003).Implant Dent.12(4)：318-24)。生物活性肽还可以是生长因子的片段。例如，Saito等，(J Biomed Mater Res A.2005 72A(1)：77-82)已证实一种相当于BMP-2氨基酸73-92的合成多肽保持着BMP-2的生物学活性，包括与BMP-2受体结合，激活基因表达以及诱导异位的骨形成。
任何植入物单元可以同任何分析物单元结合，以产生本发明的IFBM，只要能提供所期望的活性；就是说，只要IFBM特异地与一种适当的植入物结合并且具有分析物单元赋予的适当的效果，即结合BMP-2的能力就可以。本领域技术人员可以领会，可以把不同类型以及数量的植入物单元与不同类型以及数量的分析物单元结合，以产生本发明的IFBM。因此，举例来说，一或多种植入物单元可以与一或多种分析物单元连接以产生IFBM。本领域技术人员能够根据制造植入物的材料以及分析物单元(们)赋予的期望活性来选择适当的植入物单元(们)和分析物单元(们)。
本发明中使用的术语“抗体”包括单链抗体。因此，用作结合单元的抗体可以是单链可变片段抗体(scFv)。单链抗体是一种包括连接在一起的可变重链和可变轻链的抗体，连接方式可以是直接连接或者通过一个多肽接头连接，以形成连续多肽。本发明中使用的术语“单链抗体”包含一种免疫球蛋白或其功能部分，包括但不限于：单克隆抗体、嵌合抗体、杂化抗体、诱变抗体、人源化抗体、以及包括抗原结合部位的抗体片段(例如，Fab和Fv抗体片段)。
噬菌体展示技术是本领域公知的技术。利用噬菌体展示，可将各种多肽的文库呈递给目标底物，并选择特异结合该底物的多肽用作结合单元。也可经过多轮系列选择，称作“淘选”。如本领域公知，任何一种类型的文库和淘选方法都可以用于鉴别出对于本发明的方法有用的结合单元。例如，抗体或抗体片段文库可以用于鉴别出结合特定的细胞群体或病毒的抗体或片段(例如，参见美国专利Nos.6,174,708；6,057,098；5,922,254；5,840,479；5,780,225；5,702,892；以及5,667,988)。淘选方法可以包括，例如，液相筛选、固相筛选，或基于细胞的筛选。一旦鉴别出一个候选结合单元，可利用定向或随机诱变来优化该结合单元的结合性质。术语“细菌噬菌体”和“噬菌体”同义，在本发明中可互换使用。
文库可以包括分子的随机的集合。另外，文库也可以是包括具有偏好某一特定序列、结构或构象的分子集合。例如，可参见美国专利第5,264,563号和第5,824,483号。包含数目不同的各种类型分子的文库的制备方法对于本领域是已知的，并且许多文库也是市场上可买到的。制备噬菌体文库的方法可见于，例如，Kay等，(1996)Phage Display of Peptides and Proteins(圣地亚哥，Academic出版社)；Barbas(2001)Phage Display：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory出版社，Cold Spring Harbor，NY)。
一个多肽结合单元(即植入物单元或分析物单元)包括大约3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，50，60，70，80，90，100，200，或高达300个氨基酸。可用作结合单元的多肽可以是线形的、分枝的，或环状的，并且可以包括非肽基部分。术语“多肽”泛指一种氨基酸链，包括天然氨基酸、合成氨基酸、基因编码的氨基酸、非基因编码的氨基酸，以及它们的混合。多肽可以既包括L-型又包括D-型氨基酸。
用作结合单元的多肽可以进行不同的变化，置换，插入，缺失，只要这种变化能给它的应用提供益处。因此、术语“多肽”包括任何类型的多肽衍生物，包括，例如，酰胺、与蛋白的缀合物，环酮多肽、聚合多肽、保守替换变体、类似物、片段、化学修饰的多肽，以及多肽模拟物。任何具有期望的结合特性的多肽都可被用于本发明。
典型的非基因编码的氨基酸包括但不限于：2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；β-丙氨酸；2-氨基丁酸；4-氨基丁酸(哌啶酸)；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基异丁酸；3-氨基异丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；锁链赖氨素；2，2′-二氨基庚二酸；2，3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟基赖氨酸；别-羟基赖氨酸；3-羟脯氨酸；4-羟脯氨酸；异锁链赖氨素；别-异亮氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸)；N-甲基异亮氨酸；N-甲基缬氨酸；正缬氨酸；正亮氨酸；和鸟氨酸。
典型的氨基酸衍生物包括，例如，游离氨基衍生为胺氯化物，p-甲苯磺酰基基团，苄氧羰基基团，t-丁基氧羰基基团，氯乙酰基基团或醛基基团的分子。游离羧基可经衍生而形成盐、甲基和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离羟基可以经衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-亚胺基-苯甲基组氨酸。
术语“保守替换变体”指的是一种多肽，其氨基酸残基序列大体上和一个对照多肽序列相同，其中一个或多个残基用功能类似的残基保守地替换，使得该保守替换变体能够以与母体变体基本上相同的亲合力与相同的结合对象结合，并且可以阻止母体变体的结合。在一个实施例中，一个保守替换变体表现出与对照多肽类似的结合特异性。短语“保守替换变体”也包括其中一个残基被一个化学衍生残基替换的多肽。
保守性替换的例子包括一个非极性的(疏水的)残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸替换为另一氨基酸；一个芳香残基例如色氨酸、酪氨酸，或苯基丙氨酸替换为另一氨基酸；一个极性(亲水的)残基替换为另一氨基酸，例如在精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酰胺和天门冬酰胺之间，在甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸和丝氨酸之间替换；将基本氨基酸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸替换为另一氨基酸；或将一个酸性的残基例如天冬氨酸或谷氨酸替换为另一氨基酸。
尽管本发明公开了作为本发明的IFBMs中的结合单元的示范性多肽序列(例如，在序列表的SEQ ID NOs：1-74和77-96)，本领域技术人员可以领会，序列所带来的结合性质或其它性质应只归因于包括在该序列中的一些氨基酸。作为本发明的结合单元的多肽也可以包括相对于本发明中公开的示范性的多肽序列具有一个或多个替换、添加和/或缺失的残基的多肽，只要所期望的结合性质能够保持。因此，本发明的结合单元包括与本发明公开的示范性序列差别约1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20个氨基酸的多肽，但其保持了其相应的示范性的序列结合特定材料或者作为一个分析物单元的能力。利用适当检测方法测量，与本发明公开的示范性序列不同的本发明的结合单元保持了包括完整的本发明公开的示范性序列的结合单元活性的至少25％，50％，75％，或100％。
就是说，本发明的结合单元包括与本发明公开的示范性的序列所共有同一性至少有70％，75％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或具有更高的序列同一性。序列同一性可以人工计算或利用电脑执行数学算法进行计算，例如，Genetics电脑集团的威斯康辛遗传学程序包中的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA，和TFASTA，版本10(可购自Accelrys，9685 Scranton Road，圣地亚哥，加利福尼亚，92121，美国)。威斯康辛遗传学程序包的版本10中所应用的打分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 89：10915)。使用该程序进行的比对可利用缺省参数进行。
多肽可以经过修饰，例如，通过末端-NH2酰化作用(例如，乙酰化，或巯基乙酸酰胺化)或通过末端-羧基酰胺化作用(例如，与氨或甲胺)发生酰胺化作用而修饰。末端修饰作用有利于降低对蛋白酶消化的敏感性，因此延长多肽在溶液中的半寿期，特别是在存在有蛋白酶的生物液体中。
多肽环化也是一种有用的修饰作用，因为环化作用形成了稳定的结构，并且兼顾到该环肽所保有的生物学活性。将多肽环化的方法已有记载，例如，Schneider和Eberle(1993)Peptides.1992：1992年9月13日至19日在瑞士的因特拉肯市和荷兰的伊斯卡姆市及莱顿市举行的第22届欧洲多肽研讨会(Proceedings of the Twenty-Second European Peptide Symposium，September13-19，1992，Interlaken，Switzerland，Escom，Leiden，The Netherlands)。
可选地，结合单元多肽可以包括一个或多个经修饰后含有一个或多个卤素，例如氟、溴，或碘的氨基酸，以促进与接头分子连接。本发明使用的术语“多肽”也包括其中一个或多个肽键被拟肽键取代，拟肽键包括但不限于：carba键(CH2-CH2)，depsi键(CO-O)，羟基亚乙基键(CHOH-CH2)，亚甲基酮键(CO-CH2)，亚甲基-氧键(CH2-O)，还原键(CH2-NH)，硫亚甲基键(CH2-S)，N-修饰键(-NRCO-)，以及硫肽键(CS-NH)。例如，参见，Garbay-Jaureguiberry等，(1992)Int.J.Pept.Protein Res.39：523-527；Tung等，(1992)Pept.Res.5：115-118；Urge等，(1992)Carbohydr.Res.235：83-93；Corringer等，(1993)J.Med.Chem.36：166-172；Pavone等，(1993)Int.J.Pept.Protein Res.41：15-20。
特异性结合到本发明所考虑的表面(包括钛、不锈钢、胶原，以及聚羟基乙酸(PGA))，并适于用作本发明的IFBMs中的结合单元的典型多肽显示于序列表中，并在下面作进一步说明。尽管本发明公开了示范性的多肽，本领域技术人员可以领会，这些序列所带来的结合性质可以只归因于包括在该序列中的一些氨基酸。因此，一个只包括本发明所公开的示范性序列中的一部分的序列也可以与全长的示范性序列有基本相同的结合性质。因此，还可用作结合单元的是那些只包括特定的示范性序列中的3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12个氨基酸的序列，并且这些氨基酸在示范性序列中可以是连续的或不连续的。这样的氨基酸可以集中在示范性多肽的氨基末端(例如，4个氨基酸可以集中在该多肽的前5，6，7，8，9，10，11，或12个氨基酸中)或者它们分散于整个示范性多肽，但仍然决定着该多肽的结合性质。例如，特异结合BMP-2的多肽可以包括全部或部分的序列基元，如实施例3的描述，且显示在SEQ ID NO：27或28。因此，特异结合BMP-2的多肽可能具有符合该序列基元的每个必需条件的序列，如SEQ ID NO：27或28，也可能具有符合该序列基元中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10个必需条件的序列。显示于SEQ ID NO：27中的序列基元可被称作具有四个“必需条件”，其限定了在位置1，4，6，以及7出现的氨基酸。特异结合BMP-2的多肽可以具有如SEQ ID NO：11所显示的序列，它符合全部的四个必需条件，也可以具有如SEQ ID NO：21所显示的序列，它符合四个必需条件中的三个。这两种类型的序列都在本发明提供的范围之内。
在一些实施例中，IFBM经过构建使其摹拟蛋白质生长因子的生物效应。在这些实施例中，分析物单元包括一种多肽，其含有与BMP受体BMPRI结合的氨基酸序列，还含有与BMP受体BMPRII结合的氨基酸序列(例如，参见实施例6)。这些受体是本领域公知的，并且可在市场上买到(例如，R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，目录号315-BR和811-BR)。在这些实施例中，分析物单元具有经测量的BMP活性，例如，通过本领域公知的方法以及实施例6中所描述的方法进行测量。尽管本发明不限于任何特定的作用机制，但我们相信，通过将每个BMPRI和BMPRII结合，分析物单元将会促进这些受体的异源二聚作用，从而触发经由BMP-SMAD通路的信号。以这样的方式，IFBM可被构建并用于涂在植入物表面，以便触发经由BMP-SMAD通路的信号，而不用添加BMP本身。一般来说，在天然的BMP-SMAD通路中，BMP的I型和II型受体的异源二聚体是必需的信号(例如，参见Chen等，(2004)Growth Factors 22：233-241)。二聚体形成使I型和II型受体的胞质结构域得以接近，使得结构活化的II型受体激酶能磷酸化I型受体。I型受体的胞质结构域的磷酸化激活其潜在的激酶活性，进而激活Smad蛋白。从受体上释放后，磷酸化的Smad蛋白与Smad4结合，该复合物转运到核内，与其它蛋白一起具有转录因子的功能并调节基因应答(Chen等，(2004)Growth Factors 22：233-241)。总起来说，这可以称为是下游的Smad或BMP-SMAD信号转导通路，并且基因藉此而被激活。作为Smad或BMP-SMAD通路活化的结果而生成的蛋白可被称为Smad活化的下游蛋白产物。
作为本发明的结合单元的多肽可以通过本领域技术人员公知的任何多肽合成方法合成。例如，代表性的技术可以参见Stewart&Young(1969)固相多肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)，(Freeman，旧金山，加利福尼亚)；Merrifield(1969)Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.32：221-296；Fields&Noble(1990)Int.J.Pept.Protein Res.35：161-214；和Bodanszky(1993)多肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis)，2nd Rev.Ed.(Springer-Verlag，柏林)。典型的固相合成方法可以参见Andersson等，(2000)Biopolymers 55：227-250，其中引用的参考文献，以及美国专利第6,015,561号；第6,015,881号；第6,031,071号；和第4,244,946号。液相中的多肽合成记载于
Figure A20091014992400141
和Lübke(1965)多肽(The Peptides)(Academic出版社，纽约，纽约州)。用于多肽合成中的适当的保护基团记载于上述文献以及McOmie(1973)有机化学中的保护基团(ProtectiveGroups in Organic Chemistry)(Plenum出版社，伦敦)。多肽，包括含有非遗传编码氨基酸的多肽，还可以在无细胞翻译系统中生成，例如，Shimizu等，(2001)NatBiotechnol 19：751-755所记载的系统。另外，具有指定氨基酸序列的多肽可以从商业来源购买(例如，Biopeptide公司，LLC，圣地亚哥，加利福尼亚；以及PeptidoGenics，利弗莫尔，加利福尼亚)。
结合单元之间通过至少一个接头连接以形成本发明的IFBM。在一些实施例中，组成IFBMs的粘接单元是合成的单一连续多肽；在这些实施例中，接头只不过是多肽中的一个键。在本发明的其它实施例中，接头可以由聚合物组成，包括合成聚合物或天然聚合物。可用作接头的典型的合成聚合物包括但不限于：聚醚(例如，聚乙二醇；PEG)、聚酯(例如，聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)、聚酰胺(例如，尼龙)、聚胺、聚丙烯酸、聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯，及其它分子量为大约200道尔顿至大约1,000千道尔顿的合成聚合物。可用作接头的典型的天然聚合物包括但不限于：透明质酸、藻朊酸盐、硫酸软骨素、纤维蛋白原、粘连蛋白、白蛋白、胶原，及其它分子量为大约200道尔顿至大约20,000千道尔顿的天然聚合物。聚合的接头可以包括二嵌段聚合物、多嵌段共聚物、梳形聚合物、星形聚合物、枝状聚合物、杂化的线形-枝状聚合物，或无规共聚物。
接头还可以包括巯基(氨基)羧酸、丙烯酰胺羧酸、丙烯酰胺-胺基三乙撑羟基乙酸，及其衍生物。例如，可参见美国专利第6,280,760号。如果接头包含多肽，该多肽可以包括公知的具有特定生物功能的序列，例如YGD和GSR。
将接头分子与结合结构域连接的方法根据每个分子上存在的活性基团而有所不同。利用活性基团和分子连接的方案是本领域技术人员所公知的。例如，可参见Goldman等，(1997)Cancer Res.57：1447-1451；Cheng(1996)Hum.Gene Therapy 7：275-282；Neri等，(1997)Nat.Biotechnol.19：958-961；Nabel(1997)Current Protocols in Human Genetics，它记录在CD-ROM(John Wiley&Sons，纽约)上；Park等，(1997)Adv.Pharmacol.40：399-435；Pasqualini等，(1997)Nat.Biotechnol.15：542-546；Bauminger&Wilchek(1980)Meth.Enzymol.70：151-159；美国专利第6,280,760号和第6,071,890号；以及欧洲专利第0439095号和第0712621号。
包覆医疗器件表面可通过任何适当的方法进行，例如，通过浸渍、喷雾，或在器件上刷涂IFBM。涂层可以经稳定处理，例如，通过干燥或通过冷冻干燥。但是，这些处理不是排他的，其它的涂层和稳定方法也可应用。适当的方法在本领域中是已知的。例如，可参见Harris等，(2004)Biomaterials 25：4135-4148以及美国专利申请第10/644,703号，其于2003年8月19日申请，2004年5月6日公布，公开号是20040087505。
以上特别提到的全部出版物和专利申请是本发明所从属的领域中的技术人员水平的代表。本发明引入全部的出版物和专利申请作为参考，其程度就好象特别指出每一个出版物或专利申请引入作为参考一样。
存在于上述说明和相关附图中的教导将有利于启发本发明所属领域的技术人员对本文所阐述的本发明的许多更改及其它实施例。因此，本发明应被理解为不限于所公开的特定实施例，而是应当理解为对本发明的更改以及其它实施例也包括在所附的权利要求的范围之内。尽管本发明使用了专用名词，但它们也可以用于一般的和描述性的意义，只是其目的不是用于限制。
实验方法
实施例1：分离结合钛的多肽
十种不同的噬菌体展示文库用于筛选与钛珠结合的多肽。用70％乙醇、40％硝酸、蒸馏水、70％乙醇，和丙酮清洗直径约5/32英寸的钛(Ti6Al4V)珠，以除去任何表面污染物。将每一个钛珠放置于96-孔的聚丙烯平板(Nunc)的每个孔中。
钛上面的非特异性结合部位和聚丙烯表面用溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS；Sigma化学公司，圣路易斯，密苏里州，目录号P-3813)中的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭。平板在室温下以50rpm摇动保温1小时。然后将孔用300μl PBS洗5遍。每个文库稀释在PBS+1％BSA中，以1010pfu/ml的浓度加入250μl。室温下以50rpm摇动培养3小时后，用300μl磷酸盐缓冲液-TweenTM 20(PBS-T；Sigma化学公司，圣路易斯，密苏里州，目录号P-3563)清洗3次除去未结合的噬菌体。为了回收结合到钛珠上的噬菌体，结合的噬菌体通过用50mM甘氨酸，pH 2处理10分钟，然后用100mM乙醇胺，pH 12处理10分钟而释放出来。将洗脱的噬菌体集中，用200μl的200mM NaPO4，pH 7溶液中和。将洗脱的噬菌体和小珠直接加入处于2xYT培养基中的E.coli DH5αF′细胞。混合物在37℃，210rpm的摇床中保温过夜。8500xg旋转离心10分钟后收集噬菌体上清液。第二轮和第三轮的选择按照第一轮类似的方式进行，利用第一轮中得到的扩增的噬菌体50μl作为进料，用200μl PBS+1％BSA稀释。第四轮的选择按照类似的方式进行；但是洗涤方法改变。经过4小时的结合反应，珠子用PBS-T(Sigma化学公司，圣路易斯，密苏里州，目录号P-3563)洗涤五遍，将珠子转移到一个干净的具有2ml孔的聚丙烯平板中，向每孔中加入1ml PBS+1％BSA，并在室温下以50rpm摇动培养过夜。次日早晨以第1-3轮所述的相同方法洗脱和扩增噬菌体。然后分离单克隆噬菌体并通过对噬菌体池进行平板稀释检测以获得单个的噬菌斑。
为了检出与钛特异结合的噬菌体，利用缀合到HRP上的抗-M13噬菌体抗体进行常规ELISAs，然后加入显色剂ABTS。噬菌体的相对结合强度通过ELISA中对与钛结合的噬菌体连续稀释而决定。
测定编码特异结合钛的多肽的DNA序列。编码多肽插入片段的序列位于噬菌体基因组内，经翻译产生相应的展示在噬菌体表面的氨基酸序列。
与钛特异结合的典型多肽列于表I并显示在SEQ ID NOs：1-8。展示这些多肽的噬菌体与钛珠的结合如图1所示。
表1：钛结合多肽
  克隆编号   合成多肽编号   展示的多肽   SEQ.ID.NO.
  AP06-22   AFF-6002   SSHKHPVTPRFFVVESR   1
  AP06-23   AFF-6003   SSCNCYVTPNLLKHKCYKICSR   2
  AP06-24   AFF-6004   SSCSHNHHKLTAKHQVAHKCSR   3
  AP06-25   AFF-6005   SSCDQNDIFYTSKKSHKSHCSR   4
  AP06-26   AFF-6006   SSSSDVYLVSHKHHLTRHNSSR   5
  AP06-27   AFF-6007   SSSDKCHKHWYCYESKYGGSSR   6
  AP06-28   HHKLKHQMLHLNGG   7
  AP06-29   GHHHKKDQLPQLGG   8
然后合成带有C-末端生物素残基的展示多肽，并测试其与钛的结合。结果如图2所示。简单地说，将粉末溶于100％DMSO中配制1mM的多肽溶液作为多肽贮液。将多肽用PBS-T连续稀释。钛珠用溶于PB S中的1％脱脂奶粉封闭，与不同浓度的多肽在室温下摇动保温1小时。珠子用PBS-T洗3遍。加入购自USB(美国生化试剂公司，目录号11687)的抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶(SA-AP)(与PBS-T 1∶1000)并在室温下摇动保温1小时。珠子用PBS-T洗三遍，加入PNPP(Sigma-Aldrich公司，SigmaFast片剂，目录号N1891)，并显色大约10分钟测定多肽：SA-AP的量。将溶液转移到一个透明的微量滴定板中，在分子动力学平板读数器上进行405nm吸光度读数，通过这种方式进行定量。多肽“9003”是本领域中公知的。该多肽是通过与己糖激酶结合的噬菌体展示而鉴定出来的；它作为本实验的阴性对照(例如，可参见Hyde-DeRuyscher等，(2000)Chem.Biol.7：17-25)。
实施例2：半胱氨酸残基在钛-结合多肽6007中的作用
为了研究半胱氨酸残基和二硫结构在多肽6007与钛结合中的作用，把存在于钛-结合多肽AFF6007中的半胱氨酸残基转换为丝氨酸残基，从而合成AFF6010(表2)。多肽AFF6010的序列(SSSDKSHKHWYSYESKYGGSGSSGK)显示于SEQ ID NO：9，而多肽AFF6007的序列(SSSDKCHKHWYCYESKYGGSGSSGK)显示于SEQ ID NO：10。然后将多肽AFF6007和AFF6010与生物素缀合，并按下面的方法比较其与钛珠的结合。
钛珠在室温下用溶于PBS中的1％BSA封闭30分钟。多肽AFF6007和AFF6010的贮液通过将1-2mg多肽溶于水中而制备。每种多肽的最终浓度利用280nm下的吸光度和每种多肽的吸光系数而确定。AFF6007和AFF6010制备成200μM。然后对每种多肽样品制备稀释系列。将每种多肽用溶于PBS中的1％BSA稀释三倍。
将多肽与钛珠在室温下保温1小时。接着用PBS/TweenTM 20把珠子洗两遍。然后把抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶以1∶500加入钛珠，在室温下保温30分钟。用PBS/TweenTM 20把珠子洗两遍。用PNPP进行显色检测，记录405nm吸光度。
结果如图3所示，证明多肽AFF6007和AFF6010都与钛结合。一种评价多肽与钛的相对亲合力的方法是测定能产生最大信号的一半时的多肽浓度(表2)。完全消除AFF6007中的半胱氨酸残基使多肽与钛的亲合力下降了大约10倍，但没有使亲合力消失(表2)。因此，半胱氨酸不是与钛结合所必不可少的，但它确实增强了多肽与钛的亲合力。
表2：钛-结合多肽的相对亲合力
样品   [多肽]1/2最大信号
  AFF6007   0-35μM
  AFF6010   3μM
实施例3：特异结合骨形态发生蛋白2(“BMP-2”)的多肽
多肽的分离和分析
十种不同的噬菌体展示文库用于筛选与BMP-2结合的多肽。BMP-2(Medtronic)用NHS-生物素(Pierce)生物素化以制备标记蛋白，平均每个蛋白质分子结合一个生物素。该蛋白固定在抗生物素蛋白链菌素(SA)包覆的平板上，作为噬菌体展示的对象。还有另一种展示蛋白的方法，根据厂家说明(Amersham-Pharmacia，参考编号18-1022-29，标题为“Coupling through thePrimary Amine of a Ligand to NHS activated Sepharose 4 Fast Flow”，105-108页)利用NHS-琥珀酰亚胺化学作用，使BMP-2与琼脂糖凝胶珠结合起来，并且珠子用作固相来分离未结合的噬菌体。经过3轮选择后，对于每种形式中选出的单独的克隆测试其与SA包覆的平板上的BMP-2的结合能力，测试利用常规ELISA技术进行，利用与HRP缀合的抗-M13噬菌体抗体，然后加入显色剂ABTS。
测定编码特异结合BMP-2的多肽的DNA序列。编码多肽插入片段的序列位于噬菌体基因组内，经翻译产生相应的展示在噬菌体表面的氨基酸序列。与BMP-2特异结合的典型多肽列于表3并显示在SEQ ID NOs：11-26。在一些实施例中，本发明的示范性的结合单元只包括序列中以大写字母显示的部分。
表3：特异结合BMP-2的多肽
  克隆编号   合成的多肽编号   序列   SEQ.ID.NO.
  AP02-45   AFF-2011   ssDWGVVASAWDAFEALDAsr   11
  AP02-46   ssGADFGYGSWVSFSALSAsr   12
  AP02-47   srGEASGWEAFSALEAAVVsr   13
  AP02-48   AFF-2006   srSSDSAFSSFSALEGSVVsr   14
  AP02-49   srDGAGAAAWGAFSALASEsr   15
  AP02-50   AFF-2007   srGGEAAAGAWVSFSALESsr   16
  AP02-51   srVSGVAAWEAFAGLSVSSsr   17
  AP02-52   AFF-2010   srDGGSFSAFSSLVWAADSsr   18
  AP02-53   ssVAGDVGSSWAAFASLAAsr   19
  AP02-54   AFF-2008   ssWEVFSSLESGSVGAGAGsr   20
  AP02-55   ssSSGAVSSFESLSGSVVSsr   21
  AP02-56   srEGVAWEAFGALSSFAADsr   22
  AP02-57   ssWGLASEASFFSFSALSSsr   23
  AP02-58   srEGAAWDSFFALSGGSAAsr   24
  AP02-59   AFF-2012   ssSVDLYFPLKGDVVsr   25
  AP02-60   AFF-2009   ssFEPLRFPLKGVPVsr   26
鉴定出的多肽属于2种不同的“序列簇”。每个序列簇含有一个共有序列基元。对于BMP-结合多肽的第一个序列簇，其共有基元(命名为“基元1”，并显示于SEQ ID NO：27)是芳香氨基酸-X-X-Phe-X-“小氨基酸”-Leu(芳香氨基酸＝Trp，Phe，或Tyr；X＝任何氨基酸；“小氨基酸”＝丝氨酸，苏氨酸，Ala，或甘氨酸)。基元1至少有一部分存在于SEQ ID NOs：11-24，如上面表3所示。第二个序列簇基元(还显示于SEQ ID NO：28)包含序列(Leu或Val)-X-Phe-Pro-Leu-(Lys或Arg)-Gly。该基元命名为基元2，存在于SEQ IDNOs：25和26，如上面表3所示。示范性的结合单元还包括那些满足本发明所鉴别出的这个和其它序列基元要求的序列(即，那些包含属于这些基元序列的序列)。
其它实验旨在确定与BMP-2结合的序列的附加特征。具体地说，为了确定这些基元周围是否存在额外的优选的氨基酸，进行进一步的筛选。设计中心文库并克隆入mAEK噬菌体展示载体中，对于得到的噬菌体筛选与BMP-2结合的噬菌体，如下面进一步详述。设计基元1的中心文库，使其表达含有下列序列的多肽：X-X-X-X-X-(W/L/C/Y/F/S)-X-X-(W/L/C/Y/F/S)-X-(A/G/N/S/T)-(L/F/I/M/V)-X-X-X-X-X，其中X代表20种天然氨基酸的任何一种，括号中的位置只限于括号中所列氨基酸。这些多肽由包含序列5′-GATCCTCGAGNNNKNNKNNKNNKNNKTNBNNKNNKTNBNNKRSYNTKNNKNNKNNKNNKNNKTCTAGAGCGCTACG 3′的寡核苷酸编码的(其中“N”是4种核苷酸A，G，C或T中的任何一种；“K”是G或T；“R”是A或G；“S”是C或G；“B”是C，G，或T；和“Y”是C或T)。设计基元2的中心文库，目的是使其表达包含下列序列的多肽：X-X-X-(L/F/I/M/V)-X-(W/L/C/Y/F/S)-(P/S/T/A)-(L/F/I/M/V)-(I/M/T/N/K/S/R)-X-X-X-X-X-X-X-X。这些多肽由包含以下序列的寡核苷酸编码：5′-GATCCTCGANNNKNNKNNKNTKNNKTNBNCKNTKANKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTCTAGAGCGCTACG 3′。
下面提供关于基元1中心文库的示范性的文库构建方案。本领域技术人员可以领会，近似的策略可用于其它文库。为了生成基元1的中心文库，合成包含连接有适当的限制酶位点的上述序列的寡核苷酸。该寡核苷酸包含序列：5′-GATCCTCGAGNNNKNNKNNKNNKNNKTNBNNKNNKTNBNNKRSYNTKNNKNNKNNKNNKNNKTCTAGAGCGCTACG-3′。在该序列中，下划线标注的序列CTCGAG和TCTAGA代表用于将文库转入噬菌体载体的XhoI和XbaI限制酶位点。将该寡核苷酸与短引物退火，用DNA聚合酶合成互补链。得到的双链DNA分子用XhoI和XbaI消化，克隆到噬菌体展示载体中。连接的DNA转化到适当的细菌宿主并进行扩增，以产生噬菌体文库。
如上所述，利用固定在抗生物素蛋白链菌素包覆的平板上的生物素化的BMP-2筛选与BMP-2结合的基元1和基元2中心文库。经过两轮的BMP-2选择后，文库已经富集了结合BMP-2的噬菌体展示多肽。富集的噬菌体池在细菌细胞的菌苔上铺板，以分离单株噬菌体。利用ELISA-典型检测和缀合于HRP上的抗-M13噬菌体抗体(Amersham Biosciences公司，编号27-9421-01)检验单株噬菌体克隆与BMP-2的结合，然后加入显色试剂ABTS(Sigma化学公司，圣路易斯，密苏里州，目录号A3219)。
确定编码特异结合BMP-2的多肽的DNA序列。编码插入多肽的序列位于噬菌体基因组内，并经过翻译产生相应的氨基酸序列，展示于噬菌体表面。
特异结合BMP-2的基于基元的中心文库的典型多肽列于表4和5，并显示于SEQ ID NOs：44-71和77-92。在一些实施例中，本发明的示范性的结合单元只包含序列中大写字母所示的部分，或只包含属于一个基元或基于这些序列所鉴别出的共有序列(即，包括一个属于基元1，基元1a，或基元2范围之内的序列，或包含SEQ ID NO：72，74，或93所鉴别出的共有序列)。
表4：来自基元1中心文库的BMP结合多肽
  克隆标识符   序列   SEQ.ID NO.
  AP02-01   ssAPLTESEAWRGF SKLEVsr   44
  AP02-02   ssSMPVGWDSWRGLEWSDRsr   45
  AP02-03   ssEGRGGWNSWEAFRELVVsr   46
  AP02-04   ssGGGGAWESWRGLSGVELsr   47
  AP02-05   srNVEGSWESFAGLSHVREsr   48
  AP02-06   srEDGGRWESFLGLSAVEVsr   49
  AP02-07   ssVEGSAWSAFKSLSSEGVsr   50
  AP02-08   srVEGGAWQALAGLTVERVsr   51
  AP02-09   ssPPKHAWGSFDALGGQVVsr   52
  AP02-10   ssERGVGWEVFLAMEGARMsr   53
  AP02-11   ssSSSGTWQAFTGLSGERVsr   54
  AP02-12   ssSPGGGSGGWDAFYSLVGsr   55
  AP02-13   ssGGGGGGEGFSSLSGNGRsr   56
  AP02-14   ssTGGGSWEEFKAMTPSWTsr   57
  AP02-15   ssEGSGLWDSFSSLSVHEVsr   58
  AP02-16   ssGVTQESASWSSFRTLAVsr   59
  AP02-17   ssSKVAPSGEWRSFATLEVsr   60
  AP02-18   ssEAGRGWEGFKALEGYQVsr   61
  AP02-19   ssLGQTGWEAFESLSGTRGsr   62
  AP02-20   ssVAWDAFTVFESLEGVATsr   63
  AP02-21   ssEVVEPWEWWVALERAGGsr   64
  AP02-22   srVAAVSWEFFGSLSSAGVsr   65
  AP02-23   ssADLGVSGSWEGFALMRGsr   66
  AP02-24   ssVGQMGWEAFESLSGTGGsr   67
  AP02-25   ssGQGETWEWFAGMRGSVAsr   68
  AP02-26   ssYFDVFSSMTGTRAAGSWsr   69
  AP02-27   ssAYSVFSSLRADNSGGAVsr   70
  AP02-44   ssGGIASLKYDVVKTWEsr   71
图7显示结合BMP-2并且包含基元1的选自表3和6的所有多肽序列的分析结果。从40种含有基元1的BMP-结合序列的比对中可推导出一个共有序列(Gly-Gly-Gly-Ala-Trp-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Leu-Ser-Gly-Ser-Arg-Val；SEQ  IDNO：72)，它代表了在所有多肽进行比对之后在每个位置出现的占优势的氨基酸。在40种序列中，最保守的氨基酸形成一个核心结合基元，代表了含有基元1的所有序列的子集。该基元命名为“基元1a”，具有序列Trp-X-X-Phe-X-X-Leu(SEQ ID NO：73)。尽管本发明不限于任何特定的作用机理，但我们相信，在这些基元中，多肽中的Trp，Phe，和Leu残基参与和BMP-2蛋白的特异性相互作用，与多肽和BMP的结合有关。在此基础上，我们假设其它的包含这些核心结合基元的多肽也可以结合BMP。
为了检验这种看法，设计一种寡核苷酸盒，使其表达包含这种核心结合基元1a的多肽，在多肽序列中还包含与核心结合基元结合的、经鉴定出来的共有残基(参见图8；SEQ ID NO：74)。附带地，以前通过噬菌体展示分离的BMP-结合多肽中实际上没有一个包含一模一样的序列(例如，参见表4)。把寡核苷酸盒克隆到mAEK噬菌体展示载体中，产生的噬菌体，命名为AP02-61，用来检验与BMP-2的结合，并与其它展示BMP-结合多肽的噬菌体比较(一些噬菌体的结果示于图9)。至少有一种检验的噬菌体(命名为AP02-37)显示的结合水平相当于或低于展示载体mAEK。在一些实施例中，本发明的示范性的结合单元只包括序列中以大写字母显示的部分。
表5：来自基元2中心文库的BMP-结合多肽
  克隆标识符   序列   SEQ.ID.NO.：
  AP02-28   ssEGVGGFPIKGIPQEAWAsr   77
  AP02-29   ssPSGVVFPLRGELLGVXKsr   78
  AP02-30   ssGGFVPFPLRGEVWDGVHsr   79
  AP02-31   ssEGSLSFPLKGQVYSGWGsr   80
  AP02-32   ssGKPLEFPLRGTLAEWPVsr   81
  AP02-33   srGEALGFPLTGQLMEAAEsr   82
  AP02-34   ssMWDVGFPLKGRWIDGADsr   83
  AP02-35   ssSNSLWFPLRGSTVEVGAsr   84
  AP02-36   ssGPALRLPLRGTVVSDVPsr   85
  AP02-37   ssADRVAWPLKGAPVWVKEsr   86
  AP02-38   ssGLALGLPIKGWTVSGKDsr   87
  AP02-39   ssGYTLGFPLSGQTIKDWPsr   88
  AP02-40   ssEGWVHFPLKGDVMGGPFsr   89
  AP02-41   ssGRYVSLPLKGEVVPQTAsr   90
  AP02-42   ssEGGVGFPLKGIPQEAWAsr   91
  AP02-43   srVDSVNFPLRGETVTSMVsr   92
对表3和7中包含基元2的多肽进行比对可以得到一个共有序列(Gly-Gly-Ala-Leu-Gly-Phe-Pro-Leu-Lys-Gly-Glu-Val-Val-Glu-Gly-Trp-Ala；SEQID NO：93；参见图10)，它代表着在所有的多肽进行比对之后，在每个位置占优势的氨基酸。在所研究的序列中，最保守的氨基酸形成一个核心结合基元，命名为“基元2a”，具有序列Leu-X-Phe-Pro-Leu-Lys-Gly (SEQ ID NO：94)。
基元2相比基元1在序列上有更多限制，表现在基元2在6个位置具有必需条件，而基元1只在三个位置具有必需条件。基元2中的Pro和Gly残基看来对于结合是必不可少的，因为每个包含基元2的BMP-结合多肽都在其核心结合基元中含有Pro和Gly残基。利用基元2的共有序列信息，可将基元2核心结合基元合并到多肽序列中而设计BMP-结合多肽。
制备合成多肽和BMP-2结合测定
然后合成一套典型的具有C-末端生物素残基的展示多肽，并检测其与BMP-2的结合。结果显示于图4。简单来说，将粉末溶于100％DMSO制备成10mM的多肽溶液作为贮液，然后加入水至最终贮存浓度为溶于10％DMSO的1mM的多肽。将多肽用PBS-T连续稀释。将浓度从100nM到0.1nM的BMP-2系列稀释剂固定在微量滴定板(Immulon-HBX，购自Dynex科技公司，尚蒂伊，弗吉尼亚)的孔上并用1％BSA封闭。这些平板与不同浓度的多肽在室温下摇动保温1小时。珠子用PBS-T洗3遍。加入购自USB(美国生化试剂公司，抗生物素蛋白，目录号11687)的链菌素-碱性磷酸酶(SA-AP)(1∶1000于PBS-T中)并在室温下摇动保温1小时。用PBS-T把平板洗3遍，加入PNPP(Sigma-Aldrich公司，SigmaFast片剂，目录号N1891)确定多肽：SA-AP的量并显色10分钟。在分子动力学平板读数器上对405nm吸光度读数进行定量。结果总结在图4中。
为了印证这些BMP结合结果，还对这些多肽进行另一种形式的测定，使多肽与BMP2在溶液中结合然后进行测定。简单来说，合成一种多肽，在该多肽的C-末端的赖氨酸残基的氨基上结合一个生物素基团。使生物素化的多肽(0-12皮摩尔)与BMP-2(0-25皮摩尔)在溶液中混合，并在聚丙烯平板中于37℃保温30分钟。将溶液转入一个抗生物素蛋白链菌素包覆的平板中并在37℃保温1小时，以俘获生物素化的多肽。用TBS-TweenTM 20洗涤平板，然后与抗-BMP抗体(1∶1000稀释；R&D systems)在室温下保温1小时。洗涤后，向平板中加入碱性磷酸酶标记的次级抗体，然后在室温下保温30分钟。用TBS-TweenTM20洗涤平板，用发光的AP底物pNPP检测结合的抗体。典型的结果示于图11。根据该数据，估算出每种BMP-结合多肽与BMP-2的亲合力(表6)。
表6：估算出的BMP结合多肽与BMP-2的亲合力
  多肽   估算出的亲合力(nM)
  2012   9
  2009   10
  2006   21
  2011   55
  2007   79
  2008   99
BMP-2结合多肽与其它BMP蛋白的结合
骨形态发生蛋白(BMPs)是TGF-β超家族的成员，包括BMPs，转化生长因子-β(TGF-β)和生长/分化因子(GDFs)。TGF-β超家族中的蛋白在结构上非常类似。蛋白骨架的折叠结构在该家族的所有成员中都基本相同。基于BMPs结构上的类似性，我们检测了一些BMP-2结合多肽与BMP-4和BMP-7的结合能力。用上面所述的方法检测生物素化的多肽2007和2011与BMP-2，BMP-4，以及BMP-7的结合。2007和2011都与三种BMPs结合，而一个与无关目标结合的多肽(AFF-9001)不与任何BMPs结合(图12)。
实施例4：把BMP-2固定在胶原上以制备IFBM
为了设计具有胶原和BMP-2结合性质的分子，制备一类IFBM，其包括一个与胶原结合的多肽和一个与BMP-2结合的多肽。这类“杂合多肽”IFBM示于表7。
表7：与胶原和BMP-2结合的IFBMs
  IFBM编号 多肽 多肽序列   SEQIDNO：
  AFF7005   2009-0016   SSFEPLRFPLKGVPVSRGSSGKDVNSIWMSRVIEWTYDS-NH2   29
  AFF7006   0016-2009   DVNSIWMSRVIEWTYDSGSSGKSSFEPLRFPLKGVPVSR-NH2   30
  AFF7007   2006-0016   SRSSDSAFSSFSALEGSVVSRGSSGKDVNSIWMSRVIEWTYDS-NH2   31
  AFF7008   0016-2006   DVNSIWMSRVIEWTYDSGSSGKSRSSDSAFSSFSALEGSVVSR-NH2   32
  AFF7009   2012-0016   SSSVDLYFPLKGDVVSRGSSGKDVNSIWMSRVIEWTYDS-NH2   33
  AFF7010   0016-2012   DVNSIWMSRVIEWTYDSGSSGKSSSVDLYFPLKGDVVSR-NH2   34
  AFF7014   2007-0016   SRGGEAAAGAWVSFSALESSRGSSGKDVNSIWMSRVIEWTYDS-NH2   35
  AFF7015   0016-2007   DVNSIWMSRVIEWTYDSGSSGKSRGGEAAAGAWVSFSALESSR-NH2   36
  AFF7016   2011-0016   SSDWGVVASAWDAFEALDASRGSSGKDVNSIWMSRVIEWTYDS-NH2   37
  AFF7017   0016-2011   DVNSIWMSRVIEWTYDSGSSGKSSDWGVVASAWDAFEALDASR-NH2   38
如表7所示，每种IFBM在一个“杂合多肽”中包含来自AFF0016的胶原结合结构域，该结构域与一个短的接头序列结合，然后连接有一个来自上述实施例的BMP结合序列。这些分子有两种合成方向，以评估N-末端或C-末端位点对于IFBM与胶原或BMP-2结合的能力的影响。
为了确定这些IFBM’s是否通过胶原海绵提高了BMP的数量，我们把IFBM与BMP混合，将混合物加入海绵，使其结合1.5小时，洗涤海绵并用抗BMP抗体检测结合的BMP。简单来说，称取1-2mg多肽并溶于水中来制备IFBM贮液。分析280nm的多肽吸光度和消光系数以确定最终的多肽浓度。向聚丙烯微量滴定板的每一排的每一孔中加入20μL的多肽。然后向这些孔的每一个中加入BMP三倍稀释剂系列，从32μM BMP开始。使IFBM和BMP在室温下混合30分钟。
向每一个孔中加入一个2/16直径胶原海绵(Medtronic)。胶原和多肽溶液在室温下保温1.5小时。然后把海绵用200μL的Medtronic缓冲液在2200rpm离心1分钟漂洗3遍上。向每一个海绵中加入抗BMP的初级抗体(1∶1000，R&DSystems#MAB3552)，在室温下保温1小时。然后向体系中加入缀合于碱性磷酸酶(1∶5000)的次级抗体，在室温下保温0.5小时。向体系中加入PNPP显色，对405nm的吸光度进行读数。结果示于图5。
图5中所示结果证明，IFBM AFF7010比没有IFBM的海绵保留了更多的BMP。IFBM AFF7008和AFF7017相比不含IFBM提高了海绵上的BMP，但提高程度比AFF7010要差一些。加入AFF2006没有提高在海绵上保留的BMP，AFF2006是一种不含有胶原结合序列的BMP结合多肽。
为了证明这种效果不仅对于放在海绵上的BMP的数量是剂量依赖性的，而且对于所呈递的IFBM的数量也是剂量依赖性的，制作一系列二维剂量反应曲线，其中IFBM和BMP的浓度都发生变化。这些结果示于图6A-6D，证明BMP与胶原海绵的结合既依赖于BMP浓度，也依赖于IFBM浓度。提高IFBM(AFF7005，AFF7006，AFF7009，或AFF7010)的浓度使得胶原上保留更大数量的BMP-2。
实施例5：与不锈钢结合的多肽
对于不锈钢结合多肽的选择按照上述的钛结合多肽进行，只是用5/32英寸不锈钢珠替代了钛珠。分离的不锈钢结合多肽示于表8。在一些实施例中，本发明的示范性的结合单元只包含序列中大写字母部分。
表8：不锈钢结合多肽
  噬菌体名称   多肽序列   SEQ IDNO：
  AP08-03   ssSSYFNLGLVKHNHVRHHDSsr   39
  AP08-02   ssCHDHSNKYLKSWKHQQNCsr   40
  AP08-01   ssSCKHDSEFIKKHVHAVKKCsr   41
  AP08-04   ssSCHHLKHNTHKESKMHHECsr   42
  AP08-06   ssVNKMNRLWEPLsr   43
实施例6：与特氟隆结合的多肽
按照上面选择钛结合多肽的方法选择与特氟隆(Gore
Figure A20091014992400241
polytetrafuorethylene(PTFE))结合的多肽，只是用GoreTex材料代替钛珠。分离的特氟隆结合多肽示于表9。在一些实施例中，本发明的示范性的结合分子包括的只有以大写字母所示的序列。
表9：特氟隆结合多肽
  克隆编号   多肽序列   SEQ.ID.NO.：
  AP16-01   ssCWSRFRLFMLFCMFYLVSsr   95
  AP16-02   srCIKYPFLYCCLLSLFLFSsr   96
实施例7：分离特异性结合BMPRI和/或BMPRII的多肽
鉴定与BMPRI和/或BMPRII结合的多肽：为了鉴别出特异结合骨形态发生蛋白受体I(BMPRIA)和/或骨形态发生蛋白受体II(“BMPRII”)的多肽，筛选噬菌体展示文库来鉴别编码结合到每种受体细胞外结构域的多肽的噬菌体。这些受体的细胞外结构域对于本领域是公知的(Rosenweig等，(1995)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 92：7632-7636；Ten Dijke等，(1994)J.Biol.Chem.269：16985-16988)。对各个噬菌体文库进行筛选。适当的，可对围绕一个特定的氨基酸基元设计的，或者说产生特定氨基酸偏好的噬菌体文库进行筛选。把BMPRIA和BMPRII(R&D Systems，目录号315-BR/CF和811-BR)溶于碳酸盐涂层缓冲液(100mM NaHCO3，pH 9.6)；将100μl的这种溶液加入96孔的
Figure A20091014992400251
-4微量滴定板(Dynex Technologies，尚蒂伊，弗吉尼亚)。将平板在4℃保温过夜，用溶于碳酸盐包被缓冲液中的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭聚苯乙烯表面的非特异性结合部位。然后将平板在室温下以50rpm摇动保温一小时。然后用300μlPBS-T(Sigma化学公司，圣路易斯，密苏里州，目录号P-3563)把孔洗5遍。用PBS-T稀释每种文库，并以1010pfu/ml的浓度加入，总体积为100ul。平板在室温下以50rpm摇动保温3小时；未结合的噬菌体通过PBS-T洗5遍而除去。利用0.1M结合的噬菌体甘氨酸缓冲液pH 2.2(参见Phage Display of Peptidesand Proteins：A Laboratory Manual，1996，eds.Kay等，(Academic出版社，圣地亚哥，加利福尼亚))变性回收未结合的噬菌体。用磷酸缓冲液中和洗脱下来的的噬菌体，并加入悬浮于2x YT培养基中的E.coli DH5α细胞。使混合液在37℃以210rpm摇动保温过夜。以8500xg离心10分钟回收噬菌体上清液。第二轮和第三轮的选择利用第一轮近似的方式进行，以上一轮的噬菌体作为进料噬菌体。噬菌体展示技术对于本领域是公知的，例如，可参见：Sparks等，(1996)“Screening phage-displayed random peptide libraries”227-253页，Phage Displayof Peptides and Proteins：A Laboratory Manual，Kay等主编(Academic出版社，圣地亚哥，加利福尼亚)。
为了鉴别特异结合BMPRIA或BMPRII的噬菌体，利用一种缀合于辣根过氧化酶(HRP)的抗M13噬菌体抗体进行常规ELISAs，然后加入显色剂ABTS(Sigma化学公司，圣路易斯，密苏里州，目录号A3219)。噬菌体的相对结合强度通过测定在ELISA中噬菌体的系列稀释液与BMP受体的结合而确定。分离编码每种所选择的多肽的DNA并进行测序，以确定所选择出的多肽的氨基酸序列。
然后将这些多肽连接以产生能与每一个BMPRI和BMPRII结合的分析物单元，形成这两种受体的异源二聚体，以诱导信号。合成候选多肽并进行生物素化，并证实其与BMP受体的结合。简单来说，合成生物素化的多肽，多肽中带有一个接头，位于BMP受体结合序列与连接的生物素部分之间。接头具有氨基酸序列GSSGK，它的作用是将生物素部分与受体结合部分分开，并且具有柔性。在Rainin Symphony多肽合成仪(Rainin器械公司，Emeryville，加利福尼亚)上利用标准Fmoc化学法，采用固相多肽合成技术合成多肽。N-α-Fmoc-氨基酸(带有垂直侧链保护基)可购自Novabiochem(Calbiochem-Novabiochem公司，Laufelfingen，瑞士)。当所有的残基都被偶联以后，利用三氟乙酸(TFA)混合物处理而同时裂解和对侧链解保护。用冷的二乙醚沉淀粗肽，并利用高效液相色谱纯化，纯化在Vydac C18二氧化硅柱(预制为10μm，250mmx22mm；GraceVydac公司，Hesperia，加利福尼亚)上的Shimadzu Analytical/Semi-preparativeHPLC单位进行，利用含有0.1％TFA线性梯度水/氰甲烷高效液相色谱纯化。合成的多肽的均一性通过分析型RP-HPLC(Vydac C18二氧化硅柱，10μm，250mmx4.6mm)进行评价，并利用MALDI-TOF-MS证实多肽的均一性，例如，可通过商业途径在UNC-CH Proteomics核心设备上进行。
制造以高亲合力与BMPRI和/或BMPRII结合的多肽：最早鉴定为与BMPRI和/或BMPRII结合的多肽也许只有较弱的亲合力，例如在中等或低等μM级，而在IFBM中使用具有较高的结合亲合力的多肽可能更为有利，例如，在nM级。为鉴别出这样的多肽，构建开始鉴别出的文库的变体并通过相对于BMPRI和/或BMPRII的亲合力选择进行筛选。
测定结合亲合力是利用本领域公知的方法进行评价。例如，将BMPRI，BMPRII，以及适当的对照蛋白溶于碳酸盐包被缓冲液(100mM NaHCO3，pH 9.6)，并加入96-孔聚丙烯平板的孔中。在4℃保温过夜后，用溶于PBS-T中的1％BSA将孔封闭。对每种受体和对照检测其与溶于无菌的PBS(pH 7.2)中的浓度从0到200μM的多肽的结合。然后洗涤孔以除去未结合的多肽，然后向每个孔中加入抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶共轭溶液(SA-AP)购自USB(美国生化试剂，#11687)，对结合的多肽进行定量。抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶活性通过利用显色试剂p-磷酸硝基苯基二乙酯试剂(Sigma-Aldrich公司，SigmaFast tablets，目录号N1891)和测量405nm的吸光度而测量。为了确定结合曲线和近似KD，对每种多肽的吸光度与浓度的关系作图。其它因素对于结合的影响也可评价，例如，pH，温度，盐浓度，缓冲液成分，以及保温时间。
为了产生并鉴别与BMPRI和/或BMPRII具有较高亲合力的多肽，建立基于氨基酸基元的噬菌体文库，氨基酸基元是从最初分离出的与BMPRI和/或BMPRII结合的多肽中鉴定出来的，并进一步筛选具有改进的结合性质的多肽。这样的技术在本领域中是已知的(例如，可参见Hyde-DeRuyscher等，(2000)Chem Biol.7：17-25；Dalby等，(2000)Protein Sci.9：2366-2376)。
鉴定包含BMPRI-结合多肽和BMPRII-结合多肽的杂化多肽的激动剂活性：被化学合成的合成多肽，其既包括一个BMPRI-结合多肽，而且包括一个通过一个柔性接头(例如，具有序列GSSGSSG序列的接头)连接的BMPRII-结合多肽。替代地，这两个受体-结合多肽也可以通过赖氨酸的α和ε氨基连接(例如，参见Cwirla等，(1997)Science 276：1696-1699或Wrighton等，(1997)Nat.Biotechnol.15：1261-1265所述)。这些多肽的长度大约40个氨基酸，并且很容易进行合成和纯化。
然后测定这些多肽的BMP活性，例如，在老鼠间充质C3H10T1/2细胞中诱导碱性磷酸酶活性，该诱导活性在本领域是公知的，并且可参见Cheng等，(2003)J.Bone Joint Surg.Am.85-A：1544-1552和Ruppert等，(1996)Eur.J.Biochem.237：295-302的记述。简单来说，向96孔板中与10％FBS以及适当的抗体和抗真菌剂一起加入悬浮于
Figure A20091014992400271
MEM/EBSS培养基中的C3H10T1/2细胞(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚，目录号11095-080)(每孔加入体积为200μl的3x104个细胞)，将细胞在37℃，5％CO2的环境中保温，使其贴附到平板上至少3小时。然后完全吸出培养基，然后将BMP-2或多肽溶于高葡萄糖DMEM(Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚，目录号11965-092)加2％FBS，以不同的浓度加入。将细胞与要测试的化合物保温三天，期间将培养基吸出，并将细胞用300μl的PBS洗三遍(PBS，目录号14190-144，Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚)。向每个孔中加入溶于H2O中的100μl的pNPP(p-Nitrophenyl Phosphate Sigma Fast Tablet Set目录号N-1891)，在37℃显色至18小时，然后对405nm的吸光度读数。
然后利用本领域公知的方法测定EC50值。BMP-2测试的典型EC50值在1μg/ml至10μg/ml之间(例如，可参见，Wiemann等，(2002)J.Biomed.Mater.Res.62：119-127)。本领域已知，分离自不同来源的BMP-2可以显示出不同水平的活性，并且本领域技术人员可以相应地调整方法将这些差异考虑在内，以达到期望的效果。例如，本领域已知，利用CHO细胞制备的重组人BMP-2(“rhBMP-2”)的活性与利用E.coli制备的重组人BMP-2的活性相差5-10倍(例如，参见Zhao and Chen(2002)，“Expression of rhBMP-2 in Escherichia coli andIts Activity in Inducing Bone Formation”，Advances in Skeletal ReconstructionUsing Bone Morphogenic Proteins，T.S.Lindholm主编)。
将杂化的多肽固定在胶原上：合成表现出BMP活性的杂化多肽，其连接有能与胶原结合的多肽。简单来说，合成一种包含胶原结合单元和BMPRI-结合单元的多肽，在单元之间的接头中的一个氨基酸上带有交错保护基团，例如Fmoc-Lys(Dde)-OH。在赖氨酸侧链ε氨基上的Dde保护基团可以有选择地除去，并且BMPRII-结合多肽与ε氨基可以连接起来。替代地，可以合成一个线形多肽，其包含胶原-结合单元，BMPRI-结合单元，以及BMPRII-结合单元。
然后检验胶原-结合杂化多肽的BMP活性，例如在杂化多肽结合到胶原矩阵上时，测定其在小鼠间充质C3H10T1/2细胞中对碱性磷酸酶活性的诱导。简单来说，用PBS清洗5mm胶原片，并将其用于基于细胞的BMP活性测定。
实施例8：涂有IFBMs的表面的消毒
IFBM包覆的表面用电子束消毒法和γ消毒法进行处理。在消毒操作的前后对包覆的表面的结合性能进行评价。检测是在聚苯乙烯以及钛表面进行的。对于聚苯乙烯检测，是将结合单元(“AFF-0002-PS”)生物素化，使结合单元接触抗生物素蛋白链菌素-缀合的碱性磷酸酶来评价其相对结合活性。结果显示，在消毒操作前后，结合到聚苯乙烯表面的生物素化的多肽的数量基本上是相同的。对于结合单元(“AFF-0006-Ti”)在钛上的测试也得到近似的结果；在这些测试中，贴合表面的性能在消毒前和消毒后是近似相等的。
实施例9：初步的毒性试验
将聚乙二醇化的聚苯乙烯-结合多肽涂在各种聚苯乙烯表面上，并按如下所述测试其副作用，包括细胞毒性、溶血作用、以及凝结作用。操作是在白化的瑞士鼠(小家鼠)中进行的。如下面进一步的论述，没有一种进行测试的IFBMs显示出任何的毒性迹象。
为了测定急性全身毒性，将聚苯乙烯方块(每个方块4x4cm；总共60cm2)在两种载体：0.9％USP生理盐水或棉籽油(美国药典级)之一的20mL中于37℃保温70-74小时。向五只小鼠中的每一只全身注射载体或载体浸出液，剂量是每公斤体重50mL浸出液。在注射后立即观察，并在注射后的4，24，48以及72小时观察小鼠的毒性体征。没有一种注射了载体浸出液的动物比只接受了载体的动物显示出更强的生物反应。
根据ISO流程10993-4(国际标准化组织，日内瓦，瑞士)测定贴合表面的局部凝血时间。简单来说，将新鲜的人类全血吸入含有柠檬酸钠的真空采血管并向下旋转以分离血浆，贮存在冰上备用。然后将被包覆的聚苯乙烯方块(如上所述)以每毫升4cm2的比例加入血浆中，置于聚丙烯管中，以60rpm速率搅动于37℃保温15分钟。然后分离血浆浸出液，置于冰上，并在M-4手动凝血分析仪(Helena Laboratories，博蒙特，德克萨斯州)上进行测试。凝血时间与纯的血浆或标准参考对照没有显著差异。
细胞毒性是在L-929小鼠成纤维细胞中测定的，按照ISO 10993-5的说明进行。简单来说，是将60.8cm2的聚苯乙烯-包覆的方块浸入20.3mL的Eagle’s基本培养基+5％FBS，于37℃下保温24小时。将阳性的、阴性的以及居间的细胞系测试盘放在37℃下、湿润的、含有5％CO2环境中保温。通过在24，48，以及72小时的显微镜观察来评价培养物的细胞毒效果。阳性对照显示出强烈的细胞毒反应，得分为“4”，而测试细胞在全部时间点上保持正常(得分为“0”)的形状(得分为“0”)。中间对照细胞在整个时间点中得分为“2”。
溶血作用试验测量材料或材料浸出液促使红细胞破裂的能力。该试验利用ASTM F-756直接接触法进行。用盐来提取浸出的物质。对包覆的聚苯乙烯表面进行抽提，并加入含枸橼酸盐的兔血(3.2％，用PBS稀释，使得总血红蛋白浓度为10mg/ml)。观察到的记数为0.4％，它处于0-2％合格的等级。阴性对照的记数为0.1％，而阳性对照的记数为12.2％。
序列表
<110>小韦恩·Fl·拜耶
罗宾·海德·德鲁勒
保罗·T·汉密尔顿
雷·爱德华·本森
<120>促进目标分析物附着的IFBM’S
<130>AFF006
<140>11/152,974
<141>2005-06-15
<150>60/580,019
<151>2004-06-16
<150>60/651,338
<151>2005-02-09
<150>60/651,747
<151>2005-02-10
<160>96
<170>FastSEQ for Windows译文4.0
<210>1
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>1
Ser Ser His Lys His Pro Val Thr Pro Arg Phe Phe Val Val Glu Ser
 1               5                  10                  15
Arg
<210>2
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>2
Ser Ser Cys Asn Cys Tyr Val Thr Pro Asn Leu Leu Lys His Lys Cys
 1               5                  10                  15
Tyr Lys Ile Cys Ser Arg
            20
<210>3
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>3
Ser Ser Cys Ser His Asn His His Lys Leu Thr Ala Lys His Gln Val
 1               5                  10                  15
Ala His Lys Cys Ser Arg
            20
<210>4
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>4
Ser Ser Cys Asp Gln Asn Asp Ile Phe Tyr Thr Ser Lys Lys Ser His
 1               5                  10                  15
Lys Ser His Cys Ser Arg
            20
<210>5
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>5
Ser Ser Ser Ser Asp Val Tyr Leu Val Ser His Lys His His Leu Thr
 1               5                  10                  15
Arg His Asn Ser Ser Arg
            20
<210>6
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>6
Ser Ser Ser Asp Lys Cys His Lys His Trp Tyr Cys Tyr Glu Ser Lys
 1               5                  10                  15
Tyr Gly Gly Ser Ser Arg
            20
<210>7
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>7
His His Lys Leu Lys His Gln Met Leu His Leu Asn Gly Gly
 1               5                  10
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>8
Gly His His His Lys Lys Asp Gln Leu Pro Gln Leu Gly Gly
 1               5                  10
<210>9
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>9
Ser Ser Ser Asp Lys Ser His Lys His Trp Tyr Ser Tyr Glu Ser Lys
 1               5                  10                  15
Tyr Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Lys
            20                  25
<210>10
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>10
Ser Ser Ser Asp Lys Cys His Lys His Trp Tyr Cys Tyr Glu Ser Lys
 1               5                  10                  15
Tyr Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Lys
            20                  25
<210>11
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>11
Ser Ser Asp Trp Gly Val Val Ala Ser Ala Trp Asp Ala Phe Glu Ala
 1               5                  10                  15
Leu Asp Ala Ser Arg
            20
<210>12
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>12
Ser Ser Gly Ala Asp Phe Gly Tyr Gly Ser Trp Val Ser Phe Ser Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ser Ala Ser Arg
            20
<210>13
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>13
Ser Arg Gly Glu Ala Ser Gly Trp Glu Ala Phe Ser Ala Leu Glu Ala
 1               5                  10                  15
Ala Val Val Ser Arg
            20
<210>14
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>14
Ser Arg Ser Ser Asp Ser Ala Phe Ser Ser Phe Ser Ala Leu Glu Gly
 1               5                  10                  15
Ser Val Val Ser Arg
            20
<210>15
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>15
Ser Arg Asp Gly Ala Gly Ala Ala Ala Trp Gly Ala Phe Ser Ala Leu
 1               5                  10                  15
Ala Ser Glu Ser Arg
            20
<210>16
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>16
Ser Arg Gly Gly Glu Ala Ala Ala Gly Ala Trp Val Ser Phe Ser Ala
 1               5                  10                  15
Leu Glu Ser Ser Arg
            20
<210>17
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>17
Ser Arg Val Ser Gly Val Ala Ala Trp Glu Ala Phe Ala Gly Leu Ser
 1               5                  10                  15
Val Ser Ser Ser Arg
            20
<210>18
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>18
Ser Arg Asp Gly Gly Ser Phe Ser Ala Phe Ser Ser Leu Val Trp Ala
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ser Ser Arg
            20
<210>19
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>19
Ser Ser Val Ala Gly Asp Val Gly Ser Ser Trp Ala Ala Phe Ala Ser
 1               5                  10                  15
Leu Ala Ala Ser Arg
            20
<210>20
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>20
Ser Ser Trp Glu Val Phe Ser Ser Leu Glu Ser Gly Ser Val Gly Ala
 1               5                  10                  15
Gly Ala Gly Ser Arg
            20
<210>21
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>21
Ser Ser Ser Ser Gly Ala Val Ser Ser Phe Glu Ser Leu Ser Gly Ser
 1               5                  10                  15
Val Val Ser Ser Arg
            20
<210>22
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>22
Ser Arg Glu Gly Val Ala Trp Glu Ala Phe Gly Ala Leu Ser Ser Phe
 1               5                  10                  15
Ala Ala Asp Ser Arg
            20
<210>23
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>23
Ser Ser Trp Gly Leu Ala Ser Glu Ala Ser Phe Phe Ser Phe Ser Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ser Ser Ser Arg
            20
<210>24
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>24
Ser Arg Glu Gly Ala Ala Trp Asp Ser Phe Phe Ala Leu Ser Gly Gly
 1               5                  10                  15
Ser Ala Ala Ser Arg
            20
<210>25
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>25
Ser Ser Ser Val Asp Leu Tyr Phe Pro Leu Lys Gly Asp Val Val Ser
 1               5                  10                  15
Arg
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>26
Ser Ser Phe Glu Pro Leu Arg Phe Pro Leu Lys Gly Val Pro Val Ser
 1               5                  10                  15
Arg
<210>27
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离的多肽对比共有序列
<221>变体
<222>(1)...(1)
<223>在这个位置的Xaa可被Trp，Phe，或Tyr
<221>变体
<222>(2)...(3)
<223>Xaa可被任何氨基酸
<221>变体
<222>(5)...(5)
<223>Xaa可被任何氨基酸
<221>变体
<222>(6)...(6)
<223>在这个位置的Xaa可被Ser，Thr，Ala，或Gly
<400>27
Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Leu
 1               5
<210>28
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离的多肽对比共有序列
<221>变体
<222>(1)...(1)
<223>在这个位置的Xaa可被Leu或Val
<221>变体
<222>(2)...(2)
<223>Xaa可被任何氨基酸
<221>变体
<222>(6)...(6)
<223>在这个位置的Xaa可被Lys或Arg
<400>28
Xaa Xaa Phe Pro Leu Xaa Gly
 1               5
<210>29
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFBM
<400>29
Ser Ser Phe Glu Pro Leu Arg Phe Pro Leu Lys Gly Val Pro Val Ser
 1               5                  10                  15
Arg Gly Ser Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Trp Met Ser Arg Val
            20                  25                  30
Ile Glu Trp Thr Tyr Asp Ser
        35
<210>30
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFBM
<400>30
Asp Val Asn Ser Ile Trp Met Ser Arg Val Ile Glu Trp Thr Tyr Asp
 1               5                  10                  15
Ser Gly Ser Ser Gly Lys Ser Ser Phe Glu Pro Leu Arg Phe Pro Leu
            20                  25                  30
Lys Gly Val Pro Val Ser Arg
        35
<210>31
<211>43
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFBM
<400>31
Ser Arg Ser Ser Asp Ser Ala Phe Ser Ser Phe Ser Ala Leu Glu Gly
 1               5                  10                  15
Ser Val Val Ser Arg Gly Ser Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Trp
            20                  25                  30
Met Ser Arg Val Ile Glu Trp Thr Tyr Asp Ser
        35                  40
<210>32
<211>43
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFBM
<400>32
Asp Val Asn Ser Ile Trp Met Ser Arg Val Ile Glu Trp Thr Tyr Asp
 1               5                  10                  15
Ser Gly Ser Ser Gly Lys Ser Arg Ser Ser Asp Ser Ala Phe Ser Ser
            20                  25                  30
Phe Ser Ala Leu Glu Gly Ser Val Val Ser Arg
        35                  40
<210>33
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFBM
<400>33
Ser Ser Ser Val Asp Leu Tyr Phe Pro Leu Lys Gly Asp Val Val Ser
 1               5                  10                  15
Arg Gly Ser Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Trp Met Ser Arg Val
            20                  25                  30
Ile Glu Trp Thr Tyr Asp Ser
        35
<210>34
<211>39
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFBM
<400>34
Asp Val Asn Ser Ile Trp Met Ser Arg Val Ile Glu Trp Thr Tyr Asp
 1               5                  10                  15
Ser Gly Ser Ser Gly Lys Ser Ser Ser Val Asp Leu Tyr Phe Pro Leu
            20                  25                  30
Lys Gly Asp Val Val Ser Arg
        35
<210>35
<211>43
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFBM
<400>35
Ser Arg Gly Gly Glu Ala Ala Ala Gly Ala Trp Val Ser Phe Ser Ala
 1               5                  10                  15
Leu Glu Ser Ser Arg Gly Ser Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Trp
            20                  25                  30
Met Ser Arg Val Ile Glu Trp Thr Tyr Asp Ser
        35                  40
<210>36
<211>43
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFBM
<400>36
Asp Val Asn Ser Ile Trp Met Ser Arg Val Ile Glu Trp Thr Tyr Asp
 1               5                  10                  15
Ser Gly Ser Ser Gly Lys Ser Arg Gly Gly Glu Ala Ala Ala Gly Ala
            20                  25                  30
Trp Val Ser Phe Ser Ala Leu Glu Ser Ser Arg
        35                  40
<210>37
<211>43
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFBM
<400>37
Ser Ser Asp Trp Gly Val Val Ala Ser Ala Trp Asp Ala Phe Glu Ala
 1               5                  10                  15
Leu Asp Ala Ser Arg Gly Ser Ser Gly Lys Asp Val Asn Ser Ile Trp
            20                  25                  30
Met Ser Arg Val Ile Glu Trp Thr Tyr Asp Ser
        35                  40
<210>38
<211>43
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>IFBM
<400>38
Asp Val Asn Ser Ile Trp Met Ser Arg Val Ile Glu Trp Thr Tyr Asp
 1               5                  10                  15
Ser Gly Ser Ser Gly Lys Ser Ser Asp Trp Gly Val Val Ala Ser Ala
            20                  25                  30
Trp Asp Ala Phe Glu Ala Leu Asp Ala Ser Arg
        35                  40
<210>39
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>39
Ser Ser Ser Ser Tyr Phe Asn Leu Gly Leu Val Lys His Asn His Val
 1               5                  10                  15
Arg His His Asp Ser Ser Arg
            20
<210>40
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>40
Ser Ser Cys His Asp His Ser Asn Lys Tyr Leu Lys Ser Trp Lys His
 1               5                  10                  15
Gln Gln Asn Cys Ser Arg
            20
<210>41
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>41
Ser Ser Ser Cys Lys His Asp Ser Glu Phe Ile Lys Lys His Val His
 1               5                  10                  15
Ala Val Lys Lys Cys Ser Arg
            20
<210>42
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>42
Ser Ser Ser Cys His His Leu Lys His Asn Thr His Lys Glu Ser Lys
 1               5                  10                  15
Met His His Glu Cys Ser Arg
            20
<210>43
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>43
Ser Ser Val Asn Lys Met Asn Arg Leu Trp Glu Pro Leu Ser Arg
 1               5                  10                  15
<210>44
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>44
Ser Ser Ala Pro Leu Thr Glu Ser Glu Ala Trp Arg Gly Phe Ser Lys
 1               5                  10                  15
Leu Glu Val Ser Arg
            20
<210>45
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>45
Ser Ser Ser Met Pro Val Gly Trp Asp Ser Trp Arg Gly Leu Glu Trp
 1               5                  10                  15
Ser Asp Arg Ser Arg
            20
<210>46
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>46
Ser Ser Glu Gly Arg Gly Gly Trp Asn Ser Trp Glu Ala Phe Arg Glu
 1               5                  10                  15
Leu Val Val Ser Arg
            20
<210>47
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>47
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ala Trp Glu Ser Trp Arg Gly Leu Ser Gly
 1               5                  10                  15
Val Glu Leu Ser Arg
            20
<210>48
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>48
Ser Arg Asn Val Glu Gly Ser Trp Glu Ser Phe Ala Gly Leu Ser His
 1               5                  10                  15
Val Arg Glu Ser Arg
            20
<210>49
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>49
Ser Arg Glu Asp Gly Gly Arg Trp Glu Ser Phe Leu Gly Leu Ser Ala
 1               5                  10                  15
Val Glu Val Ser Arg
            20
<210>50
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>50
Ser Ser Val Glu Gly Ser Ala Trp Ser Ala Phe Lys Ser Leu Ser Ser
 1               5                  10                  15
Glu Gly Val Ser Arg
            20
<210>51
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>51
Ser Arg Val Glu Gly Gly Ala Trp Gln Ala Leu Ala Gly Leu Thr Val
 1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Arg
            20
<210>52
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>52
Ser Ser Pro Pro Lys His Ala Trp Gly Ser Phe Asp Ala Leu Gly Gly
 1               5                  10                  15
Gln Val Val Ser Arg
            20
<210>53
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>53
Ser Ser Glu Arg Gly Val Gly Trp Glu Val Phe Leu Ala Met Glu Gly
 1               5                  10                  15
Ala Arg Met Ser Arg
            20
<210>54
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>54
Ser Ser Ser Ser Ser Gly Thr Trp Gln Ala Phe Thr Gly Leu Ser Gly
 1               5                  10                  15
Glu Arg Val Ser Arg
            20
<210>55
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>55
Ser Ser Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Trp Asp Ala Phe Tyr Ser
 1               5                  10                  15
Leu Val Gly Ser Arg
            20
<210>56
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>56
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Phe Ser Ser Leu Ser Gly
 1               5                  10                  15
Asn Gly Arg Ser Arg
            20
<210>57
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>57
Ser Ser Thr Gly Gly Gly Ser Trp Glu Glu Phe Lys Ala Met Thr Pro
 1               5                  10                  15
Ser Trp Thr Ser Arg
            20
<210>58
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>58
Ser Ser Glu Gly Ser Gly Leu Trp Asp Ser Phe Ser Ser Leu Ser Val
 1               5                  10                  15
His Glu Val Ser Arg
            20
<210>59
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>59
Ser Ser Gly Val Thr Gln Glu Ser Ala Ser Trp Ser Ser Phe Arg Thr
 1               5                  10                  15
Leu Ala Val Ser Arg
            20
<210>60
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>60
Ser Ser Ser Lys Val Ala Pro Ser Gly Glu Trp Arg Ser Phe Ala Thr
 1               5                  10                  15
Leu Glu Val Ser Arg
            20
<210>61
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>61
Ser Ser Glu Ala Gly Arg Gly Trp Glu Gly Phe Lys Ala Leu Glu Gly
 1               5                  10                  15
Tyr Gln Val Ser Arg
            20
<210>62
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>62
Ser Ser Leu Gly Gln Thr Gly Trp Glu Ala Phe Glu Ser Leu Ser Gly
 1               5                  10                  15
Thr Arg Gly Ser Arg
            20
<210>63
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>63
Ser Ser Val Ala Trp Asp Ala Phe Thr Val Phe Glu Ser Leu Glu Gly
 1               5                  10                  15
Val Ala Thr Ser Arg
            20
<210>64
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>64
Ser Ser 6lu Val Val Glu Pro Trp Glu Trp Trp Val Ala Leu Glu Arg
 1               5                  10                  15
Ala Gly Gly Ser Arg
            20
<210>65
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>65
Ser Arg Val Ala Ala Val Ser Trp Glu Phe Phe Gly Ser Leu Ser Ser
 1               5                  10                  15
Ala Gly Val Ser Arg
            20
<210>66
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>66
Ser Ser Ala Asp Leu Gly Val Ser Gly Ser Trp Glu Gly Phe Ala Leu
 1               5                  10                  15
Met Arg Gly Ser Arg
            20
<210>67
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>67
Ser Ser Val Gly Gln Met Gly Trp Glu Ala Phe Glu Ser Leu Ser Gly
 1               5                  10                  15
Thr Gly Gly Ser Arg
            20
<210>68
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>68
Ser Ser Gly Gln Gly Glu Thr Trp Glu Trp Phe Ala Gly Met Arg Gly
 1               5                  10                  15
Ser Val Ala Ser Arg
            20
<210>69
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>69
Ser Ser Tyr Phe Asp Val Phe Ser Ser Met Thr Gly Thr Arg Ala Ala
 1               5                  10                  15
Gly Ser Trp Ser Arg
            20
<210>70
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>70
Ser Ser Ala Tyr Ser Val Phe Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asn Ser Gly
 1               5                  10                  15
Gly Ala Val Ser Arg
            20
<210>71
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>71
Ser Ser Gly Gly Ile Ala Ser Leu Lys Tyr Asp Val Val Lys Thr Trp
 1               5                  10                  15
Glu Ser Arg
<210>72
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离的多肽对比共有序列
<400>72
Gly Gly Gly Ala Trp Glu Ala Phe Ser Ser Leu Ser Gly Ser Arg Val
 1               5                  10                  15
<210>73
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离的多肽对比共有序列
<221>变体
<222>(0)...(0)
<223>Xaa可被任何氨基酸
<400>73
Trp Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Leu
 1               5
<210>74
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离的多肽对比共有序列
<400>74
Ser Ser Gly Ala Trp Glu Ser Phe Ser Ser Leu Ser Gly Ser Ser
 1               5                  10                  15
<210>75
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码共有序列
<400>75
tcgagtggtg cttgggagtc tttttcgtca ctgagtggat    40
<210>76
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：75的部分补充
<400>76
caccacgaac cctcagaaaa agcagtgact cacctagatc    40
<210>77
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>77
Ser Ser Glu Gly Val Gly Gly Phe Pro Leu Lys Gly Ile Pro Gln Glu
 1               5                  10                  15
Ala Trp Ala Ser Arg
            20
<210>78
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<221>变体
<222>(18)...(0)
<223>Xaa可被任何氨基酸
<400>78
Ser Ser Pro Ser Gly Val Val Phe Pro Leu Arg Gly Glu Leu Leu Gly
 1               5                  10                  15
Val Xaa Lys Ser Arg
            20
<210>79
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离的多肽对比共有序列
<400>79
Ser Ser Gly Gly Phe Val Pro Phe Pro Leu Arg Gly Glu Val Trp Asp
 1               5                  10                  15
Gly Val His Ser Arg
            20
<210>80
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>80
Ser Ser Glu Gly Ser Leu Ser Phe Pro Leu Lys Gly Gln Val Tyr Ser
 1               5                  10                  15
Gly Trp Gly Ser Arg
            20
<210>81
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>81
Ser Ser Gly Lys Pro Leu Glu Phe Pro Leu Arg Gly Thr Leu Ala Glu
 1               5                  10                  15
Trp Pro Val Ser Arg
            20
<210>82
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>82
Ser Arg Gly Glu Ala Leu Gly Phe Pro Leu Thr Gly Gln Leu Met Glu
 1               5                  10                  15
Ala Ala Glu Ser Arg
            20
<210>83
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>83
Ser Ser Met Trp Asp Val Gly Phe Pro Leu Lys Gly Arg Trp Ile Asp
 1               5                  10                  15
Gly Ala Asp Ser Arg
            20
<210>84
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>84
Ser Ser Ser Asn Ser Leu Trp Phe Pro Leu Arg Gly Ser Thr Val Glu
 1               5                  10                  15
Val Gly Ala Ser Arg
            20
<210>85
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>85
Ser Ser Gly Pro Ala Leu Arg Leu Pro Leu Arg Gly Thr Val Val Ser
 1               5                  10                  15
Asp Val Pro Ser Arg
            20
<210>86
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>86
Ser Ser Ala Asp Arg Val Ala Trp Pro Leu Lys Gly Ala Pro Val Trp
 1               5                  10                  15
Val Lys Glu Ser Arg
            20
<210>87
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>87
Ser Ser Gly Leu Ala Leu Gly Leu Pro Ile Lys Gly Trp Thr Val Ser
 1               5                  10                  15
Gly Lys Asp Ser Arg
            20
<210>88
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>88
Ser Ser Gly Tyr Thr Leu Gly Phe Pro Leu Ser Gly Gln Thr Ile Lys
 1               5                  10                  15
Asp Trp Pro Ser Arg
            20
<210>89
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>89
Ser Ser Glu Gly Trp Val His Phe Pro Leu Lys Gly Asp Val Met Gly
 1               5                  10                  15
Gly Pro Phe Ser Arg
            20
<210>90
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>90
Ser Ser Gly Arg Tyr Val Ser Leu Pro Leu Lys Gly Glu Val Val Pro
 1               5                  10                  15
Gln Thr Ala Ser Arg
            20
<210>91
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>91
Ser Ser Glu Gly Gly Val Gly Phe Pro Leu Lys Gly Ile Pro Gln Glu
 1               5                  10                  15
Ala Trp Ala Ser Arg
            20
<210>92
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>92
Ser Arg Val Asp Ser Val Asn Phe Pro Leu Arg Gly Glu Thr Val Thr
 1               5                  10                  15
Ser Met Val Ser Arg
            20
<210>93
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离的多肽对比共有序列
<400>93
Gly Gly Ala Leu Gly Phe Pro Leu Lys Gly Glu Val Val Glu Gly Trp
 1               5                  10                  15
Ala
<210>94
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离的多肽对比共有序列
<221>变体
<222>(2)...(0)
<223>Xaa可被任何氨基酸
<400>94
Leu Xaa Phe Pro Leu Lys Gly
 1               5
<210>95
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>95
Ser Ser Cys Trp Ser Arg Phe Arg Leu Phe Met Leu Phe Cys Met Phe
 1               5                  10                  15
Tyr Leu Val Ser Ser Arg
            20
<210>96
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>从噬菌体展示文库分离
<400>96
Ser Arg Cys Ile Lys Tyr Pro Phe Leu Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Leu
 1               5                  10                  15
Phe Leu Phe Ser Ser Arg
            20

Claims (23)

1、一种结合单元，包含具有如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所定义的序列基元的多肽，其中该结合单元与骨形态发生蛋白结合。
2、如权利要求1所述的结合单元，其中SEQ ID NO：27是从SEQ ID NOs：11-20、22-24、48-50、52、54-55、58-63、67、70和72-74中选出的。
3、如权利要求1所述的结合单元，其中SEQ ID NO：28是从SEQ ID NOs：25-26、78-81、83-84、89和91-94中选出的。
4、如权利要求1所述的结合单元，其中该骨形态发生蛋白是骨形态发生蛋白-2。
5、如权利要求1所述的结合单元，其中该结合单元由7～60个氨基酸构成。
6、一种分离的核酸，包含编码如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所定义的氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列是一种与骨形态发生蛋白结合的结合单元。
7、一种用于植入物的界面生物涂层，该涂层包括：
a.至少一种与植入物表面结合的结合单元；和
b.至少一种与骨形态发生蛋白结合的结合单元，其中该骨形态发生蛋白结合单元包含具有如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所定义的序列基元的多肽，
其中，该表面结合单元和该骨形态发生蛋白结合单元连接在一起，并且能够被修饰以包含一个或多个末端修饰以及促进所述连接的修饰。
8、如权利要求7所述的涂层，其中该植入物包含一种从聚合物、塑料、金属、陶瓷、去矿化骨基质和它们的混合物中选出的材料。
9、如权利要求7所述的涂层，其中如SEQ ID NO：27所定义的序列基元是从SEQ ID NOs：11-20、22-24、48-50、52、54-55、58-63、67、70和72-74中选出的。
10、如权利要求7所述的涂层，其中如SEQ ID NO：28所定义的序列基元是从SEQ ID NOs：25-26、78-81、83-84、89和91-94中选出的。
11、如权利要求7所述的涂层，其中该骨形态发生蛋白结合单元由7～60个氨基酸构成。
12、如权利要求7所述的涂层，其中该骨形态发生蛋白是骨形态发生蛋白-2。
13、如权利要求7所述的涂层，其中该植入物包含胶原，并且该骨形态发生蛋白是骨形态发生蛋白-2。
14、如权利要求7所述的涂层，其中该植入物包含去矿化骨基质，并且该骨形态发生蛋白是骨形态发生蛋白-2。
15、一种对植入物进行涂布的方法，该方法包括让涂层与该植入物接触，该涂层包括：
a.至少一种与植入物表面结合的结合单元；和
b.至少一种与骨形态发生蛋白结合的结合单元，其中该骨形态发生蛋白结合单元包含具有如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所定义的序列基元的多肽，
其中，该表面结合单元和该骨形态发生蛋白结合单元连接在一起，并且能够被修饰以包含一个或多个末端修饰以及促进所述连接的修饰。
16、如权利要求15所述的方法，其中该植入物包含一种从聚合物、塑料、金属、陶瓷、去矿化骨基质和它们的混合物中选出的材料。
17、如权利要求15所述的方法，其中如SEQ ID NO：27所定义的序列基元是从SEQ ID NOs：11-20、22-24、48-50、52、54-55、58-63、67、70和72-74中选出的。
18、如权利要求15所述的方法，其中如SEQ ID NO：28所定义的序列基元是从SEQ ID NOs：25-26、78-81、83-84、89和91-94中选出的。
19、如权利要求15所述的方法，其中该骨形态发生蛋白结合单元由7～60个氨基酸构成。
20、如权利要求15所述的方法，其中该骨形态发生蛋白是骨形态发生蛋白-2。
21、如权利要求15所述的方法，其中该植入物包含胶原，并且该骨形态发生蛋白是骨形态发生蛋白-2。
22、如权利要求15所述的方法，其中该植入物包含去矿化骨基质，并且该骨形态发生蛋白是骨形态发生蛋白-2。
23、一种涂布的植入物，其中该植入物的至少一部分由权利要求7～14中任一项所述的界面生物涂层所涂布。
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