CN101370444A - 促进血管内皮细胞谱系的细胞附着于医疗器材的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于改进对医疗器材进行覆膜的组合物和方法。本发明提供一种生物活性涂层组合物，其包括至少一个对于医疗器材的金属表面材料具有结合特异性的结合结构域，和至少一个对于内皮细胞谱系的细胞具有结合特异性的结合结构域。对于医疗器材的金属表面进行覆膜，以及制造医疗器材的方法包括：使要进行覆膜的金属表面与数量上有效的生物活性涂层材料接触，形成一层覆膜，并且可以进一步包括使覆膜表面与内皮细胞谱系的细胞接触，使内皮细胞谱系的细胞结合到覆膜表面。

Description

促进血管内皮细胞谱系的细胞附着于医疗器材的组合物和方法

技术领域

本发明涉及促进血管内皮细胞谱系的细胞附着于一种血管内的装置的组合物和方法。

背景技术

发明背景

动脉粥样硬化引起动脉狭窄和阻塞。支架置入术和旁路手术经常用于治疗小口径动脉(定义为小于6mm)方面的严重疾病。动脉的旁路方法受到血管导管，如乳房内动脉或隐静脉的有效性限制。令人遗憾地，由聚四氟乙烯(PTFE)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制成的合成导管由于缺少附着的、静止的内皮而不能承受小口径移植体内高速的血栓生成。因此，在老年人群的心血管介入治疗中开发一种不形成血栓的、小口径人造血管成为一个最重要的目标。

血管内的装置置于身体脉管系统内部；一般位于血管或心脏中的阻塞部位，或者替换或者支持血管或心脏的一部分。血管内的装置通常由生物学上的惰性物质，如不锈钢、钛、聚合物，或其混合剂制成，其目的在于减少外来物插入脉管系统后引起的并发症。但是，与这些装置相关的许多问题已经被报道出来，包括血栓形成、新生内膜形成和再狭窄。人们已经努力减少或消除血管内装置的并发症。例如，为了解决血栓形成的问题，体内有血管内装置的个体可以服用抗凝剂和抗血小板的药物，如抵克立得或阿斯匹林。

一个克服与血管内装置相关并发症的方法是促进与脉管系统和/或血液接触的装置表面的快速内皮化策略。在此方面，美国专利第7,037,332号记述了一种医疗器材，其具有一种基质覆膜，是由交联到基质上的对于内皮细胞抗原具有结合特异性的抗体制成的，用于促进内皮细胞附着到医疗器材上。美国专利第6,897,218号公开了一种哌嗪衍生物的金属复合物，其声称可以促进再内皮化，但是它看来似乎不能直接地结合到装置上，并且要依赖大量的血液循环组合物才有效。美国专利第6,140,127号记述了一种涂覆支架的方法，它是使用一种聚合物涂层，使用吡啶和三氟代乙烷磺酰氯，和使用一种五个氨基酸的多肽(甘氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸；SEQ ID NO：50)将细胞粘附到支架上。美国专利第5,929,060号公开了一种类固醇DHEA的衍生物，其被称作对于内皮化有帮助。美国专利第5,643,712号公开了一种器官或组织的血管的覆膜，其与部分聚合的衍生自内皮细胞的细胞外基质制剂一起移植，可以作为一种促进再内皮化的表面。装置可设计为经过修饰的，以促进再内皮化的发生。美国专利第6,436,132号公开了一种用于治疗血管中狭窄的区域的管腔内的假体。据说支架中的通路容许血管的再内皮化。

内皮细胞谱系的细胞包括内皮细胞和内皮祖细胞。内皮细胞排列在脉管系统的所有部分，起到调节凝血、炎症、血管通透性，以及在血液和间质之间进行营养交换的作用。在内皮病灶性地削蚀的地方，凝血快速地跟着发生。血管的病灶性凝血可以导致血栓形成以及血管闭塞，或其它的血栓栓塞性事件。内皮祖细胞已经表现出在各种模型系统中有助于血管生成以及血管发生，并且有助于移植到动物模型中的血管内的内皮化。但是，在患者体内，血管内的移植体的自发的内皮化是罕有的，也许因为工程化的移植材料抗拒分子的附着和凝血，以及内皮祖细胞没有在材料上面粘附，生存以及增殖的能力。因此，仍然需要一种促进血管内的装置内皮化的方法，例如通过将装置进行处理，以促进初期的内皮细胞在处理过的装置上定殖和/或生长。

从外周血液中至少可以分离出两种类型的内皮祖细胞：“早期”内皮祖细胞，它在体外存活2到4周，并分泌有效的血管生成因子；和“晚期”内皮祖细胞，它在3周后长出，可以复制高达100代。早期内皮祖细胞是在血管内皮生长因子(VEGF)的影响下起源于骨髓成血管细胞。早期内皮祖细胞具有表型CD133+/-，CD34+，VEGFR-2+，CD31+，vWF-，VE-钙粘蛋白-，E-选择素-，eNOS-，以及端粒酶+。晚期内皮祖细胞具有表型CD133+/-，CD34+，VEGFR-2+，CD31+，vWF+，VE-钙粘蛋白+，E-选择素+，eNOS+，以及端粒酶+。分化的内皮祖细胞类似于晚期内皮祖细胞，除了前者是CD133(-)以及端粒酶(-)。其它的内皮祖细胞亚群，以及它们的表型标记记载于本领域中。

我们期望有一种方法，能够使初期的内皮细胞谱系的细胞层在血管内的装置表面发生附着、募集、支持，以及分化。例如，我们期望有一种血管内的装置，其有一种覆膜，能够俘获内皮细胞谱系的循环细胞，使得它们植入血管内的装置表面，并具有我们想要的减少与血管内装置类型相关的并发症，如一个或多个血栓形成，新生内膜形成，以及再狭窄的发生的优点。

发明内容

发明概要

本发明提供生理活性的涂层组分，其包含至少一个能特异地结合一种医疗器材的金属表面的结合结构域(为便于引用，该结合结构域在本发明中称作“表面结合结构域”)，该表面结合结构域连接有至少一个能特异地结合内皮细胞谱系的细胞的结合结构域(为便于引用，该结合结构域在本发明中称作“内皮细胞结合结构域”)；其中表面结合结构域和内皮细胞结合结构域基本上分别由表1和表3所例举的氨基酸序列组成。表面结合结构域和内皮细胞结合结构域可以直接连接(例如，在合成期间或通过化学方法)或者通过接头连结，以形成本发明的生理活性涂层组分的单一分子。

本发明还提供基本上由SEQ ID NOs：1-8的多肽组成的表面结合结构域；和编码该表面结合结构域的多核苷酸。

本发明还提供基本由SEQ ID NOs：9-46的多肽组成的内皮细胞结合结构域；和编码该内皮细胞结合结构域的多核苷酸。

利用根据本发明的组合物，本发明还提供：在一种医疗器材的金属表面覆膜的方法，使得有覆盖层的表面在与内皮细胞谱系的细胞接触时，能够粘附内皮细胞谱系的细胞(例如，一种或多种内皮细胞，和内皮祖细胞)；促进内皮细胞谱系的细胞粘附在一种医疗器材的至少一个金属表面的方法；和通过在至少一个表面覆膜促进内皮细胞谱系的细胞的附着而促进一种医疗器材的至少一个金属表面内皮化的方法。这些方法包括使准备覆膜的医疗器材的至少一个金属表面与生理活性涂层组分(亦称作“界面生物材料”)接触，生理活性涂层组分包含至少一个本发明的表面结合结构域，其连结有至少一个本发明的内皮细胞结合结构域。生物活性涂层组分与一种医疗器材的至少一个金属表面接触并在医疗器材上面形成一层覆膜，其中该覆膜内至少一个内皮细胞结合结构域的数量对于粘附内皮细胞谱系的细胞是有效的，并且优选地促进该医疗器材的至少一个被包覆的表面内皮化。该方法可以进一步包括使该被包覆的装置与内皮细胞谱系的细胞接触的步骤，以促进附着、粘附、支持生长、支持分化的一种或多种作用。后一步骤可以发生在体外(例如，在植入该装置前先使内皮细胞附着)；或可以发生在体内(例如，一旦植入，个体的内皮细胞从邻近的完整的内皮动脉区域迁移，或者如循环细胞那样，与该被生理活性涂层组分包覆的装置的表面接触，并且粘附)。

对于本发明的方法和组合物，至少一个内皮细胞结合结构域可以包括一个单一类型(例如，特异地结合内皮细胞内皮细胞谱系细胞的一个子集；例如，只结合内皮细胞；或具有较宽的特异性(例如，一般而言，结合内皮细胞和内皮细胞祖细胞))，或可以包括多种类型(例如，一个类型特异地结合内皮细胞；另一个类型特异地结合内皮细胞祖细胞)。

利用本发明的组合物，本发明还涉及一种促进内皮细胞谱系的细胞粘合在一种医疗器材，更优选一种血管内的器材上的方法。此外提供一种制造一种医疗器材的方法。这些方法包括使一种医疗器材的至少一个金属表面与一种生理活性涂层组分(其特异地结合内皮细胞谱系的细胞)接触，形成至少一个包覆的金属表面；以及使至少一个被包覆的表面与内皮细胞谱系的细胞接触(例如，促进内皮细胞谱系的细胞粘合到至少一个被包覆的表面)；其中生物活性涂层组合物包含至少一个表面结合结构域以及至少一个内皮细胞结合结构域；并且其中至少一个表面结合结构域和至少一个内皮细胞结合结构域是连接在一起的。内皮细胞谱系的细胞与生物活性医疗器材上的涂层组分接触可以通过本领域公知的任何方法进行，以促进亲合性分子和其配体之间的相互结合，例如，在一种包含生物活性涂层组合物的上面使一种包含内皮细胞谱系的细胞的溶液进行保温、浸渍、喷雾或刷涂。此外提供一种包含一种覆膜的医疗器材，它是将有效量的生物活性涂层组合物涂在医疗器材的金属表面，使得医疗器材适于内皮细胞附着，优选内皮细胞附着后发生覆膜表面的内皮化。

或者，提供一种促进一种血管装置内皮化的方法，使得对于该装置选定的金属表面，一旦该表面被包覆并且该装置被移植，可促进内皮细胞谱系的细胞附着。该方法包含以下步骤：(a)使本发明所述的一种生物活性涂层组合物与准备内皮化的一种血管装置的至少一个金属表面接触，使得该生物活性涂层组合物结合到该至少一个金属表面上，在该血管装置上形成一个被包覆的金属表面。其中该生物活性涂层组合物包含至少一个具有基本上为SEQ ID NOs：1-8的氨基酸序列的表面结合结构域，连接至少一个具有基本上为SEQ ID NOs：9-46的氨基酸序列的内皮细胞结合结构域；和(b)将该装置移植到一个需要该装置的个体(人或非人)中；其中内皮细胞谱系的细胞(由该个体生成)接触，附着和粘附于该装置的覆膜表面(主要通过细胞结合该生物活性涂层组合物的至少一个内皮细胞结合结构域进行介导)，促进内皮细胞谱系的细胞在该装置的被包覆的金属表面铺展，和促进该血管装置的内皮化。促进该移植装置的内皮化可以进一步促进靠近该移植装置的组织或脉管系统愈合，促进移植装置与邻近的组织结合(整合)，以及减少与移植装置有关的血栓形成。

具体实施方式

发明详述

本发明提供一种用于医疗器材的改进的覆膜组合物，利用该组合物包覆医疗器材的方法，以及一种医疗器材的一种金属表面，其表面涂有一种本发明的生物活性涂层组合物。

定义部分：尽管可以认为以下术语能够被本领域的普通技术人员很好地理解，但还是阐述下列定义以便于解释本发明。

本发明中用到的术语“有效量”，在涉及到根据本发明的生物活性涂层组合物时，为达到说明书和权利要求的目的，指该生物活性涂层组合物的数量足够应用于至少待包覆的一个金属表面(通过使该至少一个表面与该生物活性覆膜接触)以便(a)介导该生物活性涂层组合物与该医疗器材的至少一个金属表面结合而形成一层覆膜；以及(b)促进内皮细胞粘附到覆膜表面，优选覆膜表面内皮化。

本发明中为达到说明书和权利要求的目的而使用的术语“内皮细胞谱系的细胞”，指的是任何发育阶段的内皮细胞(例如，从生长初期阶段，如内皮细胞干细胞或祖细胞，到发育成熟期例如完全分化的，组织特异性内皮细胞)；并且包括能够分化为内皮细胞祖细胞和/或内皮细胞的干细胞，这种干细胞与内皮细胞共有至少一个相同的表面分子或受体(例如，骨髓成血管细胞；一种心脏Sca-1+干细胞(它可以在白血病抑制因子(LIF)存在的情况下分化为内皮细胞，一种脂肪干细胞)；或其组合。因此，内皮细胞谱系的细胞包括内皮细胞，内皮细胞祖细胞，和能够分化为内皮细胞和/或内皮细胞祖细胞的干细胞。优选的内皮细胞谱系的细胞可以用于根据本发明排除除了该优选的内皮细胞谱系的细胞外的内皮细胞谱系的细胞。

本发明中使用的术语“内皮化”，除非另作说明，对于说明书和权利要求来说，指的是一个或多个内皮细胞在一种医疗器材的至少一个金属表面的生长(理想地包括增殖)，和内皮细胞的分化，该医疗器材被有效量的本发明的生物活性涂层组合物所包覆。优选地，一旦该内皮细胞谱系的细胞附着于被有效量的该生物活性涂层组合物包覆的医疗器材的表面，可以促进内皮细胞生长发育以提供一个内皮组织层。因此，术语“内皮化”可以指一种由于任何生物学过程或机械过程而失去或被剥掉内皮的血管移植体的再内皮化；或它可以包括生长新的内皮细胞，以覆盖在一种已移植的或可移植的移植体，或者已移植的或可移植的医疗器材的金属表面，其之前没有被内皮细胞所覆盖。

本发明说明书和权利要求中使用的术语“医疗器材”，指一种血管内装置，血管装置，血管移植体，一种(例如，从心脏起搏器或心脏电击器)到暴露于血管系统的导线或导线头。在一个优选的实施例中，本发明中“医疗器材”的范围和意义是一种包含一个斯坦特固定模的装置(本领域公知，斯坦特固定模是一种金属的和/或聚合物的笼状或管状的支撑装置，通常用于保持导管(例如血管)畅通)。本发明说明书和权利要求中可交换使用的术语“血管内装置”和“血管装置”，指一种被引入人或动物的脉管系统的结构，以恢复功能受损的、患病的或被堵塞的组织，包括假肢器官和血管移植体。在一个优选的实施例中，本发明的“血管内装置”和“血管装置”的范围和意义是一种包含一个斯坦特固定模的装置。本发明中使用的术语“血管内装置”还包括装置相连的材料，这些材料连同该装置一起被引入人体或动物体。典型的血管装置包括，但不限于：心脏补片、人工心脏瓣膜、瓣环成形环、环状圈、机械辅助医疗装置、血管封口装置、中心静脉导管、动脉插管、起搏器、除颤器、导丝、栓子保护滤器、栓子装置(例如，弹簧圈)、植入型输注泵和血管缝线。血管移植体包括冠状动脉旁路移植体，人工心脏瓣膜，外周血管旁路移植体外，血管移植体，以及人造移植体。可以使用根据本发明优选的医疗器材，而不使用除了该优选的医疗器材之外的其它医疗器材。

医疗器材可以由以下材料组成：各种材料包括但不限于：金属，金属氧化物，非金属氧化物，陶瓷，橡胶，塑料，丙烯酸，有机硅，聚合物以及它们的组合物，因此医疗器材也可以具有以上材料组成的一种或多种表面。血管内装置可以用任何生物相容性材料制成；但是，由于在脉管系统中存在生物适合性的困难，该生物相容性材料最好是相对惰性的。这种装置由本领域公知的各种材料制成，但最典型的是生物学惰性聚合物或金属。用于制造医疗器材的金属是本领域中公知的，包括但不限于：不锈钢、钽、金、铂、银、钨、钛、钛合金(例如记忆钛合金，如镍钛合金)、过渡金属、碱金属和碱土金属(周期表分类中，每类在结构和功能上相关的组成金属中的后三种)。金属合金(例如钴铬合金)和这些群组中的每种金属氧化物也个别地和独立地包括在内。在本发明中，本发明的生物活性涂层组合物结合的表面材料优选是一种金属，更优选地是不锈钢。可以使用根据本发明的优选的医疗器材的表面材料，而不使用除了该优选的表面材料之外的其它表面材料。

当术语“表面”在本文中与医疗器材一起使用时，它通常指医疗器材的一个或多个金属表面，其处于生物学溶液和/或生物学组织中，优选与血液接触和/或被引入个体的脉管系统；因此，这种表面对任何一个或多个血栓，新内膜形成，再狭窄是敏感的。“金属表面”指一种表面材料，由一种或多种金属、金属合金、金属氧化物，以及它们的组合物组成。

本发明说明书和权利要求中使用的术语“个体”，指人或者动物。

本发明中使用的术语“血管生物制剂”，指一种生物学物质，其在以下一个或多个方面具有特异的生物学效用：修复或整合血管系统内部的血管装置，特别是在手术后或紧接着移植一个血管内装置后；以及促进内皮化。一种血管生物制剂可以包括一种生物学物质，其选自由以下物质组成的组：胶原(例如IV型和/或V型)，vitrogen，层粘连蛋白，巢蛋白，纤连蛋白，聚糖(例如，蛋白多糖，氨基多糖)，支持内皮细胞生长的一种或多种生长因子(例如，血管内皮生长因子(VEGF)，表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF))，肝素结合表皮样生长因子，血管生成素1(ang-1)，血管生成素2(ang-2)，肝细胞生长因子(HGF)，血小板衍化内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，LIF)，血管生成素(例如，ang-3，ang-4)以及它们的组合物。可以依照本发明使用一种优选的血管生物制剂，而不使用除了该优选的血管生物制剂之外的血管生物制剂。

本发明说明书和权利要求中使用的术语“表面结合结构域”，指一种特异地结合一种医疗器材的金属表面的多肽；尤其是，它具有斯坦特固定模的不锈钢具有结合特异性，并且基本上具有选自SEQ ID NOs：1-8的氨基酸序列(还可以参见表1)。依据本发明，可使用一种优选的表面结合结构域(包括其特异结合的表面类型)，而不使用除了该优选的表面结合结构域之外的表面结合结构域。本发明的生物活性涂层组合物的表面结合结构域选择那些特异地结合(例如，典型地，通过非共价键、离子键或静电相互作用)到期望被包覆的医疗器材的至少一个表面的金属材料上，通常，当医疗器材植入需要该医疗器材的个体中时，所述至少一个表面处于脉管系统相关的生物学组织和/或生物体液中。

术语“足够结合的时间”泛指一段持续时间，它足以满足本发明所述的结合结构域和该结合结构域具有结合特异性的基质的特异性结合，如本领域公知的那样。

本发明说明书和权利要求中使用的术语“内皮细胞结合结构域”，指一种特异地结合内皮细胞谱系的一种或多种细胞的多肽，并且该多肽基本上具有选自SEQ ID NOs：9-46的氨基酸序列(也可参见表3)。这样的内皮细胞细胞结合结构域可以特异地结合内皮细胞谱系的一种特定类型的细胞(例如，内皮细胞，或内皮细胞祖细胞，或一种特定的组织来源(例如心脏内皮细胞)的内皮细胞)，或者结合内皮细胞谱系的超过一种类型的细胞(例如，共有一种共同的被该内皮细胞结合结构域结合的表面分子)。或者，本发明的该生物活性涂层组合物可以包括超过一种类型的内皮细胞结合结构域(例如，两个或更多不同的多肽，其中每个特异性结合内皮细胞谱系的不同细胞)。因此，在此情况下，一种内皮细胞结合结构域具有内皮细胞谱系的细胞的一种结合特异性，该结合特异生不同于该生物活性涂层组合物中存在的其它类型的内皮细胞结合结构域的结合特异性。“内皮细胞结合结构域”的定义中排除抗体，尤其是对于内皮细胞具有结合特异性的抗体。根据本发明，可以使用一种优选的内皮细胞结合结构域(包括它特异性结合的内皮细胞谱系的细胞类型)，而不使用除了该优选的内皮细胞结合结构域之外的内皮细胞结合结构域。因此，优选的内皮细胞结合结构域多肽基本上具有选自SEQ ID NOs：9-46的氨基酸序列，并且排除除了氨基酸序列为SEQ ID NOs：9-46之外的内皮细胞结合结构域多肽。

本发明说明书和权利要求中的术语“生物活性涂层组合物”和“界面生物材料”可以交互使用，指一种组合物，它包括至少一个表面结合结构域，其包含基本上具有选自SEQ ID NOs：1-8的氨基酸序列，和至少一个内皮细胞结合结构域，其包含基本上具有SEQ ID NOs：9-46的氨基酸序列，其中该至少一个表面结合结构域和至少一个内皮细胞结合结构域连接在一起(例如，通过一种或多种物理的、化学的、合成的或生物学的(例如通过重组体表达)方式)，使得每个结合结构域保持它各自的功能，能够结合与其具有结合特异性的各自的分子(如本发明所述)。这种连结可以包括一种具有两个或更多表面结合结构域结合在一起的多体分子，其中内皮细胞结合结构域与该多体分子的全部或部分表面结合结构域连接在一起。例如，利用多肽化学领域公知的标准试剂和方法，两个结合结构域可以通过侧链-侧链键合(例如，每个多肽具有一个侧链胺(如赖氨酸的ε胺))，侧链到-N末端键合(例如，一个多肽的N-末端与另一个多肽的侧链胺)，侧链到C-末端键合(例如，一个多肽的C-末端化学部分与另一个多肽的侧链连接)，N-末端到N-末端键合，N-末端到C-末端的键合，C-末端到C-末端的键合，以及它们的组合。在合成或重组体表达中，通过合成或者将两种多肽作为一个单一多肽表达，表面结合结构域的多肽可以直接与内皮细胞结合结构域的多肽连接。表面结合结构域与内皮细胞结合结构域也可以通过接头连接而形成生物活性涂层组合物。

本发明的生物活性涂层组合物或界面生物材料包括：(a)至少一个根据本发明的表面结合结构域，其数量足以介导该生物活性涂层组合物或界面生物材料与该至少一个表面结合结构域特异性结合的该医疗器材的金属表面材料结合；和(b)至少一个根据本发明的内皮细胞结合结构域，其数量足以使得被包覆的医疗器材能够附着或粘附内皮细胞谱系的细胞，优选地，除此之外，还可以促进该医疗器材的覆膜表面的内皮化；其中该至少一个表面结合结构域和该至少一个内皮细胞结合结构域连接在一起。在一个优选的实施例中，使用接头把该至少一个表面结合结构域和该至少一个内皮细胞结合结构域连接起来。

在功能上，当该生物活性涂层组合物涂在医疗器材的金属表面时(使生物活性涂层组合物与金属接触)，生物活性涂层组合物与金属表面的结合主要通过包括根据本发明的至少一个表面结合结构域的生物活性涂层组合物的结构域介导；并且该生物活性涂层组合物的性质，或与该生物活性涂层组合物相关的附着、粘附、内皮化，或者它们的组合，主要是通过包括本发明的至少一个内皮细胞结合结构域的生物活性涂层组合物的结构域介导。因此，当医疗器材表面涂有本发明的生物活性涂层组合物，并且该被包覆的医疗器材被引入或应用于一个个体时，该生物活性涂层组合物就成为医疗器材和该个体的生物学组织和/或生物体液之间的界面(由此成为“界面生物材料”)。据此，本发明提供一种促进内皮细胞谱系的细胞附着和粘附到医疗器材上的方法，该方法包括用一种生物活性涂层组合物或界面生物材料覆盖在医疗器材的一个或多个金属表面上，所述的生物活性涂层组合物或界面生物材料包括至少一个根据本发明的表面结合结构域和至少一个根据本发明的内皮细胞结合结构域，其中该至少一个表面结合结构域和该至少一个内皮细胞结合结构域是连接在一起的。在另一个实施方案中，提供一种促进医疗器材的金属表面内皮化的方法，该金属表面适于接触一种或多种与脉管系统相关的生物学组织(例如，一根血管)或生物体液(例如血液)，该方法包括：用一种生物活性涂层组合物或界面生物材料覆盖在医疗器材的一个或多个金属表面上，所述的生物活性涂层组合物或界面生物材料包括至少一个根据本发明的表面结合结构域和至少一个根据本发明的内皮细胞结合结构域，其中该至少一个表面结合结构域和该至少一个内皮细胞结合结构域连接在一起，并且该至少一个内皮细胞结合结构域与内皮细胞谱系的细胞结合。

说明书和权利要求中使用的术语“接头”，指一种化合物或分子的某部分，它可以作为一种分子桥连接至少两个不同分子(例如，对于本发明，连结一个表面结合结构域和一个内皮细胞结合结构域，或在形成一个包括两个或更多表面结合结构域的多体分子时连结两个或更多表面结合结构域，或在形成一个包括两个或更多内皮细胞结合结构域的多体分子时连结两个或更多内皮细胞结合结构域)。因此，举例来说，接头的一部分结合本发明的表面结合结构域，接头的另一部分结合本发明的内皮细胞结合结构域。如本领域技术人员公知的那样，利用本领域公知的方法，一个表面结合结构域和一个内皮细胞结合结构域与接头的结合可以是逐步的方式，也可以同时连结到接头上，以形成本发明的生物活性涂层组合物或界面生物材料。对于接头，没有特定的大小或含量限制，只要它能达到作为分子桥的目的，而且生物活性涂层组合物的结合特异性能大体上保持。

接头对于本领域技术人员是公知的，包括但不限于：化学链，化合物(例如试剂)等等。接头可以包括，但不限于：同型双功能接头和异型双功能接头。异型双功能接头，如本领域技术人员公知的那样，包含具有第一种反应功能的一端(或化学部分)来特异地连结第一种分子，以及相对的具有第二种反应功能的一端来特异地连接第二种分子。本领域技术人员显然了解各种双功能或多功能试剂，不管是同型的还是异型功能的(如Pierce化学公司，Rockford，I11产品目录上所述)，氨基酸接头(典型地，3到15个氨基酸之间的短肽，通常包含如甘氨酸，和/或丝氨酸之类的氨基酸)，以及聚合物(例如聚乙二醇)都可以用作本发明的接头。在一个实施例中，典型的多肽接头包括多个与结合结构域结合的活性部位(例如聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚胱氨酸、聚谷氨酸以及聚天冬氨酸)或包括基本上惰性的多肽接头(例如，lipolyglycine，聚丝氨酸，聚脯氨酸，聚丙氨酸，及其它包括丙氨酰，丝氨酰，脯氨酰，或苷氨酰氨基酸残基的低聚肽)。在一些实施例中选择氨基酸接头，本发明的生物活性涂层组合物可以合成为一个单一的，连续的多肽，包括一个表面结合结构域，一个接头，以及一个内皮细胞结合结构域。因此，接头只是通过单一连续多肽的键进行连接。

适当的聚合接头在本领域中是已知的，可以包括合成聚合物或天然聚合物。代表性的合成聚合物包括但不限于聚醚(例如聚乙二醇(“PEG”)，聚酯(例如聚乳酸(PLA)以及聚羟基乙酸(PGA))，聚胺，聚酰胺(例如尼龙)，聚氨基甲酸酯，聚甲基丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸甲酯；PMMA)，聚丙烯酸，聚苯乙烯，聚己酸，柔性的螯合剂如EDTA、EGTA，及其它合成聚合物，优选分子量大约20道尔顿至大约1,000千道尔顿。代表性的天然聚合物包括但不限于：透明质酸，海藻酸盐，硫酸软骨素，纤维蛋白原，纤连蛋白，白蛋白，胶原，钙调蛋白，及其它天然聚合物，优选地分子量大约200道尔顿至大约20,000千道尔顿(对于构成的单体)。聚合接头可以包括二嵌段聚合物，多嵌段共聚物，梳形聚合物，星形聚合物，枝状或支化聚合物，杂合的线形枝状聚合物，由赖氨酸组成的支链，或无规共聚物。接头还可以包括巯基(氨基)羧酸，丙烯酰胺羧酸，丙烯酰胺-胺基三乙撑羟基乙酸，7-氨基苯甲酸，及其衍生物。接头在本领域中已知，并且包括可以被分开的接头，可以制成对于其它的分子部分或对于其自身具有反应性的接头，以用于交联的目的。

取决于要连接的分子的要素以及进行连接的条件，接头可以在长度以及组成上进行变化，以优化其维持生物功能，稳定性，抵抗一定的化学和/或温度参数，以及足够的立体选择性或大小的性质。例如，接头不应该显著地影响表面结合结构域在生物活性涂层组合物中发挥功能的能力(即以适当的亲合力与根据本发明与其具有结合特异性的医疗器材表面充分地结合)。同样地，接头不应该显著地影响内皮细胞结合结构域在生物活性涂层组合物发挥功能的能力(即以适当的亲合力充分地结合根据本发明与其具有特异性的内皮细胞谱系的细胞)。优选的接头可以是具有增强或补充本发明的生物活性涂层组合物效果的活性的分子。例如，利用聚乙二醇或其它的聚合分子或蛋白质(例如白蛋白)作为接头，可以帮助阻止非特殊蛋白质和/或不想要的细胞粘附在涂有本发明的生物活性涂层组合物的医疗器材表面。本发明可以使用优选的接头，而不使用除了优选的接头之外的接头。

术语“结合特异性”或“结合的特异性”，以及本发明说明书和权利要求中使用的类似术语，可以交互使用，指一个结合结构域(如本发明描述的那样)所具有的的能力，其对于一种目的分子或选定结合的表面材料(后者称“目标表面材料”)的结合亲合力要大于别的分子或表面材料(除了目的分子或目标表面材料之外)；例如，对于处于其它基质的异源群体中的一种特定的基质的亲合力大于非特异性吸附的亲合力。举例来说，如果一种表面结合结构域对一种金属表面具有结合特异性，优选对于医疗器材的不锈钢表面具有结合特异性，与医疗器材的其它成分或材料的结合相比较，这时该表面结合结构域表现出优先结合金属。这种优先的结合可以依赖于对于该结合结构域具有结合特异性的分子或材料上面或内部的一种特定的构象，结构，和/或电荷存在，使得它能够识别该分子或材料并与之结合，而不是一般的分子或材料。

在一些实施例中，一种结合结构域与一种特定的表面，材料或化学成份的特异结合，与该结合结构域与一种适当的对照，如一种不同的材料或表面，或一种一般用来作对比的蛋白如牛血清白蛋白的结合相比，比值至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，200％，300％，400％，500％，或更高的百分比。例如，结合特异性可以通过试验确定，在试验中定量的信号(例如荧光，或比色)代表多肽和靶细胞的结合与多肽和非目的细胞结合的相对数量。因此，如果在这种检测中，结果表明大约40％的内皮细胞(作为靶细胞)与一种多肽结合，并且小于10％的另一种细胞(例如平滑肌细胞；“非目的细胞”)与该多肽结合，那么这种多肽就可以说对于内皮细胞具有结合特异性。在一个优选的实施例中，结合结构域的结合特异性具有另外的特征，即EC50为10μM或更低，优选小于1μM。EC50可以利用许多本领域公知方法测定，如根据一个结合试验制出浓度响应曲线，其中多肽的浓度与已知数量的该多肽具有结合特异性的材料或细胞进行滴定(例如，参见本发明实施例2和3所述的方法)。在此情况下，EC50代表在该试验中该多肽被观察到形成最大结合值的50％时的多肽浓度。

本发明说明书和权利要求中使用的术语“多肽”指的是一条氨基酸链，其长度不小于约3个氨基酸并且不大于约500氨基酸残基，其中该氨基酸链可以包括天然氨基酸，合成氨基酸，遗传编码氨基酸，非遗传编码氨基酸，以及它们的组合；但是，“多肽”的范围和定义中特别地排除其是一种抗体。优选地，多肽包括一个根据本发明的结合结构域，其包括一个连续的序列，长度不小于7个氨基酸并且不大于约60个氨基酸。本发明使用的多肽可以通过化学合成，重组体表达，大分子的生化或酶法断裂，大分子的化学裂解，其前述方法的组合而生成，或者，一般而言，由本领域中的其它任何方法制得，优选地用分离的方法。术语“分离”指一种多肽基本上不含有那些不具有该多肽本身的整体结构的一部分的成分；例如，通过重组体方法制备时基本上不含多孔材料或培养基，或通过化学合成或利用生化或化学方法制备时基本上不含有化学前体或其它化学物质。本发明可以使用一种优选的多肽，而不使用除了该优选多肽之外的多肽。

多肽可以包括L型氨基酸、D型氨基酸，或其组合。代表性的非遗传编码氨基酸包括但不限于：2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；β-丙氨酸；2-氨基丁酸；4-氨基丁酸(哌啶酸)；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基异丁酸；3-氨基异丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；锁链赖氨素；2，2′-二氨基庚二酸；2，3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟基赖氨酸；别羟基赖氨酸；3-羟脯氨酸；4-羟脯氨酸；异锁链赖氨素；别-异亮氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸)；N-甲基异亮氨酸；N-甲基缬氨酸；正缬氨酸；正亮氨酸；鸟氨酸；和3-(3，4-二羟苯基)-L-丙氨酸(“DOPA”)。典型的氨基酸衍生物包括，例如，自由氨基衍生为胺氯化物，p-甲苯磺酰基基团，苄氧羰基基团，t-丁基氧羰基基团，氯乙酰基基团或醛基基团的分子。自由羧基可经衍生而形成盐、甲基和乙酯或其它类型的酯或酰肼。游离羟基可以经衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生形成N-亚胺基-苯甲基组氨酸。在一个优选的实施例中，在本发明的生物活性涂层组合物中，该至少一个表面结合结构域包括一个N末端氨基酸，一个C末端氨基酸，或其组合，其中该氨基酸是一种非遗传编码氨基酸，可增强该表面结合结构域与它具有结合特异性的医疗器材表面的结合亲合力(相互结合的力)。可以利用本领域公知的标准方法如固相和/或液相合成把这种氨基酸合并到一个包含表面结合结构域的多肽中。例如，在一个实施例中，在合成期间，将大约一到大约四个DOPA的残基，一个羟基氨基酸(例如，一个或多个羟基赖氨酸，别-羟基赖氨酸，羟脯氨酸，等等)或其组合加入到一个多肽的氨基酸序列的氨基酸末端，其中该多肽包括一个用于本发明的生物活性涂层组合物的表面结合结构域，来增强该生物活性涂层组合物和被包覆的医疗器材的至少一个金属表面之间相互结合的力(例如通过静电作用或离子相互作用)。

本发明的多肽可以经过修饰，例如添加化学部分，或进行氨基酸的替换，插入和缺失，在这种情况下该修饰对于它的应用可以提供一定的优势；只要这种多肽基本为SEQ ID NOs：1-47所例举的氨基酸序列。在本发明的说明书和权利要求中所使用的术语“基本上存在”或类似的术语(例如，“基本上由……组成”)指一种多肽，其包括本发明所述多肽的氨基酸序列，或者一种具有最小70％同一性(和优选至少90％同一性)的多肽(如本发明更详细描述的那样)，并且可以在羧基和/或氨基末端包括另外的氨基酸(例如，每端大约1到大约20个氨基酸)，并且其保持多肽作为一个本发明所述的结合结构域的基本活性。在一个实施例中，多肽基本上由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成包括一个SEQ ID NO：1的氨基酸序列(后者的差别在于N末端具有另外的20个氨基酸，但是保持着对于金属表面的结合特异性；例如，参见实施例2和表2)。在另一个非限制性的实施例中，一个内皮细胞结合结构域包括一个多肽，“基本上”由SEQ ID NOs：9-46所示氨基酸序列中的任何一个组成，其对于内皮细胞谱系的细胞具有结合活性；并且由此组成的材料所具有的特性不会转变为作为内皮细胞结合结构域多肽的基本的和新的特性(例如，在前面所述的实施方式中，一个全长的天然的多肽，或一种遗传工程产生的多肽，其具有除了作为本发明所述的结合结构域的基本活性，并且其包含如本发明所述的多肽的结合结构域的氨基酸序列，不会构成“基本上”由本发明所述的多肽或氨基酸序列的多肽)。

因此，术语“多肽”包括任何一种形式的多肽衍生物，包括，例如：酰胺，蛋白质缀合物，环酮多肽，聚合的多肽，保守替换变体，类似物，片段，化学修饰多肽，以及多肽模拟物。任何具有期望的本发明的结合结构域特征的多肽衍生物都可用于本发明的实施。例如，可以将一个化学基团添加到多肽的N末端氨基酸以封闭多肽的氨基末端的化学反应性，包括N末端基团。这种用于保护氨基末端的N末端基团在本领域中是公知的，包括但不限于：低级烷酰基基团、酰基基团、磺酰基团，以及氨基甲酸盐形成基团。优选的N末端基团可以包括乙酰基、Fmoc，以及Boc。也可以将一个化学基团添加到一个合成多肽的C末端氨基酸来封闭多肽的羧基末端的化学反应性，包括C-末端基团。这种用于保护多肽的羧基末端的C末端基团在本领域是公知的，包括，但不限于：酯基或酰胺基。多肽的末端修饰对于减少被蛋白酶消化的敏感性通常是有用的，并因而在多肽存在于含有蛋白酶的生物体液中时可延长多肽的半寿期。或者，本发明所述的包括一个结合结构域的多肽，可以包括一个或多个经修饰的氨基酸，以包含一个或多个化学基团(例如具有活性的官能团，如氟、溴或碘)来促进多肽连结到接头分子上。本发明使用的术语“多肽”也包括其中一个或多个肽键被拟肽键取代，拟肽键包括但不限于：carba键(CH₂-CH₂)、depsi键(CO-O)、羟基亚乙基键(CHOH-CH₂)、亚甲基酮键(CO-CH₂)、亚甲基-氧键(CH₂-O)、还原键(CH₂-NH)、硫亚甲基键(CH₂-S)、N-修饰键(-NRCO-)、以及硫肽键(CS-NH)。

作为根据本发明的生物活性涂层组合物或利用生物活性涂层组合物的方法中的结合结构域的多肽还可以包括相对于本发明的表1和3以及SEQ ID NOs：1-47中公开的任何一个示范性多肽具有一个或多个残基的替换，添加和/或缺失的多肽，只要基本上保持原有的示范性多肽的结合性质。因此，本发明的结合结构域包括下述多肽，它与本发明公开的示范性的序列的不同之处在于，例如，与示范性多肽之间相差大约1％到大约25％的氨基酸序列；但基本上保持相应的示范性序列结合特定材料的能力或者具有结合特异性而起到结合结构域的作用的能力(例如，利用适当的试验检测，其保持本发明公开的示范性序列的至少50％、75％、100％或更多的结合特异性)。也就是说，本发明的结合结构域优选包括那些与本发明公开的示范性序列的序列同一性在至少50％到大约99％之间，或具有更高序列同一性的多肽。序列同一性可以人工计算，也可能利用一种数学算法，例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，或本领域已知的其它程序或方法的计算机实现进行计算。利用这些程序的序列对比可以利用缺省参数执行。

例如，对比包括基本上由表1中鉴定的氨基酸序列SEQ ID NOs：3和4的表面结合结构域。共有序列可以(利用标准单字母氨基酸符号)记作一种基本上由SEQID NO：5所示的氨基酸序列组成的多肽。因此，这些氨基酸序列(SEQ ID NOs：3和4)共有显著的序列同源性(如本发明所示)，但是共有序列同一性小于大约50％，而基本上保持了对于金属，尤其是不锈钢的结合特异性。

一种具有基本上与本发明公开的示范性多肽相同的氨基酸序列的多肽也可以具有一个或多个不同的氨基酸残基，其由示范性多肽序列中的氨基酸残基被功能上类似的氨基酸残基替换(“保守替换”)而得到；只要包含保守替换的多肽基本上保持了不包含保守替换的示范性多肽的结合特异性。保守替换的例子包括将非极性的(疏水的)残基如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸中的一个替换为另一个；将芳香氨基酸残基如色氨酸，酪氨酸，或苯基丙氨酸中的一个替换为另一个；将极性的(亲水的)残基中的一个替换为另一个，如精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酰胺和天冬酰胺之间，苏氨酸和丝氨酸之间的替换；将碱性残基如赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的一个替换为另一个；或将酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸中的一个替换为另一个。

在本发明的另一个实施方案中，本发明所述的结合结构域包括一个多肽，其基本上由可用于本发明的多肽(和/或其氨基酸序列)组成。

[正式定义结束]

本发明提供了一种生物活性涂层组合物(或界面生物材料)，包括内皮细胞结合结构域的多肽，包括表面结合结构域的多肽，包覆一种医疗器材的方法，制造一种医疗器材的方法，和一种被包覆的医疗器材；其都涉及一种生物活性涂层组合物，包括：至少一个表面结合结构域，其包括一个基本上由选自SEQ ID NOs：1-8，及其组合的氨基酸序列组成的多肽；和至少一个内皮细胞结合结构域，其包括一个其本上由选自SEQ ID NOs：9-46，及其组合的氨基酸序列组成的多肽；其中该至少一个表面结合结构域与该至少一个内皮细胞结合结构域结合在一起。该至少一个表面结合的数量对于介导该生物活性涂层组合物与医疗器材的经过选择的金属表面的结合是有效的，所述表面结合结构域对于医疗器材的金属表面具有结合特异性；并且该至少一个内皮细胞结合结构域在数量上对于赋予被本发明的生物活性涂层组合物包覆的医疗器材表面能够促进内皮细胞谱系的细胞的连接，粘附，和内皮化中的一种或几种。本发明在下面的例子中进行说明，其用意不在于限制。

实施例1

本实施例说明生成本发明的生物活性涂层组合物中的一种表面结合结构域和一种内皮细胞结合结构域的各种方法。包括本发明的生物活性涂层组合物中的结合结构域(即一种表面结合结构域和一种内皮细胞结合结构域)的许多多肽是利用噬菌体展示技术开发的。

噬菌体展示技术在本领域中是公知的，可用于鉴定其它的多肽，用作本发明的界面结合材料中的结合结构域。通常，利用噬菌体显示，各种多肽的库可以展示在目的基质上，并且可以选择特异结合该基质的多肽作为结合结构域。可以利用连续多轮选择，称为“淘选”。如本领域中已知的那样，任何一个库和淘选方法都可用于鉴定可用于本发明的生物活性涂层组合物中的结合结构域。淘选方法可以包括，例如，液相筛选、固相筛选，或基于细胞的筛选。一旦一种候选的结合结构域被鉴定出来，该序列的定向或随机诱变可以用于优化该结合结构域的结合性质(包括一种或多种特异性和亲合力)。

例如，筛选各种不同的噬菌体展示文库，得到与选定的目标基质(例如，一种选定的基质，用于找到可用于本发明的结合结构域)结合的多肽。该基质结合到96孔板的孔上或置于孔中(取决于选择的基质)。该聚苯乙烯微孔板的孔表面的非特异性结合位点用含有1％牛血清白蛋白的缓冲液在4℃下保温过夜封闭。然后用含有磷酸盐缓冲盐水和Tween^TM 20(“PBS-T”)的缓冲液将孔洗5遍。每个库在PBS-T中稀释到浓度为10¹⁰pfu/ml，总体积为100μl。在室温下以50rpm振荡保温3小时后，用多次PBS-T洗涤去除未结合的噬菌体。结合噬菌体用0.1M甘氨酸缓冲液，pH2.2变性回收。洗脱的噬菌体用磷酸盐缓冲液中和，然后加入到含有E.coli细胞的生长培养基中。含细胞和噬菌体的培养基在震荡器中以200rpm的转速于37℃保温过夜培养。将培养液离心后收集含有噬菌体的上清液。第二轮和第三轮的选择按第一轮选择的类似方式进行，利用前一轮扩增的噬菌体作为给料。为了检测特异结合选择的基质的噬菌体，利用抗噬菌体抗体缀合到检测分子上进行酶联免疫吸附(ELISA-型)试验，然后对试验中结合的检测分子进行检测和定量。然后确定编码来自噬菌体的与选定的基质特异结合的多肽的DNA序列；即编码该多肽的序列定位于噬菌体基因组的插入部分，并且可以在噬菌体表面展示相应的氨基酸序列。

如本领域技术人员所知，以及根据本领域公知的方法，包含本发明结合结构域的多肽可以通过任何方法进行多肽合成，包括但不限于，固相合成、液相合成，以及它们的组合。例如，包含可用于本发明的结合结构域的多肽可在多肽合成仪上利用标准固相合成方法，利用标准FMOC多肽化学合成。在所有的残基都已经连结后，利用本领域公知的标准方法和试剂同时进行解离和侧链脱保护。从树脂上解离后，将多肽沉淀，并且将沉淀物冷冻干燥。然后利用反相高效液相色谱法纯化多肽；用质谱分析法确认多肽同一性。

实施例2

本实施例用于说明表面包含对于一种医疗器材的金属表面，如一种斯坦特固定模的不锈钢表面具有结合特异性的结合结构域的发现和特性。

A.噬菌体筛选和选择

作为一个特定的说明性实施例，在含有不锈钢斯坦特固定模材料的聚苯乙烯微孔板的孔中，非特异性结合位点用含有1％牛血清白蛋白的缓冲液在室温下封闭2小时。然后将孔和不锈钢斯坦特固定模材料用PBS-T洗3遍。平板在室温下以50rpm振荡保温1小时。17个不同的噬菌体展示文库的每一个都用PBS+1％ BSA稀释，加至浓度为10¹⁰pfu/ml，总体积为250μl。在室温下以50rpm振荡保温1小时后，加入70μl牛血清，然后将平板在37℃振荡保温1小时。非结合的噬菌体用300μl PBS-T洗3遍除去。最后一遍洗涤后，结合到斯坦特固定模上的噬菌体用于感染E.coli细胞。受感染细胞置于96深孔平板中保温，每孔含1ml生长培养基(例如，2xYT+5μg/ml四环素)，在37℃振荡过夜。通过离心作用收集每孔中含有扩增噬菌体的上清液。第二、第三和第四轮的选择按照第一轮类似的方式进行，利用前一轮的150μl扩增噬菌体上清液作为给料，并且用150μl的PBS-T+1％ BSA稀释。从第四轮的选择中，分离出340个单株的克隆噬菌体，通过平板稀释噬菌体库来获得单个的溶菌斑。为了检测特异地结合金属，如不锈钢的噬菌体，利用缀合到辣根过氧化物酶上的抗M13噬菌体抗体进行常规ELISAs，然后加入显色剂ABTS(2，2’-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)。噬菌体的相对的结合强度通过在ELISA中噬菌体与不锈钢结合能力的连续稀释检验进行测定，利用缀合于辣根过氧化物酶上的抗M13噬菌体抗体，然后加入显色剂ABTS，并测量405nm下的吸光度。在测定相对结合强度的ELISA中，噬菌体滴定是只使用缓冲液，或使用含20％全血的缓冲液进行的。确定编码特异结合金属表面的多肽的DNA序列。编码多肽插入片段的序列位于噬菌体基因组中，并翻译产生相应的氨基酸序列，展示在噬菌体表面。

在噬菌体滴定实验中，有三株噬菌体显示出期望的相对结合特异性。这3株噬菌体的核酸插入片段的氨基酸分析显示，该噬菌体展示了2种不同的多肽序列(即，3株中有2株具有相同的氨基酸序列)，如表1所示。因此，表1列出了这种表面结合结构域，它对于金属，如斯坦特固定模的不锈钢具有结合特异性，并且包含基本上由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽。

表1

 

	对于金属，如不锈钢的结合特异性
		SEQIDNO：	氨基酸序列(单字母代码)
1	SGVVDAGVVAEDGVSGEASRSSHRTNHKKNNPKKKNKTR
		2	SVEVACVSAGGGSSDVCASRNHTISKNHKKKNKNSNKTR
3	SSHRTNHKKNNPKKKNKTR
		4	NHTISKNHKKKNKNSNKTR

B.表面结合结构域的特性和修饰

对于两个表面结合结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)的分析显示，在每个序列中，多肽的C末端富含碱性氨基酸，如赖氨酸和组氨酸。因此，为了确定对于不锈钢的结合特异性是否主要由氨基酸序列的C末端部分产生，或者N末端区域是否也同样影响结合，合成基本上由后面的SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所列的氨基酸序列组成的多肽。合成带有生物素标记的表2中所列的SEQ IDNOs：1，3，和4的多肽，然后利用确定噬菌体展示多肽的相对结合强度的类似方法(如本发明前面所述)，通过ELISA检测相对结合强度。在本试验中，连续稀释(从0μM到10μM)每种多肽，使其与不锈钢斯坦特固定模保温，用PBS-T洗涤，通过检测由抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶(抗生物素蛋白链菌素部分结合到生物素标记多肽上)与发色基质反应引起的发色信号定量测定相对结合特异性。EC50由滴定曲线确定。如表2所列，与基本上由SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的多肽相比，基本上由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽具有最强的结合特异性(或者结合亲和性)。另外，该结果证明，富含赖氨酸和组氨酸的C末端的氨基酸(例如，SEQ ID NO：1的21-39位氨基酸，其以SEQ ID NO：3表示；和SEQ ID NO：2的21-39位氨基酸(其以SEQ ID NO：4表示))对于这些多肽与金属(例如钛，及其它具有氧化层的金属)，以及优选不锈钢的结合特异性起主要作用。

表2

 

SEQ ID NO：	以毫微摩尔(nM)表示的EC50
		1	<250nM
4	<250nM
		3	<50nM

根据这些实验，以及考虑关键位置的氨基酸对于介导与金属，例如不锈钢的结合特异性的作用，优选的表面结合结构域包含任一个具有SEQ ID NOs：1，2，3，或4的氨基酸序列多肽的变体或衍生物，该氨基酸序列至少包含一个具有SEQ IDNO：5的基元的多肽，如下所述。

SEQ ID NO：5： X₁-H-X-X-X₂-X₂-X₂-K-X₁-X₁-X-K-X₁-X₁-N-K；其中

X是任何氨基酸；

X₁是K，N，或S，但是优选K或者N；并且

X₂是K，N，或H。

因此，本发明的对于金属，如一种医疗器材的不锈钢具有结合特异性的一个优选的表面结合结构域包含一个多肽，其基本上由SEQ ID NO：5代表的氨基酸序列组成。

将基本上由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的多肽用环氧乙烷灭菌(642mg/L，2小时)，用该多肽制定其它的滴定曲线。结果显示，用环氧乙烷灭菌对于多肽与不锈钢相对结合特异性影响最小(与没有进行环氧乙烷灭菌的多肽得到的滴定曲线相比，EC50基本相同，<50nm)。

对一种包含基本由SEQ ID NO：3所列序列组成的多肽的表面结合结构域进行进一步的修饰，以评价参数，如pH对于结合特异性的影响，以及在血浆中的稳定性(例如，在血浆中的蛋白酶存在的情况下)。在一个实施方案中，基本上由SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列组成的多肽用D-氨基酸合成(SEQ ID NO：6)，而不是用L-氨基酸合成。在另一个实施方案中，合成的表面结合结构域包含基本上由SEQ IDNO：3所示氨基酸序列组成的多肽构成的一个多聚体(二价体(SEQ ID NO：7)，和四价体(SEQ ID NO：8))。SEQ ID NO：3的多聚体如下所示。

二价体(SEQ ID NO：7)

四价体(SEQ ID NO：8)

多聚体SEQ ID NOs：7和8按下述方法合成。简单来说，该多聚体以赖氨酸MAP核心构成，分别包括两个和四个SEQ ID NO：3的多肽单元。核心基元用于产生SEQ ID NO：3的两重和四重分枝。该多聚体在多肽合成器上利用固相化学顺序合成。合成在0.05mmol规模上进行以确保在合成中产物的最大程度偶联。生物素报告部分加在分子的C末端，在赖氨酸核心上附加一个短的Gly-Gly-接头。用标准的Fmoc/t-Bu化学进行合成，以AA/HBTU/HOBt/NMM(1:1:1:2)作为偶联剂(AA是氨基酸；HOBt是O-Pfp酯/1-羟基苯并-三唑；HBTU是N-[1H-苯并三唑-1-基)(二甲氨基)亚甲基]-N-甲基-甲基甲铵离子六氟磷酸盐N-氧化物；NMM是N-甲基吗啉)。在合成的循环中，所用的氨基酸保持5-10倍过量，并且所有的残基随偶联残基的组成而发生双倍、三倍甚至四倍的偶联。偶联反应通过凯撒茚三酮试验进行监测。利用含有20％哌啶的二甲基甲酰胺进行Fmoc脱保护反应。多肽从树脂上的解离是利用三氟醋酸(TFA:H₂O:三异丙基硅烷＝95:2.5:2.5)在室温下处理4小时完成的。粗产物在冷乙醚中沉淀。离心后得到的沉淀用冷的乙醚洗三次，并经冷冻干燥，得到期望的粗产物白色固体。粗产物在C-18柱上用流动洗脱液(A＝H₂O/TFA(0.1％TFA)并且B＝乙腈/TFA(0.1％TFA)进行高效液相色谱分析法(HPLC)进行分析。在通过HPLC进行最后纯化之前，对多聚体利用质谱分析法进行进一步的分析。含有想要的产物的部分集中起来并进行冷冻干燥，得到蓬松的白色粉末(>98％纯度)。

为了确定pH对于结合特异性的影响，在不同缓冲液存在的情况下(通过ELISA)进行确定相对结合强度的试验，pH的范围在pH 2到pH 12之间。例如，含甘氨酸和水的缓冲液，用HCl调节至pH2；醋酸盐缓冲液，调节至pH 4.0(离子强度约0.001M)；磷酸盐缓冲液(NaH₂PO₄)，调节至pH 6.0(离子强度约0.012M)；磷酸盐缓冲液(NaH₂PO₄)，调节至pH 7.0(离子强度约0.019M)；三羟甲基氨基甲烷缓冲液，调节至pH 8.0(离子强度约0.006M)；乙醇胺缓冲液，调节至pH 10.0(离子强度约0.003M)；磷酸盐缓冲液(NaH₂PO₄)，调节至pH 12.0(离子强度约0.044M)。本试验中，每种多肽的最终浓度是1μM。在本试验中检验表面结合结构域，其包含基本上由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成的多肽，及其多聚体(二价体(SEQ ID NO：7)和四价体(SEQ ID NO：8))。结合曲线显示，全部三种多肽(SEQ ID NO：3氨基酸序列的单体、二价体和四价体)在pH 6.0到pH 8.0的范围中都能很好地结合，结合的最适pH值是pH 7.0；在pH 6.0或pH 8.0时，结合活性的下降不超过20％。

基本上由SEQ ID NO：3的氨基酸序列的单体或四价体(SEQ ID NO：8)组成的多肽，以及包含它的D-氨基酸形式(SEQ ID NO：6)的多肽都基本上按照本发明所述在ELISA结合试验中进行检验，只是用存在于血浆中的不锈钢进行试验，以评价其稳定性(对于血浆中的蛋白酶的敏感度，或与血浆成分竞争结合到不锈钢上的能力中的一种或多种)。SEQ ID NO：3的氨基酸序列的四价体(SEQ ID NO：8)和基本上由SEQ ID NO：6所示氨基酸序列组成的多肽，与基本上由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成的多肽相比，都显著地表现出了在血浆存在下更好的稳定性(例如，保持多于1.5到4倍的结合多肽)，包括对于蛋白水解酶降解的较低敏感度。

实施例3

本实施例说明对于内皮细胞谱系的细胞包括具有结合特异性的多肽的内皮细胞结合结构域的发现和特性。

A.噬菌体筛选和选择

噬菌体库集中为四群，筛选结合到人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的多肽。这四个库首先在非靶细胞(例如，内皮细胞谱系的细胞之外的细胞)上进行预净化。对于每个库，将10μL的噬菌体(10¹⁰噬菌体)加入下列每种细胞类型的细胞的1 x 10⁶个细胞中：HEK-293细胞，主动脉血管平滑肌细胞(AoSMC)，以及血小板。噬菌体和细胞在室温下保温1小时。细胞和附着的噬菌体通过离心作用沉淀。保留在上清液中的噬菌体用于随后在HUVECs上的选择。在HUVECS上的选择利用本领域公知的方法进行，包括一轮或多轮的细胞生物淘筛，包括差速离心，荧光激活细胞分类术(FACS)，以及细胞单层。

在HUVECs上进行选择后，细胞在缓冲液中漂洗并离心。HUVECs和附着的噬菌体重新悬浮在2ml 2xYT细菌培养基中，用DH5 α F’细胞培养。将噬菌体从细菌培养基中分离出来并用荧光激活细胞分类术(FACS)检验靶细胞和非靶细胞，以确认特异性。细胞和附着的噬菌体再悬浮于含有与藻红素缀合的抗M13噬菌体抗体的培养基中。经洗涤后，将细胞再悬浮于缓冲液+1％ BSA中，通过FACS分析相对阳性率。利用该过程，鉴定相对于平滑肌细胞和血小板对于内皮细胞具有特异性的噬菌体展示多肽(例如，通过FACS显示对于平滑肌细胞和血小板小于10％的阳性率)。确定编码特异结合内皮细胞的噬菌体DNA序列插入片段，然后经翻译产生相应的氨基酸序列，展示在噬菌体表面(没有邻近的噬菌体序列；例如，SS或SR)。表3列出了这样的内皮细胞结合结构域，其包含基本上由SEQ IDNO：9-46的氨基酸序列组成的多肽。表3所列的以SEQ ID NOs：39-46表示的氨基酸序列来源于一个特定的偏好半胱氨酸存在的噬菌体库。但是，从另一个噬菌体库中发现氨基酸序列(即，SEQ ID NOs：9-38)，在序列上显示出对于甘氨酸(G)、缬氨酸(V)和丙氨酸(A)的富集的极大相关性(例如，序列中包含不少于10％至不大于75％的上述氨基酸残基)，这可能是结构-功能关系的一个指标。在这方面，已有报道说由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和天冬氨酸形成的多肽具有潜在催化功能的三级结构。

表3

B.结合结构域特征

对于表3中所列的具有期望的结合特异性部分内皮细胞结合结构域(例如，SEQ ID NOs：9-18，23-28，30-32，和35)，通过合成带有C末端生物素标记的多肽进一步通过FACS研究其在全血中与各种类型的细胞结合的特性。利用胰蛋白酶/EDTA从细胞培养瓶中收集细胞。细胞用(含血清)完全培养基进行中和，并在37℃至少恢复20分钟。将每种类型的细胞用相应的抗体进行标记，如表4所示，并在室温下保温20分钟。

表4.各种类型细胞的抗体

 

细胞类型	抗体	用量
			(人或猪的)内皮细胞	抗CD31-APC(APC是别藻蓝蛋白)	100μL/106细胞
内皮细胞祖细胞	兔抗-CD133，继之以抗-兔-APC
			平滑肌细胞	抗-α 肌动蛋白-APC	100μL/106细胞
血小板	抗-CD42b-APC	100μL/1mL血液

抗体标记的细胞用清洗缓冲液(HBSS+1％ BSA+0.1％叠氮化钠，滤过除菌)通过离心作用漂洗两次。一百(100)μL的全血按等份加入深孔聚丙烯平板的每个孔中。将多肽加入每个孔中，至要求的多肽浓度。向每孔中加入极小量的细胞(一般地10μL的细胞或约50,000个细胞)。在比较多肽与内皮细胞和血小板的相对结合的实验中，制备以下两组样品：第一组样品由含有抗体标记的内皮细胞的全血组成；第二组样品由含有未标记的内皮细胞和抗体标记的血小板的全血组成。将平板盖上，在室温下振荡保温20分钟。加入1mL的FACS裂解溶液裂解红细胞，将平板盖上，并在室温下摇动15分钟。在每个孔中加入一(1)mL的常温清洗缓冲液，在室温下以小于1500rpm的转速离心。吸出孔中液体，加入1.5mL清洗缓冲液，然后再次离心和吸出。在室温下将抗生物素蛋白链菌素-AlexaFluor 532在培养基中按1:500稀释，将细胞重悬浮于抗生物素蛋白链菌素-AlexaFluor 532溶液中。将平板盖上，在室温下保温20分钟，然后通过加入常温洗涤缓冲液，以小于1500rpm的转速离心漂洗两次。最终悬浮的细胞悬浮于250μL的洗涤缓冲液+50μL的4％多聚甲醛中。把样品转到分析平板上，利用FACS分析细胞结合。在该分析中，每种细胞类型的对照(带有如表4中的相应抗体，但不包含多肽)用来评价本底荧光。高于“无肽”的任何信号都用于计算阳性细胞百分比。

结合特性的结果显示，优选的内皮细胞结合结构域包括基本上由SEQ ID NOs：10，14-18，23，25-28，和30-32的氨基酸序列组成的多肽。经FACs测定，这些内皮细胞结合结构域显示出与人冠状动脉内皮细胞，猪冠状冠状动脉内皮细胞，和内皮细胞祖细胞的一种或几种结合，结合的特异性和选择性接近或超过40％阳性率，与血小板和平滑肌细胞的阳性率小于10％(常小于5％阳性率)。一些内皮细胞结合结构域与内皮细胞的结合相比，似乎更倾向于结合到内皮细胞祖细胞上(例如SEQID NO：14的氨基酸序列)，而其它的更倾向于结合内皮细胞(例如，SEQ ID NO：32的氨基酸序列)。表征结合特异性的辅助试验显示，这些优选的内皮细胞结合结构域的一个或多个(例如，SEQ ID NO：19)的EC50小于10μM。

实施例4

如本发明已经说过的那样，在有些情况下，包含本发明多肽的结合结构域也可以包括修饰；即，在N末端和/或C末端进行封闭，和/或与别的多肽连接。例如，利用该方法，对于医疗器材的金属表面具有结合特异性的表面结合结构域可以与内皮细胞结合结构域相连，形成本发明的生物活性涂层组合物。对于本领域技术人员显而易见的是，优选在一个结合结构域上连接一个接头分子的方法可以根据每个分子上存在的活性基团而变化。利用活性基团共价连接两个分子的流程在本领域中是公知的。如本发明中前面所述的那样，利用本领域中公知的方法，两个结合结构域通过接头连接的本发明的生物活性涂层组合物可以通过合成包含第一结合结构域(例如，一个表面结合结构域)，一个包含3个以上氨基酸的接头(例如，GSS)，和一个第二结合结构域(例如，一个内皮细胞结合结构域)的单一连续的多肽而形成。术语“第一”和“第二”只用来方便描述，而不是用于限制合成的顺序。换言之，第一结合结构域可能包括一个内皮细胞结合结构域，第二结合结构域可以包括表面结合结构域。在另一个方法中，至少一个(用抗生物素蛋白链菌素，抗生物素蛋白，或其功能衍生物，以及本领域公知的方法)亲和素化的第一结合结构域可以与至少一个已经(用生物素，和本领域公知方法)生物素化的第二结合结构域连接，形成本发明的生物活性涂层组合物。在这个实施例中，该抗生物素蛋白-生物素分子作为连结至少一个表面结合结构域和至少一个内皮细胞结合结构域的接头，形成本发明的界面生物材料。

作为制造本发明的生物活性涂层组合物的说明性实施例，至少一个包含基本上由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的表面结合结构域连接到至少一个包含基本上由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的内皮细胞结合结构域。在一个实施方案中，该表面结合结构域与该内皮细胞结合结构域通过一个包含10个单位聚乙二醇的接头(“PEG”)连接，以形成包含SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的生物活性涂层组合物(一个生物素标记作为PEG接头的一部分，便于检测生物活性涂层组合物的特性，如本发明将要描述的那样；并且游离C末端氨基酸被酰胺化)。

SEQ ID NO：47

SSFYGEVGYVGASLYAGGASSRG-PEG-SSHRTNHKKNNPKKKNKTRG

简单来说，生物活性涂层组合物是在多肽合成器以线形方式合成，并按以下顺序形成连续的链：一个SEQ ID NO：3的氨基酸序列，PEG接头，一个SEQ IDNO：19的氨基酸序列。利用AA/HBTU/HOBt/NMM(1:1:1:2)作为偶联剂，按标准Fmoc/t-Bu化学进行。在合成循环中，氨基酸过量5倍，所有残基加倍偶联。偶联反应用凯撒茚三酮试验进行监测。为了抑制多肽聚集作用，用拟脯氨酸Fmoc-Ala-Ser(Psi Me，Me pro)-OH，也是以5倍过量双倍偶联。Fmoc-Lys(生物素)-OH和Fmoc-NH-(Peg)₁₀-COOH用上述偶联条件手工加倍偶联，生成带有生物素标记的PEG接头。Fmoc脱保护反应在含有20％哌啶的DMF中进行。用试剂K(TFA:EDT:H₂O:phenol：苯硫基甲烷＝82.5:2.5:5:5:5)在室温下处理4小时将生物活性覆膜从树脂上解离，产生粗产物。粗产物在冷的乙醚中沉淀。离心作用后得到的沉淀用冷的乙醚洗涤三次，然后进行冷冻干燥，得到粗产物的白色固体。粗产物用分析型HPLC和质谱法进行分行，然后用梯度缓冲液B(乙腈/TFA(0.1％TFA))通过纯化型HPLC进行纯化。所期望的产物，生物活性涂层组合物经集中和冷冻干燥，获得蓬松的白色粉末(>95％纯度)。

用类似于实施例2和3中所描述的方法，对包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的生物活性涂层组合物，通过滴定该生物活性涂层组合物的浓度和测量其与包含不锈钢的金属的相对结合性，来测试其结合特异性。简单来说，将不锈钢珠用缓冲液(含有1％ BSA的PBS-T)封闭，洗涤，然后与生物活性涂层组合物以0到10μM的浓度在室温下保温1小时。洗涤后，用抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶(抗生物素蛋白链菌素部分结合到生物素标记的生物活性涂层组合物上)检测带有发色基质的生物活性涂层组合物的数值。EC50由滴定曲线确定。包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的生物活性涂层组合物具有与构成它的表面结合结构域(一个包含基本上由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽的表面结合结构域)类似的结合活性(例如，EC50)。

然后测试包含如SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列的生物活性涂层组合物选择性地使内皮细胞谱系的细胞粘附到医疗器材的金属表面的能力。在本实施例中，不锈钢盘用来代表一个医疗器材的金属表面。该盘与浓度为10μM的含有该生物活性涂层组合物的缓冲溶液在室温下接触1小时。作为非特异结合的对照，不锈钢盘或者不覆盖溶液，或者覆盖包含基本上由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽的表面结合结构域，或者覆盖一种不相关的多肽(已知对于金属或不锈钢或者内皮细胞没有结合特异性)。将该盘用PBS洗涤，然后将25,000内皮细胞加入含10％牛血清的细胞培养基中，并在室温下保温15分钟。将盘用PBS洗涤，将细胞用市售的荧光细胞存活力检测系统进行定量，该系统用一个荧光读出装置测量细胞内ATP。荧光用平板读数器检测。包含SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的生物活性涂层组合物显示，其能够将内皮细胞结合到金属表面，表现为与对照相比，结合到盘上的内皮细胞在数量上有几倍的增加。

实施例5

在这个实施例中，例举本发明的方法：(a)一种制造医疗器材的方法；(b)一种在医疗器材的金属表面覆膜的方法，使得覆膜表面能够粘附内皮细胞谱系的细胞；(c)一种促进医疗器材的至少一个金属表面内皮化的方法；以及(d)一种促进内皮细胞谱系的细胞粘附到医疗器材的方法。该方法包括使医疗器材的至少一个金属(优选不锈钢)表面与有效量的生物活性涂层组合物在适于在金属表面形成覆膜的条件下接触，其中该生物活性涂层组合物包含至少一个表面结合结构域和至少一个内皮细胞结合结构域；其中该至少一个表面结合结构域包含一种多肽，该多肽的氨基酸序列组成基本选自由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，及其组合所构成的组；其中该至少一个内皮细胞结合结构域包含一种多肽，该多肽的氨基酸序列组成基本选自由SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ IDNO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ IDNO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，及其组合所构成的组。其中至少一个表面结合结构域与该至少一个内皮细胞结合结构域连接。优选地，该至少一个表面结合结构域与该至少一个内皮细胞结合结构域通过一个接头共价连接。该至少一个表面结合结构域是该生物活性涂层组合物的成分，主要直到使生物活性涂层组合物与被覆盖的医疗器材的一个或多个表面结合的作用。

对于本发明的这些方法，以及对于本发明的生物活性涂层组合物，其中医疗器材的至少一个将要覆膜的表面包含超过一种金属材料(例如，两种不同的金属；一种金属和一种金属氧化物；一种金属和金属合金；等等)，生物活性膜中的至少一个表面结合结构域可以包括多种(两种或更多种)类型的表面结合结构域，其中每种类型的表面结合结构域与生物活性涂层组合物中包括的其它表面结合结构域相比，对于要被覆盖的一种不同的表面材料具有结合特异性。另外，对于本发明的方法，以及对于本发明的生物活性涂层组合物，该至少一个内皮细胞结合结构域可以包括超过一种类型(例如，通过每种内皮细胞结合结构域的结合特异性确定；例如，两种或更多种不同的多肽，一种多肽对于内皮细胞具有结合特异性，另一种多肽对于内皮细胞祖细胞具有结合特异性)。

在本发明的方法中，当生物活性涂层组合物与医疗器材的至少一个要被覆膜的金属表面接触时，(a)该至少一个内皮细胞结合结构域已经结合了内皮细胞谱系的细胞；或者(b)该至少一个内皮细胞结合结构域还没有结合内皮细胞谱系的细胞。对于后者，在进一步的覆膜步骤中，该医疗器材的覆膜表面与足够数量的内皮细胞谱系的细胞(在体外或体内)在适于内皮细胞谱系的细胞与该至少一个内皮细胞结合结构域结合的条件下接触，细胞与该至少一个内皮细胞结合结构域具有结合特异性。在一个实施例中，该医疗器材可以与(自体的或来自(例如，异源或异种)供体的内皮细胞谱系的细胞在体外接触，使细胞粘附到该器材的覆膜表面，随后将该器材移植。

在另一个实施例中，在本发明的用于促进血管装置内皮化的方法中，一般来说，一旦器材被移植到个体内，器件的一个或多个金属表面将要暴露在脉管系统中，这些表面就是所要求，并挑选出来用本发明的生物活性涂层组合物覆膜的器件表面。该方法包括以下步骤：(a)使本发明的生物活性涂层组合物与血管装置的想要内皮化的至少一个表面接触，使得生物活性涂层组合物结合到该至少一个金属表面，在该器材上形成覆膜表面；其中该生物活性涂层组合物包含至少一个表面结合结构域，连接有至少一个内皮细胞结合结构域；以及(b)将该器材移植到需要该器材的个体内；其中内皮细胞谱系的细胞(由个体生成，并在个体的脉管系统中循环)与该器材的覆膜表面(通过生物活性涂层组合物)接触和附着，其中这种接触和附着促进内皮细胞谱系的细胞在该器材的覆膜表面的扩展，以促进该血管装置的内皮化。促进该移植装置的内皮化可以进一步促进靠近该移植装置的组织或脉管系统愈合，促进移植装置与邻近的组织结合(整合)，以及减少与移植装置有关的血栓形成。

本领域公知的惯用方法可以用于将本发明的生物活性涂层组合物涂于要被覆膜的医疗器材的一个或多个金属表面(使生物活性涂层组合物与一个或多个表面接触)。这种工艺是公知的，包括但不限于：浸渍、刷涂、喷雾、汽相沉积，以及电镀。本发明的生物活性涂层组合物的剂型可以取决于用来包覆医疗器材的工艺。例如，包括生物活性涂层组合物的溶液或混悬液可以通过喷洒器进行喷涂，产生覆盖在要被覆膜的医疗器材的金属表面的液滴。医疗器材在使用前可以进行干燥，也可以进行进一步的处理(例如，在溶液(例如，水或等渗的缓冲液)中清洗以除去过量的生物活性涂层组合物；利用本领域公知的任何一种方法对医疗器材除菌；等等)。或者，该生物活性涂层组合物和该医疗器材可以在处理前先进行灭菌，并且工艺在无菌条件下操作。

在其它的将生物活性覆膜镀在要被覆膜的医疗器材的一个或多个金属表面的工艺中，要被覆膜的医疗器材的表面浸在含有效数量的用于覆膜该表面的生物活性涂层组合物液体(例如，溶液或混悬液，水或溶剂)中。例如，该表面浸渍或沉浸在含有该生物活性涂层组合物的浴器中。用于涂覆生物活性涂层组合物的适宜条件包括使要被覆膜的表面与含有生物活性涂层组合物的液体保持接触适当的时间(例如，从约5分钟到约12小时；优选地，从15分钟到60分钟)，在适当的温度下(例如，从10℃到约50℃；更优选地，从常温到37℃)该被包覆的医疗器材可以进一步处理，如果对于使用是必需的话(洗涤、灭菌等等)。

在别的将生物活性覆膜包覆在需要包覆的医疗器材的一个或多个金属表面的工艺中，本发明的生物活性涂层组合物制成干粉的剂型(例如，通过风干或冷冻干燥该生物活性涂层组合物)。然后将包括该生物活性涂层组合物的粉末用本领域公知的方法将粉末包覆在需要包覆的医疗器材表面。一般来说，一旦涂上，将这种粉末涂层经过加热处理(例如，利用红外线加热方式)来完成涂覆工艺。

但是，这些例举的用于将生物活性涂层组合物包覆在医疗器材表面的工艺不是排它的，因为其它的包覆和稳定方法也可以应用(本领域技术人员能够选择适于特定器材和目的需要的惯用方法)。例如，如果将要被包覆的医疗器材表面本质上是金属，可以将亲水聚合物(如本发明前面详细描述的那样)用于连接(与涂覆过程同时，或者在随后，来敷用本发明的生物活性涂层组合物)，只要医疗器材的金属表面的该生物活性涂层组合物基本上保持其结合内皮细胞来源的细胞的功能，以促进在覆膜表面粘附和内皮化的一种或多种作用。接着说这个例子，由于亲水聚合物的弹性材料的性质，在器材受到机械力或压力时，它能够增强生物活性涂层组合物结合到医疗器材表面的稳定性。因此，本发明的方法和组合物也可以用于连接用于药物洗脱的医疗器材，或其它的包膜技术，其提供一种或多种不通过本发明的生物活性涂层组合物而有利于医疗器材的功能。

另外，在一个根据本发明的方法中，包括生物活性涂层组合物的包膜可以进行稳定处理，例如，通过空气干燥或通过冷冻干燥。但是，这些处理不是排它的，其它的包膜和稳定方法也可以使用。适当的包膜和稳定方法在本领域中是公知的。例如，需要涂覆本发明的生物活性涂层组合物的血管装置的至少一个金属表面可以在包膜步骤前进行预处理，以增强表面结合结构域与包括将要被包覆的表面的材料的结合，以及包膜的坚固性和均匀性的一种或几种。例如，这种预处理可以包括浸蚀或血浆处理要被包覆的器材的表面材料使得表面更亲水，增强在氨基酸序列中包括一些疏水氨基酸的表面结合结构域的结合，疏水氨基酸对于作为结合特异性相互作用表面的亲水部分有影响。

另外，还可以在其它的步骤中，在覆膜后，移植到个体体内之前，对涂有本发明的生物活性涂层组合物的血管装置至少一个金属表面进行处理，以便增强该覆膜表面的内皮化。例如，可以将一种支持内皮化，特别是粘附到覆膜表面的内皮细胞生长(包括增殖)的生物学基质的一个基片或一层加入(例如，覆盖和/吸附)在覆膜表面(例如，在内皮细胞谱系的细胞结合和附着到覆膜表面之前或之后)。该层或基片的成分可以包括一个血管生物制剂，其包括一种或多种胶原(例如，IV型和/或V型)、vitrogen、层粘连蛋白、巢蛋白、纤连蛋白、聚糖(例如，蛋白多糖、氨基多糖)，以及支持内皮细胞生长的生长因子(例如，VEGF、EGF、FGF、肝素结合表皮生长因子样生长因子等等)。

因此，根据本发明的方法，医疗器材可以首先进行增强生物活性涂层组合物与至少一个经处理的器材表面结合的工艺处理(例如，通过增强该器材的至少一个金属表面亲水性，或分子的附着力)；在生物活性涂层组合物与该至少一个经处理的表面结合的过程中，使该生物活性覆膜与该至少一个经处理的表面接触，以形成覆膜表面。该方法可以进一步包括使有效数量的血管生物制剂与覆膜表面接触，以促进覆膜表面的内皮化。该方法可以进一步包括，在将该器材移植之前，有一个使被包覆的器材与内皮细胞谱系的细胞接触的步骤，以促进内皮细胞谱系的细胞的附着或粘附，支持内皮细胞生长，以及支持内皮细胞分化的一种或多种作用。例如，内皮细胞谱系的细胞可以用本领域公知的方法进行纯化和分离。例如，内皮祖细胞可以从人外周血液中用涂覆有CD34抗体的磁珠进行磁分离。在别的实施例中，可以通过胶原酶治疗血管壁释放内皮细胞，从脐带中分离人脐静脉内皮细胞，也可以在本领域公知的适当的支撑培养基中培养。

实施例6

对本领域技术人员显而易见的是，根据包含本发明的一个优选的内皮细胞结合结构域和/或表面结合结构域的多肽的氨基酸序列，可以合成或构建编码这种多肽(或如本发明所述的其变体)的多核苷酸(核酸分子)，并且这种多肽可以是通过DNA重组技术作为制备方法生成(例如，在培养物中)和/或通过将这种多核苷酸引入体内而在体内产生。例如，对于本领域技术人员显而易见的是，编码一个基本上由根据本发明的SEQ ID NO：3氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸序列可以超过一种，而且这种多核苷酸可以根据公知的编码基本上由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽的三联体密码子，三碱基简并性，以及宿主细胞对于三联体密码子用法偏好的选择而进行合成。宿主细胞一般是对于表达所需要的原核细胞或真核细胞(例如，细菌细胞，如大肠杆菌；酵母细胞；哺乳动物细胞；鸟类细胞；两栖动物细胞；植物细胞；鱼类细胞；以及昆虫细胞；无论在体外表达或体内表达)。产生如上所述的简并变体对于本领域技术人员是常规技术，例如，对于特定的宿主优化密码子表达(例如，将细菌mRNA中的密码子改变为哺乳动物、植物或其它细菌宿主如大肠杆菌所偏好的密码子)。

用于说明而非限制的是，本发明提供了SEQ ID NO：48作为编码SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多核苷酸，对于本领域技术人员显而易见的是，其中的密码子用法可以广泛地适用于编码一个优选的包含基本上由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列多肽的表面结合结构域。另外提供了SEQ ID NO：49，作为编码SEQ ID NO：19的氨基酸序列的多核苷酸，对于本领域技术人员显而易见的是，从其中得到的密码子用法可以广泛地地适合于编码优选的包含基本上由SEQ ID NO：19所示氨基酸序列组成的多肽的内皮细胞结合结构域的多核苷酸。因此，举例来说，利用与SEQ IDNO：3相关的SEQ ID NO：48和也SEQ ID NO：19相关的SEQ ID NO：49，本领域技术人员可以很容易地构建体编码如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：19所示氨基酸序列的变体，或者编码本发明提供的任何一个或一个以上的其它氨基酸序列(例如，SEQID NOs：1-2，和4-18，以及20-47)的多核苷酸。

在一个说明性的实施方案中，提供了一种包含编码一个用于本发明的结合结构域的多核苷酸的原核表达载体；以及它用于重组产生包含该结合结构域的多肽的用途。在一个实施例中，该多核苷酸可以位于一个原核表达载体中，使得当多肽在细菌宿主细胞中产生时，它是以与其它氨基酸序列融合的蛋白的形式产生(例如，有助于该多肽提纯的氨基酸序列；或与本发明的别的结合结构域重组连接在一起)。举例来说，存在本领域技术人员公知的序列，其作为融合蛋白的一部分，与期望的蛋白一起表达，促成用于表达的原核细胞的细胞质中包涵体的形成和/或利于提纯包含这种序列的融合蛋白。可以利用本领域公知方法将包涵体与其它的原核生物的细胞组分分离，包括变性剂处理，分级处理(例如，离心，柱色谱法，等等)。在别的实施例中，有市场上可买到的载体，可以将感兴趣的想要表达为蛋白质或多肽的核酸序列插入其中，使得在表达中，该基因产物还包含多个末端组氨酸残基(“组氨酸标记”)，它有利于利用本领域的标准方法提纯该基因产物。

对于本领域技术人员显而易见的是，编码一个包含用于本发明的多肽的结合结构域(内皮细胞结合结构域、或表面结合结构域、或其组合)的核酸序列可以被插入一个核酸分子，并成为其一部分，这样的核酸分子包括质粒，或除了质粒之外的载体；以及其它可以利用的表达系统，包括但不限于：用噬菌体载体，或粘粒DNA转化的细菌；包含酵母载体的酵母；包含真菌载体的真菌；感染病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系；以及(例如，通过转染或电穿孔)引入质粒或病毒表达载体，或以重组体病毒(例如牛痘病毒，腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒等等)感染的哺乳动物细胞系。多肽的成功表达要求包含多肽的编码序列的重组体核酸分子，或者载体本身包含必要的转录和翻译控制元件，该元件要适合于特定的用于表达的宿主系统，并被宿主系统所识别。

利用本领域公知的分子生物学方法，包括如上所述的方法，各种启动子和增强子可以并入包含编码序列的载体或重组核酸分子，以增强多肽的表达，只要多肽的增强表达适于特定的所使用的宿主细胞系统(举例来说，对其无毒)。对于本领域技术人员显而易见的是，启动子的选择取决于所使用的表达系统。启动子的强度，即促进转录的能力是不同的。一般来说，为了表达一个克隆基因，期望使用一个比较强的启动子，以获得该基因的高水平转录和基因产物表达。举例来说，已经发现本领域公知的细菌，噬菌体，或质粒启动子在包括E.coli的宿主细胞系统中产生高水平的转录，这些启动子包括：乳糖启动子、色氨酸启动子、T7启动子、recA启动子、核蛋白体RNA启动子、P.sub.R和P.sub.L启动子、lacUV5、ompF、bla、Ipp等等，都可以用于编码合成多肽的核苷酸序列的插入片段的转录。通常使用的用于哺乳动物表达系统的表达载体中的哺乳动物启动子来自哺乳动物病毒基因。这样的启动子的例子包括SV40早期启动子，鼠乳腺瘤病毒晚期启动子，腺病毒主要晚期启动子，单纯疱疹病毒启动子，以及CMV启动子。

如果多肽的表达对于宿主细胞是致死的或者有害的，可以对宿主细胞株/系以及表达载体进行选择，使得启动子的作用在进行诱导前受到抑制。举例来说，在特定的操纵子中添加对于插入DNA片段的有效转录所必需的特异诱导物(例如，乳糖操纵子是通过添加乳糖或异丙基-β-D-半乳糖苷(“IPTG”)诱导的；色氨酸操纵子是由生长培养基缺乏色氨酸诱导的；四环素可以用于含有tet敏感启动子的哺乳动物表达载体中)。因此，多肽的表达可以通过培养转化的或转染的细胞在一定条件下进行控制，该条件使得启动子控制的编码序列的表达不被诱导，当细胞在生长培养基中达到适当的密度时，可以对启动子诱导，使得编码序列进行表达。其它的对于有效率基因转录或信息翻译的控制元件对于本领域是公知的，包括增强子，转录或翻译起始信号，转录终止序列以及多聚腺苷酸序列，等等。

本发明前面所详细描述的特定实施方案的目的在于说明。根据说明书和插图，本领域的其它技术人员可以通过应用现有知识，容易地对本发明的各种应用在不脱离本发明基本概念的前提下进行改动和/或改编；因此，这种改动和/或改编规定为在附加的权利要求的含义和范围之内。

序列表

Claims (43)

1.一种生物活性涂层组合物，包含至少一个特异地结合一种医疗器材的金属表面材料的结合结构域(“表面结合结构域”)，和至少一个特异地结合内皮细胞谱系细胞的结合结构域(“内皮细胞结合结构域”)；其中该至少一个表面结合结构域包含一种多肽，该多肽的氨基酸序列组成基本选自由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO；7，SEQ IDNO：8，及其组合所构成的组；其中该至少一个内皮细胞结合结构域包含一种多肽，该多肽的氨基酸序列组成基本选自由SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ IDNO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，及其组合所构成的组；并且该至少一个表面结合结构域与该至少一个内皮细胞结合结构域相连。

2.根据权利要求1所述的生物活性涂层组合物，其中该至少一个内皮细胞结合结构域与内皮细胞谱系的细胞结合。

3.根据权利要求1所述的生物活性涂层组合物，其中该生物活性涂层组合物包含超过一种类型的内皮细胞结合结构域，并且其中每种内皮细胞结合结构域对于内皮细胞谱系的细胞具有一种结合特异性，其不同于存在于该生物活性涂层组合物中的别的类型的内皮细胞结合结构域。

4.根据权利要求1所述的生物活性涂层组合物，其中对于该至少一个内皮细胞结合结构域具有结合特异性的内皮细胞谱系的细胞选自由内皮细胞，内皮细胞祖细胞，及其组合所构成的组。

5.根据权利要求1所述的生物活性涂层组合物，其中该生物活性涂层组合物包含超过一种类型的表面结合结构域，其中每种表面结合结构域能够结合该医疗器材的不同表面材料。

6.根据权利要求1所述的生物活性涂层组合物，其中对于至少一个表面结合结构域具有结合特异性的金属表面材料，包括一种材料，该材料选自由金属，金属氧化物，金属合金，及其组合所组成的组。

7.根据权利要求1所述的生物活性涂层组合物，其中对于至少一个表面结合结构域具有结合特异性的金属表面材料包括不锈钢。

8.根据权利要求1所述的生物活性涂层组合物，其中至少一个表面结合结构域包括一个多肽的多聚体。

9.根据权利要求1所述的生物活性涂层组合物，其中该至少一个表面结合结构域和该至少一个内皮细胞结合结构域通过接头连接。

10.一种内皮细胞结合结构域，包括一个多肽，其氨基酸序列基本选自由：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ IDNO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ IDNO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，及其组合所组成的组。

11.一种表面结合结构域，包括一个多肽，该多肽的氨基酸序列基本上选自由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，以及它们的组合所组成的组。

12.根据权利要求11所述的表面结合结构域，其中该表面结合结构域包括该多肽的一个多聚体。

13.一种在医疗器材的至少一个金属表面覆膜的方法，该方法包括使医疗器材的至少一个金属表面与一种生物活性涂层组合物接触，使得在该至少一个表面上形成覆膜；其中该生物活性涂层组合物包括至少一个表面结合结构域和至少一个内皮细胞结合结构域；其中至少一个表面结合结构域包括一个多肽，其氨基酸序列基本上选自由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，及其组合所组成的组；其中的至少一个内皮细胞结合结构域包括一个多肽，其氨基酸序列基本选自由：SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ IDNO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ IDNO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ IDNO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ IDNO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46及其组合所组成的组；其中该至少一个表面结合结构域与该至少一个内皮细胞结合结构域连接；其中覆膜中的至少一个内皮细胞结合结构域对于内皮细胞谱系的细胞附着在该至少一个金属表面在数量上有效。

14.根据权利要求13所述的方法，其中的医疗器材包括一个血管装置。

15.根据权利要求14所述的方法，其中该血管装置包括一个斯坦特固定模。

16.根据权利要求13所述的方法，其中该至少一个表面结合结构域和该至少一个内皮细胞结合结构域通过一个接头连接。

17.根据权利要求13所述的方法，其中该表面结合结构域包括该多肽的一个多聚体。

18.一种促进医疗器材的至少一个金属表面内皮化的方法，该方法包括使医疗器材的至少一个金属表面与一种生物活性涂层组合物接触，使得在该至少一个金属表面上形成覆膜；其中该生物活性涂层组合物包括至少一个表面结合结构域，它与至少一个内皮细胞结合结构域连接；其中该至少一个表面结合结构域包括一个多肽，其氨基酸序列基本上选自由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，及其组合所组成的组；其中的至少一个内皮细胞结合结构域包括一个多肽，其氨基酸序列基本选自由：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ IDNO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ IDNO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46及其组合所组成的组；其中覆膜中的该至少一个内皮细胞结合结构域在数量上对于内皮细胞谱系的细胞在该至少一个表面上是有效的；其中该至少一个表面与内皮细胞谱系的细胞接触，使得内皮细胞谱系的细胞附着在覆膜上，促进该至少一个表面的内皮化。

19.根据权利要求18所述的方法，其中该医疗器材包括一个血管装置。

20.根据权利要求19所述的方法，其中该血管装置包括一个斯坦特固定模。

21.根据权利要求18所述的方法，其中该至少一个表面结合结构域和该至少一个内皮细胞结合结构域通过一个接头连接。

22.根据权利要求18所述的方法，其中该表面结合结构域包括该多肽的一个多聚体。

23.根据权利要求18所述的方法，其中该至少一个表面与内皮细胞谱系的细胞接触的步骤发生在体内，并且在将医疗器材移植到需要该医疗器材的个体体内之后。

24.一种制造医疗器材的方法，该方法包括使医疗器材的至少一个金属表面与一种生物活性涂层组合物接触，形成至少一个被覆膜的表面；以及使该至少一个被覆膜的表面与内皮细胞谱系的细胞接触；其中该生物活性涂层组合物包括至少一个表面结合结构域和至少一个内皮细胞细胞结合结构域；其中该至少一个表面结合结构域包括一个多肽，其氨基酸序列基本上选自由SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，及其组合所组成的组；其中的至少一个内皮细胞结合结构域包括一个多肽，其氨基酸序列基本选自由SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ IDNO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，及其组合所组成的组；并且其中至少一个表面结合结构域和至少一个内皮细胞结合结构域是连接在一起的。

25.根据权利要求24所述的方法，其中该医疗器材包括一个血管装置。

26.根据权利要求25所述的方法，其中该血管装置包括一个斯坦特固定模。

27.根据权利要求24所述的方法，其中该至少一个表面结合结构域和该至少一个内皮细胞结合结构域通过一个接头连接。

28.根据权利要求24所述的方法，其中该表面结合结构域包括该多肽的一个多聚体。

29.根据权利要求24所述的方法，其中该生物活性涂层组合物包含超过一种类型的表面结合结构域，其中每种表面结合结构域能够结合该医疗器材的不同表面材料。

30.根据权利要求24所述的方法，其中该生物活性涂层组合物包含超过一种类型的内皮细胞结合结构域，并且其中每种内皮细胞结合结构域对于内皮细胞谱系的细胞具有一种结合特异性，其不同于存在于该生物活性涂层组合物中的别的类型的内皮细胞结合结构域。

31.根据权利要求24所述的方法，进一步包括使该至少一个被覆膜的表面与一种血管生物制剂接触的步骤。

32.一种医疗器材，包括在该医疗器材的至少一个金属表面，在该金属表面涂有一种生物活性涂层组合物，其中该生物活性涂层组合物包括至少一个表面结合结构域和至少一个内皮细胞细胞结合结构域；其中该至少一个表面结合结构域包括一个多肽，其氨基酸序列基本选自由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，及其组合所组成的组；其中的至少一个内皮细胞结合结构域包括一个多肽，其氨基酸序列基本选自由：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ IDNO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ IDNO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ IDNO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ IDNO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，及其组合所组成的组；并且其中至少一个表面结合结构域和至少一个内皮细胞结合结构域是连接在一起的。

33.根据权利要求32所述的医疗器材，其中该医疗器材包括一个血管装置。

34.根据权利要求33所述的医疗器材，其中该血管装置包括一个斯坦特固定模。

35.根据权利要求32所述的医疗器材，其中该至少一个表面结合结构域和该至少一个内皮细胞结合结构域通过一个接头连接。

36.根据权利要求32所述的医疗器材，其中该表面结合结构域包括该多肽的一个多聚体。

37.根据权利要求32所述的医疗器材，其中该生物活性涂层组合物包含超过一种类型的表面结合结构域，其中每种表面结合结构域能够结合该医疗器材的不同表面材料。

38.根据权利要求32所述的医疗器材，其中该生物活性涂层组合物包含超过一种类型的内皮细胞结合结构域，并且其中每种内皮细胞结合结构域对于内皮细胞谱系的细胞具有一种结合特异性，其不同于存在于该生物活性涂层组合物中的别的类型的内皮细胞结合结构域。

39.根据权利要求32所述的医疗器材，进一步包括使该至少一个被覆膜的表面与一个血管生物制剂接触的步骤。

40.一种多核苷酸，包括编码一种表面结合结构域的核酸分子，该表面结合结构域包括一个多肽，该多肽的氨基酸序列基本上选自由SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，及其组合所组成的组。

41.一种重组载体，包括编码一种表面结合结构域的核酸分子，该表面结合结构域包括一个多肽，该多肽的氨基酸序列基本上选自由SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，及其组合所组成的组。

42.一种多核苷酸，包括一种编码内皮细胞结合结构域的核酸分子，所述的内皮细胞结合结构域包括一个多肽，其氨基酸序列基本选自由：SEQ ID NO：9，SEQID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ IDNO：45，SEQ ID NO：46及其组合所组成的组。

43.一种重组体载体，包括一种编码内皮细胞结合结构域的核酸分子，所述的内皮细胞结合结构域包括一个多肽，其氨基酸序列基本选自由：SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ IDNO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ IDNO：45，SEQ ID NO：46，及其组合所组成的组。