KR20130110606A

KR20130110606A - 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드

Info

Publication number: KR20130110606A
Application number: KR1020120032697A
Authority: KR
Inventors: 정영미; 김수현; 김상헌; 김지은
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2012-03-29
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2013-10-10
Also published as: KR101348096B1

Abstract

본 발명은 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 순차적으로 결합된 자가조립 펩타이드와 콜라겐 모사 펩타이드가 결합된 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 소재 자체에 면역반응이 없고, 생체 복원 후 무해하게 분해되는 소재로서 콜라겐 모사 펩타이드로 인하여 줄기세포가 연골 분화하는데 적합한 환경을 조성함으로써, 연골 분화 활성을 증진시키고, 이로 인하여 연골 조직의 재생을 달성할 수 있도록 한다.

Description

줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드{Polypeptide with chondrogenic activity of stem cell}

본 발명은 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 생체 적합성 펩타이드 소재에 관한 것이다.

관절 연골은 인체 조직 중 체중의 부하가 가장 큰 조직으로 마모로 인한 손상에 쉽게 노출된다. 관절 연골은 유리 연골(hyaline cartilage)로서 연골세포와 풍부한 세포외기질로 이루어져 있다. 연골세포는 연골 총부피의 10% 미만을 차지하고 있으며, 세포외기질을 합성, 분비하므로 관절 연골의 유지에 중요한 역할을 한다. 노화에 따른 연골세포 수 및 연골세포 대사작용의 감소는 유병률이 높은 노인성 질환인 골관절염의 병인 중의 하나로 생각되고 있다( Bobacz K et al, Ann Rheum Dis, Dec, 63(12), pp.1618-1622, 2004). 또한, 특이하게 관절 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직이다. 현재의 의학적 방법으로는 관절 연골을 정상적으로 재생할 수 있는 방법이 매우 제한적이다.

자가 연골세포 이식법에 의한 연골조직의 재생이 최근 시도되어 임상적으로 매우 효과적인 수술법으로 알려지고 있으나 연골의 광범위한 손상 부위에는 사용할 수 없다는 것, 관절 연골의 손상 위치, 환자의 나이 등에 따라 제한점을 가지고 있다. 이와 같은 문제점을 해결하고 보다 예측 가능하고, 보다 안전한 수술 방법을 개발하고자하는 노력이 바로 연골의 조직공학적 재생이다(kang et al. Tissue Engineering, 11(3-4), pp.438-447, 2005).

조직공학에서 줄기세포를 이용하여 연골을 제작하기 위해서는 지지체, 세포 및 성장인자를 적절하게 응용하여 그 조건을 설정해야 한다.

중간엽 줄기세포를 연골 세포로 분화시키는 것과 관련된 선행기술로는 한국특허 제1012869호에 중간엽 줄기세포를 뼈형성단백질-2(BMP-2) 또는 뼈형성단백질-7(BMP-7)이 80 ~ 500 ng/㎖ 첨가된 연골 형성 배지에서 배양하는 방법, 한국특허 제990436호에 중간엽 줄기세포를 wnt 신호전달 억제제인 DKK-1 또는 sFRP-1존재 하에서 배양하는 연골 세포 분화 방법, 한국공개특허 제2009-69013호에 중간엽 줄기세포를 부갑상선 호르몬-관련 단백질(PTHrP) 또는 PD 98059의 존재 하에서 배양하는 방법 등, 줄기세포의 분화에 영향을 주는 화합물을 중심으로 개시되고 있고, 중간엽 줄기세포를 연골 세포로 분화시키기 위한 3차원 배양에 사용되는 지지체에 관한 선행기술은 거의 드물다. 이러한 연골 세포의 분화에 이용되는 지지체에 관한 것으로는 한국특허 제684940호에 피브리과 히알루론산의 혼합 지지체가 개시된 바 있다.

본 발명은 소재 자체에 면역반응이 없고, 생체 복원 후 무해하게 분해되면서, 줄기세포가 연골 분화하는데 적합한 환경을 조성함으로써, 연골 분화 활성을 증진시키고, 이로 인하여 연골 조직의 재생을 달성할 수 있도록 하는 폴리펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 다음 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드 및 콜라겐 모사 펩타이드(collagen mimetic peptide)가 결합된 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드를 제공한다:

[일반식 1]

(αβ)_n

상기 α는 알라닌(A), 로이신(L) 및 페닐알라닌(F) 중에서 선택되는 어느 하나의 소수성 아미노산이고, 상기 β는 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 라이신(K), 글루타민산(E) 및 히스티딘(H) 중에서 선택되는 어느 하나의 친수성 아미노산이며, 상기 n은 4 내지 16 중의 어느 하나의 정수이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 일반식 1의 자가조립 펩타이드는 RADARADARADARADA, RARADADARARADADA, RARARARADADADADA, DADADADARARARARA, RADARADA, RARADADA, KLDLKLDLKLDL, AEAKAEAKAEAKAEAK, AEAKAEAK, RAEARAEARAEARAEA, RAEARAEA, KADAKADAKADAKADA, KADAKADA, EAEAHAHAEAEAHAHA, EAEAHAHA, EFEFKFKFEFEFKFKF, EFEFKFKF, EAEAEAEAKAKA, EAEAKAKA, KAKAKAKAEAEAEAEA 및 EAEAEAEAKAKAKAKA 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

또한 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 콜라겐 모사 펩타이드는 다음 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드일 수 있다:

[일반식 2]

(-글리신-프롤린-하이드록시프롤린-)_m

상기 m은 1 내지 10 중의 어느 하나의 정수이다.

또한 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 일반식 2의 콜라겐 모사 펩타이드는 (-글리신-프롤린-하이드록시프롤린-)₇일 수 있다.

또한 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 연골 분화 유도 폴리펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 생분해성 지지체를 제공한다.

본 발명은 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 순차적으로 결합된 자가조립 펩타이드가 생체 적합성이 뛰어난 지지체 형성을 위한 생체 재료이지만, 줄기세포의 연골 분화 활성이 극히 미미하다는 한계를 극복하기 위하여, 상기 자가조립 펩타이드에 콜라겐 모사 펩타이드가 결합된 폴리펩타이드를 제공하는 것으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 소재 자체에 면역반응이 없고, 생체 복원 후 무해하게 분해되는 소재로서 콜라겐 모사 펩타이드로 인하여 줄기세포가 연골 분화하는데 적합한 환경을 조성함으로써, 연골 분화 활성을 증진시키고, 이로 인하여 연골 조직의 재생을 달성할 수 있도록 한다.

도 1의 A는 KDL12 펩타이드 용액으로 제조한 펩타이드젤에서의 줄기세포의 연골 유전자 발현을 확인한 것이고, 도 1의 B는 KLD12 및 KLD12-CMP7의 50:50 중량비 혼합 펩타이드 용액으로 제조한 펩타이드 젤에서의 줄기세포의 연골 유전자 발현을 확인한 전기영동 사진이다.
도 2는 KDL12와 KDL12-CMP7의 혼합 비율에 따른 연골 분화 활성을 확인한 것으로, KLD12-CMP7의 혼합 농도와 배양 기간에 따른 Collagen type II의 상대 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체 지지체에서의 KLD12-CMP7의 연골 분화 활성을 확인한 것으로, KLD12-CMP7의 혼합 여부에 따른 Collagen type II 및 Aggrecan의 상대 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 4의 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체 지지체에서의 KLD12-CMP7의 연골 분화시킨 후 마우스 피하에 이식하여 연골 조직의 생성여부를 확인한 면역화학 염색사진이다.
도 5의 락타이드/e-카프로락톤 공중합체 지지체에서의 KLD12 또는 KLD12-CMP7의 연골 분화시킨 후 마우스 피하에 이식하여 연골 특이 세포외 기질 글라이코스아미노글라이칸 (GAG)의 양을 정량 분석한 그래프이다.

[일반식 1]

(αβ)_n

상기 n이 상한치를 초과하는 경우, 펩타이드 합성 및 정제면에서 바람직하지 않고, 하한치 미만인 경우 고차구조의 자기조립체 생성 면에서 바람직하지 않다.

참고로, 대표적인 아미노산과 각각의 약어는, 알라닌(Ala, A), 이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 발린(Val, V), 아스파라긴(Asn, N), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 티로신(Try, Y), 아스파르트산 (Asp, D), 글루탐산(Glu, E), 아르기닌(Arg, R), 히스티딘(His, H), 라이신(Lys, K)과 같다. 또한 하이드록시프롤린의 경우 Hyp 또는 P*를 약어로 한다.

본 발명에서, 펩타이드란 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis technique)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 발명의 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드는 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 순차적 결합으로 8개 내지 32개까지 반복되는 것으로, RADA16-I은 RADARADARADARADA의 아미노산 서열을 가지고 있으며, RADA16-II는 RARADADARARADADA, RAD16은 RARARARADADADADA, DAR16은 DADADADARARARARA, RADA8-I은 RADARADA, RADA8-II는 RARADADA, KLD12는 KLDLKLDLKLDL, EAKA16-1은 AEAKAEAKAEAKAEAK, EAKA8-1은 AEAKAEAK, RAEA16-I는 RAEARAEARAEARAEA, RAEA8-I은 RAEARAEA, KADA16-I은 KADAKADAKADAKADA, KADA8-I은 KADAKADA, EAH16-II는 EAEAHAHAEAEAHAHA, EAH8-II는 EAEAHAHA, EFK16-II는 EFEFKFKFEFEFKFKF, EFK8-II는 EFEFKFKF, EAK12는 EAEAEAEAKAKA, EAK8-II는 EAEAKAKA, KAEA는 KAKAKAKAEAEAEAEA, EAK16는 EAEAEAEAKAKAKAKA의 아미노산 서열이다.

본 발명의 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드는 양친매성 펩타이드로서, 베타쉬트 구조를 형성하며, 생체이온의 존재 하에서 겔화될 수 있다.

본 발명의 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드는 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드에 콜라겐 모사 펩타이드(collagen mimetic peptide)가 펩타이드 결합된다.

콜라겐은 트리플 헬릭스(triple helix)로 꼬여 있는 세 개의 가닥(strand)을 포함하는 독특한 구조로서, 각각의 가닥은 -글리신-프롤린-하이드록시프롤린- 을 반복 단위로 포함하고 있다. 여기서 하이드록시프롤린은 (2S,4R)-4-하이드록시프롤린이다.

본 발명의 콜라겐 모사 펩타이드는 다음 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함함으로써, 본 발명의 폴리펩타이드가 줄기세포에 실제 콜라겐이 존재하는 것과 같은 유사 환경을 만들어 주기 때문에, 줄기세포가 연골로 분화되는 활성을 증가시키고, 이로 인해 연골 조직의 재생을 촉진할 수 있다:

[일반식 2]

(-글리신-프롤린-하이드록시프롤린-)_m

상기 m은 1 내지 10 중의 어느 하나의 정수, 바람직하게는 4 내지 8 중의 어느 하나의 정수이다. 상기 m이 상한치를 초과하는 경우, 펩타이드 합성 및 정제면에서 바람직하지 않다. 예를 들어, 상기 일반식 2의 콜라겐 모사 펩타이드는 (-글리신-프롤린-하이드록시프롤린-)₇일 수 있다.

본 발명은 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드 및 콜라겐 모사 펩타이드(collagen mimetic peptide)가 결합된 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드를 포함하는 생분해성 지지체일 수 있다.

조직공학에 쓰이는 생체 이식용 지지체는 크게 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)와 같은 합성재료를 사용하여 만든 지지체와 아가로오스, 셀룰로오스, 키토산, 히알우론산, 피브린 등의 천연재료를 사용하는 지지체 및 자가조립 펩타이드 지지체로 분류할 수 있다. 본 발명은 합성생체재료로서 초자연골과 유사한 기계적 활성을 지니는 고탄성 다공성 지지체 PLCL과 상기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드 및 콜라겐 모사 펩타이드(collagen mimetic peptide)가 결합된 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드를 포함하는 생분해성 지지체일 수 있다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

제조예 : 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드(KDL12-CMP7)의 제조

본 발명의 일반식 1의 자가조립 펩타이드의 한 예인, KDL12 즉, KLDLKLDLKLDL(서열번호 1)과 KDL12에 콜라겐 모사 펩타이드 (GPP*)₇, 즉 GPP*GPP*GPP*GPP*GPP*GPP*GPP*(서열번호 2)가 결합된 줄기세포 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드 KDL12-CMP7(서열번호 3)을 고체상(Solid-phase) 방법으로 아래와 같이 합성하였다.

구체적으로, 0.06 mmol의 글루탐산-Wang 레진을 표준 반응용기 (Standard reaction vessel)에 넣고, 레진의 Fmoc을 염기(20% 피페리딘)로 제거하고, 합성하려는 펩타이드의 카르복시 말단의 Fmoc-아미노산을 넣고 1-히드록시-벤조트리아졸(HOBT), 디아이소프로필 카보다이이미드(DIC)을 혼합하여 활성시킨후 합성을 시작하였다. 이후 같은 방법으로 아미노산 배열 순서대로 합성을 하고, 커플링이 끝난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄으로 여러 번 세척한 다음 건조시켰다. 여기에 트리플루오로아세트산 : 페놀 : 티오아니솔 : 물 : 에탄디티올(Trifluoroacetic acid : Phenol :Thioanisole : H2O : Ethandithiol)의 82.5 : 5: 5 : 5: 2.5 (v/v)용액으로 2 내지 3시간 반응시켜 펩타이드의 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드를 분리한 후 용액에 차가운 에틸에테르를 첨가하여 흰색 침전된 펩타이드를 얻었다. 이렇게 하여 얻어진 펩타이드를 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 정제하였고, 이때 칼럼은 C4 semi-prep column(Phenomenex)을 사용하였으며, 완충용액 A는 물 및 0.1 % TFA를 사용하여 평형화시키고, 완충용액 B는 아세토나이트릴 및 0.1 % TFA를 사용하여 펩타이드를 용출시켜, 각각 KDL12와 KDL12-CMP7을 제조하였다.

실험예 1: KLD12 - CMP7 의 연골 분화 활성

상기 제조예에서 제조한 KLD12 와 KLD12-CMP7을 각각 수크로오스 용액에 녹여 1%의 펩타이드 용액을 만들고, KLD12 펩타이드 용액, 그리고 KLD12 및 KLD12-CMP7의 50:50 중량비 혼합 펩타이드 용액이 줄기세포의 연골 분화 활성에 미치는 영향을 확인하였다.

배양된 인간지방조직유래 줄기세포를 PBS에 1x10⁷cells/mL 농도의 부유액 상태로 만들고, 상기 제조된 펩타이드 용액과 함께 혼합하여 펩타이드의 최종농도는 0.5% 로 맞추어 실온에서 젤을 형성시켰다. 제조된 젤의 두께는 1 mm로 고정시키고, 21일 동안 DMEM-HG, Sodium Pyruvate, 100nM Dexamethasone, 20 ㎍/mL Proline, 37.5 ㎍/mL ascorbic 2-phosphate, 1% P-S, 10ng/mL TGF-β1, 1%FBS, 1X insulin-transferrin-selenium (ITS+) 가 포함된 연골분화배지에서 배양시킨 후 연골 분화능을 평가하였다.

상기 각각의 펩타이드젤 복합체를 TRIzol reagent를 사용하여 파쇄하고, 총 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 cDNA로 역 전사시키고, 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭시켰다. 연골분화를 확인하기 위한 유전자로 Collagen type Ⅱ를 사용하였다. Collagen type Ⅱ, Collagen type Ⅰ, Collagen type Ⅹ, hActin 유전자 각각의 PCR 생성물은 1% agarose gel 농도에서 TBE buffer 를 사용하여 전기영동을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 1의 A는 KDL12 펩타이드 용액으로 제조한 펩타이드 젤에서의 줄기세포의 연골 유전자 발현을 확인한 것이고, B는 KLD12 및 KLD12-CMP7의 50:50 중량비 혼합 펩타이드 용액으로 제조한 펩타이드 젤에서의 줄기세포의 연골 유전자 발현을 확인한 것이다.

Actin 은 공통적으로 발현하였고, Collagen type I, X는 시간이 흐름에 따라 KLD12 펩타이드젤에서 상대적으로 강하게 발현하였으나, 연골 특이적 유전자인 collagen type Ⅱ는 KLD12 펩타이드젤보다 KLD12 및 KLD12-CMP7 혼합 펩타이드젤에서 강하게 발현함을 확인하였다.

KLD12 펩타이드 젤과 KLD12 및 KLD12-CMP7 혼합 펩타이드 젤을 비교하였을 때 KLD12-CMP7 혼합 펩타이드 젤에서, 연골 특이적 유전자인 Collagen type Ⅱ가 현저히 더 많은 양이 발현되었다.

실험예 2: KLD12 - CMP7 의 혼합 비율에 따른 연골 분화 활성

KDL12와 KDL12-CMP7의 혼합 비율에 따른 연골 분화 활성을 확인하기 위하여, 실험예 1의 KLD12 및 KLD12-CMP7의 펩타이드 용액을 각각 95:5, 90:10, 및 70:30 중량비로 혼합하여, 각각의 혼합 펩타이드 용액으로 제조한 펩타이드 젤의 연골 분화 활성을 확인하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

KDL12-CMP7의 혼합 비율이 증가할수록 Collagen type Ⅱ의 발현량이 증가하였고, 14일째까지는 KDL12-CMP7가 30 중량% 혼합된 경우에서만 Collagen type Ⅱ의 발현량이 KDL12 펩타이드 젤보다 높았으나, 21일째에는 KDL12-CMP7가 10 중량% 혼합된 경우에도 KDL12 펩타이드 젤보다 발현량이 현저히 증진됨을 확인할 수 있었다.

따라서 일반식 1의 자가조립 펩타이드를 이용한 펩타이드 젤 제조시, 연골 분화 활성을 증진시키기 위해서는 KDL12-CMP7와 같은 콜라겐 모사 펩타이드가 결합된 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드가 적어도 10 중량%, 바람직하게는 30 중량% 이상 혼합된 폴리펩타이드를 이용하여 펩타이드 젤을 제조해야함을 알 수 있었다.

실험예 3: 락타이드 /ε- 카프로락톤 공중합체 지지체에서의 KLD12 - CMP7 의 연골 분화 활성

먼저 초자연골과 유사한 기계적 활성을 지니는 고탄성 다공성 지지체를 합성 / 생분해성 PLCL을 lactide와 caprolactone, 촉매제인 stannous octate를 이용하여 합성하였다. PLCL 고분자를 클로로포름 용매에 녹이고 300-500 ㎛크기의 염을 혼합한 후 몰드에 압축하여 시트 형태의 지지체를 제조하였다. 증류수로 염을 용출시킨 후, 지름 9mm 두께 3mm의 디스크 형태 연골 재생용 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체 지지체를 제조하였다.

실험예 1의 KLD12 및 KLD12-CMP7 펩타이드 용액으로부터, KLD12 및 KLD12-CMP7를 70:30 중량비로 혼합 펩타이드 용액을 제조한 후, 배양된 인간지방조직유래 줄기세포를 PBS에 1x10⁷cells/mL 농도의 부유액과 혼합하여 최종 농도를 상태로 만들고, 상기 제조된 펩타이드 용액과 함께 혼합하여 최종농도는 0.5% 로 맞추었다.

이를 상기 연골 재생용 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체 지지체에 150 ㎕/ scaffold 농도로 접종한 후, 생체 밖에서 3주 동안 연골분화 배지(DMEM-HG, Sodium Pyruvate, 100nM Dexamethasone, 20 ㎍/mL Proline, 37.5 ㎍/mL ascorbic 2-phosphate, 1% P-S, 10ng/mL TGF-β1, 1%FBS, 1X insulin-transferrin-selenium (ITS+) 가 포함된 연골분화배지)에서 배양시켜, 연골 분화능을 평가하였다.

연골분화를 확인하기 위한 유전자로 Collagen type Ⅱ 및 Aggrecan의 발현량을 Real-time PCR을 통하여 확인하여, 각각 발현율이 2 배 및 7 배 현저히 증가하였음을 확인하였다.

실험예 4: 동물시험에서의 생체 내 연골 분화 활성

실험예 3과 동일하게 KLD12 및 KLD12-CMP7를 70:30 중량비로 혼합 펩타이드 용액을 제조하고, 줄기세포를 혼합하여 연골 재생용 락타이드/ε-카프로락톤 공중합체 지지체에 접종한 후 이를 2주 동안 연골분화 배지에 배양시킨 뒤 7주령 Balb/C nude mouse의 피하에 이식하였다.

이식한 구조물은 5주 후에 적출하여 연골 분화능을 평가하였다. 조직학적 분석을 위해 포르말린 용액에 고정시키고, 에탄올 농도변화에 의한 탈수화 과정을 거쳐 수분을 모두 제거한 후, 파라핀으로 포매하고 박절기를 이용하여 조직을 6μm로 자른 후 세포의 형태학적인 분석을 위한 Hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 실시하였고, 성숙한 연골 조직 형성을 평가하기 위해 Masson Trichrome (MT)염색과 alcian blue염색을 진행하였다. 또한 주입된 세포의 연골분화능 평가를 위해 Collagen type Ⅱ antibody를 사용하여 면역화학염색 (Collagen typeⅡ; 녹색, DAPI; 파란색) 을 진행하였고, 면역화학 염색사진을 도 4에 나타내었다.

도 4의 면역화학 염색사진을 통한 조직학적 분석을 통하여 연골단백기질인 GAG와 연골세포에서 나타나는 라쿠나 구조를 확인할 수 있었다.

한편 실시예 3과 동일하게 Real- time PCR을 통하여 Collagen type Ⅱ, Aggrecan 유전자의 발현을 확인한 결과, KLD12만 접종한 군에 비하여 KDL12 및 KLD12-CMP7를 접종한 군에서 연골 분화 기질분비가 증가하였음을 확인하였다.

또한 1,9-dimethylmethylene blue(DMB) 방법을 이용하여 펩타이드 복합체의 총 GAG함량을 측정하기 위하여, DMB dye를 이용하여 발색반응 시킨 후 530nm 파장에서 측정한 결과, KDL12 및 KLD12-CMP7를 접종한 군에서 연골기질 단백인 GAG 분비가 증가함을 알 수 있었다(도 5).

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Polypeptide with chondrogenic activity of stem cell <130> HPC-3074 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Self Assembling Peptide KDL12 <400> 1 Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen Mimetic Peptide CMP7, Xaa is a Hydroxyproline <400> 2 Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa 20 <210> 3 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KDL12-CMP7, Xaa is a Hydroxyproline <400> 3 Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu Lys Leu Asp Leu Gly Pro Xaa Gly 1 5 10 15 Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro Xaa Gly Pro 20 25 30 Xaa Gly Pro Xaa 35

Claims

다음 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 자가조립 펩타이드 및 콜라겐 모사 펩타이드(collagen mimetic peptide)가 결합된 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드:
[일반식 1]
(αβ)_n
상기 α는 알라닌(A), 로이신(L) 및 페닐알라닌(F) 중에서 선택되는 어느 하나의 소수성 아미노산이고, 상기 β는 아르기닌(R), 아스파르트산(D), 라이신(K), 글루타민산(E) 및 히스티딘(H) 중에서 선택되는 어느 하나의 친수성 아미노산이며, 상기 n은 4 내지 16 중의 어느 하나의 정수이다.
제 1 항에 있어서, 상기 일반식 1의 자가조립 펩타이드는 RADARADARADARADA, RARADADARARADADA, RARARARADADADADA, DADADADARARARARA, RADARADA, RARADADA, KLDLKLDLKLDL, AEAKAEAKAEAKAEAK, AEAKAEAK, RAEARAEARAEARAEA, RAEARAEA, KADAKADAKADAKADA, KADAKADA, EAEAHAHAEAEAHAHA, EAEAHAHA, EFEFKFKFEFEFKFKF, EFEFKFKF, EAEAEAEAKAKA, EAEAKAKA, KAKAKAKAEAEAEAEA 및 EAEAEAEAKAKAKAKA 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 콜라겐 모사 펩타이드는 다음 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드:
[일반식 2]
(-글리신-프롤린-하이드록시프롤린-)_m
상기 m은 1 내지 10 중의 어느 하나의 정수이다.
제 3 항에 있어서, 상기 일반식 2의 콜라겐 모사 펩타이드는 (-글리신-프롤린-하이드록시프롤린-)₇인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드.
제 4 항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 연골 분화 유도 활성을 가지는 폴리펩타이드.
청구항 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 생분해성 지지체.