CN104603148B

CN104603148B - 包含来自胎盘生长因子的序列的偶联物及其作为生物材料组成成分和在医药中的应用

Info

Publication number: CN104603148B
Application number: CN201380045763.1A
Authority: CN
Inventors: J.A.哈贝尔; M.马蒂诺; P.S.M.布里奎兹
Original assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Current assignee: Ecole Polytechnique Federale de Lausanne EPFL
Priority date: 2012-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2018-12-11
Anticipated expiration: 2033-07-03
Also published as: EP2870175A1; AU2013285470A1; IL236488B; CN104603148A; ES2663230T3; US20140010832A1; IL236488A0; CA2878100C; CA2878100A1; EP2870175B1; US9879062B2; AU2013285470B2; WO2014006082A1; JP2015527307A

Abstract

本发明描述的具体实施方案包括用于制备具有PlGF2的特异性结合结构域的分子和材料的材料和方法，举例而言，具体实施方案包括药物,生物材料,生物分子,分子融合物,和疫苗。

Description

包含来自胎盘生长因子的序列的偶联物及其作为生物材料组成成分和在医药中的应用

对相关申请的交叉引用

本专利申请要求2012年7月3日提交的美国序列号61/667,630的优先权，据此其通过提述完整并入。

发明领域

所属技术领域，总体而言，涉及通过特异性结合相互作用结合胞外基质(extracellular matrices)的肽。

背景技术

胞外基质(ECM)为组织提供结构支撑，并为细胞提供信号传导能力。ECM在发育和组织修复中起重要作用。

发明概述

如本申请所报道的，已发现胎盘生长因子(PlGF)显示出对于ECM的特异性结合活性。PlGF是一种血管生成细胞因子，其存在多种剪接变体。PlGF最初是在胎盘中被鉴定出来，并提出其控制滋养层的生长及发育。PlGF在早期胚胎发育过程中表达。已显示PlGF在绒毛滋养层表达，而血管内皮生长因子(VEGF)在绒膜板中的间充质起源的细胞中表达。PlGF在包括心、肺、甲状腺、骨骼肌以及脂肪组织在内的若干种其他器官中表达。PlGF充当单核细胞VEGF分泌的有效刺激物，并显著地提高炎症前期趋化因子白介素-1β、白介素-8、单核细胞化学引诱物蛋白-1、以及健康受试者外周血单核细胞中VEGF的mRNA水平。PlGF通过将循环中的定向造血干细胞和巨噬细胞募集到生长中的肿瘤的位点来诱导肿瘤血管发生(Ribatti D,2008)。

一种具体实施方案是经分离的多肽，其包含选自具有0-5个保守取代的SEQ IDNO:4,具有0-5个保守取代的SEQ ID NO:5，及其亚序列的序列。所述的亚序列可以因显示出特异结合血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白和血纤蛋白中的一种或以上而被选择。可以指定解离常数，例如所述多肽与血纤蛋白原的特异结合具有小于约100nM,或小于约40nM，或小于约25nM的解离常数(KD)。

一种具体实施方案是生物递送载体(delivery vehicle)，其包含生物试剂和肽的分子融合物，所述肽包含选自具有0-约15％保守取代的SEQ ID NO:4和具有0-约15％保守取代的SEQ ID NO:5的序列的至少6个残基的序列或亚序列。如本申请中更加详细解释地，所述的肽显示出特异性结合下述一种或以上甚或全部胞外基质分子，所述胞外基质分子选自：血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白、血纤蛋白、胶原、胶原I和硫酸肝素。事实上，经测试的肽显示出特异结合上述的全部胞外基质分子。生物试剂的示例选自蛋白质、蛋白质药物、标记、免疫试剂、趋化因子、细胞因子以及细胞粘附肽。本申请所用的术语细胞因子，包括生长因子和形态发生素。

一种具体实施方案是包含基质的生物材料，所述的基质包含多肽，所述多肽包含选自具有0-5个保守取代的SEQ ID NO:4,具有0-5个保守取代的SEQ ID NO:5及其全部亚序列的序列，所述肽显示特异性结合胞外基质分子。所述基质可以是天然的和合成的、共价交联的、交联但无共价结合的和无交联的。

一种具体实施方案是药物，所述药物包含肽，载体(vehicle)，或含PlGF2(如PlGF2的结构域)的生物材料。所述药物可以用于，例如药物治疗，制备药物组合物，例如作为疫苗，用于药物递送，伤口愈合，和组织愈合，例如骨、瘘或溃疡愈合。

附图简述

图1:PlGF2(PlGF2_123-144)中的结构域，强烈地且杂乱地结合ECM蛋白。(a)GF与ECM蛋白的结合通过ELISA测定。超过0.1的信号(灰色框)被认为是代表特异性结合。PlGF2与被测试的全部ECM蛋白强烈结合(灰色柱)。(b)剪接变体PlGF2和PlGF-1(其不结合)的蛋白序列比对。PlGF2包含位于C-末端附近的附加的21氨基酸插入(PlGF2_123-144,灰色)。(c)使PlGF2_123-144在与非-结合模型蛋白GST(GST-PlGF2_123-144)融合的情况下结合ECM蛋白。扰乱形式(scrambled version)的PlGF2_123-144(GST-PlGF2_scr)不结合ECM蛋白。在(a)和(c)中，n≥3，平均值±SEM。比对显示PlGF-1的序列(PlGF-1LPAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGDENLHCVPVETANVTMQLLKIRSGDRPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERCGDAVPRR(SEQ ID NO:58)与PlGF2的序列相比较(LPAVPPQQWALSAGNGSSEVEVVPFQEVWGRSYCRALERLVDVVSEYPSEVEHMFSPSCVSLLRCTGCCGDENLHCVPVETANVTMQLLKIRSGDRPSYVELTFSQHVRCECRPLREKMKPERRRPKRGKRRREKQRPTDCHLCGDAVPRR,SEQ ID NO:59)。

图2:使各种GST-PlGF2_123-144片段与纤连蛋白、胶原I、硫酸类肝素和神经毡蛋白-1结合。(a)GST-PlGF2_123-144片段的设计方案。(b)使GST-PlGF2_123-144片段与纤连蛋白、胶原I、硫酸类肝素和神经毡蛋白-1结合。所描述的比对包括GST-PlGF2的片段：RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHLCGDAVPRR(SEQID NO:60),RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL(SEQ ID NO:61),RRPKGRGKRRREKQRPTD(SEQ ID NO:62),RRRPKGRGKRRREKQ(SEQID NO:1),GKRRREKQ(SEQID NO:2),以及RRRPKGRG(SEQ ID NO:3)。

图3:用PlGF2_123-144(黑色框)取代VEGF-A165的肝素结合结构域以生成VEGF-A121-PlGF2_123-144(SEQ ID NO:7)。PlGF2_123-144与PDGF-BB的C-末端融合以产生PDGF-BB-PlGF2_123-144(SEQ ID NO:9)。含点突变(Cys₁₄₂至Ser)的PlGF2_123-144*(灰色框)插入到BMP-2的C-末端以生成BMP-2-PlGF2_123-144*(SEQID NO:13)。

图4:有两幅子图。(a)通过ELISA测定细胞因子-PlGF2_123-144(*)与ECM蛋白(纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白、胶原I、血纤蛋白原)以及硫酸类肝素的结合。ELISA板经细胞因子包被，并进一步在升高的浓度(0.02-320nM)下与ECM蛋白一起温育。利用抗体检测结合的ECM蛋白。使结合曲线拟合非线性回归以获得应用A_450nm＝Bmax*[浓度]/(K_D+[浓度])的解离常数(K_D)。n＝3,平均值±SEM。(b)细胞因子s-PlGF2_123-144(*)保留在血纤蛋白基质中。血纤蛋白基质在野生型细胞因子(PlGF-1、PlGF2、VEGF-A121、VEGF-A165、PDGF-BB和BMP-2)或经修饰的细胞因子(VEGF-A121-PlGF2_123-144、PDGF-BB-PlGF2_123-144或BMP-2-PlGF2_123-144(*)存在下制备，并进一步在8倍体积的生理缓冲液中温育7天。每天更换所述的缓冲液，并且每天对累积释放的细胞因子进行定量。野生型PlGF-1、VEGF-A121、VEGF-A165、PDGF-BB和BMP-2被快速地释放，而VEGF-A121-PlGF2_123-144、PDGF-BB-PlGF2_123-144以及BMP-2-PlGF2_123-144*被隔离在基质中。

图5:在体外，PlGF2_123-144-融合的GFs显示与野生型GFs类似的生物活性。(a)用VEGF-A121、VEGF-A165或VEGF-A-PlGF2_123-144刺激人ECs，(b)用PDGF-BB或PDGF-BB-PlGF2_123-144刺激人间充质干细胞。磷酸化的GF受体(VEGFR-2和PDGFR-β)通过ELISA(n＝3,平均值±SEM)定量。将PlGF2_123-144插入到VEGF-A和PDGF-BB中不改变它们的信号传导。而且，PlGF2_123-144插入到VEGF-A121中，将其活性提高至VEGF-A165的水平。对于VEGF-A165而言，对受体磷酸化提高的活性最可能时由于使PlGF2_123-144结合于神经毡蛋白-1造成的，其提高VEGF-A刺激VEGFR-2磷酸化的潜力(Migdal M等,1998；Pan Q等,2007；Whitaker GB等,2001)。Student t-检验用于统计比较；*p<0.05,**p<0.01。(c)通过BMP-2-PlGF2_123-144*在人间充质干细胞中促进ALP活性的能力(诱导成骨细胞分化)对其进行评估。对在BMP-2或BMP-2-PlGF2_123-144*存在下培养了14天之后的细胞ALP进行定量。在经BMP-2或BMP-2-PlGF2_123-144*治疗的细胞间没有观察到细胞数量和ALP活性的差异。结果是以ALP/10k细胞的ng(n＝4,平均值±SEM)表达。

图6:PlGF2_123-144-融合的GFs展示对ECM组成成分增强的亲和力。(a)野生型相比于PlGF2_123-144-融合的GFs对ECM蛋白和硫酸类肝素的亲和力(表示为K_D)n＝3,平均值±SEM。(b-f)相对于野生型GFs，PlGF2_123-144-融合的GFs在递送位点持续保留一段时间。(b)在皮下注射到小鼠背部皮肤时，VEGF-A165和VEGF-A-PlGF2_123-144保持(retention)。n＝6/时间点,平均值±SEM。(c-f)当置于填充有血纤蛋白基质的、小鼠背部皮肤(c,d)和小鼠颅盖(e,f)中的5mm直径缺陷时，野生型和PlGF2_123-144-融合的GF保持。在血纤蛋白基质(灰色柱)和所述缺陷周围的组织中(黑色柱,远于2mm)3和6天后保持。n≥4/时间点,平均值±SEM。对于所有的小图，Student’s t-检验；**p<0.01,***p<0.001。

图7:VEGF-A-PlGF2_123-144和PDGF-BB-PlGF2_123-144比野生型VEGF-A和PDGF-BB诱导更好的伤口愈合和血管发生。(a-j)递送低剂量VEGF-A-PlGF2_123-144和PDGF-BB-PlGF2_123-14(各200ng，组合)₄促进糖尿病小鼠中的皮肤-伤口愈合，而相同剂量的野生型VEGF-A165和PDGF-BB没有。表面(topically)递送GFs(在第0,3,和6天，在第10天分析伤口；在0,3,6和9天，在第15天分析伤口)或在血纤蛋白基质中递送一次，治疗全层背部-皮肤伤口(直径6mm)。对6个不同的组进行的试验:表面,仅PBS载体,VEGF-A165+PDGF-BB,和VEGF-A-PlGF2_123-144+PDGF-BB-PlGF2_123-144；在血纤蛋白中,仅血纤蛋白、含VEGF-A165PDGF-BB的血纤蛋白和含VEGF-A-PlGF2_123-144+PDGF-BB-PlGF2_123-144的血纤蛋白。在10和15天后通过组织学评价(表面组；a-b),或7和10天后(血纤蛋白组；f-g)的伤口闭合以及肉芽组织形成。全部的点为平均值±SEM(n＝8-10伤口每组每时间点。Student’s t-检验；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。在第10天(c,h)对血纤蛋白组，代表性的组织学，第15天对表面组(苏木精和伊红染色)。黑色箭头指示伤口边缘；红色箭头指示愈合中的上皮舌的尖端。所述肉芽组织,染成粉-紫色。伤口下面的肌肉染成粉-红色。比例尺(Scale bar)＝1mm。(d,e,i,j)肉定量芽组织中的血管发生。10天和15天之后(表面组；d,e),或7天和10天之后(血纤蛋白组；I,J),针对ECs(CD31⁺细胞)和SMCs(结蛋白⁺细胞)将伤口组织染色；双重染色指示稳定的血管形态(n≥4/时间点,平均值±SEM)。利用Student’s t-检验比较野生型GFs和PlGF2_123-144-融合的GFs；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

图8:与相同剂量的野生型VEGF-A165(10μg)相比，VEGF-A-PlGF2_123-144诱导更少的血管渗透。(a)该图显示在小鼠耳部皮肤中的血管渗透测定。n≥4,平均值±SEM。为了统计比较,利用非参数Mann-WhitneyU试验将VEGF-A165和VEGF-A-PlGF2_123-144进行比较；*p<0.05。(b,c)应用VEGF-A20min后小鼠耳部皮肤脉管系统的代表性图像。由红色标记的葡聚糖从脉管中泄露使得VEGF-A诱导的渗透可视化。比例尺＝0.2mm。

图9:与野生型PDGF-BB和BMP-2相比，递送PDGF-BB-PlGF2_123-144和BMP-2-PlGF2_123-144*在大鼠中诱导更多的骨再生。通过表面地或在血纤蛋白基质中递送GFs治疗临界-大小的(Critical-size)颅盖缺损(直径6mm)。对6个不同的组进行的试验:表面地,仅盐水载体、BMP-2+PDGF-BB和BMP-2-PlGF2_123-144*+PDGF-BB-PlGF2_123-144；在血纤蛋白中,仅血纤蛋白、含BMP-2+PDGF-BB的血纤蛋白和含BMP-2-PlGF2_123-144*+PDGF-BB-PlGF2_123-144的血纤蛋白。剂量为：对表面治疗组，递送至硬脑膜GF各1μg，组合；对血纤蛋白组，GF各200ng，组合。(a-d)治疗后4后，通过μCT以骨量和缺损的覆盖范围(coverage)测定骨修复(a,b显示表面组；c,d显示血纤蛋白组)。(e-j)代表性的颅盖重建。e,盐水载体；f,BMP-2+PDGF-BB；g,BMP-2-PlGF2_123-144*+PDGF-BB-PlGF2_123-144；h,仅血纤蛋白，i,带有BMP-2+PDGF-BB的血纤蛋白；j,带有BMP-2-PlGF2_123-144*+PDGF-BB-PlGF2_123-144的血纤蛋白)。所述的缺损面积加了阴影。数据为平均值±SEM(n＝6/情况)。为了统计比较,利用Student’s t-检验使野生型GFs与PlGF2_123-144-融合的GFs进行比较；**p<0.01,***p<0.001。

发明详述

如本申请所报道地，已发现胎盘生长因子(PlGF)显示出对ECM的特异结合活性。本发明包括PlGF多肽，PlGF分子融合物用于生物递送,参入了PlGFs的生物材料，以及药物递送。所述PlGF可包括或限于，例如PlGF的一个或以上的结构域或片段。

纤连蛋白

纤连蛋白(FN)在多种细胞类型中广泛表达，并且因其在细胞粘附、迁移、生长和分化中所起的重要作用(Mao Y and Schwarzbauer JE,2005；Pankov Rand Yamada KM,2002)，在脊椎动物中许多依赖-ECM(Krammer A等,2002)的过程中至关重要。FN是二聚体糖蛋白包含两个几乎同一的230-270kDa亚基，所述亚基在邻近其C-末端处通过一对二硫键共价连接。每个亚基由三种类型(I,II和III型)的重复模块组成。这些模块包含介导与其他ECM组成成分、与细胞表面受体、以及与FN自身相互作用的功能结构域。FN包含12个I型重复，2个II型重复和15-18个III型重复。FN可以再分成两种形式，可溶的血浆FN(大量可溶的血浆组分[300μg/mL])和可溶性较小的(less-soluble)细胞FN。血浆FN由肝细胞分泌，在血液中富集，而细胞FN由成纤维细胞以及许多其他类型的细胞分泌并参入到细胞表面的纤丝状基质中。由产生具有不同细胞-粘附、配体结合以及溶解特性的FN的细胞-类型特异的剪接模式，使得细胞FN由更大且更异源组的FN同种型(isoform)组成，由此提供一种使得细胞以发育和组织-特异性方式精确地改变ECM的组合的机制。

FN是整合素受体家族若干成员的配体。得以最充分研究的识别序列，三肽RGD，位于第10个III型重复(FN III10)中。对这个简单的三肽序列的识别是复杂的且依赖于侧翼残基，其三维呈现以及整合素-结合口袋的个别特征。例如在第9个III型重复(FN III9)中的第二位点，包含五肽PHSRN(SEQ ID NO:50)(Mardon HJ and Grant KE,1994)的“协同位点”，通过与α5亚基(Mould AP等,1997)的相互作用，促进特异的α5β1整合素结合于FN且在FNIII9-10中，而αvβ3整合素结合于RGD与该协同位点无关(Danen EH等,1995)。整合素α5β1是介导纤丝基质形成中FN组装的起始受体(Mao Y and Schwarzbauer JE,2005；Pankov Rand Yamada KM,2002)。

除了整合素结合之外，FN还结合细胞因子。FN的第二肝素结合结构域(FN III12-14)结合来自血小板-衍生的生长因子和成纤维细胞生长因子家族，以及一些来自转化生长因子β和神经营养素家族的生长因子(Martino MM and Hubbell JA,2010)的大多数生长因子(能够刺激细胞生长的细胞因子)。尽管FN是单一基因的产物，由于前-mRNA的可变剪接使所得的蛋白质可以多种形式存在，在人FN中可产生20种之多的变体。剪接的主要类型出现在中央的III型重复组(FN III7-FN III15)中。外显子使用或跳过(Exon usage orskipping)导致包含或排除两个III型重复–EDB(也称作EIIIB或EDII，位于FN重复III7和III8之间)和EDA(也叫作EIIIA或EDI，位于FN重复III11和III12之间)中的任意一个。所述可变剪接的EDA和EDB结构域通常不存在于血浆FN中。有报道称，α₄β₁以及α₉β₁结合于定位在可变剪接的EDA节段中的EDGIHEL序列(SEQ ID NO:51)，表明增加的含EDA的FN种类可能的粘附功能。已有研究FN EDA作为亚基疫苗的平台。基于对FN EDA连接(ligates)并激活Toll-样受体4(TLR4)的观察，一个研究小组已研究开发利用FN EDA作为亚基疫苗中的佐剂DAMP，生成融合蛋白FN III EDA-抗原(Lasarte JJ等，2007)。含EDA和衍生自卵清蛋白C-末端的MHC I表位SIINFEKL的融合蛋白，以及含EDA和完整卵清蛋白的融合蛋白，提高卵清蛋白通过DC的呈递，并在体内诱导细胞毒性应答。这些EDA重组蛋白显示出保护小鼠不受表达卵清蛋白的肿瘤细胞的攻击。尽管FN EDA在重组亚基疫苗中有效，FN EDA的佐剂性(adjuvancy)尚不足以在小鼠中的病毒攻击模型中赋予保护性(Mansilla C等,2009)。事实上，需要与另一种佐剂，poly(I:C),以及抗-CD40，组合来降低肝炎病毒DNA在肝内的表达。如此，发现FN EDA在疫苗学领域效力不够。

生腱蛋白C

生腱蛋白C(TNC)是一种大的多功能胞外基质糖蛋白，其出现在发育过程中以及成年人在发生组织重建，如伤口愈合(Trebaul A等,2007),癌症(Orend G,2005)以及炎症(Udalova IA等,2011)的情况下。在发育过程中，生腱蛋白C在神经和血管网络以及骨骼形成中起高度限制性且驱动性(dynamic)的作用。已显示出其通过与细胞的直接相互作用或剪接地通过结合于其他胞外基质分子(如牵连蛋白)影响细胞粘附、增殖以及迁移(JonesFS and Jones PL,2000)。

在健康的成年生物体中，生腱蛋白C以严格控制的、快速且瞬时的方式产生，并处于需要进行组织修复(如伤口愈合和神经再生(Joester A和FaissnerA,2001))以及需要对感染进行处理(Udalova IA等,2011)的位置。但是，在不受控制的生腱蛋白C产生的情况下，这一分子是病理性的，导致异常的组织生长，如癌症，经皮冠状动脉的血管成形术后再狭窄(Imanaka-Yoshida K等，2001)和支架植入(stent implantation)、纤维变性疾病、慢性伤口、心血管疾病(Golledge J等,2011)以及自身免疫疾病(Udalova IA等,2011)。近来，已将生腱蛋白C与心脏和动脉损伤，肿瘤血管发生以及转移(metastasis)(O'Connell JT等,2011；Oskarsson T等,2011)以及调节肝细胞行为(Midwood KS等,2011)联系在一起。对于癌症转移，已显示出癌细胞负责转移、产生生腱蛋白C,抑制生腱蛋白C的产生导致转移降低(Oskarsson T等,2011)。因此，生腱蛋白可能是诊断和治疗性治疗的研发中的重要的靶，尤其是当这一大分子中的特定功能能被定义并定位到缩小的、特定的区域时。

人生腱蛋白C是包含4个主要的结构域的、二硫键合的hexabranchion:第一个,是在N-末端的组装结构域，形成卷曲螺旋结构和介导六聚体形成的链内二硫键。第二个，一系列14.5表皮生长因子-样重复，30-50个氨基酸之间的长度，各包含6各半胱氨酸，已显示出获得抗-粘附特性。第三个，一系列15纤连蛋白III型重复，其为约90个氨基酸长，形成两片反向平行β-链折叠，包含若干整合素结合区域(Jones FS and Jones PL,2000)。第四个，定位于C末端的血纤蛋白原样球状结构域(Midwood KS等，2011；Udalova IA等,2011)。已显示这一血纤蛋白原-样球状结构域激动(agonize)TLR4(Midwood K等，2009)。由此，这一结构域是身体的危险信号并起始免疫反应。

由于依赖于TNC源的可变剪接，生腱蛋白的纤连蛋白III型结构域区域显示出大的变异性(Jones FS and Jones PL,2000)。TNC的纤连蛋白III型结构域的数字(x-y)在本报告中将被定义为TNC IIIx-y。结构域TNC III3(Peng Q等，2009)包含RGD肽以及多个整合素结合结构域(例如:α_vβ₃,α₉β₁,α₃β₆,,α₈β₁(Yokosaki Y等，1998),α_xβ₁,α₈β₁)(对于大量的细胞类型(例如:平滑肌细胞、内皮细胞、神经元、星形胶质细胞、神经胶质瘤)(Jones FS andJones PL,2000)。结构域TNC III5已被证明结合肝素(Weber P等，1995)。如本申请所报道地，结构域TNC III5，以及包含TNC III5结构域的更长的结构域，如TNC III1-5和TNCIII3-5，已被证明结合趋化因子。

血纤蛋白原和血纤蛋白

血纤蛋白原是一种可溶性的血浆糖蛋白，由肝脏以及血液凝固过程中的前体蛋白合成。蛋白水解酶,凝血因子II，在凝血过程中通过从其中央结构域切割血纤肽将血纤蛋白原聚合成为血纤蛋白，防止所述分子的物理化学自组装或聚合(Weisel JW,2007)。血纤蛋白通过因子XIIIa顺次化学交联，形成粘弹性血块的初级结构蛋白(Mosesson MW,2005)，并起专门的临时蛋白质网络的作用，所述网络主要是在自发组织修复中形成。血纤蛋白的稳定性依赖于其与止血系统的分子/细胞组成成分的相互作用(Hantgan RR等,1994)。除了使血纤蛋白与其自身交联之外，因子XIIIa交联其他黏附蛋白质成为血块。血纤蛋白能结合若干种细胞-黏附受体，如整合素，并明显地促进血小板和白细胞(如单核细胞和嗜中性粒细胞)的黏附(Flick MJ等,2004；Ugarova TP and Yakubenko VP,2001)。

血纤蛋白基质是防止流血和促进伤口愈合的重要生物材料之一(Janmey PA等,2009)。血纤蛋白可从自身来源或由冷沉淀混合人血浆获得。目前，血纤蛋白是临床最常用的水凝胶之一。血纤蛋白基质的复合纤丝结构和交联特征可通过其形成细节来控制(Lorand L and Graham RM,2003；Standeven KF等,2007；Weisel JW,2004)。重要的是，相比于其中的细胞迁移通过依赖或不依赖蛋白水解降解的机制出现的纤维胶原基质，血纤蛋白中的细胞迁移几乎只依赖于细胞-相关的蛋白水解活性(基本上来自于纤溶酶和基质金属蛋白酶(Mosesson MW,2005))。血纤蛋白的主要优势之一是在凝血过程中，通过经由转谷胺酰胺酶因子XIIIa的共价交联，若干蛋白质天然地参入到血纤蛋白基质中，如纤连蛋白和α-2-纤溶酶抑制物(Mosesson MW,2005)。因此，可以容易地利用这一天然反应使血纤蛋白与多种细胞-信号传导分子行使功能(Patterson J等,2010；Schense JC and Hubbell JA,1999)。此外，血纤蛋白原与成纤维细胞生长因子(FGF)-2,VEGF-A165以及胰岛素-样生长因子结合蛋白(IGFBP)-3特异性地相互作用(Peng H等,2004；Sahni A等,1998；Sahni A等,2006；Werner S and Grose R,2003)。

血纤蛋白是有用的基础基质(base matrix)，可以和本申请所描述的肝素结合肽以及分子融合物一同使用。也可以将其他材料工程化以包括TG或与转谷胺酰胺酶相互作用以接收TG分子融合物的部分(moieties)。US 7241730,6,331,422,US 6,607,740,US 6,723,344,US Pub 2007/0202178,US Pub2007/0264227并入本申请以用于所有目的的参考，发生冲突时，以本说明书为准。

血纤蛋白基质易于在体内通过蛋白酶降解，在体外经常将蛋白酶抑制剂配制到血纤蛋白原/血纤蛋白基质中，以延长其在体内的寿命。这使得血纤蛋白基质在组织黏附和密封剂应用，以及组织工程化应用中更加有用。一种此类蛋白酶抑制剂是抑肽酶(aprotinin)。抑肽酶的血纤蛋白-结合形式已通过在含抑肽酶的融合蛋白质中包含因子XIIIa底物工程化(Lorentz KM等,2011)。

基质对于药物持续释放的目的有用。药物可以包载于所述基质中，由所述基质中缓慢地扩散出来。可将所述药物和所述基质的组成成分之间的亲和力工程化。例如,已将对肝素的亲和力用于延长肝素-结合的细胞因子从基于血纤蛋白的基质的释放，向血纤蛋白基质中参入肝素结合位点，利用肝素作为所述结合相互作用的中间物(Sakiyama SE等,1999)。

组织修复和再生

损伤后，组织修复或再生是细胞命运过程的时空协作的结果，其受控于来自胞外微环境以及募集于损伤位点的细胞的众多细胞-信号传导事件(Gurtner GC等,2008)。在这一弹性环境(elastic milieu)(Discher DE等,2009)提供的生物力学背景下，通过受体-介导的相互作用，经由特定的黏附受体，如整合素等(Berrier AL and Yamada KM,2007)，细胞与胞外基质组成成分，如纤连蛋白和层粘连蛋白(以及众多其他的成分)相黏附。这些受体由所述胞外基质，通过细胞膜，以驱动性的且一致的方式将应力(stress)传递到细胞内的细胞骨架(Hinz B,2009)。然而，所述黏附受体远不止传递应力；在特定的细胞膜中的黏附受体簇内，生化信号传导通过激酶活化以及其他机制发生(Berrier AL and Yamada KM,2007；Hinz B,2009)。除黏附蛋白之外，所述胞外基质还螯合(sequesters)并呈递许多形态调节(morphoregulatory)分子，包括形态发生素、细胞因子和生长因子,其控制细胞分裂、和/或迁移、和/或分化、和/或多细胞形态发生(Discher DE等,2009；Schultz GS andWysocki A,2009)。形态发生素,细胞因子和生长因子是功能强大的可溶性信号分子,因为它们能改变细胞的命运并直接诱导组织形态发生。术语形态发生素主要用于发育生物学，以描述以浓度依赖的方式诱导细胞应答的特定类型的信号分子(Affolter M and BaslerK,2007)，而细胞因子和趋化因子(小细胞因子诱导趋化性)是发育以及先天性和适应性免疫应答发挥功能必不可少的调节蛋白(Rossi D and Zlotnik A,2000；Vilcek J andFeldmann M,2004)。就其定义而言，除诸如迁移和分化之类的其他细胞应答之外，生长因子能诱导细胞生长(Cross M and Dexter TM,1991)。生长因子可以是形态发生素或细胞因子。

例如,参与组织形态发生的关键细胞因子包括血管内皮生长因子(VEGFs)、血小板衍生的生长因子(PDGFs)、成纤维细胞生长因子(FGFs)、胰岛素-样生长因子(IGFs)、骨形态发生蛋白(BMPs)、转化生长因子β(TGF-βs)和神经营养素(β-NGF,NT-3,BDNF)。许多细胞因子结合胞外基质组成成分，如硫酸类肝素蛋白多糖(Lindahl U and Li JP,2009)，并驻留在那里直至通过酶促过程或解离释放。当被释放时，也有当基质-结合时(Makarenkova HP等,2009)，这些因子结合于细胞表面受体并触发信号传导，主要是通过激酶活化。由此，所述胞外基质作为信号分子(黏附分子和细胞因子)的储藏库(reservoir)指示细胞决策过程。血管发生，多细胞形态发生以及干细胞分化是由胞外基质和细胞因子严格控制的细胞过程，尤其是通过它们的协同信号传导进行控制。由于组织修复由这些过程驱动，胞外基质的功能引导组织工程化和再生医学中的生物材料设计，总体目标是模拟下述关键特征:黏附分子的呈递以及细胞因子释放。

疫苗学

如上所述，细胞因子在组织形态发生中起着基础性的作用。通过调节不同免疫细胞类型的增殖、成熟和迁移，由此驱动针对不同类型抗原的合适的免疫应答，细胞因子在免疫学中也起着基础性的作用。在免疫学中，细胞因子TGF-β是尤其重要的细胞因子。

趋化因子是小的蛋白质，其也在免疫学中起着基础性的作用。在趋化因子中，干扰素-γ(IFN-γ)是针对病毒和细菌抗原的先天性和适应性免疫，以及肿瘤控制的决定性免疫调节趋化因子。IFN-γ主要由天然杀伤(NK)以及天然杀伤T-细胞(NKT)表达，作为先天性免疫应答的一部分，在适应性免疫应答中通过CD4和CD8T细胞表达。IFN-γ是调节Th1和Th2平衡中最重要的趋化因子：Th1细胞表达IFN-γ,其反过来引起Th1分化和Th2分化抑制。对IFN-γ的不同细胞应答是通过其结合到异源二聚体受体(IFNGR1和IFNGR2)激活的，所述异源二聚体受体激活JAK/STAT1信号途径。这一细胞内信号传导活化触发多种下游基因的表达，其中包括趋化因子干扰素γ-诱导的蛋白10(CXCL10)和趋化因子(C-X-X基序)配体11(CXCL11)。这两种趋化因子通过结合细胞表面的CXCR3受体发挥它们的作用，并被认为分别是单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、NK和T-细胞的有效化学引诱物。

在疫苗学中，抗原是肽或蛋白质结构域，或病原体或自身来源的完整蛋白质(Hubbell JA等,2009)。在感染性疾病中的疫苗抗原基于在所关注的病原体中发现的蛋白质，如流感抗原或结核病抗原。在感染性疾病中靶定的抗原，无论是预防性的还是治疗性疫苗，不计其数。癌症中的疫苗抗原是基于在肿瘤细胞类型中发现的蛋白质，如将在许多肿瘤类型中高度表达的抗原存活蛋白，或在黑色素细胞中表达的抗原TRP-2，以及用于黑素瘤中癌症接种疫苗的靶。在癌症中靶定的抗原数量不计其数。

可制备包含PlGF2结构域和抗原(例如本申请所述的载体或基质)的疫苗。PlFG2提供附着于天然组织或基质中的ECM。疫苗组合物可包含佐剂，危险信号和/或趋化因子，其可能是基质、包含PlGF2结构域的分子融合物的一部分，或是在PlGF2之外加入的。

PlGF

本申请描述了模拟来自PlGF2的结构域的肽。细胞因子PlGF存在多种同种型。PlGF2是PlGF-1的加长的同种型，在人中包含插入序列RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL(SEQ IDNO:4)，在小鼠中包含RRKTKGKRKRSRNSQTEEPHP(SEQ ID NO:5)，在其他哺乳动物中包含其他相关序列。本申请报道了出人意料的发现，即，这种肽与血纤蛋白原和血纤蛋白，以及胞外基质蛋白纤连蛋白、玻连蛋白、骨桥蛋白、生腱蛋白C非常强烈地结合，并以稍弱的程度结合胶原I。这一结构域称作PlGF2_123-144。术语PlGF2用于指这一结构域和展示出特异性结合胞外基质的亚结构域。PlGF2_123-144和血纤蛋白原/血纤蛋白之间的强烈结合可用于结合血纤蛋白基质中的包含PlGF2_123-144的蛋白质，包括蛋白质药物和抗原。PlGF2_123-144和血纤蛋白原/血纤蛋白和/或胞外基质之间的强烈结合可用于，使得下述蛋白质的存在延长，所述蛋白质为包含已施用于血纤蛋白基质中的PlGF2_123-144的蛋白质、包含已施用到损伤位点上或之中的PlGF2_123-144的蛋白质、或包含已施用到组织位点上或之中的PlGF2_123-144的蛋白质。PlGF2结构域和胞外基质蛋白之间的强烈结合可用于延长包含PlGF2结构域的蛋白质在组织中的保持，其借助所述蛋白质结合于内源性地存在于组织中或组织损伤位点的胞外基质实现。所发现的PlGF2_123-144和血纤蛋白原/血纤蛋白之间的亲和力，以及存在于PlGF2_123-144和胞外基质分子之间的亲和力促成了多个优选的具体实施方案。

术语PlGF2或PlGF2结构域包括SEQ ID NO:4和5的肽，及其亚序列，以及这些序列的变体。SEQ ID NO:4和5是PlGF2结构域的具体实施方案。另外的PlGF2结构域的具体实施方案包括所述序列的保守取代，以及N-末端和/或C-末端残基被截短的截短形式。通过阅读本申请，本领域技术人员能够容易地实现对所述截短的鉴定。提供特异性结合的保守残基的数量在约4到约15个残基之间，更长的序列也显示特异性结合。因此，PlGF2的具体实施方案包括包含选自具有0-5个保守取代的SEQ ID NO:4,具有0-5个保守取代的SEQ ID NO:5，及其亚序列的序列的经分离的多肽，所述的亚序列表现出与血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白和血纤蛋白中的一种或以上的特异结合活性。所述的亚序列包括4到15个残基长的全部亚序列，例如所有的4,5,6和7个残基的亚序列，以及所有7-12和5-15个残基的亚序列。所述序列的解离常数值低，例如所述多肽与血纤蛋白原的特异性结合具有小于约40nM的解离常数(KD)。此外，通常可以实现用D-氨基酸取代所发现的序列中的L-氨基酸，如Giordano中所述。

参照图2,子图a,测试PlGF2_123-152的亚序列的数据显示7个残基的片段保留有对胞外基质(ECM)的特异结合活性。但是，更大的片段显示出更高的亲和力。这一数据指示可以合理地预期更短的序列也可以显示出与合适的ECM的特异性结合，包括全部4个以上残基的亚序列。此外，在生物领域中已知有许多序列当其是更大的分子的一部分的时候是有效力的，例如RGD细胞黏着基序。尽管一些分子将以扰乱此类相对小的序列的特异性结合的方式折叠，本领域技术人员非常熟悉那些用于创建以有效的方式应用此类序列的甚或非常大的分子的技术。另一方面，考虑到存在有大量的天然生物分子而仅有约20种天然氨基酸，作为随机概率的结果，存在一定量可能具有一个和以上此类序列的天然生物分子。这样的序列不应被认为就特异性结合而言是活性的，因为这样的生物分子已进化调整为完成特定的功能。结合于ECM是非常重要的天然发生的特异性功能，没有具体情况下合适生物学证据时其不应被归因于特定生物分子。

大多数的黏附结合基序可进行一些保守取代同时保持其功能性。尽管并非所有的此类取代都是有效的，此类改变通常有效。有通常可以对氨基酸序列实施、不改变其活性的多种保守变化。这些改变称作保守取代或突变；也就是说，属于具有特定大小或特征的一组氨基酸中的一种氨基酸可被另一种氨基酸取代。氨基酸序列的取代物可选自所述氨基酸所属类别中的其他成员。例如非极性的(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸。所述极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷胺酰胺。所述带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期这些改变基本上不会影响通过丙烯酰胺凝胶电泳或等电点确定的表观分子量。保守取代还包括将序列的旋光异构体置换为另一种旋光异构体，特别是将序列中的一个或以上的残基由L氨基酸置换为D氨基酸。此外，对序列中的所有氨基酸均可进行由D氨基酸到L氨基酸的置换。示例性的保守取代但不限于，Lys取代Arg，反之亦然，以保持正电荷；Glu取代Asp，反之亦然，以保持负电荷；Ser取代Thr以保持游离-OH；和Gln取代Asn以保持游离NH₂。此外，有时也可以进行多肽序列和相应的核酸序列中的点突变，缺失和插入，而不丧失多肽或核酸片段的功能。取代，可以包括例如1,2,3或更多个残基。本申请中描述的氨基酸残基或使用单字母氨基酸代号或使用三字母缩写。本申请所使用的缩写与标准的多肽命名一致,J.Biol.Chem.,(1969),243,3552-3559。所有的氨基酸残基序列均以由左到右的方向表示，即按照常规的由氨基末端到羧基末端的方向。因此，本申请中所示的肽的保守取代可以定量的方式描述，例如1-5,或百分比,例如0％-33％。本领域技术人员容易理解，所有所述明确提及的界线内的范围和数值均包括在内，约5％,7约％,或约15％。对于7个残基中有一个取代的情况，所述取代为14.2％,也即约15％。对于22个残基中2个取代的情况，所述百分比为9.1，也即约10％。

一些具体实施方案提供多种多肽序列和/或经纯化的或经分离的多肽。术语多肽指氨基酸残基链，无关乎翻译后修饰(例如磷酸化或糖基化)和/或与另外的多肽复合，与核酸和/或碳水化合物或其他分子一起合成到多亚基复合物中。本申请中蛋白聚糖也称作多肽。本申请中所用的"功能性多肽”是能促进所指示的功能的多肽。可通过多种方法生产多肽，许多方法是本领域所公知的。例如,多肽可通过提取(例如从经分离的细胞)获得、通过编码所述多肽的重组核酸表达获得或通过化学合成获得。多肽可通过，例如重组技术，将编码所述多肽的表达载体引入用于表达所述多肽的宿主细胞(例如通过转化或转染)来生产。

有些情况下，需要确定某种肽与本申请中的序列的同一性百分数。在此种情况下，就所述肽或所述肽的部分的残基数量测定同一性百分数，例如，具有90％同一性的肽有可能是较大的肽的一部分。

本申请所用的术语，纯化的，在用于多肽时指某种多肽经化学合成因此基本上不被其他多肽污染，或已经和与其天然地伴随存在的大多数细胞成分(如其他的细胞蛋白，多核苷酸或细胞成分)相分离并纯化的。经纯化的多肽的一个示例是，已与至少70％(以干重计)的蛋白质以及与其天然伴随出现的有机分子相分离。因此，经纯化的肽的制备物可以是所述多肽的，例如至少80％,至少90％或至少99％(以干重计)。所述多肽可被工程化以包含标签序列(如聚组氨酸标签，myc标签，或标签)，以有利于多肽的纯化和标记(如捕获到亲和基质上，在显微镜下可见)。由此，除非另有说明，经纯化的组合物，其包含的多肽指经纯化的多肽。术语经分离的指示本发明的多肽或核酸非处于它们的天然环境之下。因此，本发明的经分离的产物可包含于培养物上清中，可以是部分富集的，由异源来源生产的，克隆于载体中或与载体配制在一起，等等。

多肽可以包括化学修饰；在本申请的背景下，该术语指氨基酸天然存在的化学结构的变化。此类修饰可对侧链或末端实施，例如改变氨基末端或羧基末端。在一些具体实施方案中，所述修饰用于创建化学基团，其便于使所述多肽与其他材料相连，或附加治疗剂。

特异性结合，如该术语在生物领域所常用的，指所述分子以比非靶组织相对高的亲合性与靶结合，通常包括多种非共价相互作用，如静电相互作用，范德瓦尔斯(van derWaals)相互作用以及氢键等。特异性结合相互作用表征抗体-抗原结合，酶-底物结合，以及特异性结合蛋白-受体相互作用；有时此类分子可能结合它们的靶之外的组织，此种结合称作缺乏特异性，不是特异性结合。

讨论

实施例1(参见图1)描述了确定发现PlGF2内的结构域PlGF2_123-144强烈且杂乱地结合ECM蛋白的结果。这一结构域仅是PlGF2的一部分，因此并不存在于自然界中。PlGF2与所有经测试的ECM蛋白强烈结合(图1,灰色柱)。剪接变体PlGF2和PlGF-1(其不结合)的蛋白序列比对图示说明PlGF2如何包含位于近C-末端的额外21个氨基酸插入(PlGF2_123-144,灰色)。在PlGF2结构域与蛋白质GST(GST-PlGF2_123-144)融合时仍显示有效地结合。由实施例1可以得出结论PlGF2_123-144包含ECM蛋白结合结构域。测试了多种PLGF2片段与多种ECM蛋白、硫酸类肝素以及神经毡蛋白-1的结合，结果描述于图2中。实施例2详细描述了所述实验，以及对所述序列进行截短和/或取代的示例。

应用多种细胞因子与PlGF2结构域一起制备融合蛋白(实施例3；图3)。图4(参见实施例4)示出所述融合蛋白与ECM结合的结果。测定了所述特异性结合的解离常数，确定了PlGF2对多种ECM蛋白的亲和力被赋予到所述融合物分子。它们包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板-衍生的生长因子(PDGF)和骨形态发生蛋白(BMP)。实施例5详细描述了进一步生产细胞因子-PlGF2结构域分子融合物，包括与胰岛素生长因子-I(IGF-I)、转化生长因子β1(TGF-β1)、TGF-β2(TGF-β2)、脑衍生神经营养因子(BDNF)和神经营养素(NT)NT-3的融合物。观察到这些生物因子(实施例6,图5)在与PlGF2结构域融合时保持了其生物活性。事实上，VEGF融合物分子具有提高的活性。

在将VEGF-A转移用于临床用途中出现了重要的问题。实际上，尽管VEGF-受体2(VEGF-R2)的VEGF-A活化是可能有效地促进血管发生的方法，实际施用VEGF-A却迅速地诱导血管渗透，其导致全身性低血压和浮肿；这一现象已属于外周和心-血管应用中的剂量限制性毒性反应(Simons M and Ware JA,2003)，是再生医学中的严重问题。理论上推定，组合VEGF和PlGF2结构域不会影响VEGF的效力，但会使得其释放更加缓慢由此减少血管渗透，所述的组合将比VEGF自身更有效。类似地推定，各种细胞因子与PlGF2结构域的融合物是有效的。这些推论得到一系列实验的支持。实施例7(图6)详细描述了如何创建各种ECM超-亲和力细胞因子变体，其在体内结合ECM分子并由此被保留。实施例8(图7)利用重要的临床模型测试具有PlGF2结构域的PDGF-BB和VEGF-A分子融合物的治愈能力。利用工程化的PDGF-BB和VEGF-A分子融合物治疗伤口显著地加快了伤口闭合，并且通过观察到更好的肉芽组织和显示改善的血管发生的生物标记(CD31和结蛋白)确证了所述经改善的治愈。

除了这些改善的结果之外，还观察到VEGF和PlGF2结构域的分子融合物还大量减少血管渗透。实施例9(图8)详细描述了所述结果。简要地，看起来所述融合物使得血管发生与过度-渗透去偶联(decouple)。

根据这些各样的结果显示PlGF2结构域能在融合物中创建期望的特异性结合而不破坏细胞因子的功能，还实施了进一步的实验以证明此类组合的普遍适用性。实施例10(图9)详细描述了细胞因子与PlGF2结构域的分子融合物对骨损伤的治疗。在这些实验中，应用基质保留并可控地递送所述分子融合物。简要地，所述融合物分子比细胞因子本身有效得多，少得多的剂量即可起效(纳克量的融合物堪比微克量的未经改变的细胞因子)。这些结果证明了特异性结合所述分子融合物的基质的有效性，以及它们在骨愈合治疗中的有效性。

还提供了各种详尽的实施例，其描述如何设计并制备各种分子融合物。实施例11详细描述了细胞黏着基序如何能与PlGF2结构域融合。以纤连蛋白结构域作为示例。用于递送药物和/或促进细胞侵入和治愈的基质曝露于此类分子融合物，以进行或被修饰以负载药物或细胞黏着基序之类的其他生物活性试剂。多种基质是已知的，包括合成基质,血纤蛋白基质,以及天然的或合成的基质,包括共价交联的和非共价交联的。实施例12详细介绍了用于从基质释放的药物的分子融合物，以甲状旁腺激素片段1-34作为示例。实施例13详细介绍了PlGF2结构域和蛋白酶抑制剂的分子融合物。其间以血纤蛋白基质与抑肽酶作为示例。实施例14详细介绍了趋化因子CXCL10、CXCL11、IFN-γ、CCL21和PlGF2的分子融合物。

也可以利用PlGF2结构域制备疫苗。实施例15详细介绍了免疫原性抗原与PlGF2结构域的分子融合物。例如在本申请其他部分详细描述的，这种分子可以在药学上可接受的化合物的背景下施用，并与其他的疫苗特征相结合。例如，实施例16提供了工程化Toll-样受体激动剂与PlGF2结构域融合的详细说明。

通过实施例17的详细描述给出了药物-递送和控制释放的一般性示例说明，其间描述了生物活性试剂与PlGF2结构域的分子融合物。例如，通过FGF18和PlGF2结构域之间的融合蛋白提供了胞外基质-结合的FGF18。还提供了所述融合物的各种替代性方案。

分子融合物

优选的具体实施方案是PlGF2结构域和治疗剂的分子融合物。具体实施方案包括PlGF2结构域与例如治疗剂、标记、细胞黏附分子、抗原、蛋白质、蛋白质药物或细胞因子的分子融合物。可以在第一PlGF2肽和第二肽之间形成分子融合物。除第二肽外还可以使用化学部分(chemical moiety)，例如标记，荧光标记。所述融合物包含彼此间直接或间接偶联的肽。所述的肽可以是彼此间直接偶联的，或是通过接头间接偶联的。所述的接头可以是肽、聚合物、适体、核酸或颗粒。所述颗粒可以是例如微颗粒、纳米颗粒、聚合物囊(Polymersome)、脂质体或微团。所述的聚合物可以是例如天然的、合成的、线性的或分支的。包含第一肽和第二肽的融合蛋白是所述肽的分子融合物的示例，所述融合蛋白包含彼此直接相互连接的肽，或通过插入其间的接头序列和/或在其一端或两端的其他序列序列相连。可通过共价键与所述接头偶联。方法包括制备分子融合物或包含所述分子融合物的组合物,包括药学上可接受的形式的组合物。

具体实施方案包括，包含PlGF2结构域和转谷胺酰胺酶底物(TG)的多肽的分子融合物。TG底物的具体实施方案是包含α2-纤溶酶抑制物(NQEQVSPL)(SEQ ID NO:50)的残基1-8的肽。具体实施方案包括，此类多肽是重组的融合物多肽。所述分子融合物还可以包含对细胞黏附分子具有特异性亲和力的细胞黏附部分(adhension moiety)。多种细胞黏附部分(adhesion moieties)是已知的，例如其中的细胞黏附部分包含糖蛋白或细胞表面受体的配体。或者所述细胞黏附部分可包含对细胞黏附分子具有特异性亲和力的配体，所述细胞黏附分子是选自整合素和钙粘附蛋白的细胞表面受体。

术语分子融合物，或术语偶联的，指通过化学键，包括共价的、静电离子的、或电荷-电荷的，直接或间接的关联。所述的偶联创建了一种单元(aunit)，其通过化学键维持。直接偶联指化学键合到所述试剂，通过或不通过中间接头或化学基团。间接偶联指化学连接(chemical linkage)到载体。所述载体可以基本上封装(largely encapsulate)所述试剂，例如脂质体或微团或一些类型的纳米颗粒，或使得所述试剂于其表面上,例如金属纳米颗粒或珠子，或两者，例如在其内部和外部均包含一些试剂的颗粒。所述载体也可以封装用于免疫耐受的抗原。例如聚合物囊(Polymersome)、脂质体，或可以生成封装所述抗原的颗粒。术语封装(encapsulate)指有效地完全覆盖，没有任何部分暴露，例如可以制备封装抗原或试剂的聚合物囊(Polymersome)。

可通过将所述肽共价键合到另一分子来实现偶联，可使用或不使用接头。形成所述的偶联属于本领域技术人员的能力范围，并且由多种实现所述偶联的技术是已知的，由有待偶联的材料引导选择特定的技术。向多肽(C-或N-末端)添加氨基酸，其包含可离子化的侧链，即天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、组氨酸或酪氨酸，且不包含于所述多肽序列的活性部分中，以未质子化的状态作为有效的亲核试剂，与附着于聚合物(即同-或异-双功能PEG)的反应基团一起参与多种生物偶联反应(例如Lutolf和Hubbell,Biomacromolecules 2003；4:713-22,Hermanson,Bioconjugate Techniques,London.Academic Press Ltd；1996)。在一些具体实施方案中，使用可溶性的聚合物接头，可以药学上可接受的形式施用于患者。或者药物抗原封装在聚合物囊(Polymersomes)或胶囊中或是共价地附着于所述肽配体。

所述的分子融合物抗原包含颗粒。所述的PlGF2结构域可以附着于颗粒上。抗原、试剂或其他底物抗原在所述颗粒内或颗粒上。纳米颗粒，微团或其他颗粒的示例可参见例如US 2008/0031899,US 2010/0055189,US 2010/0003338，其作为参考并入本申请用于包括将其与本申请所述的配体相结合在内的所有目的，发生冲突时以本说明书为准。

纳米颗粒可制备成颗粒组，平均直径约10nm到约200nm，包括明确指明的界线内的所有范围和数值，例如约20到约200、约20到约40、到约70、到约100nm，这取决于因制备方法所致的多分散性。可以利用各种纳米颗粒系统，例如那些由聚(乙二醇)和聚(乳酸)的共聚物形成的，那些由聚(环氧乙烷)和聚(β-氨基酯)的共聚物形成的,以及那些由如血清白蛋白之类的蛋白质形成的。其他的纳米颗粒系统是这些领域的技术人员已知的。还可参见Devalapally等,Cancer Chemother Pharmacol.,07-25-06；Langer等,InternationalJournal of Pharmaceutics,257:169-180(2003)；和Tobío等,Pharmaceutical Research,15(2):270-275(1998)。

也可以制备参入肝素结合配体的、平均直径约200nm以上的较大的颗粒，由于这些颗粒接近微米范围并大约落入光学分辨率的限度，其在本申请中称作微颗粒。例如，某些制备微颗粒的技术示于U.S.Pat Nos.5,227,165,6,022,564,6,090,925,和6,224,794。

纳米颗粒功能化以实施靶向能力需要使靶向的多肽与所述颗粒相关联，例如利用生物偶联技术通过共价结合，由有待与所述所述多肽连接的颗粒、纳米颗粒或其他构建体引导选择特定的技术。一般而言，用于将肽附着于其他材料的许多生物偶联技术是公知的，可以针对特定的材料选择最适合的技术。例如，可将另外的氨基酸可附着于多肽序列，例如在将所述多肽附着于巯基-反应性分子时的半胱氨酸。

分子融合物可以包含聚合物。所述的聚合物可以时分支的或线性的。分子融合物可包含树状聚体。一般而言，可使用可溶性亲水生物相容性聚合物以使得所述偶联物引入到患者中后是可溶的且是可被生物利用的。可溶性聚合物的示例是至少100、400，或100和400,000之间(包括所述明确界定值之间的所有范围和数值)的聚乙烯醇,聚乙烯亚胺,和聚乙二醇(该术语包括聚环氧乙烷)。所述的可溶性指在水或至少1g/L的生理盐水中的可溶性。也可以使用可生物降解的聚合物的结构域，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃和聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacylates)。

具体实施方案包括包含多肽的聚合物，所述多肽包含合成的PlGF2肽。例如具体实施方案包括以上列出的聚合物以及聚糖、聚乙二醇、聚环氧烷(polyalkylene oxide)、胶原或明胶。所述聚合物还可以包含转谷胺酰胺酶底物(TG)，细胞因子，等等。

在一些具体实施方案中，可以制备多肽-聚合物缔合物(association),例如分子融合物，作为药学上可接受的、经纯化的组合物并引入到体内，或连同赋形剂一起。引入的位点可以是，例如全身，或某个组织，或移植位点。

具体实施方案包括PlGF2结构域和蛋白质药物的分子融合物，如包含PlGF2结构域和所述蛋白质药物的重组的融合蛋白、包含PlGF2结构域和所述蛋白质药物的化学偶联物、或包含PlGF2结构域和所述蛋白质药物的间接化学偶联物，其通过连接融合物介导与聚合物或聚合微团或纳米颗粒相连。

PlGF2结构域和蛋白质药物的分子融合物当使用于组织位点时，可通过其与损伤组织位点中的血纤蛋白原/血纤蛋白的亲和力、或其与组织位点中的ECM蛋白的亲和力，用于将蛋白质药物锚定于组织。由此，优选的具体实施方案是药学上可接受的载体中PlGF2结构域和蛋白质药物的分子融合物。另外，PlGF2结构域和蛋白质药物的分子融合物可用于在血纤蛋白基质中锚定所述蛋白质药物。血纤蛋白是常用的生物材料基质，用于封闭和粘接(sealing and adhering)组织，在再生医学以及药物递送中应用。血纤蛋白基质中的锚定蛋白质药物可以在这些及其他应用中提供药学上的益处。肽和蛋白质抗原可以通过在所述抗原与PlGF2结构域之间形成分子融合物连接并锚定于血纤蛋白基质中。由此，优选的具体实施方案是药学上可接受的血纤蛋白原/血纤蛋白制剂形式的、PlGF2结构域和蛋白质药物或抗原的分子融合物。血纤蛋白原/血纤蛋白也可以是自体来源的，由此，优选的具体实施方案是针对自体血纤蛋白应用的、药学上可接受的载体中的、PlGF2结构域和蛋白质药物或抗原的分子融合物。

载体

在许多情况下，治疗剂，例如蛋白质药物，如细胞因子、激素或细胞-黏附蛋白可直接递送到身体中需要治疗的位点，无需应用任何基质。但是，由于间质流动和引流(drainage),细胞因子或其他可溶性试剂可以很快的由注射位点清除，这取决于它们和ECM的亲和力。由于细胞因子经PlGF2，例如PlGF2_123-144序列修饰，显示出改善的与包括纤连蛋白、生腱蛋白C、玻连蛋白、骨桥蛋白和胶原I在内的若干种胞外基质的结合，其可以在注射位点更好的保留，由此改善治疗。

PlGF2肽可用作递送治疗剂的载体。所述载体是可溶的或生理溶液中的胶体，在释放于体内时，所述载体的全部组成成分最大直径优选地小于约500μm。PlGF2载体的具体实施方案包括生物试剂与肽的分子融合物，所述的肽选自具有0-5个保守取代的SEQ ID NO:4,具有0-5个保守取代的SEQ ID NO:5，及其亚序列，所述核酸表现出与血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白和血纤蛋白中的一种或以上特异性结合。所述生物试剂可选自蛋白质、蛋白质药物、标记、免疫试剂、趋化因子、细胞因子以及细胞粘附肽。

使用中，PlGF2肽自身或作为分子融合物的一部分，显示出对包括血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白和血纤蛋白在内的各种ECM分子的结合特异性。在此种情况下，血纤蛋白原和血纤蛋白可被视为临时的ECM。将PlGF2载体置于组织中导致所述载体被局部固定于放置位点或其附近，而不是全身。所述载体负载的试剂随时间推移而释放或在其固定处被与所述组织相互作用的细胞消耗。由此，患者自身的组织用作因子递送的基质。生物基质的许多应用是已知的，包括药物的延长释放(extended release)。

基质

具体实施方案包括在某种基质中参入PlGF2结构域的生物材料。术语基质指合成的三维结构，包括块、片或膜；它是相对于可溶性的或流体材料而言的术语。术语合成的指对患者而言非天然的，且对患者而言是外源的。所述基质，当在内部作为支架使用时，需要承担机械负荷，包含合适的降解动力学，并呈递生物活性分子。支架用作细胞载体的融合物以及药物递送装置，用于组织工程化。为模拟细胞的天然微环境以便于诱导组织修复和再生，可用ECM片段修饰合成材料。本申请中所描述的ECM片段可被设计成与转谷胺酰胺酶(TG)底物在N末端(由蛋白质α2纤溶酶抑制物(α2PI1–8,NQEQVSPL(SEQ ID NO:50))的残基1-8组成)形成分子融合物。因此，因子XIIIa用作转谷胺酰胺酶，以催化这一序列(NQEQVSPL)中的谷胺酰胺与不同生物材料中的赖氨酸之间的反应。所述的凝血酶，因子XIIIa，将使赖氨酸(Lys)游离的氨基基团共价连接到谷胺酰胺(Gln)的γ-氨甲酰基团，形成的键显示出对蛋白水解降解的高度抗性。例如，天然的血纤蛋白水凝胶通过这一机制交联，TG-PlGF2结构域可因此交联至所述凝胶内部(Schense and Hubbell,1999)。

关于将生物分子锚定于血纤蛋白基质的具体实施方案，所述生物分子可以是用于在组织修复中局部递送的重组蛋白质药物，包括细胞因子，因此，用于组织修复的优选的具体实施方案是包含血纤蛋白原或血纤蛋白的组织修复基质的药物制剂，以及PlGF2_123-144和包括表皮生长因子(EGF)、VEGF、PDGF、FGF、IGF、BMP、TGF-β和神经营养素家族和超家族的成员在内的重组的细胞因子的分子融合物。血纤蛋白基质可作为控制释放基质用于持续递送蛋白质药物和PlGF2结构域或PlGF2_123-144的分子融合物，以及蛋白质药物。

优选的具体实施方案是，包含PlGF2结构域或PlGF2_123-144和细胞因子VEGF-A的融合蛋白，指称VEGF-A指VEGF-A的任意同种型。

PlGF2_123-144可用于工程化血纤蛋白基质以用于局部免疫调节和免疫增强，包括接种疫苗。优选地具体实施方案是包含PlGF2_123-144和趋化因子的分子融合物，所关注的趋化因子包括INF-β、CXCL10、CXCL11和CCL21，或包括TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3在内的细胞因子。优选的具体实施方案是免疫调剂和免疫增强基质，所述基质包含血纤蛋白原或血纤蛋白，和PlGF2结构域或PlGF2_123-144与重组的趋化因子之间的分子融合物，所关注的趋化因子包括INF-β,CXCL10,CXCL11,和CCL21，或包括TGF-β1,TGF-β2或TGF-β3在内的细胞因子。PlGF2_123-144可用于在血纤蛋白中参入免疫危险信号胞外基质蛋白。PlGF2_123-144可用于在血纤蛋白中参入危险信号胞外基质蛋白，包括生腱蛋白C的血纤蛋白原-样球状结构域，其是一种免疫危险信号。优选的具体实施方案是PlGF2结构域和生腱蛋白C的血纤蛋白原-样球状结构域的分子融合物。

在免疫增强中的重要应用是接种疫苗。优选的具体实施方案是疫苗基质，其包含血纤蛋白原或血纤蛋白，以及PlGF2结构域和肽或蛋白质抗原的分子融合物。优选的具体实施方案是PlGF2结构域和肽或蛋白质抗原之间的分子融合物。进一步优选的具体实施方案是疫苗基质，其包含血纤蛋白原或血纤蛋白，PlGF2结构域和趋化因子之间的分子融合物，PLGF2和生腱蛋白C的血纤蛋白原-样球状结构域之间的分子融合物，以及PlGF2结构域和肽或蛋白质抗原之间的分子融合物。

血纤蛋白基质还提供黏附环境，在其中，细胞迁移、浸润以及侵入。可以对这一黏附环境进行调节是有用的，其可通过制备黏附肽或黏附蛋白质结构域的分子融合物进行，所述结构域如FN III9-10,以及在例如纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白以及生腱蛋白C中发现的相应的结构域。优选的具体实施方案是PlGF2_123-144和包括整合素-结合衍生自纤连蛋白的肽的黏附结构域(adhesion domains)的分子融合物；以及PlGF2_123-144和下述黏附结构域的分子融合物，所述黏附结构域包含氨基酸序列RGD、RGDS、RGDSP(SEQ ID NO:52)、KLDAPT(SEQ ID NO:51)、IDGIHEL(SEQ ID NO:49)、IDAPS(SEQ ID NO:48)、LDV和REDV；以及PlGF2_123-144和纤连蛋白黏附结构域FN III10、FN III9-10以及生腱蛋白的1^st-5^th FN III型重复，生腱蛋白C的3^th FN III型重复的分子融合物。

除黏附结构域外，可将细胞因子-结合结构域、趋化因子-结合结构域锚定于血纤蛋白基质内。这可利用PlGF2结构域和细胞因子-结合结构域和趋化因子-结合结构域(例如来自纤连蛋白、生腱蛋白C、玻连蛋白、层粘连蛋白和其他基质分子)的分子融合物来实现。优选的具体实施方案是PlGF2结构域和FN III12-14的分子融合物，PlGF2结构域和TNCIII1-5的分子融合物，PlGF2结构域和TNCIII 3-5的分子融合物，PlGF2结构域和TNCIII5的分子融合物。

将蛋白酶抑制剂锚定于血纤蛋白对在移植到体内或身体表面后延迟血纤蛋白的降解也是有价值的。这可利用PlGF2结构域和蛋白酶抑制剂(如抑肽酶)的分子融合物实现。优选的具体实施方案是PLGF2和抑肽酶的分子融合物。优选的具体实施方案是包含PlGF2结构域和抑肽酶的分子融合物的血纤蛋白制剂。

施用

药学上可接受的载体和赋形剂可用于递送本申请所描述的具体实施方案。赋形剂指用作稀释剂或治疗剂载体的惰性物质。通常，药学上可接受的载体与化合物一起使用使所述化合物用于治疗或作为产品。一般而言，对于任何物质，载体是与递送至动物的物质结合的材料。常规的药物载体，水性的，粉末状的或油性基质，增稠剂等可能是必需的或所期望的。在一些情况下，载体是递送所必需的，例如溶解不溶性化合物用于液体递送；缓冲液用于控制物质的pH值以保持其活性；或稀释剂防止物质于储存容器中损失。但在另外一些情况下，使用载体是为了方便，例如液体为了更方便地施用。可根据本领域技术人员所知的方法合成本申请中所描述化合物的药学上可接受的盐。药学上可接受的物质或组合物是高度纯化的以不含污染物，是无菌的，并且是生物相容性的。它们还可以包含适合施用于患者的载体、盐或赋形剂。对于水作为载体的情况，所述的水是经高度纯化并加工以不含污染物，如内毒素。

本申请所描述的化合物可与合适的药物稀释剂、赋形剂、补充剂或载体(本申请中称作药学上可接受的载体或载体)混合施用，考虑到预期的施用形式并根据常规的药物实践适当地选择。由此，可递送的化合物可制备成适合于经口、直肠、表面、静脉内注射、关节内注射、肠胃外施用、鼻内或气管内施用的形式。载体包括固体或液体，载体的类型根据所使用的施用类型选择。合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、流动-诱导剂以及消融剂(melting agents)可包括在载体范畴内，如对于丸剂。举例而言，活性成分可以与经口的、非毒性的、药学上可接受的惰性载体，如乳糖、明胶、琼脂、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露糖醇、山梨醇等结合。所述化合物可以口服的固体剂型，如胶囊、片剂和粉剂，或液体剂型，如酏剂、糖浆和悬浮液的形式施用。活性化合物也可以无菌的液体剂量用于形式肠胃外施用。也可以使用以达到生理pH或渗透性的缓冲液。

实施例

实施例1:PlGF2(PlGF2_123-144)内的短氨基酸序列强烈地结合ECM蛋白

在PlGF2(PlGF2_123-144)内发现了强烈且杂乱地结合ECM蛋白的结构域。通过ELISA测定GF与ECM蛋白的结合。超过0.1的信号(灰色框)被认为是代表特异性结合。PlGF2与被测试的全部ECM蛋白强烈结合(灰色柱)。剪接变体PlGF2和PlGF-1(其不结合)的蛋白序列比对图示说明PlGF2如何包含位于近C-末端的额外21个氨基酸插入(PlGF2_123-144,灰色)。测试了在与非-结合模型蛋白谷胱甘肽S-转移酶(GST)(GST-PlGF2_123-144)融合时，PlGF2_123-144对ECM蛋白的结合。混杂形式(crambled version)的PlGF2_123-144(GST-PlGF2_scr)不结合ECM蛋白。图1中示出实验数据。

实施例2:PlGF2的ECM结合结构域的优化

由实施例1可以得出结论，PlGF2_123-144包含ECM蛋白结合结构域。测试了多种PLGF2片段与多种ECM蛋白,硫酸类肝素，以及神经毡蛋白-1的结合，结果描述于图2中。

通过实验，可以去除对结合ECM蛋白并非至关重要的序列，对所述结构域进一步工程化。所述实验可以如下进行。在所述优化实验中，实施例1中的ELISA测定可以作为有用的读出(read-out)。融合蛋白可由，诸如在一个末端(例如C-末端)包含全长结构域PlGF2_123-144的GST的蛋白质制备，利用检测蛋白质GST的抗体通过ELISA检测,测定其与表面-结合血纤蛋白原的结合，建立通过全长结构域PlGF2_123-144诱导的结合的基础(baseline)。制备其他包含PlGF2_123-144结构域的融合蛋白，所述的PlGF2_123-144结构域已被从全长PlGF2_123-144的C-末端或N-末端修剪掉一个或以上的氨基酸残基。由此形成两个融合蛋白家族，一个从PlGF2_123-144的N-末端缩短，一个从PlGF2_123-144的C-末端缩短。测定与表面-结合ECM的结合，可以确定PlGF2_123-144长度(从任一末端)和对ECM蛋白的亲和力之间的结构-功能关系。可以类似地表征这一结构域中的氨基酸保守取代。

实施例3:包含PlGF2_123-144的ECM-结合细胞因子的设计和生产

通过聚合酶链式反应扩增编码人细胞因子(VEGF-A165,PDGF-BB和BMP-2)和PlGF2_123-144结构域的分子融合物(尤其是融合蛋白)的序列，并组装到哺乳动物表达载体pXLG中，以获得细胞因子-PlGF2_123-144(SEQ ID NO:s 7,9,11,12和13)。为避免由于PlGF2_123-144的包含物造成的蛋白质错误折叠事件，可去除PlGF2_123-144(Cys¹⁴²)中单一的半胱氨酸，或利用诸如丝氨酸(PlGF2_123-144*)对其进行取代。融合蛋白在HEK细胞中表达，并利用含500mMNaCl,20mM磷酸钠和10mM咪唑,pH 7.4的结合缓冲液，通过固定金属亲和层析纯化所述融合蛋白。利用Tris缓冲液(20mM Tris,150mM NaCl,pH 7.4)对所述蛋白质进行透析。包含PlGF2_123-144*的细胞因子的设计方案示例示于图3。

SEQ ID NO:6:人VEGF-A121

APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQECDKPRR

SEQ ID NO:7:人VEGF-A121-PlGF2_123-144

APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQERRRPKGRGKRRREKQRPTDCHLCDKPRR

指称(denotation)VEGF-A-PlGF2_123-144指SEQ ID NO:7以及其他含PlGF2_123-144结构域的VEGF-A融合物设计方案。

SEQ ID NO:8:人PDGF-BB

SLGSLTIAEPAMIAECKTRTEVFEISRRLIDRTNANFLVWPPCVEVQRCSGCCNNRNVQCRPTQVQLRPVQVRKIEIVRKKPIFKKATVTLEDHLACKCETVAAARPVT

SEQ ID NO:9:人PDGF-BB-PlGF2_123-144

SLGSLTIAEPAMIAECKTRTEVFEISRRLIDRTNANFLVWPPCVEVQRCSGCCNNRNVQCRPTQVQLRPVQVRKIEIVRKKPIFKKATVTLEDHLACKCETVAAARPVTRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

SEQ ID NO:10:人BMP-2

QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR

SEQ ID NO:11:人BMP-2-PlGF2_123-144

QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

SEQ ID NO:12:人PlGF2_123-144-BMP-2

RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHLSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR

SEQ ID NO:13:人BMP-2-PlGF2_123-144*

QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCRRRPKGRGKRRREKQRPTDSHL

实施例4:经PlGF2_123-144,或PlGF2_123-144*修饰的细胞因子展示对ECM组成成分增强的亲和力

检测了各种经PlGF2123-144(*)修饰的细胞因子对各种ECM蛋白和硫酸类肝素的结合，结果描述于图4中的子图a和b中。所确定的解离常数示于表1中，其示出通过ELIS测定的、对各种ECM蛋白和硫酸类肝素的细胞因子-PlGF2_123-144(*)亲和常数。所述解离常数(K_D)通过非线性回归利用A450nm＝Bmax*[浓度]/(K_D+[浓度])获得。观察到与野生型细胞因子相比，经PlGF2_123-144(*)(VEGF-A121-PlGF2_123-144，PDGF-BB-PlGF2_123-144,和BMP-2-PlGF2_123-144*)修饰的细胞因子对ECM蛋白和硫酸类肝素的亲和力提高很多(较低的K_D)。由此，通过PlGF2_123-144分别与VEGF-A165，PDGF-BB，和BMP-2的融合，PlGF2对ECM蛋白的亲和力被赋予到VEGF-A165，PDGF-BB，和BMP-2。

表1

实施例5:融合于PlGF2_123-144(*)的ECM-结合细胞因子或具有用PlGF2123-133(*)取代的细胞因子结构域的设计方案

利用聚合酶链式反应扩增出编码细胞因子和PlGF2_123-144(*)结构域的分子融合物(尤其是融合蛋白)的序列，并组装进哺乳动物表达载体pXLG,以获得细胞因子-PlGF2_123-144(*)或PlGF2_123-144(*)-细胞因子。PlGF2_123-144(*)和人源形式的IGF-I,TGF-β1,TGF-β2,BDNF及NT-3的融合蛋白设计方案示于SEQ ID NO:s 15,17,18,20,22和24中。也可以利用来自PlGF2_123-144(*)的较短的序列。SEQ ID NO:s 1-20被实际制备出来，示出的SEQ ID NO:Nos 21-24作为另外的具体实施方案的示例。

SEQ ID NO:14:人IGF-I:

GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA

SEQ ID NO:15:人IGF-I-PlGF2_123-144:

GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

SEQ ID NO:16:人TGF-β1:

ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS

SEQ ID NO:17:人TGF-β1-PlGF2_123-144:

ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCSRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

SEQ ID NO:18:人PlGF2_123-144*-TGF-β1:

RRRPKGRGKRRREKQRPTDSHLALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS

SEQ ID NO:19:人TGF-β2:

ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS

SEQ ID NO:20:人PlGF2_123-144*-TGF-β2

RRRPKGRGKRRREKQRPTDSHLALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS

SEQ ID NO:21:人BDNF

HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR

SEQ ID NO:22:人BDNF-PlGF2_123-144

HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

SEQ ID NO:23:人NT-3:

YAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRIDTSCVCALSRKIGRT

SEQ ID NO:24:人NT-3-PlGF2_123-144

YAEHKSHRGEYSVCDSESLWVTDKSSAIDIRGHQVTVLGEIKTGNSPVKQYFYETRCKEARPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTYVRALTSENNKLVGWRWIRIDTSCVCALSRKIGRTRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

实施例6:融合于PlGF2_123-144的细胞因子的活性

图5示出所示结果。在体外，PlGF2_123-144-融合的生长因子(GFs)显示与野生型GFs类似的生物活性。用VEGF-A121,VEGF-A165或VEGF-A-PlGF2_123-144刺激人ECs，用PDGF-BB或PDGF-BB-PlGF2_123-144刺激人间充质干细胞。通过ELISA定量磷酸化的GF受体(VEGFR-2和PDGFR-β)(n＝3,平均值±SEM)。PlGF2_123-144向VEGF-A和PDGF-BB中的插入不改变它们的信号传导。而且PlGF2_123-144插入到VEGF-A121中提高了其对VEGF-A165的活性水平。通过其促进人间充质干细胞(诱导成骨细胞分化)中的ALP活性的能力评估BMP-2-PlGF2_123-144*。对在BMP-2或BMP-2-PlGF2_123-144*存在下培养了14天后的细胞ALP进行定量。没有观察到用BMP-2或BMP-2-PlGF2_123-144*处理的细胞之间，细胞数量和ALP活性的差异。

实施例7:融合于PlGF2_123-144(*)的细胞因子在体内的保持

结果示于图6。创建出ECM超-亲和力细胞因子变体，其结合于ECM分子并被其保留在体内。例如对小鼠背部皮肤进行皮下注射，VEGF-A165迅速地从注射位点消失，3天后只有10％保留在组织中。相比之下，所注射的VEGF-A-PlGF2_123-144在3天后有约50％保留，6天后仍有10％以上可被检测到。此外，在填充有包含野生型或PlGF2_123-144-融合的细胞因子的血纤蛋白基质的小鼠背部或颅盖中，3-6天后在所述递送位点可检测到低量的野生型细胞因子，而PlGF2_123-144-融合的细胞因子显著地保留在所述损伤周围的组织中。

实施例8:利用包含融合于PlGF2_123-144的细胞因子的血纤蛋白基质治疗皮肤伤口

结果示于图7。通常在啮齿类且最经常在db/db糖尿病小鼠模型(Hanft JR等,2008；Robson MC等,1992；Robson MC等,1992；Robson MC等,2001)中进行细胞因子对慢性皮肤-伤口愈合的临床前评估，尽管尚不存在针对人慢性伤口的优化的疾病模型。然而，一般认为经遗传修饰的db/db小鼠代表糖尿病-损伤皮肤-伤口愈合的临床相关模型(Davidson JM,1998；Sullivan SR等,2004)。db/db小鼠模型中的成功直接开启了临床试验的途径(Hanft JR等,2008；Robson MC等,1992)。大致100-倍更低剂量的细胞因子(PDGF-BB和VEGF-A各200ng，组合)于血纤蛋白基质中递送一次，或仅表面施用3到4次，治疗全层背部-皮肤伤口。根据伤口闭合程度(以再-上皮形成指示)或肉芽组织量所指示的，与未经治疗的或仅用血纤蛋白-治疗的伤口相比，这些低剂量的野生型PDGF-BB和VEGF-A(在血纤蛋白中递送或表面施用)没有显著地增强伤口愈合。相比之下，无论是通过表面施用还是在血纤蛋白中递送，利用工程化的ECM超-亲和力PlGF2_123-144-融合的PDGF-BB和VEGF-A治疗伤口，导致显著加快的伤口闭合以及更多的肉芽组织。由于血管发生是维持新形成的肉芽组织的关键步骤(Gurtner GC等,2008),我们着重关注在所述治疗之间血管发生程度的差异。对CD31(由ECs高表达)和结蛋白(由稳定血管的平滑肌细胞(SMCs)表达)的免疫组织分析揭示出，在递送PlGF2_123-144-融合的GFs时肉芽组织中的血管发生更为明显。例如，已有报道称，对db/db小鼠连续5天表面施用20μg/伤口的VEGF-A165或10μg/伤口的PDGF-BB是有效的(Chan RK等,2006；Galiano RD等,2004)。

实施例9:用融合于PlGF2_123-144的VEGF-A诱导的血管渗透

结果示于图8。与相同剂量的野生型VEGF-A165(10μg)相比，VEGF-A-PlGF2_123-144诱导显著较少的血管渗透。血管渗透在小鼠耳部皮肤中进行测定。由VEGF-A诱导的渗透由红色-标记的葡聚糖从血管中泄露观察到。VEGF-A165与VEGF-A-PlGF2_123-144进行了比较。应用VEGF-A后对小鼠耳部皮肤的脉管系统图像进行分析。结果显示这一方法可解决将VEGF-A在临床上进行应用所引起的主要问题。事实上，虽然VEGF-A活化VEGF-受体2(VEGF-R2)是促进血管发生的强有力方式，已显示出实际施用VEGF-A时迅速诱导血管渗透，导致全身性低血压和浮肿；这一现象已属于外周和心-血管应用中的剂量限制性毒性反应(Simons M andWare JA,2003)，是再生医学中的严重问题。由于VEGF-A-PlGF2_123-144具有增强的结合内源ECM的能力，VEGF-A-PlGF2_123-144可能诱导较少的血管渗透。在葡聚糖从小鼠耳部皮肤血管中溢出的模型(Kilarski WW等,2013)中，尽管磷酸化的VEGFR-2显示出与VEGF-A165同等活性，施用10μg VEGF-A-PlGF2_123-144的泄露率仅为施用野生型VEGF-A165导致泄露的19±7％。由此，工程化VEGF-A以形成VEGF-A-PlGF2_123-144看起来使得血管发生(在皮肤伤口愈合模型中显示)与过渡-渗透去偶联有效地解决了VEGF-A应用于临床的主要问题。

实施例10:用包含融合于PlGF2_123-144的VEGF-A的血纤蛋白基质治疗骨损伤

结果示于图9。融合于PlGF2_123-144的细胞因子可用于工程化骨愈合微环境。由于细胞因子BMP-2和PDGF-BB有益于骨修复(Hollinger JO等,2008),对含低剂量组合的BMP-2(200ng)和PDGF-BB(200ng)的血纤蛋白基质用于骨修复进行了评估。解释人平移潜力(translational potential)的相关模型是骨骼成熟的大鼠中临界-大小的颅盖损伤，其是骨不连(nonunion)骨愈合的标准临床相关模型(Hollinger JO and Kleinschmidt JC,1990；Muschler GF,et al.)。对骨修复材料和诱导骨生成的蛋白质的临床前评估通常包括临界大小的骨损伤模型，如大鼠中临界-大小的颅盖损伤(Hollinger JO andKleinschmidt JC,1990)。BMP-2-PlGF2_123-144*和PDGF-BB-PlGF2_123-144(各200ng)的组合在血纤蛋白基质中递送,或在手术皮肤缝合前以某种更高的剂量(各1μg，组合)表面递送至硬脑膜。4周后，利用微机算断层显象(microCT)对骨愈合—以骨组织沉积和损伤覆盖表征—进行分析。与未经治疗或仅用血纤蛋白治疗相比，单独递送野生型GFs或在血纤蛋白中递送略微加速骨愈合。相比之下，与野生型GF相比，利用PlGF2_123-144-融合的GFs显著增加骨组织沉积。作为比较，1μg通常不足以治疗大鼠中6mm的颅盖损伤(Schmoekel HG等,2005)，而治疗人胫骨骨折需要毫克量的BMP-2(Gautschi OP等,2007)。

实施例11:工程化融合于PlGF2_123-144结构域的ECM蛋白的黏附结构域

FN III10和FN III9-10的分子融合物和PlGF2_123-144可用于将细胞黏附-促进结构域参入血纤蛋白基质。SEQ ID NO:25显示出利用，通过阅读本说明书本领域技术人员能够容易制备的FN III9-10的设计方案。

SEQ ID NO:25:人FN III9-10-PlGF2_123-144

GLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPPLIGQQSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

实施例12:利用PlGF2_123-144结构域工程化蛋白质药物以从血纤蛋白基质中持续释放

已知PTH1-34可用于调节系统骨量，已证明局部施用血纤蛋白-结合PTH1-34变体刺激局部骨形成(Arrighi I等,2009)。设计PTH1-34和PlGF2_123-144的融合蛋白，如SEQ IDNO:27所示；通过阅读本说明书本领域技术人员能够容易的制备该蛋白质。

SEQ ID NO:26:人PTH1–34

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF

SEQ ID NO:27:人PTH1–34-PlGF2_123-144

SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNFRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

实施例13:工程化融合于PlGF2_123-144的蛋白酶抑制剂

血纤蛋白长期在临床上用于止血和封闭，但是由于即使添加抑肽酶或其他蛋白酶抑制剂，其在体内相对快的再吸收还是限制了将其扩展应用到其他方面。可通过设计和应用抑肽酶和PlGF2_123-144的融合物来实现蛋白酶抑制剂抑肽酶在血纤蛋白基质中的保持。设计了该融合物，如SEQ ID NO:29所示；通过阅读本说明书本领域技术人员能够容易的制备该蛋白质。

SEQ ID NO:28:牛抑肽酶

RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA

SEQ ID NO:29:牛抑肽酶-PlGF2_123-144

RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGARRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

实施例14:工程化融合于PlGF2_123-144的趋化因子

血纤蛋白-结合趋化因子可用于免疫调节和免疫治疗，包括接种疫苗。设计了趋化因子CXCL10,CXCL11,IFN-γ以及CCL21和PlGF2_123-144的融合物，分别示于SEQ ID NO:31,33,35和37。过阅读本说明书本领域技术人员能够容易的制备这些蛋白质。

SEQ ID NO:30:人CXCL10

VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP

SEQ ID NO:31:人CXCL10-PlGF2_123-144

VPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSPRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

SEQ ID NO:32:人CXCL11-PlGF2_123-144

FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLKENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNF

SEQ ID NO:33:人CXCL11-PlGF2_123-144

FPMFKRGRCLCIGPGVKAVKVADIEKASIMYPSNNCDKIEVIITLKENKGQRCLNPKSKQARLIIKKVERKNFRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

SEQ ID NO:34:人IFN-γ

QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRG

SEQ ID NO:35:人IFN-γ-PlGF2_123-144

QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

SEQ ID NO:36:人CCL21

SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQKPAQGCRKDRGASKTGKKGKGSKGCKRTERSQTPKGP

SEQ ID NO:37:人CCL21-PlGF2_123-144

SDGGAQDCCLKYSQRKIPAKVVRSYRKQEPSLGCSIPAILFLPRKRSQAELCADPKELWVQQLMQHLDKTPSPQRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

实施例15:工程化融合于PlGF2_123-144的肽和蛋白质抗原

已鉴定出L-多巴色素互变异构酶，也称作酪氨酸酶-相关蛋白2(TRP-2)是人黑素瘤-相关抗原，由大多数黑素瘤以及人和小鼠中的正常黑色素细胞表达。已显示人TRP-2蛋白或肽-脉冲(pulsed)树突细胞诱导特异性的CD8+T细胞，表明自身-反应性TRP-2CD81T-细胞表位180–188(trp2)-特异性细胞可能逃避胸腺选择(Sierro SR等,2011)。PlGF2_123-144的血纤蛋白-结合亲和力可用于将抗原参入血纤蛋白基质中用作疫苗。设计了黑素瘤治疗中的癌症疫苗相关抗原，如SEQ ID NO:39中所示的包含来自TRP-2的特异性肽抗原，如SEQIDNO:41所示的包含整个TRP-2，两种设计中均融合了PlGF2_123-144。设计并描述这些示例以显示本领域技术人员如何能容易地采用这些方法来利用这些或其他抗原。

SEQ ID NO:38:人L-多巴色素互变异构酶180–188

SVYDFFVWL

SEQ ID NO:39:人PlGF2_123-144/纤溶酶切割位点，衍生自因子X/L-多巴色素互变异构酶180–188

RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHLITFRSVYDFFVWL

SEQ ID NO:40:人L-多巴色素互变异构酶

QFPRVCMTVDSLVNKECCPRLGAESANVCGSQQGRGQCTEVRADTRPWSGPYILRNQDDRELWPRKFFHRTCKCTGNFAGYNCGDCKFGWTGPNCERKKPPVIRQNIHSLSPQEREQFLGALDLAKKRVHPDYVITTQHWLGLLGPNGTQPQFANCSVYDFFVWLHYYSVRDTLLGPGRPYRAIDFSHQGPAFVTWHRYHLLCLERDLQRLIGNESFALPYWNFATGRNECDVCTDQLFGAARPDDPTLISRNSRFSSWETVCDSLDDYNHLVTLCNGTYEGLLRRNQMGRNSMKLPTLKDIRDCLSLQKFDNPPFFQNSTFSFRNALEGFDKADGTLDSQVMSLHNLVHSFLNGTNALPHSAANDPIFVVLHSFTDAIFDEWMKRFNPPADAWPQELAPIGHNRMYNMVPFFPPVTNEELFLTSDQLGYSYAIDLPVSVEETPGWPTTLLVVMGTLVALVGLFVLLAFLQYRRLRKGYTPLMETHLSSKRYTEEA

SEQ ID NO:41:人L-多巴色素互变异构酶-PlGF2_123-144

QFPRVCMTVDSLVNKECCPRLGAESANVCGSQQGRGQCTEVRADTRPWSGPYILRNQDDRELWPRKFFHRTCKCTGNFAGYNCGDCKFGWTGPNCERKKPPVIRQNIHSLSPQEREQFLGALDLAKKRVHPDYVITTQHWLGLLGPNGTQPQFANCSVYDFFVWLHYYSVRDTLLGPGRPYRAIDFSHQGPAFVTWHRYHLLCLERDLQRLIGNESFALPYWNFATGRNECDVCTDQLFGAARPDDPTLISRNSRFSSWETVCDSLDDYNHLVTLCNGTYEGLLRRNQMGRNSMKLPTLKDIRDCLSLQKFDNPPFFQNSTFSFRNALEGFDKADGTLDSQVMSLHNLVHSFLNGTNALPHSAANDPIFVVLHSFTDAIFDEWMKRFNPPADAWPQELAPIGHNRMYNMVPFFPPVTNEELFLTSDQLGYSYAIDLPVSVEETPGWPTTLLVVMGTLVALVGLFVLLAFLQYRRLRKGYTPLMETHLSSKRYTEEARRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

实施例16:工程化融合于PlGF2_123-144的Toll-样受体激动剂

具有参入的危险信号的疫苗提供信号以激活针对参入抗原的免疫应答。ECM蛋白片段TNC血纤蛋白球状结构域(也称作血纤蛋白原球形结构域)是此类危险信号。利用PlGF2_123-144对血纤蛋白的亲和力，可将所述危险信号结构域参入到血纤蛋白基质中。设计了TNC血纤蛋白球状结构域(SEQ ID NO:42)和PlGF2_123-144的融合蛋白，示于SEQ ID NO:43中。

SEQ ID NO:42:人TNC血纤蛋白原球状结构域

GLLYPFPKDCSQAMLNGDTTSGLYTIYLNGDKAQALEVFCDMTSDGGGWIVFLRRKNGRENFYQNWKAYAAGFGDRREEFLHWLGLDNLNKITAQGQYELRVDLRDHGETAFAVYDKFSVGDAKTRYKLKVEGYSGTAGDSMAYHNGRSFSTFDKDTDSAITNCALSYKGAFWYRNCHRVNLMGRYGDNNHSQGVNWFHWKGHEHSIQFAEMKLRPSNFRNLEGRRKRA

SEQ ID NO:43:人TNC血纤蛋白原球状结构域-PlGF2_123-144

GLLYPFPKDCSQAMLNGDTTSGLYTIYLNGDKAQALEVFCDMTSDGGGWIVFLRRKNGRENFYQNWKAYAAGFGDRREEFLHWLGLDNLNKITAQGQYELRVDLRDHGETAFAVYDKFSVGDAKTRYKLKVEGYSGTAGDSMAYHNGRSFSTFDKDTDSAITNCALSYKGAFWYRNCHRVNLMGRYGDNNHSQGVNWFHWKGHEHSIQFAEMKLRPSNFRNLEGRRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

实施例17:含PlGF2_123-144的细胞因子的组织保持

已显示将细胞因子FGF18注射到骨关节炎模型中的动物关节里可改善软骨修复(Moore EE等,2005)。从注射位点的清除限制了该方法的效力。通过FGF18和PlGF2_123-144的融合蛋白提供胞外基质-结合FGF18变体，设计示于SEQ ID NO:45。通过阅读本说明书本领域技术人员能够容易的制备该蛋白质，以及用于其他试剂或细胞因子的其他载体。

SEQ ID NO:44:人FGF18

EENVDFRIHVENQTRARDDVSRKQLRLYQLYSRTSGKHIQVLGRRISARGEDGDKYAQLLVETDTFGSQVRIKGKETEFYLCMNRKGKLVGKPDGTSKECVFIEKVLENNYTALMSAKYSGWYVGFTKKGRPRKGPKTRENQQDVHFMKRYPKGQPELQKPFKYTTVTKRSRRIRPTHPA

SEQ ID NO:45:人FGF18-PlGF2_123-144

EENVDFRIHVENQTRARDDVSRKQLRLYQLYSRTSGKHIQVLGRRISARGEDGDKYAQLLVETDTFGSQVRIKGKETEFYLCMNRKGKLVGKPDGTSKECVFIEKVLENNYTALMSAKYSGWYVGFTKKGRPRKGPKTRENQQDVHFMKRYPKGQPELQKPFKYTTVTKRSRRIRPTHPARRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL

可以制备其他FGF-18变体，其中，FGF-18内的天然结构域替换为PlFG-2结构域。假定的肝素结合结构域存在于FGF-18之内，即KRYPKGQPELQKPFKYTTVTKRSRRIR(SEQ ID NO:56),其关键结构域是KRSRRIR(SEQ ID NO:57)。由此一种替代实施是，用PlGF2结构域,例如SEQ ID NO:53替换KRSRRIR结构域。

SEQ ID NO:53:人FGF18-PlGF2_123-138

EENVDFRIHVENQTRARDDVSRKQLRLYQLYSRTSGKHIQVLGRRISARGEDGDKYAQLLVETDTFGSQVRIKGKETEFYLCMNRKGKLVGKPDGTSKECVFIEKVLENNYTALMSAKYSGWYVGFTKKGRPRKGPKTRENQQDVHFMKRYPKGQPELQKPFKYTTVTRRRPKGRGKRRREKQRPTHPA

另一种替代示例是利用PlGF2_119-144,即MKPERRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL(SEQ ID NO:55)在PlGF2结构域的N末端使其延伸，以与FGF-18内的氨基酸SEQ ID NO:54更加匹配。还存在其他可能的实施。

SEQ ID NO:54:人FGF18-PlGF2_121-138

EENVDFRIHVENQTRARDDVSRKQLRLYQLYSRTSGKHIQVLGRRISARGEDGDKYAQLLVETDTFGSQVRIKGKETEFYLCMNRKGKLVGKPDGTSKECVFIEKVLENNYTAL

MSAKYSGWYVGFTKKGRPRKGPKTRENQQDVHFMKPERRRPKGRGKRRREKQRPTHPA

对细胞因子TGF-β3限制真皮疤痕(例如术后切口疤痕)已有充分的研究。沿着所述切口线注射细胞因子(Ferguson MW等,2009)。从注射位点的清除限制了该方法的效力。通过TGF-β3和PlGF2_123-144*的融合蛋白提供胞外基质-结合TGF-β3变体,设计示于SEQ ID NO:47。通过阅读本说明书本领域技术人员能够容易的制备该蛋白质，以及用于其他试剂或细胞因子的其他载体。SEQ ID NO:46:人TGF-β3:

ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

SEQ ID NO:47:人PlGF2_123-144*-TGF-β3:

RRRPKGRGKRRREKQRPTDSHLALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS

其他公开内容

1.生物递送载体，其包含生物试剂和肽的分子融合物，所述的肽包含选自具有0-约15％保守取代的SEQ ID NO:4和具有0-约15％保守取代的SEQ ID NO:5的序列的、至少5个、或6个、或7个残基的序列或亚序列，所述的肽表现出特异性结合血纤蛋白原。2.1的载体，其中所述的肽表现出特异性结合血纤蛋白原,纤连蛋白,玻连蛋白,生腱蛋白C,骨桥蛋白,血纤蛋白,以及硫酸类肝素。3.1或2的载体，其中所述的肽以小于约24,约40,或约100nM的解离常数(Kd)特异性结合血纤蛋白原。4.1-3中任一项的载体，其中所述的生物试剂选自蛋白质，蛋白质药物，标记，免疫试剂，趋化因子，细胞因子，以及细胞粘附肽。5.1-4中任一项的载体，其中所述的分子融合物包含重组蛋白质，所述重组蛋白质包含所述生物制剂和所述的肽。6.1-4中任一项的载体，其中所述的分子融合物包含与所述试剂和所述肽共价连接的接头。7.6的载体，其中所述的接头包含聚合物，所述聚合物具有针对所述肽的N-末端或C-末端的第一共价键和针对所述生物试剂的第二共价键。8.1-4中任一项的载体，其中所述的分子融合物包含连接所述生物试剂和所述肽的颗粒。9.8的载体，其中所述的颗粒选自微颗粒，纳米颗粒，聚合物囊(Polymersome)，微团，以及脂质体。10.8的载体，其是可溶的或是生理溶液中的胶体，所述载体的所有组成成分的最大尺寸小于约500μm。11.8的载体，其中所述的颗粒包括多个参与针对所述的生物(试剂)和/或所述肽的共价键的胺(amines)和/或硫醇(thiols)。12.1-11任一项的载体，其中所述的生物试剂包含细胞因子，所述细胞因子选自表皮生长因子s(EGFs),VEGFs,VEGF-A,VEGF-C,PDGFs,PDGF-AB,PDGF-BB,FGFs,FGF-2,FGF-18,IGFs,IGF-1,BMPs,BMP-2,BMP-7,TGF-βs,TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,神经营养素,NT-3，以及BDNF。13.1-11任一项的载体，其中所述的生物试剂包含趋化因子，所述趋化因子选自干扰素,INF-β,CXCL趋化因子,CXCL10,CXCL11,CXCL12,CCL趋化因子，以及CCL21。14.1-11任一项的载体，其中所述的生物试剂包含免疫试剂。15.14的载体，其中所述的免疫试剂提供抗原。16.15的载体，其中所述的抗原至少是酪氨酸-相关蛋白2(TRP-2)的一部分。17.14的载体，其中所述的免疫试剂包含危险信号。18.17的载体，其中所述的危险信号包含生腱蛋白的球状结构域或纤连蛋白的EDA结构域。19.1-11任一项的载体，其中所述的生物试剂包含细胞粘附肽。20.19的载体，其中所述的细胞粘附肽包含细胞表面受体的配体，所述细胞表面受体选自整合素和钙粘附蛋白。21.19的载体，其中所述的细胞粘附肽包含细胞黏着基序，所述细胞黏着基序选自纤连蛋白细胞黏附结构域，玻连蛋白细胞黏附结构域，层粘连蛋白细胞黏附结构域，生腱蛋白细胞黏附结构域，纤连蛋白FN III10结构域，纤连蛋白FNIII9-10结构域，取自纤连蛋白III型重复1-5的一个或以上的生腱蛋白结构域，生腱蛋白C的3^rd FN III型重复，生腱蛋白的FN III9-10结构域，RGD，RGDS，RGDSP，KLDAPT，IDGIHEL，IDAPS，LDV，以及REDV。22.1-11任一项的载体，其中所述的生物试剂包含蛋白酶抑制剂。

23.生物分子，其包含经衍生以包含PlGF2结构域的细胞因子。24.23的生物分子，其中所述细胞因子的内源胞外基质结合结构域已被去除或被失能。25.23或24的生物分子，其中经衍生的细胞因子特异性结合胞外基质分子，所述胞外基质分子选自血纤蛋白原,纤连蛋白,玻连蛋白,生腱蛋白C,骨桥蛋白以及血纤蛋白。26.25的生物分子，其中所述的经衍生的细胞因子与所述胞外基质分子结合的解离常数低于非经衍生的细胞因子与相同胞外基质分子结合的解离常数的50％。27.23-26任一项的生物分子，其中所述的细胞因子选自表皮生长因子(EGFs),VEGFs,VEGF-A,VEGF-C,PDGFs,PDGF-AB,PDGF-BB,the FGFs,FGF-2,FGF-18,IGFs,IGF-1,BMPs,BMP-2,BMP-7,TGF-βs,TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,神经营养素,NT-3，以及BDNF。28.23-27任一项的生物分子，其中所述的生物分子是融合蛋白，或进一步包含生物试剂的分子融合物。

经分离的多肽，其包含选自具有0-约15％保守取代的SEQ ID NO:4和具有0-约15％保守取代的SEQ ID NO:5的序列的、至少6个(或至少5个，或至少7个，或至少8个)残基的序列或亚序列，所述的肽表现出特异性结合血纤蛋白原。29.28的多肽，其中所述的肽还表现出特异性结合纤连蛋白,玻连蛋白,生腱蛋白C,骨桥蛋白,以及血纤蛋白。30.28或29的多肽，其中所述的多肽与血纤蛋白原的特异性结合具有小于约25nM的解离常数(Kd)。31.28-30任一项的多肽，其中所述的序列选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5。32.融合蛋白，其包含28-31任一项的多肽。

33.生物材料，其包含基质，所述基质包含肽，所述的肽包含选自具有0-约15％保守取代的SEQ ID NO:4和具有0-约15％保守取代的SEQ ID NO:5的序列的至少6个残基的序列或亚序列，所述的肽表现出特异性结合所述基质。34.33的生物材料，其中所述肽与所述基质的特异性结合具有小于约100nM的解离常数(Kd)。35.33的生物材料，其中所述肽与所述基质的特异性结合具有小于约25nM的解离常数(Kd)。36.33-35任一项的生物材料，其中所述的肽特异性地结合于所述基质，并且可以结合生物分子。37.33或34的生物材料，其中所述的肽与所述基质之间无共价键。38.33-37任一项的生物材料，其包含特异性地结合所述肽的胞外基质结构域。39.38的生物材料，，其中所述的胞外基质结构域是生物分子的结构域，所述生物分子选自血纤蛋白原,纤连蛋白,玻连蛋白,生腱蛋白C,骨桥蛋白，以及血纤蛋白。40.33-39任一项的生物材料，其包含亲水聚合物,其中所述肽通过谷胺酰胺酶底物附着于所述基质，由转谷胺酰胺酶在所述底物和多肽之间形成键。41.40的生物材料的生物材料，其中所述的聚合物或所述肽包含转谷胺酰胺酶底物，所述底物包含NQEQVSPL(SEQ IDNO:50)。42.33-41任一项的生物材料，其还包含所述肽和生物试剂的分子融合物。43.42的生物材料，其中所述的生物试剂包含细胞因子，所述细胞因子选自表皮生长因子s(EGFs),VEGFs,VEGF-A,VEGF-C,PDGFs,PDGF-AB,PDGF-BB,FGFs,FGF-2,FGF-18,IGFs,IGF-1,BMPs,BMP-2,BMP-7,TGF-βs,TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,神经营养素,NT-3以及BDNF。44.42的生物材料，其中所述的生物试剂包含趋化因子，所述趋化因子选自干扰素,INF-γ,CXCL趋化因子,CXCL10,CXCL11,CXCL12,CCL趋化因子，以及CCL21。45.42的生物材料，其中所述的生物试剂包含免疫试剂。46.42的生物材料，其中所述的免疫试剂提供抗原。47.42的生物材料，其中所述的抗原是酪氨酸-相关蛋白2(TRP-2)的至少一部分。48.42的生物材料，其中所述的免疫试剂包含危险信号。49.48的生物材料，其中所述的危险信号包含生腱蛋白的球状结构域或纤连蛋白的EDA结构域。50.42的生物材料，其中所述的生物试剂包含细胞粘附肽。51.42的生物材料，其中所述的细胞粘附肽包含细胞表面受体的配体，所述细胞表面受体选自整合素,钙粘附蛋白。52.42的生物材料，其中所述的细胞粘附肽包含细胞黏着基序，所述细胞黏着基序选自纤连蛋白细胞黏附结构域，玻连蛋白细胞黏附结构域，层粘连蛋白细胞黏附结构域，生腱蛋白细胞黏附结构域，纤连蛋白FN III10结构域，纤连蛋白FN III9-10结构域，取自纤连蛋白III型重复1-5的一个或以上的生腱蛋白结构域，生腱蛋白C的3^rd FN III型重复，生腱蛋白的FN III9-10结构域，RGD,RGDS,RGDSP,KLDAPT,IDGIHEL,IDAPS,LDV以及REDV。53.42的生物材料，其中所述的生物试剂包含蛋白酶抑制剂。54.28-53任一项的生物材料，其中所述的生物试剂包含蛋白酶抑制剂。55.54的生物材料，其中所述的蛋白酶抑制剂包含抑肽酶，所述基质包含血纤蛋白。56.28-55任一项的生物材料，其还包含多个分子融合物,所述多个融合物中的每一个具有与所述肽中的至少一种相融合的不同生物试剂。57.56的生物材料，其包含2-10个分子融合物，各融合物的生物试剂是独立选择的。58.57的生物材料，其中所述的多个分子融合物具有独立选择的生物试剂，所述生物试剂选自表皮生长因子(EGFs),VEGFs,VEGF-A,VEGF-C,PDGFs,PDGF-AB,PDGF-BB,FGFs,FGF-2,FGF-18,IGFs,IGF-1,BMPs,BMP-2,BMP-7,TGF-βs,TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3，神经营养素,NT-3,BDNF,干扰素-β,干扰素,CXCL趋化因子,CXCL10,CXCL11,CXCL12,CCL趋化因子以及CCL21，球状结构域，纤连蛋白细胞黏附结构域，玻连蛋白细胞黏附结构域，层粘连蛋白细胞黏附结构域，生腱蛋白细胞黏附结构域，纤连蛋白FN III10结构域，纤连蛋白FN III9-10结构域，取自纤连蛋白III型重复1-5的一个或以上的生腱蛋白结构域，生腱蛋白C的3^rd FN III型重复，生腱蛋白的FN III9-10结构域，RGD,RGDS,RGDSP,KLDAPT,IDGIHEL,IDAPS,LDV,以及REDV。

59.药物，其包含1-22任一项的药学上可接受的载体，23-27任一项的生物分子，28-31任一项的多肽，32的融合蛋白质，或33-58任一项的生物材料。60.59的药物，用于治疗疾病症状、伤口愈合、骨愈合或接种疫苗。61.59的药物，其包含多个分子融合物,所述多个融合物中的各融合物具有与所述肽中的至少一种相融合的不同生物试剂。62.61的药物，其包含2-10个分子融合物，各融合物的生物试剂是独立选择的。63.利用药物治疗患者的方法，包含施用1-22任一项的药学上可接受的载体，23-27任一项的生物分子，28-31任一项的多肽，32的融合蛋白质，或33-58任一项的生物材料。64.利用药物治疗患者的方法，包括施用药学上可接受的、生物试剂和肽的分子融合物，或生物材料基质，其包含药学上可接受的、生物试剂和肽的分子融合物，该肽包含选自具有0-约15％保守取代的SEQ ID NO:4和具有0-约15％保守取代的SEQ ID NO:5的序列的至少6个残基的序列或亚序列。65.64的方法，其中所述的生物试剂提供抗原，所述患者通过施用所述分子融合物被接种疫苗。66.64的方法，其中所述的试剂包含危险信号，抗原与所述试剂结合施用。67.64的方法，其中所述的分子融合物能使得所述生物试剂由所述的施用位点延长释放。68.64的方法，其中所述的生物试剂包含细胞因子,施用位点选自瘘，伤口和溃疡。69.疫苗，其包含1-68任一项的具体实施方案。70.包含1-69任一项的具体实施方案的基质或系统，用于药物递送，接种疫苗，伤口愈合或骨愈合。71.核酸，其包含编码1-70任一项的肽或蛋白质的序列。

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Claims

1.生物递送载体，其包含

肽和包含第一肝素结合结构域的生物试剂的分子融合物，

其中所述的肽包含第二肝素结合结构域，所述第二肝素结合结构域是由以下序列组成的肽：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、或从SEQ ID NO:4的N端和/或C端截去仅7个残基的SEQ ID NO:4的亚序列，所述的肽表现出特异性结合血纤蛋白原。

2.权利要求1的载体，其中所述的肽表现出特异性结合血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白、血纤蛋白、以及硫酸类肝素。

3.权利要求1或2的载体，其中所述的肽以小于40nM的解离常数(K_D)特异性结合血纤蛋白原。

4.权利要求1的载体，其中所述的生物试剂是蛋白质、标记、或免疫试剂。

5.权利要求1的载体，其中所述的分子融合物包含重组蛋白质，所述重组蛋白质包含所述生物试剂和所述的肽。

6.权利要求1的载体，其中所述的生物试剂具有提供所述第一肝素结合结构域的内源肝素结合结构域，且包含细胞因子，所述细胞因子是表皮生长因子(EGFs)、VEGF、VEGF-A、PDGF、PDGF-AB、PDGF-BB、FGF、FGF-2、FGF-18、BMP、BMP-2、BMP-7、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、NT-3，或BDNF，或者其中所述生物试剂包含CXCL12或CCL21的趋化因子。

7.权利要求1的载体，其包含免疫试剂或细胞粘附肽。

8.权利要求4的载体，其中所述蛋白质是蛋白质药物、细胞因子、或细胞粘附肽。

9.权利要求8的载体，其中所述细胞因子是趋化因子。

10.生物分子，其包含包含第一肝素结合结构域的细胞因子和包含第二肝素结合结构域的PlGF2结构域，所述第二肝素结合结构域是由以下序列组成的肽：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、或从SEQ IDNO:4的N端和/或C端截去仅7个残基的SEQ ID NO:4的亚序列。

11.权利要求10的生物分子，其中所述的细胞因子的内源肝素结合结构域已被去除。

12.权利要求10的生物分子，其中所述的细胞因子的内源肝素结合结构域已被失能。

13.权利要求10或11的生物分子，其中所述细胞因子特异性结合胞外基质分子，所述胞外基质分子是血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白或血纤蛋白。

14.权利要求13的生物分子，其中所述生物分子细胞因子与所述血纤蛋白原结合的解离常数低于非经衍生的细胞因子与血纤蛋白原结合的解离常数的50％。

15.权利要求10的生物分子，其中所述的细胞因子是表皮生长因子(EGFs)、VEGF、VEGF-A、PDGF、PDGF-AB、PDGF-BB、FGF、FGF-2、FGF-18、BMP、BMP-2、BMP-7、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、NT-3、或BDNF。

16.权利要求10的生物分子，其中所述的生物分子是融合蛋白，或进一步包含生物试剂的分子融合物。

17.分离的多肽，其由以下序列组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、或从SEQ ID NO:4的N端和/或C端截去仅7个残基的SEQ ID NO:4的亚序列，所述的肽表现出特异性结合血纤蛋白原，条件是所述多肽不天然存在。

18.生物材料，其包含基质，所述生物材料还包含

肽，所述肽特异性结合所述基质并且包含以下序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、或从SEQ ID NO:4的N端和/或C端截去仅7个残基的SEQ ID NO:4的亚序列。

19.权利要求18的生物材料，其中所述基质包含特异性地结合所述肽的胞外基质结构域。

20.权利要求18或19的生物材料，其还包含所述的肽和生物试剂的分子融合物。

21.权利要求20的生物材料，其中所述的生物试剂包含细胞因子，所述细胞因子是表皮生长因子(EGFs)、VEGF、VEGF-A、VEGF-C、PDGF、PDGF-AB、PDGF-BB、FGF、FGF-2、FGF-18、IGF、IGF-1、BMP、BMP-2、BMP-7、TGF-β、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、神经营养素、NT-3，或BDNF，或者趋化因子，所述趋化因子是干扰素、INF-γ、CXCL趋化因子、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCL趋化因子、或CCL21。

22.权利要求20的生物材料，其中所述的生物试剂包含免疫试剂或细胞粘附肽。

23.权利要求20的生物材料，其还包含多个分子融合物，所述多个融合物中的各融合物具有与所述肽中的至少一种相融合的不同生物试剂。

24.药物，其包含权利要求1-9任一项的生物递送载体、权利要求10-16任一项的生物分子、权利要求17的多肽、或权利要求18-23任一项的生物材料。

25.疫苗，其包含权利要求1-9任一项的生物递送载体、权利要求10-16任一项的生物分子、权利要求17的分离的多肽、权利要求18-23任一项的生物材料或权利要求24的药物。

26.包含权利要求1-9任一项的生物递送载体、权利要求10-16任一项的生物分子、权利要求17的分离的多肽、权利要求18-23任一项的生物材料或权利要求24的药物的基质或系统，用于药物递送、接种疫苗、伤口愈合或骨愈合。

27.权利要求19的生物材料，其中所述胞外基质结构域是生物分子的结构域，所述生物分子是血纤蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白C、骨桥蛋白或血纤蛋白。

28.权利要求18的生物材料，其中所述基质是天然的或合成的。

29.权利要求18的生物材料，其中所述基质包含血纤蛋白或血纤蛋白原。