JP2015527307A - 胎盤成長因子からの配列を含有するコンジュゲートならびに生体材料および医薬の成分としてのその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明の実施形態、例としてPlGF2の特異的結合ドメインを有する分子および材料を作製するための材料および方法が記載される。実施形態は、例えば医薬品、生体材料、生体分子、分子融合物およびワクチンを含む。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、本明細書における参照により本明細書に援用される2012年7月3日に出願された米国特許出願第61/667,630号明細書の優先権を主張する。
本出願は、本明細書における参照により本明細書に援用される2012年7月3日に出願された米国特許出願第61/667,630号明細書の優先権を主張する。
技術分野は、一般に、細胞外マトリックスに特異的結合相互作用を介して結合するペプチドに関する。
細胞外マトリックス(ECM)は、組織に構造的支持を、および細胞にシグナリング能を提供する。ECMは、発生および組織修復における重要な役割を担う。
本明細書に報告されるとおり、胎盤成長因子(PlGF)がECMに対する特異的結合活性を示すことが発見された。PlGFは、複数のスプライスバリアントで存在する血管新生サイトカインである。PlGFは、元々は胎盤中で同定され、そこで栄養膜成長および分化を制御することが提案されている。PlGFは、初期胚発生の間に発現される。PlGFは、絨毛栄養膜中で発現される一方、血管内皮成長因子(VEGF)は、絨毛膜板内の間葉起源の細胞中で発現されることが示されている。PlGFは、いくつかの他の器官、例として心臓、肺、甲状腺、骨格筋および脂肪組織中で発現される。PlGFは、単球によるVEGF分泌の強力な刺激因子として作用し、健常対象の末梢血単核細胞中の炎症促進性ケモカインのインターロイキン−1ベータ、インターロイキン−8、単球走化性タンパク質−1およびVEGFのmRNAレベルを顕著に増加させる。PlGFは、循環造血前駆細胞およびマクロファージを成長腫瘍の部位に動員することにより腫瘍血管新生を誘導する(Ribatti D,2008)。
一実施形態は、0から5つの保存的置換を有する配列番号4、0から5つの保存的置換を有する配列番号5およびそれらの部分配列からなる群から選択される配列を含む単離されたポリペプチドである。前記部分配列は、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチンおよびフィブリンの1つ以上への特異的結合を示すものを選択することができる。解離定数を規定することができ、例えばポリペプチドのフィブリノーゲンへの特異的結合は、約100nM未満または約40nM未満または約25nM未満の解離定数(KD)を有する。
一実施形態は、生物学的薬剤と、0から約15%の保存的置換を有する配列番号4および0から約15%の保存的置換を有する配列番号5からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも6残基の部分配列を含むペプチドとの分子融合物を含む生物学的送達媒体である。本明細書においてより詳細に説明されるとおり、ペプチドは、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチン、フィブリン、コラーゲン、コラーゲンIおよびヘパリン硫酸からなる群から選択される細胞外マトリックス分子の1つ以上または全てへの特異的結合を示す。実際、試験されたペプチドは、前記細胞外マトリックス分子の全てへの特異的結合を示した。生物学的薬剤の例は、タンパク質、タンパク質薬物、マーカー、免疫剤、ケモカイン、サイトカインおよび細胞接着ペプチドからなる群から選択されるものである。本明細書において使用されるサイトカインという用語は、成長因子およびモルフォゲンを含む。
一実施形態は、マトリックスを含み、マトリックスが、0から5つの保存的置換を有する配列番号4、0から5つの保存的置換を有する配列番号5およびそれらの全ての部分配列からなる群から選択される配列を含むポリペプチドを含み、前記ペプチドが、細胞外マトリックス分子への特異的結合を示す生体材料である。マトリックスは、天然でも合成でもよく、共有結合により架橋していても、共有結合を有さずに架橋していても、架橋していなくてもよい。
一実施形態は、PlGF2、例えばPlGF2のドメインを含むペプチド、媒体または生体材料を含む医薬品である。医薬品は、例えば医療的治療において、医療組成物を例えばワクチンとして作製するため、薬物送達、創傷治癒および組織治癒、例えば骨、瘻孔または潰瘍の治癒のために使用することができる。
詳細な説明
本明細書に報告されるとおり、胎盤成長因子(PlGF)がECMに対する特異的結合活性を示すことが発見された。本発明の態様は、PlGFポリペプチド、生物学的薬剤の送達のためのPlGFの分子融合物、PlGFを取り込む生体材料および薬物送達を含む。PlGFポリペプチドは、例えばPlGFの1つ以上のドメインまたは断片を含み得、またはそれに限定することができる。
本明細書に報告されるとおり、胎盤成長因子(PlGF)がECMに対する特異的結合活性を示すことが発見された。本発明の態様は、PlGFポリペプチド、生物学的薬剤の送達のためのPlGFの分子融合物、PlGFを取り込む生体材料および薬物送達を含む。PlGFポリペプチドは、例えばPlGFの1つ以上のドメインまたは断片を含み得、またはそれに限定することができる。
フィブロネクチン
フィブロネクチン(FN)は、複数の細胞型により広く発現され、脊椎動物における多くのECM依存性(Krammer A,et al.,2002)プロセスにおいて、細胞接着、遊走、成長および分化における重要な役割を担うことにより決定的に重要である(Mao Y and Schwarzbauer JE,2005;Pankov R and Yamada KM,2002)。FNは、C末端近傍でジスルフィド結合のペアにより共有結合している2つのほぼ同一の230〜270kDaサブユニットから構成される二量体糖タンパク質である。それぞれのサブユニットは、繰り返しモジュールの3つの型、I、IIおよびIII型からなる。これらのモジュールは、他のECM成分との、細胞表面受容体との、およびFNそれ自体との相互作用を媒介する機能ドメインを含む。FNは、12のI型リピート、2つのII型リピートおよび15〜18のIII型リピートを含有する。FNは、2つの形態、可溶性血漿FN(血漿の豊富な可溶性構成要素[300μg/mL])および低可溶性細胞FNに下位分類することができる。血漿FNは造血細胞により分泌され、血液中で濃縮される一方、細胞FNは線維芽細胞および多くの他の細胞型により分泌され、細胞表面において線維状マトリックス中に取り込まれる。細胞FNは、発生および組織特異的にECMの組成を正確に変える機序を細胞に提供する異なる細胞接着、リガンド結合および溶解度特性を有するFNを産生する細胞型特異的スプライシングパターンから生じるかなり大きく、より不均一なFNアイソフォーム群からなる。
フィブロネクチン(FN)は、複数の細胞型により広く発現され、脊椎動物における多くのECM依存性(Krammer A,et al.,2002)プロセスにおいて、細胞接着、遊走、成長および分化における重要な役割を担うことにより決定的に重要である(Mao Y and Schwarzbauer JE,2005;Pankov R and Yamada KM,2002)。FNは、C末端近傍でジスルフィド結合のペアにより共有結合している2つのほぼ同一の230〜270kDaサブユニットから構成される二量体糖タンパク質である。それぞれのサブユニットは、繰り返しモジュールの3つの型、I、IIおよびIII型からなる。これらのモジュールは、他のECM成分との、細胞表面受容体との、およびFNそれ自体との相互作用を媒介する機能ドメインを含む。FNは、12のI型リピート、2つのII型リピートおよび15〜18のIII型リピートを含有する。FNは、2つの形態、可溶性血漿FN(血漿の豊富な可溶性構成要素[300μg/mL])および低可溶性細胞FNに下位分類することができる。血漿FNは造血細胞により分泌され、血液中で濃縮される一方、細胞FNは線維芽細胞および多くの他の細胞型により分泌され、細胞表面において線維状マトリックス中に取り込まれる。細胞FNは、発生および組織特異的にECMの組成を正確に変える機序を細胞に提供する異なる細胞接着、リガンド結合および溶解度特性を有するFNを産生する細胞型特異的スプライシングパターンから生じるかなり大きく、より不均一なFNアイソフォーム群からなる。
FNは、インテグリン受容体ファミリーのいくつかのメンバーについてのリガンドである。最も十分に研究された認識配列トリペプチドRGDは、10番目のIII型リピート(FN III10)中に位置する。この単純なトリペプチド配列の認識は複雑であり、フランキング残基、その三次元提示およびインテグリン結合ポケットの個々の特性に依存する。例えば、9番目のIII型リピート(FN III9)中の2番目の部位、ペンタペプチドPHSRN(配列番号50)を含む「相乗作用部位」(Mardon HJ and Grant KE,1994)は、α5サブユニットとの相互作用を介してFNへのおよびFN III9−10中での特異的α5β1インテグリン結合を促進する(Mould AP,et al.,1997)一方、RGDへのαvβ3インテグリン結合は、相乗作用部位から独立している(Danen EH,et al.,1995)。インテグリンα5β1は、線維状マトリックス形成におけるFNの集合を媒介する初期受容体である(Mao Y and Schwarzbauer JE,2005;Pankov R and Yamada KM,2002)。
インテグリン結合に加え、FNはサイトカインにも結合する。FNの2番目のヘパリン結合ドメイン(FN III12−14)は、血小板由来成長因子および線維芽細胞成長因子ファミリーからのほとんどの成長因子(細胞成長を刺激し得るサイトカイン)ならびにトランスフォーミング成長因子ベータおよび神経栄養因子ファミリーからの一部の成長因子に結合する(Martino MM and Hubbell JA,2010)。
FN分子は単一遺伝子の産物であるが、生じるタンパク質は、ヒトFNにおける20ほど多くのバリアントを生成し得る単一プレmRNAの択一的スプライシングから生じる複数の形態で存在し得る。主要な類型のスプライシングは、III型リピートの中央の組(FN III7からFN III15)内で生じる。エキソン使用またはスキッピングは、2つのIII型リピート−EDB(EIIIBまたはEDIIとも称され、FNリピートIII7およびIII8間に位置する)およびEDA(EIIIAまたはEDIとも称され、FNリピートIII11およびIII12間に位置する)のいずれかの包含または排除をもたらす。択一的にスプライシングされたEDAおよびEDBドメインは、大抵、血漿FNに不存在である。α4β1およびα9β1の、択一的にスプライシングされたEDAセグメント内に位置するEDGIHEL配列(配列番号51)への結合が報告されており、このことは、増加したEDA含有FN種について考えられる接着機能を示唆する。FN EDAは、サブユニットワクチンのためのプラットフォームとして調査されてきた。FN EDAがToll様受容体4(TLR4)に結合し、それを活性化させる観察に基づき、ある研究グループは、FN EDAをサブユニットワクチン中のアジュバントDAMPとして使用し、融合タンパク質FN III EDA−抗原を生成して調査した(Lasarte JJ,et al.,2007)。EDAとC末端におけるオボアルブミンに由来するMHCIエピトープSIINFEKLとを含有する融合タンパク質およびEDAと完全オボアルブミンとを含有する融合タンパク質は、DCによるオボアルブミン提示を改善し、インビボで細胞傷害応答を誘導した。これらのEDA組換えタンパク質は、オボアルブミンを発現する腫瘍細胞によるチャレンジからマウスを保護することが示された。組換えサブユニットワクチン中のFN EDAの有用な効果にかかわらず、FN EDAのアジュバンシー(adjuvancy)はマウスにおけるウイルスチャレンジモデルにおける保護を付与するために適切でなかった(Mansilla C,et al.,2009)。実際、別のアジュバント、ポリ(I:C)および抗CD40との組合せが、肝炎ウイルスRNAの肝臓内発現を下方制御するために必要とされた。したがって、FN EDAはワクチン学の分野のための効力が不十分であることが見出されている。
テネイシンC
テネイシンC(TNC)は、発生の間に存在し、組織リモデリング、例えば創傷治癒(Trebaul A,et al.,2007)、癌(Orend G,2005)および炎症(Udalova IA,et al.,2011)の場合に成人期において再発現される、大型多機能細胞外マトリックス糖タンパク質である。発生の間、テネイシンCは、神経および血管ネットワークならびに骨格のパターニングにおける高度に制限された動的役割を担う。これは、細胞との直接的な相互作用を介して、または他の細胞外マトリックス分子、例えばフィブロネクチンへの結合を介して間接的に細胞接着、増殖および遊走に影響を与えることが示されている(Jones FS and Jones PL,2000)。
テネイシンC(TNC)は、発生の間に存在し、組織リモデリング、例えば創傷治癒(Trebaul A,et al.,2007)、癌(Orend G,2005)および炎症(Udalova IA,et al.,2011)の場合に成人期において再発現される、大型多機能細胞外マトリックス糖タンパク質である。発生の間、テネイシンCは、神経および血管ネットワークならびに骨格のパターニングにおける高度に制限された動的役割を担う。これは、細胞との直接的な相互作用を介して、または他の細胞外マトリックス分子、例えばフィブロネクチンへの結合を介して間接的に細胞接着、増殖および遊走に影響を与えることが示されている(Jones FS and Jones PL,2000)。
健常成体生物において、テネイシンCは、厳密に制御され、急速で一過的な様式で産生され、組織修復、例えば創傷治癒および神経再生(Joester A and Faissner A,2001)が必要であり、感染の消散(Udalova IA,et al.,2011)が必要な特異的な位置に含有される。しかしながら、制御不能なテネイシンC産生の場合、この分子は、異常な組織成長、例えば癌、経皮的冠動脈血管形成術(Imanaka−Yoshida K,et al.,2001)およびステント移植後の再狭窄、線維症、慢性創傷、心血管疾患(Golledge J,et al.,2011)ならびに自己免疫疾患(Udalova IA,et al.,2011)をもたらす病的状態となる。近年、テネイシンCは、心臓および動脈損傷、腫瘍血管新生および転移(O’Connell JT,et al.,2011;Oskarsson T,et al.,2011)ならびに幹細胞挙動の調節(Midwood KS,et al.,2011)と関連づけられている。癌転移の場合、転移を担う癌細胞がテネイシンCを産生し、このテネイシンC産生の阻害が転移の低減をもたらすことが示されている(Oskarsson T,et al.,2011)。したがって、テネイシンは、特にこの巨大分子における特定の機能を限られた規定の領域に定義および局限することができる場合、診断および治療的治療の開発における重要な標的であり得る。
ヒトテネイシンCは、4つの主要ドメインを含有するジスルフィド結合ヘキサブランチオン(hexabranchion)である:第1に、N末端におけるアセンブリドメインが、ヘキサマー形成を媒介するコイルドコイル構造および鎖間ジスルフィド結合を形成する。第2に、30から50アミノ酸長であり、6つのシステインをそれぞれ含有する一連の14.5の上皮成長因子様リピートが、抗接着特性を得ることが示されている。第3に、約90アミノ酸長であり、逆行性ベータストランドの2つのシートを形成する一連の15のフィブロネクチンIII型リピートが、いくつかのインテグリン結合領域を含有する(Jones FS and Jones PL,2000)。第4に、フィブリノーゲン様球状ドメインが、C末端に位置する(Midwood KS,et al.,2011;Udalova IA,et al.,2011)。このフィブリノーゲン様球状ドメインは、TLR4をアゴナイズすることが示されている(Midwood K,et al.,2009)。したがって、このドメインは、身体に対する危険のシグナルであり、免疫学的反応を開始させる。
テネイシンのフィブロネクチンIII型ドメイン領域は、TNC源に応じた択一的にスプライシングに起因する大きい変動性を示している(Jones FS and Jones PL,2000)。TNCのフィブロネクチンIII型ドメインの数字(x−y)は、この報告においてTNC IIIx−yとして定義される。ドメインTNC III3(Peng Q,et al.,2009)は、RGDペプチドおよび複数のインテグリン結合ドメイン(例えば:αvβ3、α9β1、α3β6、α8β1(Yokosaki Y,et al.,1998),αxβ1、α8β1))を含有する(多種多様の細胞型(例えば:平滑筋細胞、内皮細胞、神経細胞、星状細胞、神経膠腫)について)(Jones FS and Jones PL、2000)。ドメインTNC III5は、ヘパリンに結合することが実証されている(Weber P,et al.,1995)。本明細書に報告されるとおり、ドメインTNC III5およびTNC III5ドメインを含むより長いドメイン、例えばTNC III1−5およびTNC III3−5はケモカインに結合することが示された。
フィブリノーゲンおよびフィブリン
フィブリノーゲンは、肝臓により合成される可溶性血漿糖タンパク質であり、血液凝固の間の前駆タンパク質である。タンパク質分解酵素トロンビン、第II凝固因子は、凝固の間にフィブリノペプチドをフィブリノーゲンの中央ドメインから開裂させることによりフィブリノーゲンをフィブリンに重合し、物理化学的な自己集合または分子の重合を防止する(Weisel JW,2007)。続いて、フィブリンは、第XIIIa因子により化学架橋され、粘弾性血餅の一次構造タンパク質を形成し(Mosesson MW,2005)、主として自然組織修復において形成される特殊化した一時的なタンパク質ネットワークとして機能する。フィブリンの安定性は、止血系の分子/細胞成分とのその相互作用に依存する(Hantgan RR,et al.,1994)。フィブリンのそれ自体への架橋に加え、第XIIIa因子は、他の接着タンパク質を血餅に架橋する。フィブリンは、いくつかの細胞接着受容体、例えばインテグリンに結合し得、血小板および白血球、例えば単球および好中球の接着を特に促進する(Flick MJ,et al.,2004;Ugarova TP and Yakubenko VP,2001)。
フィブリノーゲンは、肝臓により合成される可溶性血漿糖タンパク質であり、血液凝固の間の前駆タンパク質である。タンパク質分解酵素トロンビン、第II凝固因子は、凝固の間にフィブリノペプチドをフィブリノーゲンの中央ドメインから開裂させることによりフィブリノーゲンをフィブリンに重合し、物理化学的な自己集合または分子の重合を防止する(Weisel JW,2007)。続いて、フィブリンは、第XIIIa因子により化学架橋され、粘弾性血餅の一次構造タンパク質を形成し(Mosesson MW,2005)、主として自然組織修復において形成される特殊化した一時的なタンパク質ネットワークとして機能する。フィブリンの安定性は、止血系の分子/細胞成分とのその相互作用に依存する(Hantgan RR,et al.,1994)。フィブリンのそれ自体への架橋に加え、第XIIIa因子は、他の接着タンパク質を血餅に架橋する。フィブリンは、いくつかの細胞接着受容体、例えばインテグリンに結合し得、血小板および白血球、例えば単球および好中球の接着を特に促進する(Flick MJ,et al.,2004;Ugarova TP and Yakubenko VP,2001)。
フィブリンマトリックスは、出血を防止し、創傷治癒を促進するために使用される最初の生体材料の1つであった(Janmey PA,et al.,2009)。フィブリンは、自己資源から、およびクリオプレシピテートのプールヒト血漿から入手可能である。今日では、フィブリンは診療所において最も使用されるヒドロゲルの1つである。フィブリンマトリックスの複雑なフィブリル構造および架橋特徴は、その形成の細部により制御することができる(Lorand L and Graham RM,2003;Standeven KF,et al.,2007;Weisel JW,2004)。重要なことに、細胞遊走がタンパク質分解に依存性および非依存性の両方の機序を介して生じる線維状コラーゲンマトリックスとは対照的に、フィブリン中の細胞遊走は、ほぼもっぱら細胞関連タンパク質分解活性(本質的には、プラスミンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼからのもの(Mosesson MW,2005))に依存する。フィブリンの主な利点の1つは、いくつかのタンパク質、例えばフィブロネクチンおよびアルファ−2−プラスミン阻害剤が、トランスグルタミナーゼ第IIIa因子を介する共有結合架橋により凝固の間にフィブリンマトリックス中に天然に取り込まれることである(Mosesson MW,2005)。したがって、この天然反応を容易に利用してフィブリンを複数の細胞シグナリング分子により機能化することができる(Patterson J,et al.,2010;Schense JC and Hubbell JA,1999)。さらに、フィブリノーゲンは、線維芽細胞成長因子(FGF)−2、VEGF−A165およびインスリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP)−3との特異的相互作用を有することが公知である(Peng H,et al.,2004);Sahni A,et al.,1998;Sahni A,et al.,2006;Werner S and Grose R,2003)。
フィブリンは、有用なベースマトリックスであり、本明細書に記載のヘパリン結合ペプチドおよび分子融合物をそれとともに使用することができる。他の材料をエンジニアリングしてTGまたはトランスグルタミナーゼと相互作用する分子を含めてTG分子融合物を得ることもできる。米国特許第7241730号明細書、米国特許第6,331,422号明細書、米国特許第6,607,740号明細書、米国特許第6,723,344号明細書、米国特許出願公開第2007/0202178号明細書、米国特許出願公開第2007/0264227号明細書は、全ての目的のために本明細書における参照により本明細書に援用され;矛盾する場合は本明細書が優先する。
フィブリンマトリックスは、インビボでプロテアーゼにより分解に供され、プロテアーゼ阻害剤は、インビボでのその寿命を持続するためにフィブリノーゲン/フィブリンマトリックス中で配合されることが多い。このことにより、フィブリンマトリックスが組織接着剤および密封剤の用途において、ならびにティッシュエンジニアリングの用途においてより有用になる。1つのそのようなプロテアーゼ阻害剤は、アプロチニンである。アプロチニンのフィブリン結合形態が、アプロチニンを含む融合タンパク質内に第XIIIa因子基質を含めることによりエンジニアリングされている(Lorentz KM,et al.,2011)。
マトリックスは、薬物の徐放の目的に有用である。薬物は、マトリックス中で捕捉させることができ、マトリックスからゆっくりと拡散する。親和性は、薬物とマトリックスの成分との間でエンジニアリングすることができる。例えば、ヘパリンについての親和性を使用してフィブリンベースマトリックスからのヘパリン結合サイトカインの放出、ヘパリンについての結合部位のフィブリンマトリックス中への取り込みおよびその結合相互作用における中間体としてのヘパリンの利用が持続されている(Sakiyama SE,et al.,1999)。
組織修復および再生
損傷後、組織修復または再生は、細胞外微小環境および損傷部位に動員される細胞から生じる多数の細胞シグナリングイベントにより制御される細胞運命プロセスの時空座標の結果である(Gurtner GC,et al.,2008)。この弾性環境により提供される生体力学的背景(Discher DE,et al.,2009)内で、細胞は、特殊化接着受容体、例えばインテグリンなどが介在する細胞外マトリックス成分、例えばフィブロネクチンおよびラミニン(多数の中から)との受容体介在相互作用により接着する(Berrier AL and Yamada KM,2007)。これらの受容体は、細胞外マトリックスからのストレスを膜を介して細胞内の細胞骨格に動的および協調的に伝達する(Hinz B,2009)。接着受容体は、ストレスを伝達するよりもかなり多くのことを行うが;特に膜中の接着受容体のクラスター内で、生化学的シグナル伝達がキナーゼ活性化および他の機序を介して生じる(Berrier AL and Yamada KM,2007;Hinz B,2009)。接着タンパク質に加え、細胞外マトリックスは、細胞分裂および/または遊走および/または分化および/または多細胞形態形成のプロセスを制御する多数の形態調節分子、例としてモルフォゲン、サイトカインおよび成長因子も封鎖および提示する(Discher DE,et al.,2009;Schultz GS and Wysocki A,2009)。モルフォゲン、サイトカインおよび成長因子は、それらが細胞運命を変化させ、組織形態形成を直接誘導し得るため、強力な可溶性シグナリング分子である。モルフォゲンという用語は、主として、発生生物学において濃度依存的に細胞応答を誘導し得る特定の類型のシグナリング分子を説明するために使用される(Affolter M and Basler K,2007)一方、サイトカインおよびケモカイン(化学遊走を誘導する低分子サイトカイン)は、発生ならびに自然および適応免疫応答の両方の機能化に不可欠な調節タンパク質である(Rossi D and Zlotnik A,2000;Vilcek J and Feldmann M,2004)。定義により、成長因子は、他の細胞応答、例えば遊走および分化に加え、細胞成長を誘導し得る(Cross M and Dexter TM,1991)。成長因子は、モルフォゲンまたはサイトカインのいずれかであり得る。
損傷後、組織修復または再生は、細胞外微小環境および損傷部位に動員される細胞から生じる多数の細胞シグナリングイベントにより制御される細胞運命プロセスの時空座標の結果である(Gurtner GC,et al.,2008)。この弾性環境により提供される生体力学的背景(Discher DE,et al.,2009)内で、細胞は、特殊化接着受容体、例えばインテグリンなどが介在する細胞外マトリックス成分、例えばフィブロネクチンおよびラミニン(多数の中から)との受容体介在相互作用により接着する(Berrier AL and Yamada KM,2007)。これらの受容体は、細胞外マトリックスからのストレスを膜を介して細胞内の細胞骨格に動的および協調的に伝達する(Hinz B,2009)。接着受容体は、ストレスを伝達するよりもかなり多くのことを行うが;特に膜中の接着受容体のクラスター内で、生化学的シグナル伝達がキナーゼ活性化および他の機序を介して生じる(Berrier AL and Yamada KM,2007;Hinz B,2009)。接着タンパク質に加え、細胞外マトリックスは、細胞分裂および/または遊走および/または分化および/または多細胞形態形成のプロセスを制御する多数の形態調節分子、例としてモルフォゲン、サイトカインおよび成長因子も封鎖および提示する(Discher DE,et al.,2009;Schultz GS and Wysocki A,2009)。モルフォゲン、サイトカインおよび成長因子は、それらが細胞運命を変化させ、組織形態形成を直接誘導し得るため、強力な可溶性シグナリング分子である。モルフォゲンという用語は、主として、発生生物学において濃度依存的に細胞応答を誘導し得る特定の類型のシグナリング分子を説明するために使用される(Affolter M and Basler K,2007)一方、サイトカインおよびケモカイン(化学遊走を誘導する低分子サイトカイン)は、発生ならびに自然および適応免疫応答の両方の機能化に不可欠な調節タンパク質である(Rossi D and Zlotnik A,2000;Vilcek J and Feldmann M,2004)。定義により、成長因子は、他の細胞応答、例えば遊走および分化に加え、細胞成長を誘導し得る(Cross M and Dexter TM,1991)。成長因子は、モルフォゲンまたはサイトカインのいずれかであり得る。
例えば、組織形態形成に関与する重要なサイトカインとしては、血管内皮成長因子(VEGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、インスリン様成長因子(IGF)、骨形態形成タンパク質(BMP)、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF−β)および神経栄養因子(β−NGF、NT−3、BDNF)が挙げられる。多くのサイトカインは、細胞外マトリックス成分、例えばヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合し(Lindahl U and Li JP,2009)、酵素的プロセスまたは解離により放出されるまでそこに残留する。これらの因子は、放出される場合およびさらにはマトリックスに結合している場合も(Makarenkova HP,et al.,2009)、細胞表面受容体に結合し、主としてキナーゼ活性化を介してシグナリングをもたらす。したがって、細胞外マトリックスは、細胞決定プロセスを律するシグナリング分子の接着分子およびサイトカインの両方のリザーバーとして機能する。血管新生、多細胞形態形成および幹細胞分化は、細胞外マトリックスおよびサイトカインにより、特にそれらの共同シグナリングにより厳密に制御される細胞プロセスである。組織修復はこれらのプロセスにより駆動されるため、細胞外マトリックスの機能は、以下の重要な特性:接着分子の提示およびサイトカインの放出を模倣することを全体の目的とするティッシュエンジニアリングおよび再生医療における生体材料の設計を導く。
ワクチン学
上記のとおり、サイトカインは、組織形態形成における根本的な役割を担う。サイトカインは、様々な免疫細胞型の増殖、成熟および遊走を調節し、したがって様々な類型の抗原に対する適切な免疫応答を駆動させることにより免疫学における根本的な役割も担う。サイトカインTGF−βは、免疫学における特に重要なサイトカインである。
上記のとおり、サイトカインは、組織形態形成における根本的な役割を担う。サイトカインは、様々な免疫細胞型の増殖、成熟および遊走を調節し、したがって様々な類型の抗原に対する適切な免疫応答を駆動させることにより免疫学における根本的な役割も担う。サイトカインTGF−βは、免疫学における特に重要なサイトカインである。
ケモカインも、免疫学における根本的な役割を担う低分子タンパク質である。ケモカインのうち、インターフェロン−γ(IFN−γ)は、ウイルスおよび細菌抗原に対する自然および適応免疫ならびに腫瘍制御に重要な免疫調節ケモカインである。IFN−γは、主としてナチュラルキラー(NK)およびナチュラルキラーT細胞(NKT)により自然免疫応答の一部として、ならびにCD4およびCD8T細胞により適応免疫応答の間に発現される。IFN−γは、Th1およびTh2細胞間の平衡の調節において最も重要なケモカインであり:Th1細胞は、IFN−γを発現し、次いでそれがTh1分化およびTh2分化抑制を引き起こす。IFN−γに対する様々な細胞応答は、JAK/STAT1シグナリング経路を活性化させるヘテロ二量体受容体(IFNGR1およびIFNGR2)へのその結合により活性化される。この細胞内シグナリングの活性化は、複数の下流遺伝子、そのうちケモカインインターフェロンガンマ誘導タンパク質10(CXCL10)およびケモカイン(C−X−Xモチーフ)リガンド11(CXCL11)の発現をもたらす。これら2つのケモカインは、細胞表面上のCXCR3受容体に結合することによりそれらの効果を誘発し、それぞれ単球/マクロファージ、樹状細胞、NKおよびT細胞についての強力な化学誘引物質とみなされる。
ワクチン学において、抗原は、病原体または自己起源のペプチドまたはタンパク質ドメインまたは完全タンパク質である(Hubbell JA,et al.,2009)。感染性疾患におけるワクチン抗原は、関心対象の病原体中に見出されるタンパク質、例えばインフルエンザ抗原または結核抗原をベースとする。予防および治療ワクチンの両方において感染性疾患における標的化される抗原の数は、無数である。癌におけるワクチン抗原は、腫瘍細胞型中に見出されるタンパク質、例えば多くの腫瘍型中で高度に発現される抗原スルビビンまたはメラニン細胞中で発現される抗原TRP−2および黒色腫における癌ワクチン接種のための標的をベースとする。癌において標的化される抗原の数は、無数である。
PlGF2ドメインおよび抗原を含むワクチン、例えば本明細書に記載の媒体またはマトリックスを作製することができる。PlFG2は、天然組織またはマトリックス中のECMへの付着を提供する。ワクチン組成物は、PlGF2ドメインを含むマトリックス、分子融合物の一部であり得、またはPlGF2に加えて添加することができるアジュバント、危険シグナルおよび/またはケモカインを含み得る。
PlGF
PlGF2からのドメインを模倣するペプチドが、本明細書に記載される。サイトカインPlGFは、複数のアイソフォームで存在する。PlGF2は、ヒトにおける配列RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL(配列番号4)、マウスにおけるRRKTKGKRKRSRNSQTEEPHP(配列番号5)および他の哺乳動物種における関連配列のインサートを含有するPlGF−1の伸長アイソフォームである。本明細書において、このペプチドがフィブリノーゲンおよびフィブリンならびに細胞外マトリックスタンパク質のフィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンCに極めて強力に、ならびにコラーゲンIにより低い程度で結合する予測されない驚くべき発見が報告される。このドメインはPlGF2123−144と称される。PlGF2ドメインという用語は、このドメインおよび細胞外マトリックスについての特異的結合を実証するサブドメインを指すために使用される。PlGF2123−144とフィブリノーゲン/フィブリンとの間の強力な結合を使用してPlGF2123−144を含むタンパク質、例としてタンパク質薬物および抗原をフィブリンマトリックス中で結合させることができる。PlGF2123−144およびフィブリノーゲン/フィブリンおよび/または細胞外マトリックスタンパク質間の強力な結合を使用してフィブリンマトリックス中で投与され、損傷部位上もしくは部位内で投与され、または組織部位上もしくは部位内で投与されたPlGF2123−144を含むタンパク質の存在を持続することができる。PlGF2ドメインと細胞外マトリックスタンパク質との間の強力な結合を使用して組織または組織病変部位中に内因的に存在する細胞外マトリックスへの結合を介して組織中のPlGF2ドメインを含むタンパク質の保持を持続することができる。PlGF2123−144とフィブリノーゲン/フィブリンとの間の発見された親和性およびPlGF2123−144と細胞外マトリックス分子との間に存在する親和性は、多数の好ましい実施形態をもたらす。
PlGF2からのドメインを模倣するペプチドが、本明細書に記載される。サイトカインPlGFは、複数のアイソフォームで存在する。PlGF2は、ヒトにおける配列RRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL(配列番号4)、マウスにおけるRRKTKGKRKRSRNSQTEEPHP(配列番号5)および他の哺乳動物種における関連配列のインサートを含有するPlGF−1の伸長アイソフォームである。本明細書において、このペプチドがフィブリノーゲンおよびフィブリンならびに細胞外マトリックスタンパク質のフィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオポンチン、テネイシンCに極めて強力に、ならびにコラーゲンIにより低い程度で結合する予測されない驚くべき発見が報告される。このドメインはPlGF2123−144と称される。PlGF2ドメインという用語は、このドメインおよび細胞外マトリックスについての特異的結合を実証するサブドメインを指すために使用される。PlGF2123−144とフィブリノーゲン/フィブリンとの間の強力な結合を使用してPlGF2123−144を含むタンパク質、例としてタンパク質薬物および抗原をフィブリンマトリックス中で結合させることができる。PlGF2123−144およびフィブリノーゲン/フィブリンおよび/または細胞外マトリックスタンパク質間の強力な結合を使用してフィブリンマトリックス中で投与され、損傷部位上もしくは部位内で投与され、または組織部位上もしくは部位内で投与されたPlGF2123−144を含むタンパク質の存在を持続することができる。PlGF2ドメインと細胞外マトリックスタンパク質との間の強力な結合を使用して組織または組織病変部位中に内因的に存在する細胞外マトリックスへの結合を介して組織中のPlGF2ドメインを含むタンパク質の保持を持続することができる。PlGF2123−144とフィブリノーゲン/フィブリンとの間の発見された親和性およびPlGF2123−144と細胞外マトリックス分子との間に存在する親和性は、多数の好ましい実施形態をもたらす。
PlGF2またはPlGF2ドメインという用語は、配列番号4および5のペプチドおよびそれらの部分配列ならびにそれらの配列のバリエーションを含む。配列番号4および5は、PlGF2ドメインの実施形態である。PlGF2ドメインのさらなる実施形態は、配列の保存的置換物ならびにさらにはN末端および/またはC末端残基がトランケートされたトランケート形態を含む。トランケーションの同定は、本開示を読む当業者により容易に達成することができる。特異的結合を提供する連続残基の数は、約4から約15残基であり、より長い配列も特異的結合を示す。したがって、PlGF2の実施形態は、0から5つの保存的置換を有する配列番号4、0から5つの保存的置換を有する配列番号5およびそれらの部分配列からなる群から選択される配列を含み、前記部分配列が、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチンおよびフィブリンの1つ以上への特異的結合を示す単離されたポリペプチドを含む。部分配列は、4から15残基長の全ての部分配列、例えば全ての4、5、6および7残基の部分配列ならびに全ての7〜12および全ての5〜15残基の部分配列を含む。配列についての解離定数の値は低く、例えばポリペプチドのフィブリノーゲンへの特異的結合は、約40nM未満の解離定数(KD)を有する。さらに、発見された配列中のL−アミノ酸のD−アミノ酸による置換は、Giordanoにおけるように達成することができることが多い。
図2パネルaを参照すると、PlGF2123−152の試験部分配列についてのデータは、7残基の断片が細胞外マトリックス(ECM)についての特異的結合を保持することを示した。しかしながら、より大きい断片がより高い親和性を示した。このデータは、さらにより短い配列、例として4つ以上の残基の全ての部分配列が適切なECMへの特異的結合を示すことが合理的に予測することができることを示す。さらに、生物学分野における多くの配列、例えばRGD細胞接着モチーフは、それらがさらに極めて大きい分子の一部である場合に有効であることが公知である。一部の分子はそのような比較的小さい配列の特異的結合を悪化させるようにフォールドするものの、当業者は、そのような配列を効率的に用いるさらに極めて大きい分子を創成する技術に極めて精通している。他方、多くの天然生体分子および約20種の天然アミノ酸のみが存在することを考慮すると、偶然の結果として生じる1つ以上のそのような配列を有し得るある数の天然生体分子が存在する。このような配列は、そのような生体分子が特異的機能を達成するように進化的に調整されたため、特異的結合について活性であると想定すべきでない。ECMへの結合は、そのような例における好適な生物学的証拠なしで特定の生体分子の結果とすべきでない極めて重要な天然存在の特異的機能である。
ほとんどの接着結合モチーフは、一部の保存的置換を受け、機能性を保持し得る。全てのそのような置換が有効ではないが、そのような変化は有効であることが多い。一般にアミノ酸配列に活性を変えずに作製することができる種々の保存的変化が存在する。これらの変化は、保存的置換または突然変異と称され;すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸を別のアミノ酸に代えて置換することができる。アミノ酸配列の置換物は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正荷電(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負荷電(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。このような変更は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または等電点により測定される見かけの分子量に実質的に影響を与えるとは予測されない。保存的置換としては、配列の光学異性体を他の光学異性体に代えて置換すること、特にDアミノ酸をLアミノ酸に代えて配列の1つ以上の残基について置換することも挙げられる。さらに、配列中のアミノ酸の全ては、DからL異性体への置換を受け得る。例示的な保存的置換としては、限定されるものではないが、正電荷を維持するためにLysをArgに代えて置換することおよびその逆;負電荷を維持するためにGluをAspに代えて置換することおよびその逆;遊離−−OHが維持されるようにSerをThrに代えて置換すること;ならびに遊離NH2を維持するためにGlnをAsnに代えて置換することが挙げられる。さらに、ポリペプチド配列または対応する核酸配列の点突然変異、欠失および挿入を、一部の場合、ポリペプチドの機能損失も核酸断片の機能損失もなしで作製することができる。置換は、例えば1、2、3つ以上の残基を含み得る。本明細書に記載のアミノ酸残基は、一文字アミノ酸表記または三文字略称のいずれかを用いる。本明細書において使用される略称は、標準的なポリペプチド命名法、J.Biol.Chem.,(1969),243,3552−3559に従う。全てのアミノ酸残基配列は、本明細書においてアミノ末端からカルボキシ末端への慣用の方向で左右配向を有する式により表わされる。したがって、本明細書に記載のペプチドの保存的置換が企図され、それを量、例えば1から5つまたはパーセント、例えば0%から33%に関して記載することができる。当業者は、明示される限界内の全ての値および範囲、例えば約5%、約7%または約15%が企図されることを直ちに認識する。7残基中の1置換の場合、置換は14.2%であり、それは約15%である。22残基中の2置換の場合、割合は9.1であり、それは約10%である。
ある実施形態は、種々のポリペプチド配列および/または精製もしくは単離されたポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、翻訳後修飾(例えばリン酸化またはグリコシル化)および/または追加のポリペプチドとの複合体化、核酸および/もしくは炭水化物または他の分子との多サブユニット複合体への合成にかかわらず、アミノ酸残基の鎖を指す用語である。したがって、プロテオグリカンも本明細書においてポリペプチドと称される。本明細書において使用される「機能ポリペプチド」は、示される機能を促進し得るポリペプチドである。ポリペプチドは、多くが当分野において周知である多数の方法により産生することができる。例えば、ポリペプチドは、抽出(例えば単離細胞から)により、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、または化学合成により得ることができる。ポリペプチドは、例えば組換え技術およびコードされるポリペプチドの発現のために宿主細胞中に導入された(例えば形質転換または形質移入により)ポリペプチドをコードする発現ベクターにより産生することができる。
一部の場合、ペプチドと本明細書に記載の配列との同一性パーセントの決定が要求され得る。このような場合、同一性パーセントは、ペプチドまたはペプチドの一部の残基の数に関して計測される。例えば90%の同一性のポリペプチドは、より大きいペプチドの一部でもあり得る。
ポリペプチドに関して本明細書において使用される精製という用語は、化学合成され、したがって他のポリペプチドにより実質的に汚染されておらず、または天然に付随する他のほとんどの細胞成分(例えば他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチドまたは細胞成分)から分離もしくは精製されたポリペプチドを指す。精製ポリペプチドの一例は、乾燥重量基準で少なくとも70%であり、天然に会合するタンパク質および天然存在有機分子を含まないものである。したがって、精製ポリペプチドの調製物は、例えば乾燥重量基準で少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも99%のポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、ポリペプチドの精製または標識(例えば親和性マトリックス上への捕捉、顕微鏡下での可視化)を容易にするタグ配列(例えばポリヒスチジンタグ、mycタグまたはFLAG(登録商標)タグ)を含有するようにエンジニアリングすることもできる。したがって、ポリペプチドを含む精製組成物は、別記のない限り精製ポリペプチドを指す。単離されたという用語は、本発明のポリペプチドまたは核酸がそれらの天然環境中に存在しないことを示す。したがって、本発明の単離された産物は、培養上清中に含有させ、部分濃縮し、異種資源から産生し、ベクター中でクローニングし、または媒体と配合などすることができる。
ポリペプチドは、化学的修飾を含み得;これに関して、この用語は、アミノ酸の天然存在の化学構造の変化を指す。このような修飾は、側鎖または末端に、例えばアミノ末端またはカルボキシル末端を変化させて作製することができる。一部の実施形態において、修飾は、ポリペプチドを他の材料に結合させるため、または治療剤に付着させるために簡便に使用することができる化学基の創成に有用である。
生物学分野において一般に使用される用語の特異的結合は、非標的組織と比較して相対的に高い親和性で標的に結合する分子を指し、一般に、複数の非共有結合相互作用、例えば静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などを含む。特異的結合相互作用は、抗体−抗原結合、酵素−基質結合および特異的結合タンパク質−受容体相互作用を特徴づける一方、そのような分子は、その標的以外の組織に結合し得ることもあり、そのような結合は特異性を欠くと示され、特異的結合ではない。
考察
実施例1(図1参照)は、ECMタンパク質に強力および広域に結合するドメインPlGF2123−144がPlGF2内で発見されたことを確立する結果を記載する。このドメインは、PlGF2の一部のみであり、したがって、天然には存在しない。PlGF2は、試験された全てのECMタンパク質に強力に結合した(図1、灰色バー)。スプライスバリアントPlGF2およびPlGF−1(結合しない)のタンパク質配列のアラインメントは、PlGF2がC末端近傍に位置する追加の21アミノ酸インサート(PlGF2123−144、灰色)をいかに含有するかを説明する。結合は、PlGF2ドメインがタンパク質GSTに融合された場合(GST−PlGF2123−144)に有効であることも示された。実施例1から、PlGF2123−144は、ECMタンパク質結合ドメインを含むことが結論づけられた。種々のPLGF2断片の種々のECMタンパク質、ヘパラン硫酸およびニューロピリン−1への結合を試験し、結果を図2に示す。実施例2は、配列中へのトランケーションおよび/または置換の作製の実験および記載例を詳述する。
実施例1(図1参照)は、ECMタンパク質に強力および広域に結合するドメインPlGF2123−144がPlGF2内で発見されたことを確立する結果を記載する。このドメインは、PlGF2の一部のみであり、したがって、天然には存在しない。PlGF2は、試験された全てのECMタンパク質に強力に結合した(図1、灰色バー)。スプライスバリアントPlGF2およびPlGF−1(結合しない)のタンパク質配列のアラインメントは、PlGF2がC末端近傍に位置する追加の21アミノ酸インサート(PlGF2123−144、灰色)をいかに含有するかを説明する。結合は、PlGF2ドメインがタンパク質GSTに融合された場合(GST−PlGF2123−144)に有効であることも示された。実施例1から、PlGF2123−144は、ECMタンパク質結合ドメインを含むことが結論づけられた。種々のPLGF2断片の種々のECMタンパク質、ヘパラン硫酸およびニューロピリン−1への結合を試験し、結果を図2に示す。実施例2は、配列中へのトランケーションおよび/または置換の作製の実験および記載例を詳述する。
種々のサイトカインを、PlGF2ドメインとの融合タンパク質として作製した(実施例3;図3)。図4(実施例4参照)は、そのような融合タンパク質とECMとの結合についての結果を記載する。特異的結合についての解離定数を計測し、PlGF2の広範なECMタンパク質についての親和性が融合分子に付与されることが決定された。これらのサイトカインとしては、血管内皮成長因子(VEGF)、血小板由来成長因子(PDGF)および骨形態形成タンパク質(BMP)を挙げた。実施例5は、サイトカイン−PlGF2ドメイン分子融合物、例としてインスリン成長因子−I(IGF−I)、トランスフォーミング成長因子ベータ1(TGF−β1)、TGF−ベータ2(TGF−β2)、脳由来神経栄養因子(BDNF)および神経栄養因子(NT)、NT−3との融合物のさらなる製造を詳述する。これらの生物学的因子は、PlGF2ドメインに融合された場合にそれらの生物学的活性を維持することが観察された(実施例6、図5)。実際、VEGF融合分子は増加した活性を有した。
VEGF−Aの臨床使用への転換において生じる主要な問題が存在する。実際、VEGF受容体2(VEGF−R2)のVEGF−A活性化は血管新生を促進するための潜在的に強力なアプローチである一方、VEGF−Aの実際の投与は、血管浸透性を急速に誘導し、それが全身性低血圧および浮腫をもたらすことが示されており;この現象は、末梢および心血管用途における用量を制限する毒性応答であり(Simons M and Ware JA,2003)、再生医療における深刻な問題を提示する。VEGFとPlGF2ドメインとの組合せは、VEGFの効力に影響を与えないが、より緩慢なその放出を引き起こし、その結果、血管浸透性を低下させ、組合せがVEGFそれ自体よりも有効であることが理論化された。同様に、種々のサイトカインのPlGF2ドメインへの融合物は有効であることが同様に理論化された。これらの理論は、一連の実験において支持された。実施例7(図6)は、インビボでECM分子に結合し、それにより保持される種々のECM超親和性サイトカインバリアントをいかに創成したかを詳述する。実施例8(図7)は、臨床的に重要なモデルを使用してPDGF−BBおよびVEGF−AとPlGF2ドメインとの分子融合物の治癒力を試験した。PDGF−BBおよびVEGF−Aのエンジニアリングされた分子融合物により処理された創傷は、顕著に早い創傷閉鎖をもたらし、より良好な肉芽組織および改善された血管新生を示すバイオマーカー(CD31およびデスミン)の観察により改善された治癒が確認された。
さらに、VEGFとPlGF2ドメインとの分子融合物は、その改善された結果を引き起こすにもかかわらず、かなり低い血管浸透性を引き起こすことが観察された。実施例9(図8)は、結果を詳述する。手短に述べると、融合分子は、血管新生を過浸透性から分断すると考えられた。
PlGF2ドメインが融合分子中でサイトカイン機能を破壊せずに所望の特異的結合を創成し得ることを示すこれらの種々の結果に照らして、さらなる試験を実施してそのような組合せの一般的適用可能性を実証した。実施例10(図9)は、サイトカインとPlGF2ドメインとの分子融合物による骨欠損の処理を詳述する。これらの実験において、マトリックスを使用して分子融合物を保持し、制御可能に送達した。手短に述べると、融合分子は、サイトカインそれ自体よりもかなり有効であり、かなり低い用量が有効であった(マイクログラム量の未変更サイトカインと比較してナノグラム量の融合分子)。これらの結果は、分子融合物に特異的に結合するマトリックスの有効性および骨治癒処理におけるその有効性を実証する。
種々の分子融合物をいかに設計および作製するかを記載する種々の詳細な実施例をさらに提供する。実施例11は、細胞接着モチーフをPlGF2ドメインにいかに融合させることができるかを詳述する。フィブロネクチンドメインを一例として使用する。薬物の送達および/または細胞侵入の促進または治癒のためのマトリックスをそのような分子融合物に曝露し、修飾して薬物または他の生物活性剤、例えば細胞接着モチーフを担持させることができる。種々のマトリックス、例として合成マトリックス、フィブリンマトリックスならびに天然または合成マトリックス、例として共有結合により架橋しているものおよび共有結合により架橋していないものが公知である。実施例12は、一例として使用される副甲状腺ホルモン断片1〜34との、マトリックスからの放出のための薬物の分子融合物を詳述する。実施例13は、PlGF2ドメインとプロテアーゼ阻害剤との分子融合物を詳述する。本背景は、一例としてのアプロチニンを有するフィブリンマトリックスである。実施例14は、ケモカインCXCL10、CXCL11、IFN−γおよびCCL21とPlGF2との分子融合物を詳述する。
PlGF2ドメインを使用してワクチンを作製することもできる。実施例15は、免疫原性抗原とPlGF2ドメインとの分子融合物を詳述する。この分子は、薬学的に許容可能な化合物に関して、および例えば本明細書の他箇所で詳述されるワクチンについての他の特性との組合せで投与することができる。例えば、実施例16はPlGF2ドメインと融合しているToll様受容体アゴニストのエンジニアリングについての詳細を提供する。
薬物送達および制御放出は、一般に、生物活性剤とPlGF2ドメインとの分子融合物を記載する実施例17の詳細により例示される。例えば、細胞外マトリックス結合FGF18は、FGF18とPlGF2ドメインとの間の融合タンパク質により提供される。この融合物についての種々の代替例を提示する。
分子融合物
好ましい実施形態は、PlGF2ドメインと治療剤との間の分子融合物である。実施形態は、例えば治療剤、マーカー、細胞接着分子、抗原、タンパク質、タンパク質薬物またはサイトカインとの分子融合物中のPlGF2ドメインを含む。分子融合物は、第1のPlGF2ペプチドと第2のペプチドとの間で形成することができる。第2のペプチドに代えて、化学部分、例えばマーカー、蛍光マーカーを使用することができる。融合物は、互いに直接または間接的にコンジュゲートしているペプチドを含む。ペプチドは、互いに直接またはリンカーを介して間接的にコンジュゲートすることができる。リンカーは、ペプチド、ポリマー、アプタマー、核酸または粒子であり得る。粒子は、例えばマイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、リポソームまたはミセルであり得る。ポリマーは、例えば天然、合成、直鎖または分枝鎖であり得る。第1のペプチドおよび第2のペプチドを含む融合タンパク質は、ペプチドの分子融合物の一例であり、融合タンパク質は、互いに直接または介在リンカー配列および/もしくは一方もしくは両方の末端におけるさらなる配列により連結しているペプチドを含む。リンカーへのコンジュゲーションは、共有結合を介するものであり得る。方法は、分子融合物または分子融合物を含む組成物、例として薬学的に許容可能な形態のそのような組成物を調製することを含む。
好ましい実施形態は、PlGF2ドメインと治療剤との間の分子融合物である。実施形態は、例えば治療剤、マーカー、細胞接着分子、抗原、タンパク質、タンパク質薬物またはサイトカインとの分子融合物中のPlGF2ドメインを含む。分子融合物は、第1のPlGF2ペプチドと第2のペプチドとの間で形成することができる。第2のペプチドに代えて、化学部分、例えばマーカー、蛍光マーカーを使用することができる。融合物は、互いに直接または間接的にコンジュゲートしているペプチドを含む。ペプチドは、互いに直接またはリンカーを介して間接的にコンジュゲートすることができる。リンカーは、ペプチド、ポリマー、アプタマー、核酸または粒子であり得る。粒子は、例えばマイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、リポソームまたはミセルであり得る。ポリマーは、例えば天然、合成、直鎖または分枝鎖であり得る。第1のペプチドおよび第2のペプチドを含む融合タンパク質は、ペプチドの分子融合物の一例であり、融合タンパク質は、互いに直接または介在リンカー配列および/もしくは一方もしくは両方の末端におけるさらなる配列により連結しているペプチドを含む。リンカーへのコンジュゲーションは、共有結合を介するものであり得る。方法は、分子融合物または分子融合物を含む組成物、例として薬学的に許容可能な形態のそのような組成物を調製することを含む。
実施形態は、PlGF2ドメインおよびトランスグルタミナーゼ基質(TG)を含むポリペプチドの分子融合物を含む。TG基質の一実施形態は、アルファ2−プラスミン阻害剤の残基1〜8(NQEQVSPL)(配列番号50)を含むペプチドである。実施形態は、組換え融合ポリペプチドであるそのようなポリペプチドを含む。分子融合物は、細胞接着分子についての特異的結合親和性を有する細胞接着部分をさらに含み得る。種々の細胞接着部分が公知であり、例えば細胞接着部分は、糖タンパク質または細胞表面受容体についてのリガンドを含む。あるいは細胞接着部分は、細胞接着分子への特異的結合を有するリガンドを含み得、細胞接着分子は、インテグリンおよびカドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体である。
分子融合物という用語またはコンジュゲートという用語は、化学結合、例として共有結合、静電イオン結合または電荷−電荷結合による直接または間接的会合物を指す。コンジュゲーションは、化学結合により保持される単位を創成する。直接的コンジュゲーションは、中間リンカーまたは化学基を用いるまたは用いない薬剤への化学結合を指す。間接的コンジュゲーションは、担体への化学結合を指す。担体は、薬剤を広く封入し得、例えばポリマーソーム、リポソームもしくはミセルもしくは一部の類型のナノ粒子であり、または薬剤をその表面上に有し得、例えば金属ナノ粒子もしくはビーズもしくはその両方、例えば薬剤の一部を内部中および外部上に含む粒子である。担体は、免疫寛容のための抗原も封入し得る。例えば、抗原を封入するポリマーソーム、リポソームまたは粒子を作製することができる。封入するという用語は、いかなる部分も露出させずに全体的に有効にカバーすることを意味し、例えば抗原または薬剤を封入するポリマーソームを作製することができる。
コンジュゲーションは、リンカーを使用するまたは使用しないペプチドの別の分子への共有結合により達成することができる。このようなコンジュゲートの形成は、当業者の技能の範囲内であり、コンジュゲーションを達成するための種々の技術が公知であり、特定の技術の選択はコンジュゲートすべき材料により導かれる。イオン性側鎖を含有し(すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、システイン、ヒスチジンまたはチロシン)、ポリペプチド配列の活性部分中に含有されないアミノ酸のポリペプチド(CまたはN末端)への付加は、その非プロトン化状態で強力な求核試薬としてポリマーに付着している反応性基、すなわちホモまたはヘテロ二官能性PEGとの種々のバイオコンジュゲーション反応に関与するように機能する(例えばLutolf and Hubbell,Biomacromolecules 2003;4:713−22,Hermanson,Bioconjugate Techniques,London.Academic Press Ltd;1996)。一部の実施形態において、可溶性ポリマーリンカーを使用し、患者に薬学的に許容可能な形態で投与することができる。あるいは薬物をポリマーソームもしくは媒体中に封入し、またはペプチドリガンドに共有結合により付着させることができる。
分子融合物は粒子を含み得る。PlGF2ドメインを粒子に付着させることができる。抗原、薬剤または他の物質は、粒子中または粒子上に存在し得る。ナノ粒子、ミセルおよび他の粒子の例は、例えば米国特許出願公開第2008/0031899号明細書、米国特許出願公開第2010/0055189号明細書、米国特許出願公開第2010/0003338号明細書に見出され、それらの出願は全ての目的、例としてそれを本明細書に記載のリガンドと組み合わせるために本明細書における参照により本明細書に援用され;しかしながら、矛盾する場合は本出願が優先する。
ナノ粒子は、約10nmから約200nmの平均直径を有する粒子の集合物として調製することができ、調製法により得られる多分散度に応じて例えば約20から約200、約20から約40、約70または約100nmの明示された境界間の全ての範囲および値を含む。種々のナノ粒子系、例えばポリ(エチレングリコール)およびポリ(乳酸)のコポリマーから形成されるもの、ポリ(エチレンオキシド)およびポリ(ベータ−アミノエステル)のコポリマーから形成されるものならびにタンパク質、例えば血清アルブミンから形成されるものを利用することができる。他のナノ粒子系は当業者に公知である。Devalapally et al.,Cancer Chemother Pharmacol.,07−25−06;Langer et al.,International Journal of Pharmaceutics,257:169−180(2003);およびTobio et al.,Pharmaceutical Research,15(2):270−275(1998)も参照。
ヘパリン結合リガンドを取り込む約200nmの平均直径を超えるより大きい粒子を調製することもでき、それらの粒子は、ミクロンスケールに接近し始め、光学的分解能のほぼ限界内に収まるため、本明細書においてマイクロ粒子と称される。例えば、マイクロ粒子を作製するためのある技術は、米国特許第5,227,165号明細書、米国特許第6,022,564号明細書、米国特許第6,090,925号明細書および米国特許第6,224,794号明細書に記載されている。
標的化能を用いるためのナノ粒子の機能化には、例えばバイオコンジュゲーション技術を使用する共有結合による標的化ポリペプチドと粒子との会合が要求され、特定の技術の選択はポリペプチドを連結すべき粒子もしくはナノ粒子または他の構築物により導かれる。一般に、ペプチドを他の材料に付着させるための多くのバイオコンジュゲーション技術が周知であり、特定の材料について最も好適な技術を選択することができる。例えば、追加のアミノ酸、例えばポリペプチドをチオール反応性分子に付着させる場合にシステインをポリペプチド配列に付着させることができる。
分子融合物は、ポリマーを含み得る。ポリマーは分枝鎖でも直鎖でもよい。分子融合物は、デンドリマーを含み得る。一般に、コンジュゲートが可溶性で、患者中への導入後に生体利用可能になるように、可溶性親水性生体適合性ポリマーを使用することができる。可溶性ポリマーの例は、少なくとも100、400または100から400,000(それらの明示値間の全ての範囲および値が企図される)の分子量を有するポリビニルアルコール、ポリエチレンイミンおよびポリエチレングリコール(ポリエチレンオキシドを含む用語)である。これに関する溶解度は、1リットル当たり少なくとも1グラムの水または生理学的食塩水中の溶解度を指す。生体分解性ポリマーのドメイン、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピランならびにポリシアノアクリレートを使用することもできる。
実施形態は、合成PlGF2ペプチドを含むポリペプチドを含むポリマーを含む。例えば、実施形態は、上記列挙されるポリマーおよび多糖、ポリエチレングリコール、ポリアルキレンオキシド、コラーゲンまたはゼラチンを含む。ポリマーは、トランスグルタミナーゼ基質(TG)、サイトカインなどをさらに含み得る。
一部の実施形態において、ポリペプチド−ポリマー会合物、例えば分子融合物を調製し、精製組成物として薬学的に許容可能な条件下でまたは医薬賦形剤とともに体内に導入する。導入部位は、例えば全身または組織もしくは移植部位であり得る。
実施形態は、PlGF2ドメインとタンパク質薬物との間の分子融合物、例えばPlGF2ドメインおよびタンパク質薬物を含む組換え融合タンパク質、PlGF2ドメインおよびタンパク質薬物を含む化学コンジュゲートまたはポリマーもしくはポリマーミセルもしくはナノ粒子への連結融合物が介在するPlGF2ドメインおよびタンパク質薬物を含む間接的化学コンジュゲートを含む。PlGF2ドメインとタンパク質薬物との間の分子融合物は、組織部位中に投与された場合、損傷組織部位中のフィブリノーゲン/フィブリンとの親和性により、または組織部位中のECMタンパク質への親和性によりタンパク質薬物を組織に固定するように機能し得る。したがって、好ましい実施形態は、薬学的に許容可能な担体中のPlGF2ドメインとタンパク質薬物との分子融合物である。あるいは、PlGF2ドメインとタンパク質薬物との間の分子融合物は、タンパク質薬物をフィブリンマトリックス内で固定するように機能し得る。フィブリンは、一般に使用される生体材料マトリックスであり、組織の密封および接着において、再生医療用途において、および薬物送達用途において使用される。フィブリンマトリックス内でのタンパク質薬物の固定は、それらのおよび他の用途における薬理学的利益を提供し得る。ペプチドおよびタンパク質抗原を、抗原とPlGF2ドメインとの間の分子融合物の形成によりフィブリンマトリックス内で固定して結合させることもできる。したがって、好ましい実施形態は、薬学的に許容可能なフィブリノーゲン/フィブリンの配合物中のPlGF2ドメインとタンパク質薬物または抗原との分子融合物である。フィブリノーゲン/フィブリンは自己資源から調製することもでき、したがって、好ましい実施形態は、自己フィブリン中での適用のための薬学的に許容可能な担体中のPlGF2ドメインとタンパク質薬物または抗原との分子融合物である。
媒体
多くの場合、治療剤、例えばタンパク質薬物、例えばサイトカイン、ホルモンまたは細胞接着タンパク質は、いかなるマトリックスも使用せずに治療が必要とされる身体部位に直接送達することができる。しかしながら、腸管の流動およびドレナージに起因して、サイトカインまたは他の可溶性薬剤がECMについてのその結合親和性に応じて注射部位から容易にクリアランスされ得る。PlGF2配列、例えばPlGF2123−144配列により修飾されているサイトカインは、いくつかの細胞外マトリックスタンパク質、例としてフィブロネクチン、テネイシンC、ビトロネクチン、オステオポンチンおよびコラーゲンIへの改善された結合を示すため、それらを注射部位により良好に保持することができ、改善された治療をもたらす。
多くの場合、治療剤、例えばタンパク質薬物、例えばサイトカイン、ホルモンまたは細胞接着タンパク質は、いかなるマトリックスも使用せずに治療が必要とされる身体部位に直接送達することができる。しかしながら、腸管の流動およびドレナージに起因して、サイトカインまたは他の可溶性薬剤がECMについてのその結合親和性に応じて注射部位から容易にクリアランスされ得る。PlGF2配列、例えばPlGF2123−144配列により修飾されているサイトカインは、いくつかの細胞外マトリックスタンパク質、例としてフィブロネクチン、テネイシンC、ビトロネクチン、オステオポンチンおよびコラーゲンIへの改善された結合を示すため、それらを注射部位により良好に保持することができ、改善された治療をもたらす。
PlGF2ペプチドは、治療剤の送達のための媒体として使用することができる。媒体は生理学的溶液中で可溶性またはコロイドであり、媒体の全ての成分は体内で放出される場合、好ましくは約500μm未満の最大寸法である。PlGF2媒体の実施形態は、生物学的薬剤と、0から5つの保存的置換を有する配列番号4、0から5つの保存的置換を有する配列番号5およびそれらの部分配列からなる群から選択される配列を含むペプチドとの分子融合物を含み、前記核酸が、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチンおよびフィブリンの1つ以上への特異的結合を示す。生物学的薬剤は、タンパク質、タンパク質薬物、マーカー、免疫剤、ケモカイン、サイトカインおよび細胞接着ペプチドからなる群から選択することができる。
使用において、PlGF2ペプチドは、それ自体または分子融合物の一部として、種々のECM分子、例としてフィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチンおよびフィブリンについての結合特異性を示す。これに関して、フィブリノーゲンおよびフィブリンは一時的なECMとして捉えることができる。PlGF2媒体の組織中への配置は、配置部位またはその近傍での媒体の局在固定化をもたらし、全身性ではない。媒体により担持される薬剤は、経時的に放出され、またはそれが組織と相互作用している細胞により固定化される場所で消費される。したがって、患者自身の組織は、因子の送達のための生体マトリックスとして機能し得る。生体マトリックスのための多くの使用、例として薬物の長期放出は公知である。
マトリックス
実施形態は、PlGF2ドメインをマトリックス中に取り込む生体材料を含む。マトリックスという用語は、合成三次元構造、例としてブロック、シートまたはフィルムを指し;それは、可溶性または流動材料と対照的に使用される用語である。合成という用語は、患者に由来せず、患者に対して外因性であることを意味する。マトリックスは、足場として内部で使用される場合、機械的負荷に耐久し、好適な分解キネティックスを含有し、生物活性分子を提示しなければならない。足場は、ティッシュエンジニアリングの目的のための細胞担体および薬物送達デバイスの融合物として機能する。細胞についての天然微小環境を模倣して組織修復および再生を誘導するため、合成材料をECM断片により修飾することができる。本報告に記載のECM断片は、タンパク質アルファ2プラスミン阻害剤の残基1〜8(α2PI1〜8、NQEQVSPL(配列番号50))からなるN末端におけるトランスグルタミナーゼ(TG)基質との分子融合物を形成するように設計することができる。したがって、第XIIIa因子をトランスグルタミナーゼとして使用してこの配列(NQEQVSPL)のグルタミンと様々な生体材料のリジンとの間の反応を触媒することができる。凝固酵素の第XIIIa因子は、リジン(Lys)の遊離アミン基をグルタミン(Gln)のガンマ−カルボキサミド基に共有結合させ、タンパク質分解に高い耐性を示す結合をもたらす。例えば、天然フィブリンヒドロゲルは、この機序により架橋され、したがってTG−PlGF2ドメインはゲルの内側で架橋され得る(Schense and Hubbell,1999)。
実施形態は、PlGF2ドメインをマトリックス中に取り込む生体材料を含む。マトリックスという用語は、合成三次元構造、例としてブロック、シートまたはフィルムを指し;それは、可溶性または流動材料と対照的に使用される用語である。合成という用語は、患者に由来せず、患者に対して外因性であることを意味する。マトリックスは、足場として内部で使用される場合、機械的負荷に耐久し、好適な分解キネティックスを含有し、生物活性分子を提示しなければならない。足場は、ティッシュエンジニアリングの目的のための細胞担体および薬物送達デバイスの融合物として機能する。細胞についての天然微小環境を模倣して組織修復および再生を誘導するため、合成材料をECM断片により修飾することができる。本報告に記載のECM断片は、タンパク質アルファ2プラスミン阻害剤の残基1〜8(α2PI1〜8、NQEQVSPL(配列番号50))からなるN末端におけるトランスグルタミナーゼ(TG)基質との分子融合物を形成するように設計することができる。したがって、第XIIIa因子をトランスグルタミナーゼとして使用してこの配列(NQEQVSPL)のグルタミンと様々な生体材料のリジンとの間の反応を触媒することができる。凝固酵素の第XIIIa因子は、リジン(Lys)の遊離アミン基をグルタミン(Gln)のガンマ−カルボキサミド基に共有結合させ、タンパク質分解に高い耐性を示す結合をもたらす。例えば、天然フィブリンヒドロゲルは、この機序により架橋され、したがってTG−PlGF2ドメインはゲルの内側で架橋され得る(Schense and Hubbell,1999)。
生体分子をフィブリンマトリックスに固定する好ましい実施形態に関して、生体分子は、組織修復における局所送達のための組換えタンパク質薬物、例としてサイトカインであり得る。したがって、組織修復に好ましい実施形態は、フィブリノーゲンまたはフィブリンを含む組織修復マトリックスならびにPlGF2123−144と、組換えサイトカイン、例として上皮成長因子(EGF)、VEGF、PDGF、FGF、IGF、BMP、TGF−βおよび神経栄養因子のファミリーおよびスーパーファミリーのメンバーとの間の分子融合物の医薬配合物である。フィブリンマトリックスは、タンパク質薬物とPLGF2ドメインとの、またはPlGF2123−144とタンパク質薬物との分子融合物の徐放のための制御放出マトリックスとしても機能し得る。
好ましい実施形態は、PLGF2ドメインまたはPlGF2123−144およびサイトカインVEGF−Aを含む融合タンパク質であり、表記VEGF−Aは、VEGF−Aのアイソフォームのいずれかを指す。
PlGF2123−144を使用してフィブリンマトリックスを局所的な免疫調節および免疫増強、例としてワクチン接種のためにエンジニアリングすることができる。好ましい実施形態は、PlGF2123−144と、ケモカイン、関心対象の例としてINF−β、CXCL10、CXCL11およびCCL21またはサイトカイン、例としてTGF−β1、TGF−β2もしくはTGF−β3とを含む分子融合物である。好ましい実施形態は、フィブリノーゲンまたはフィブリンおよびPLGF2ドメインまたはPlGF2123−144と組換えケモカインとの間の分子融合物を含む免疫調節または免疫増強マトリックスであり、関心対象のケモカインとしては、INF−β、CXCL10、CXCL11およびCCL21またはサイトカイン、例としてTGF−β1、TGF−β2またはTGF−β3が挙げられる。PlGF2123−144を使用して免疫学的危険シグナル細胞外マトリックスタンパク質をフィブリン中に取り込むことができる。PlGF2123−144を使用して危険シグナル細胞外マトリックスタンパク質、例として免疫学的危険シグナルのテネイシンCのフィブリノーゲン様球状ドメインをフィブリン中に取り込むことができる。好ましい実施形態は、PLGF2ドメインとテネイシンCのフィブリノーゲン様球状ドメインとの分子融合物である。
免疫増強における重要な用途は、ワクチン接種である。好ましい実施形態は、フィブリノーゲンまたはフィブリンおよびPLGF2ドメインとペプチドまたはタンパク質抗原との分子融合物を含むワクチンマトリックスである。好ましい実施形態は、PLGF2ドメインとペプチドまたはタンパク質抗原との間の分子融合物である。さらなる好ましい実施形態は、フィブリノーゲンまたはフィブリン、PLGF2ドメインとケモカインとの間の分子融合物、PLGF2とテネイシンCのフィブリノーゲン様球状ドメインとの分子融合物およびPLGF2ドメインとペプチドまたはタンパク質抗原との間の分子融合物を含むワクチンマトリックスである。
フィブリンマトリックスは、細胞が遊走、浸潤および侵入する接着環境も提供する。この接着環境を調節し得ることは有用であり、このことは、接着ペプチドもしくは接着タンパク質ドメイン、例えばFN III9−10または例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンおよびテネイシンC中に見出される多くの対応するドメインの分子融合物を作製することにより行うことができる。好ましい実施形態は、PlGF2123−144と接着ドメインとの分子融合物であり、接着ドメインとしては、フィブロネクチンに由来するインテグリン結合ペプチド、アミノ酸配列RGD、RGDS、RGDSP(配列番号52)、KLDAPT(配列番号51)、IDGIHEL(配列番号49)、IDAPS(配列番号48)、LDVおよびREDVを含む接着ドメインならびにフィブロネクチン接着ドメインFN III10、FN III9−10ならびにテネイシンの1から5番目のFN III型リピートおよびテネイシンCの3番目のFN III型リピートが挙げられる。
接着ドメインに加え、サイトカインおよびケモカイン結合ドメインをフィブリンマトリックス内で固定することが有用である。このことは、PLGF2ドメインと、例えばフィブロネクチン、テネイシンC、ビトロネクチン、ラミニンおよび他のマトリックス分子からのサイトカインおよびケモカイン結合ドメインとの分子融合物を用いて達成することができる。好ましい実施形態は、PLGF2ドメインとFN III12−14との分子融合物、PLGF2ドメインとTNC III1−5との分子融合物、PLGF2ドメインとTNC III3−5との分子融合物およびPLGF2ドメインとTNC III5との分子融合物である。
プロテアーゼ阻害剤をフィブリン内で固定して体表内または体表上への移植後のフィブリンの分解を遅延させることも有益である。このことは、PLGF2ドメインとプロテアーゼ阻害剤、例えばアプロチニンとの分子融合物を用いて達成することができる。好ましい実施形態は、PLGF2とアプロチニンとの分子融合物である。好ましい実施形態は、PLGF2とアプロチニンとの分子融合物を含むフィブリン配合物である。
投与
薬学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して本明細書に記載の実施形態を送達することができる。賦形剤は、治療剤のための希釈剤または媒体として使用される不活性物質を指す。薬学的に許容可能な担体は、一般に、化合物を治療にまたは生成物として有用なものとするためにその化合物とともに使用される。一般に、任意の物質について、担体は、動物への送達のための物質と合わせられる材料である。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要または望ましいことがある。一部の場合、担体は、送達のため、例えば液体送達のために不溶性化合物を可溶化することが不可欠であり;活性を保存するために物質のpHを制御するための緩衝液;または貯蔵容器中の物質の損失を防止する希釈剤である。しかしながら、他の場合、担体は簡便のためのものであり、例えばより簡便な投与のための液体である。本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩は、当業者に公知の方法により合成することができる。薬学的に許容可能な物質または組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、滅菌され、生体適合性である。これらは、患者への投与に適した担体、塩または賦形剤をさらに含み得る。担体としての水の場合、水は、高度に精製され、汚染物質、例えばエンドトキシンを含まないように処理される。
薬学的に許容可能な担体または賦形剤を使用して本明細書に記載の実施形態を送達することができる。賦形剤は、治療剤のための希釈剤または媒体として使用される不活性物質を指す。薬学的に許容可能な担体は、一般に、化合物を治療にまたは生成物として有用なものとするためにその化合物とともに使用される。一般に、任意の物質について、担体は、動物への送達のための物質と合わせられる材料である。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要または望ましいことがある。一部の場合、担体は、送達のため、例えば液体送達のために不溶性化合物を可溶化することが不可欠であり;活性を保存するために物質のpHを制御するための緩衝液;または貯蔵容器中の物質の損失を防止する希釈剤である。しかしながら、他の場合、担体は簡便のためのものであり、例えばより簡便な投与のための液体である。本明細書に記載の化合物の薬学的に許容可能な塩は、当業者に公知の方法により合成することができる。薬学的に許容可能な物質または組成物は、汚染物質を含まないように高度に精製され、滅菌され、生体適合性である。これらは、患者への投与に適した担体、塩または賦形剤をさらに含み得る。担体としての水の場合、水は、高度に精製され、汚染物質、例えばエンドトキシンを含まないように処理される。
本明細書に記載の化合物は、意図される投与形態に関して、および慣用の医薬実務に一致するように好適に選択される好適な医薬希釈剤、賦形剤、増量剤または担体(本明細書において、薬学的に許容可能な担体または担体と称される)との混合物で投与することができる。したがって、送達可能な化合物は、経口、直腸、局所、静脈内注射、関節内注射、非経口投与、鼻腔内または気管投与に好適な形態で作製することができる。担体としては、固体または液体が挙げられ、担体の類型は、使用される投与の類型に基づき選択される。好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、流動誘導剤および融解剤を、例えばピルのための担体として含めることができる。例えば、活性成分は、経口非毒性の薬学的に許容可能な不活性担体、例えばラクトース、ゼラチン、寒天、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールなどと合わせることができる。化合物は、固体剤形、例えばカプセル剤、錠剤および散剤で、または液体剤形、例えばエリキシル剤、シロップ剤および懸濁液剤で経口投与することができる。活性化合物は、滅菌液体剤形で非経口投与することもできる。生理学的pHまたはオスモル濃度を達成するための緩衝液を使用することもできる。
実施例1
PlGF2内の短いアミノ酸配列(PlGF2123−144)は、ECMタンパク質に強力に結合する。
ドメインがPlGF2内で発見され(PlGF2123−144)、ECMタンパク質に強力および広域に結合する。ECMタンパク質へのGF結合をELISAにより計測した。0.1(灰色枠)を超えるシグナルを代表的な特異的結合とみなした。PlGF2は、試験された全てのECMタンパク質に強力に結合した(灰色バー)。スプライスバリアントPlGF2およびPlGF−1(結合しない)のタンパク質配列のアラインメントは、PlGF2がC末端近傍に位置する追加の21アミノ酸インサート(PlGF2123−144、灰色)をいかに含有するかを説明する。非結合モデルタンパク質グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)に融合させた場合(GST−PlGF2123−144)の、PlGF2123−144のECMタンパク質への結合を試験した。PlGF2123−144のスクランブルバージョン(GST−PlGF2scr)は、ECMタンパク質に結合しない。図1は、それらについての実験データを記載する。
PlGF2内の短いアミノ酸配列(PlGF2123−144)は、ECMタンパク質に強力に結合する。
ドメインがPlGF2内で発見され(PlGF2123−144)、ECMタンパク質に強力および広域に結合する。ECMタンパク質へのGF結合をELISAにより計測した。0.1(灰色枠)を超えるシグナルを代表的な特異的結合とみなした。PlGF2は、試験された全てのECMタンパク質に強力に結合した(灰色バー)。スプライスバリアントPlGF2およびPlGF−1(結合しない)のタンパク質配列のアラインメントは、PlGF2がC末端近傍に位置する追加の21アミノ酸インサート(PlGF2123−144、灰色)をいかに含有するかを説明する。非結合モデルタンパク質グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)に融合させた場合(GST−PlGF2123−144)の、PlGF2123−144のECMタンパク質への結合を試験した。PlGF2123−144のスクランブルバージョン(GST−PlGF2scr)は、ECMタンパク質に結合しない。図1は、それらについての実験データを記載する。
実施例2
PlGF2のECM結合ドメインの最適化
実施例1から、PlGF2123−144はECMタンパク質結合ドメインを含むことが結論づけられた。種々のGST−PLGF2断片の種々のECMタンパク質、ヘパラン硫酸およびニューロピリン−1への結合を試験し、結果を図2に示す。
PlGF2のECM結合ドメインの最適化
実施例1から、PlGF2123−144はECMタンパク質結合ドメインを含むことが結論づけられた。種々のGST−PLGF2断片の種々のECMタンパク質、ヘパラン硫酸およびニューロピリン−1への結合を試験し、結果を図2に示す。
このドメインは、実験を介してECMタンパク質の結合に重要でない配列の除去を介してさらにエンジニアリングすることができる。このような実験は以下のとおり実施することができる。実施例1に記載のELISAアッセイは、そのような実験最適化におけるリードアウトとして有用である。一方の末端、例えばC末端に全長ドメインPlGF2123−144を含むタンパク質、例えばGSTから融合タンパク質を作製し、タンパク質GSTを検出する抗体を使用して表面結合フィブリノーゲンへの結合をELISAアッセイにより計測して全長PlGF2123−144ドメインにより誘導される結合のベースラインを確立する。全長PlGF2123−144のC末端からまたは全長PlGF2123−144のN末端から1つ以上のアミノ酸残基だけトリミングされたPlGF2123−144ドメインを含むさらなる融合タンパク質を作製する。したがって、融合タンパク質の2つのファミリーを形成し、一方はPlGF2123−144のN末端において短縮しており、一方はPlGF2123−144のC末端において短縮している。表面結合ECMへの結合の計測により、PlGF2123−144の長さ(いずれかの末端からの)とECMタンパク質についての親和性との間の構造−機能関係の決定が可能となる。このドメイン内のアミノ酸の保存的置換も、同様に特性決定することができる。
実施例3
PlGF2123−144を含有するECM結合サイトカインの設計および産生
分子融合物、特にヒトサイトカイン(VEGF−A165、PDGF−BBおよびBMP−2)とPlGF2123−144ドメインとの融合タンパク質をコードする配列を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、哺乳動物発現ベクターpXLG中にアセンブルしてサイトカイン−PlGF2123−144(配列番号7、9、11、12および13)を得た。PlGF2123−144の包含に起因するタンパク質のミスフォールディング問題を回避するため、PlGF2123−144内の単一システイン(Cys142)を除去し、または別のアミノ酸、例えばセリンにより置換することができる(PlGF2123−144*)。融合タンパク質をHEK細胞中で発現させ、500mMのNaCl、20mMのリン酸ナトリウムおよび10mMのイミダゾールを含有する結合緩衝液、pH7.4を使用する固定化金属親和性クロマトグラフィーにより精製した。タンパク質をTris緩衝液(20mMのTris、150mMのNaCl、pH7.4)に対してさらに透析した。PlGF2123−144*を含有するサイトカインの設計例を図3に示す。
配列番号6:ヒトVEGF−A121
配列番号7:ヒトVEGF−A121−PlGF2123−144
PlGF2123−144を含有するECM結合サイトカインの設計および産生
分子融合物、特にヒトサイトカイン(VEGF−A165、PDGF−BBおよびBMP−2)とPlGF2123−144ドメインとの融合タンパク質をコードする配列を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、哺乳動物発現ベクターpXLG中にアセンブルしてサイトカイン−PlGF2123−144(配列番号7、9、11、12および13)を得た。PlGF2123−144の包含に起因するタンパク質のミスフォールディング問題を回避するため、PlGF2123−144内の単一システイン(Cys142)を除去し、または別のアミノ酸、例えばセリンにより置換することができる(PlGF2123−144*)。融合タンパク質をHEK細胞中で発現させ、500mMのNaCl、20mMのリン酸ナトリウムおよび10mMのイミダゾールを含有する結合緩衝液、pH7.4を使用する固定化金属親和性クロマトグラフィーにより精製した。タンパク質をTris緩衝液(20mMのTris、150mMのNaCl、pH7.4)に対してさらに透析した。PlGF2123−144*を含有するサイトカインの設計例を図3に示す。
配列番号6:ヒトVEGF−A121
表記VEGF−A−PlGF2123−144は、配列番号7を、およびPlGF2123−144ドメインを含むVEGF−Aの他の融合設計物を指すために使用される。
配列番号8:ヒトPDGF−BB
配列番号9:ヒトPDGF−BB−PlGF2123−144
配列番号10:ヒトBMP−2
配列番号11:ヒトBMP−2−PlGF2123−144
配列番号12:ヒトPlGF2123−144−BMP−2
配列番号13:ヒトBMP−2−PlGF2123−144*
配列番号8:ヒトPDGF−BB
実施例4
PlGF2123−144またはPlGF2123−144*により修飾されているサイトカインは、ECM成分についての向上した親和性を示す。
PlGF2123−144(*)により修飾されている種々のサイトカインの種々のECMタンパク質およびヘパラン硫酸への結合を試験し、結果を図4のパネルaおよびbに示す。解離定数を表1に示されるとおりに決定し、それはELISAにより計測された種々のECMタンパク質およびヘパラン硫酸に対するサイトカイン−PlGF2123−144(*)親和性定数を記載する。解離定数(KD)は、A450nm=Bmax*[濃度]/(KD+[濃度])を使用して非線形回帰により得た。PlGF2123−144(*)により修飾されているサイトカイン(VEGF−A121−PlGF2123−144、PDGF−BB−PlGF2123−144およびBMP−2−PlGF2123−144*)のECMタンパク質およびヘパラン硫酸に対する親和性は、野生型サイトカインよりもかなり高い(低いKD)ことが観察された。したがって、PlGF2のECMタンパク質についての親和性が、それぞれPlGF2123−144のVEGF−A165、PDGF−BBおよびBMP−2への融合によりVEGF−A165、PDGF−BBおよびBMP−2に付与された。
PlGF2123−144またはPlGF2123−144*により修飾されているサイトカインは、ECM成分についての向上した親和性を示す。
PlGF2123−144(*)により修飾されている種々のサイトカインの種々のECMタンパク質およびヘパラン硫酸への結合を試験し、結果を図4のパネルaおよびbに示す。解離定数を表1に示されるとおりに決定し、それはELISAにより計測された種々のECMタンパク質およびヘパラン硫酸に対するサイトカイン−PlGF2123−144(*)親和性定数を記載する。解離定数(KD)は、A450nm=Bmax*[濃度]/(KD+[濃度])を使用して非線形回帰により得た。PlGF2123−144(*)により修飾されているサイトカイン(VEGF−A121−PlGF2123−144、PDGF−BB−PlGF2123−144およびBMP−2−PlGF2123−144*)のECMタンパク質およびヘパラン硫酸に対する親和性は、野生型サイトカインよりもかなり高い(低いKD)ことが観察された。したがって、PlGF2のECMタンパク質についての親和性が、それぞれPlGF2123−144のVEGF−A165、PDGF−BBおよびBMP−2への融合によりVEGF−A165、PDGF−BBおよびBMP−2に付与された。
実施例5
PlGF2123−144(*)に融合しているまたはPlGF2123−133(*)により置換されているサイトカインドメインを有するECM結合サイトカインの設計
分子融合物、特にサイトカインとPlGF2123−144(*)ドメインとの融合タンパク質をコードする配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、哺乳動物発現ベクターpXLG中にアセンブルしてサイトカイン−PlGF2123−144(*)またはPlGF2123−144(*)−サイトカインを得た。PlGF2123−144(*)と、IGF−I、TGF−β1、TGF−β2、BDNFおよびNT−3のヒト形態との間の融合タンパク質を、配列番号15、17、18、20、22および24において設計する。PlGF2123−144(*)からのより短い配列を使用することもできる。配列番号1〜20を実際に作製し、配列番号21〜24をさらなる実施形態の例として示す。
配列番号14:ヒトIGF−I:
配列番号15:ヒトIGF−I−PlGF2123−144:
配列番号16:ヒトTGF−β1:
配列番号17:ヒトTGF−β1−PlGF2123−144:
配列番号18:ヒトPlGF2123−144*−TGF−β1:
配列番号19:ヒトTGF−β2:
配列番号20:ヒトPlGF2123−144*−TGF−β2
配列番号21:ヒトBDNF
配列番号22:ヒトBDNF−PlGF2123−144
配列番号23:ヒトNT−3:
配列番号24:ヒトNT−3−PlGF2123−144
PlGF2123−144(*)に融合しているまたはPlGF2123−133(*)により置換されているサイトカインドメインを有するECM結合サイトカインの設計
分子融合物、特にサイトカインとPlGF2123−144(*)ドメインとの融合タンパク質をコードする配列をポリメラーゼ連鎖反応により増幅させ、哺乳動物発現ベクターpXLG中にアセンブルしてサイトカイン−PlGF2123−144(*)またはPlGF2123−144(*)−サイトカインを得た。PlGF2123−144(*)と、IGF−I、TGF−β1、TGF−β2、BDNFおよびNT−3のヒト形態との間の融合タンパク質を、配列番号15、17、18、20、22および24において設計する。PlGF2123−144(*)からのより短い配列を使用することもできる。配列番号1〜20を実際に作製し、配列番号21〜24をさらなる実施形態の例として示す。
配列番号14:ヒトIGF−I:
実施例6
PlGF2123−144に融合しているサイトカインの活性
図5は結果を記載する。インビトロで、PlGF2123−144融合成長因子(GF)は、野生型GFと比較して類似の生物活性を示した。ヒトECをVEGF−A121、VEGF−A165またはVEGF−A−PlGF2123−144により刺激し、ヒト間葉幹細胞をPDGF−BBまたはPDGF−BB−PlGF2123−144により刺激した。リン酸化GF受容体(VEGFR−2およびPDGFR−β)をELISAにより定量した(n=3、平均±SEM)。PlGF2123−144のVEGF−AおよびPDGF−BB中への挿入は、それらのシグナリングを変えなかった。さらに、PlGF2123−144のVEGF−A121中への挿入は、その活性をVEGF−A165レベルに増加させた。BMP−2−PlGF2123−144*を、ヒト間葉幹細胞中のALP活性(骨芽細胞分化の誘導)を促進するその能力により評価した。細胞ALPをBMP−2またはBMP−2−PlGF2123−144*の存在下での培養の14日後に定量した。BMP−2またはBMP−2−PlGF2123−144*により処理された細胞間で細胞数およびALP活性の差異は観察されなかった。
PlGF2123−144に融合しているサイトカインの活性
図5は結果を記載する。インビトロで、PlGF2123−144融合成長因子(GF)は、野生型GFと比較して類似の生物活性を示した。ヒトECをVEGF−A121、VEGF−A165またはVEGF−A−PlGF2123−144により刺激し、ヒト間葉幹細胞をPDGF−BBまたはPDGF−BB−PlGF2123−144により刺激した。リン酸化GF受容体(VEGFR−2およびPDGFR−β)をELISAにより定量した(n=3、平均±SEM)。PlGF2123−144のVEGF−AおよびPDGF−BB中への挿入は、それらのシグナリングを変えなかった。さらに、PlGF2123−144のVEGF−A121中への挿入は、その活性をVEGF−A165レベルに増加させた。BMP−2−PlGF2123−144*を、ヒト間葉幹細胞中のALP活性(骨芽細胞分化の誘導)を促進するその能力により評価した。細胞ALPをBMP−2またはBMP−2−PlGF2123−144*の存在下での培養の14日後に定量した。BMP−2またはBMP−2−PlGF2123−144*により処理された細胞間で細胞数およびALP活性の差異は観察されなかった。
実施例7
PlGF2123−144(*)に融合しているサイトカインのインビボ保持
結果を図6に示す。ECM分子に結合し、インビボでそれにより保持されるECM超親和性サイトカインバリアントを創成した。例えば、マウスの背部皮膚中に皮下注射された場合、VEGF−A165は、注射部位から急速に消散し、3日後に皮膚組織中で10%残留したにすぎなかった。対照的に、注射されたVEGF−A−PlGF2123−144の約50%が3日後に残留し、10%超は6日後に検出することができた。さらに、野生型またはPlGF2123−144融合サイトカインを含有するフィブリンマトリックスにより充填されたマウスの背部皮膚または頭蓋冠中で、3および6日後に送達部位内で少量の野生型サイトカインが検出可能であった一方、PlGF2123−144融合サイトカインは、フィブリンマトリックス中でおよび欠損を包囲する組織内で顕著に保持された。
PlGF2123−144(*)に融合しているサイトカインのインビボ保持
結果を図6に示す。ECM分子に結合し、インビボでそれにより保持されるECM超親和性サイトカインバリアントを創成した。例えば、マウスの背部皮膚中に皮下注射された場合、VEGF−A165は、注射部位から急速に消散し、3日後に皮膚組織中で10%残留したにすぎなかった。対照的に、注射されたVEGF−A−PlGF2123−144の約50%が3日後に残留し、10%超は6日後に検出することができた。さらに、野生型またはPlGF2123−144融合サイトカインを含有するフィブリンマトリックスにより充填されたマウスの背部皮膚または頭蓋冠中で、3および6日後に送達部位内で少量の野生型サイトカインが検出可能であった一方、PlGF2123−144融合サイトカインは、フィブリンマトリックス中でおよび欠損を包囲する組織内で顕著に保持された。
実施例8
PlGF2123−144に融合しているサイトカインを含むフィブリンマトリックスによる皮膚創傷の処理
結果を図7に示す。サイトカインの慢性皮膚創傷治癒についての前臨床評価は、ヒト慢性創傷について最適な疾患モデルが依然として存在しないという事実にかかわらず、一般にげっ歯類において実施され、最も一般にはdb/db糖尿病マウス(Hanft JR,et al.,2008;Robson MC,et al.,1992;Robson MC,et al.,1992;Robson MC,et al.,2001)において実施される。これにもかかわらず、遺伝子改変されたdb/dbマウスが糖尿病損害皮膚創傷治癒について臨床的に関連するモデルを表すというコンセンサスが存在する(Davidson JM,1998;Sullivan SR,et al.,2004)。db/dbマウスモデルにおける成功により、臨床試験が直接可能となる(Hanft JR,et al.,2008;Robson MC,et al.,1992)。全層背部皮膚創傷を、フィブリンマトリックス中で1回送達されるまたは単に3から4回局所適用されるほぼ100倍低い用量のサイトカイン(それぞれ200ngのPDGF−BBおよびVEGF−A、組合せ)により処理した。これらの低用量の野生型PDGF−BBおよびVEGF−A(フィブリン中での送達または局所送達)は、創傷閉鎖(後半は再上皮化により示される)の程度または肉芽組織の量のいずれかにより示されるとおり、未処理またはフィブリン単独処理創傷と比較して創傷治癒をそれほど向上させなかった。対照的に、エンジニアリングされたECM超親和性PlGF2123−144融合PDGF−BBおよびVEGF−Aにより処理された創傷は、局所およびフィブリン中の両方で、顕著に早い創傷閉鎖およびより多くの肉芽組織をもたらした。血管新生は新たに形成された肉芽組織の保持における重要なステップであるため(Gurtner GC,et al.,2008)、血管新生が処理間でどの程度異なるかに着目した。CD31(ECにより高度に発現)およびデスミン(血管を安定化させる平滑筋細胞(SMC)により発現)についての免疫組織学的分析により、PlGF2123−144融合GFが送達された場合に肉芽組織内の血管新生がかなり著しいことが明らかになった。例えば、連続5日間局所適用される20μg/創傷のVEGF−A165または10μg/創傷のPDGF−BB(REGRANEX(登録商標))が、db/dbマウスにおいて有効であると報告されている(Chan RK,et al.,2006;Galiano RD,et al.,2004)。
PlGF2123−144に融合しているサイトカインを含むフィブリンマトリックスによる皮膚創傷の処理
結果を図7に示す。サイトカインの慢性皮膚創傷治癒についての前臨床評価は、ヒト慢性創傷について最適な疾患モデルが依然として存在しないという事実にかかわらず、一般にげっ歯類において実施され、最も一般にはdb/db糖尿病マウス(Hanft JR,et al.,2008;Robson MC,et al.,1992;Robson MC,et al.,1992;Robson MC,et al.,2001)において実施される。これにもかかわらず、遺伝子改変されたdb/dbマウスが糖尿病損害皮膚創傷治癒について臨床的に関連するモデルを表すというコンセンサスが存在する(Davidson JM,1998;Sullivan SR,et al.,2004)。db/dbマウスモデルにおける成功により、臨床試験が直接可能となる(Hanft JR,et al.,2008;Robson MC,et al.,1992)。全層背部皮膚創傷を、フィブリンマトリックス中で1回送達されるまたは単に3から4回局所適用されるほぼ100倍低い用量のサイトカイン(それぞれ200ngのPDGF−BBおよびVEGF−A、組合せ)により処理した。これらの低用量の野生型PDGF−BBおよびVEGF−A(フィブリン中での送達または局所送達)は、創傷閉鎖(後半は再上皮化により示される)の程度または肉芽組織の量のいずれかにより示されるとおり、未処理またはフィブリン単独処理創傷と比較して創傷治癒をそれほど向上させなかった。対照的に、エンジニアリングされたECM超親和性PlGF2123−144融合PDGF−BBおよびVEGF−Aにより処理された創傷は、局所およびフィブリン中の両方で、顕著に早い創傷閉鎖およびより多くの肉芽組織をもたらした。血管新生は新たに形成された肉芽組織の保持における重要なステップであるため(Gurtner GC,et al.,2008)、血管新生が処理間でどの程度異なるかに着目した。CD31(ECにより高度に発現)およびデスミン(血管を安定化させる平滑筋細胞(SMC)により発現)についての免疫組織学的分析により、PlGF2123−144融合GFが送達された場合に肉芽組織内の血管新生がかなり著しいことが明らかになった。例えば、連続5日間局所適用される20μg/創傷のVEGF−A165または10μg/創傷のPDGF−BB(REGRANEX(登録商標))が、db/dbマウスにおいて有効であると報告されている(Chan RK,et al.,2006;Galiano RD,et al.,2004)。
実施例9
PlGF2123−144に融合しているVEGF−Aにより誘導される血管浸透性
結果を図8に示す。VEGF−A−PlGF2123−144は、同一用量の野生型VEGF−A165(10μg)よりもかなり低い血管浸透性を誘導する。血管浸透性は、マウス耳介皮膚中で計測した。VEGF−Aにより誘導される浸透性を、血管から滲出する赤色標識デキストランにより可視化した。VEGF−A165をVEGF−A−PlGF2123−144と比較した。マウス耳介皮膚血管系の画像をVEGF−A適用後に分析した。結果は、このアプローチがVEGF−Aの臨床使用への転換において生じる主要な問題を解決し得ることを示した。実際、VEGF受容体2(VEGF−R2)のVEGF−A活性化は血管新生を促進するための強力なアプローチであり得る一方、VEGF−Aの実際の投与は、血管浸透性を急速に誘導し、それが全身性低血圧および浮腫をもたらすことが示されており;この現象は、末梢および心血管用途における用量を制限する毒性応答であり(Simons M and Ware JA,2003)、再生医療における深刻な問題を提示する。VEGF−A−PlGF2123−144が向上した内因性ECMへの結合能を有するため、VEGF−A−PlGF2123−144はより低い血管浸透性を誘導し得た。マウス耳介の皮膚中の血管からのデキストラン漏出のモデル(Kilarski WW,et al.,2013)において、10μgのVEGF−A−PlGF2123−144の適用に起因する滲出の比率は、それがVEGF−A165と同等のVEGFR−2のリン酸化における活性を示したにもかかわらず野生型VEGF−A165の適用に起因するものの19±7%にすぎなかった。したがって、VEGF−A−PlGF2123−144を形成するためのVEGF−Aのエンジニアリングは、血管新生(皮膚創傷治癒のモデルにおいて示される)を過浸透性から分断すると考えられ、VEGF−Aの臨床転換に伴う主要な問題を潜在的に解決する。
PlGF2123−144に融合しているVEGF−Aにより誘導される血管浸透性
結果を図8に示す。VEGF−A−PlGF2123−144は、同一用量の野生型VEGF−A165(10μg)よりもかなり低い血管浸透性を誘導する。血管浸透性は、マウス耳介皮膚中で計測した。VEGF−Aにより誘導される浸透性を、血管から滲出する赤色標識デキストランにより可視化した。VEGF−A165をVEGF−A−PlGF2123−144と比較した。マウス耳介皮膚血管系の画像をVEGF−A適用後に分析した。結果は、このアプローチがVEGF−Aの臨床使用への転換において生じる主要な問題を解決し得ることを示した。実際、VEGF受容体2(VEGF−R2)のVEGF−A活性化は血管新生を促進するための強力なアプローチであり得る一方、VEGF−Aの実際の投与は、血管浸透性を急速に誘導し、それが全身性低血圧および浮腫をもたらすことが示されており;この現象は、末梢および心血管用途における用量を制限する毒性応答であり(Simons M and Ware JA,2003)、再生医療における深刻な問題を提示する。VEGF−A−PlGF2123−144が向上した内因性ECMへの結合能を有するため、VEGF−A−PlGF2123−144はより低い血管浸透性を誘導し得た。マウス耳介の皮膚中の血管からのデキストラン漏出のモデル(Kilarski WW,et al.,2013)において、10μgのVEGF−A−PlGF2123−144の適用に起因する滲出の比率は、それがVEGF−A165と同等のVEGFR−2のリン酸化における活性を示したにもかかわらず野生型VEGF−A165の適用に起因するものの19±7%にすぎなかった。したがって、VEGF−A−PlGF2123−144を形成するためのVEGF−Aのエンジニアリングは、血管新生(皮膚創傷治癒のモデルにおいて示される)を過浸透性から分断すると考えられ、VEGF−Aの臨床転換に伴う主要な問題を潜在的に解決する。
実施例10
PlGF2123−144に融合しているサイトカインを含むフィブリンマトリックスによる骨欠損の処理
結果を図9に示す。PlGF2123−144に融合しているサイトカインは、骨治癒のための微小環境のエンジニアリングにおいて有用である。サイトカインBMP−2およびPDGF−BBは骨修復に有益であるため(Hollinger JO,et al.,2008)、低用量のBMP−2(200ng)およびPDGF−BB(200ng)の組合せを含有するフィブリンマトリックスを骨修復について評価した。ヒトへの転換潜在性を説明するための関連モデルは、骨格的に成熟したラットにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損であり、それは偽関節の骨治癒についての標準的および臨床的に関連するモデルである(Hollinger JO and Kleinschmidt JC,1990;Muschler GF,et al.)。骨修復材料および骨誘導タンパク質の前臨床評価は、一般に、臨界サイズの骨欠損モデル、例えばラットにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損を含む(Hollinger JO and Kleinschmidt JC,1990)。BMP−2−PlGF2123−144*とPDGF−BB−PlGF2123−144との組合せ(それぞれ200ng)をフィブリンマトリックス中で送達し、または外科的な皮膚閉鎖前にいくらかより高用量(それぞれ1μg、組合せ)において硬膜に局所送達した。4週間後、骨治癒(骨組織沈着および欠損の被覆により特性決定した)を、マイクロコンピュータ断層撮影法(マイクロCT)を使用して分析した。野生型GFの単独またはフィブリン内での送達は、未処理またはフィブリンのみにより処理された欠損と比較して骨治癒をわずかに増加させた。対照的に、PlGF2123−144融合GFによる処理は、野生型GFと比較して骨組織沈着の顕著な増加をもたらした。比較のため、1μgは、通常、ラットにおける6mmの頭蓋冠欠損を治療するためには不十分であり(Schmoekel HG,et al.,2005)、ヒトにおける脛骨骨折を治療するためにミリグラム量のBMP−2が必要とされる(Gautschi OP,et al.,2007)。
PlGF2123−144に融合しているサイトカインを含むフィブリンマトリックスによる骨欠損の処理
結果を図9に示す。PlGF2123−144に融合しているサイトカインは、骨治癒のための微小環境のエンジニアリングにおいて有用である。サイトカインBMP−2およびPDGF−BBは骨修復に有益であるため(Hollinger JO,et al.,2008)、低用量のBMP−2(200ng)およびPDGF−BB(200ng)の組合せを含有するフィブリンマトリックスを骨修復について評価した。ヒトへの転換潜在性を説明するための関連モデルは、骨格的に成熟したラットにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損であり、それは偽関節の骨治癒についての標準的および臨床的に関連するモデルである(Hollinger JO and Kleinschmidt JC,1990;Muschler GF,et al.)。骨修復材料および骨誘導タンパク質の前臨床評価は、一般に、臨界サイズの骨欠損モデル、例えばラットにおける臨界サイズの頭蓋冠欠損を含む(Hollinger JO and Kleinschmidt JC,1990)。BMP−2−PlGF2123−144*とPDGF−BB−PlGF2123−144との組合せ(それぞれ200ng)をフィブリンマトリックス中で送達し、または外科的な皮膚閉鎖前にいくらかより高用量(それぞれ1μg、組合せ)において硬膜に局所送達した。4週間後、骨治癒(骨組織沈着および欠損の被覆により特性決定した)を、マイクロコンピュータ断層撮影法(マイクロCT)を使用して分析した。野生型GFの単独またはフィブリン内での送達は、未処理またはフィブリンのみにより処理された欠損と比較して骨治癒をわずかに増加させた。対照的に、PlGF2123−144融合GFによる処理は、野生型GFと比較して骨組織沈着の顕著な増加をもたらした。比較のため、1μgは、通常、ラットにおける6mmの頭蓋冠欠損を治療するためには不十分であり(Schmoekel HG,et al.,2005)、ヒトにおける脛骨骨折を治療するためにミリグラム量のBMP−2が必要とされる(Gautschi OP,et al.,2007)。
実施例11
PlGF2123−144ドメインに融合しているECMタンパク質の接着ドメインのエンジニアリング
細胞接着促進ドメインをフィブリンマトリックス内に取り込むため、FN III10とFN III9−10とPlGF2123−144との分子融合物が有用である。配列番号25は、本明細書を読む当業者により容易に作製することができるFNIII9−10を使用する設計を表す。
配列番号25:ヒトFN III9−10−PlGF2123−144
PlGF2123−144ドメインに融合しているECMタンパク質の接着ドメインのエンジニアリング
細胞接着促進ドメインをフィブリンマトリックス内に取り込むため、FN III10とFN III9−10とPlGF2123−144との分子融合物が有用である。配列番号25は、本明細書を読む当業者により容易に作製することができるFNIII9−10を使用する設計を表す。
配列番号25:ヒトFN III9−10−PlGF2123−144
実施例12
PlGF2123−144ドメインを利用するフィブリンマトリックスからの徐放のためのタンパク質薬物のエンジニアリング
PTH1−34は、系の骨量の調節において有用であることが公知であり、フィブリン結合PTH1−34バリアントの局所適用は、局所骨形成を刺激することが示されている(Arrighi I,et al.,2009)。PTH1−34とPlGF2123−144との融合タンパク質を配列番号27におけるとおり設計し;このタンパク質は本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号26:ヒトPTH1−34
配列番号27:ヒトPTH1−34−PlGF2123−144
PlGF2123−144ドメインを利用するフィブリンマトリックスからの徐放のためのタンパク質薬物のエンジニアリング
PTH1−34は、系の骨量の調節において有用であることが公知であり、フィブリン結合PTH1−34バリアントの局所適用は、局所骨形成を刺激することが示されている(Arrighi I,et al.,2009)。PTH1−34とPlGF2123−144との融合タンパク質を配列番号27におけるとおり設計し;このタンパク質は本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号26:ヒトPTH1−34
実施例13
PlGF2123−144に融合しているプロテアーゼ阻害剤のエンジニアリング
フィブリンは、アプロチニンまたは他のプロテアーゼ阻害剤を添加してもインビボで比較的急速に吸収されることに起因して他の用途における使用の拡張が制限されているにもかかわらず、止血および密封に長きにわたり臨床使用されている。フィブリンマトリックス中でのプロテアーゼ阻害剤アプロチニンの保持は、アプロチニンとPlGF2123−144との融合物の設計および使用により達成することができる。この融合物を配列番号29におけるとおり設計し;このタンパク質は本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号28:ウシアプロチニン
配列番号29:ウシアプロチニン−PlGF2123−144
PlGF2123−144に融合しているプロテアーゼ阻害剤のエンジニアリング
フィブリンは、アプロチニンまたは他のプロテアーゼ阻害剤を添加してもインビボで比較的急速に吸収されることに起因して他の用途における使用の拡張が制限されているにもかかわらず、止血および密封に長きにわたり臨床使用されている。フィブリンマトリックス中でのプロテアーゼ阻害剤アプロチニンの保持は、アプロチニンとPlGF2123−144との融合物の設計および使用により達成することができる。この融合物を配列番号29におけるとおり設計し;このタンパク質は本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号28:ウシアプロチニン
実施例14
PlGF2123−144に融合しているケモカインのエンジニアリング
フィブリン結合ケモカインは、免疫調節および免疫療法、例としてワクチン接種において有用である。ケモカインCXCL10、CXCL11、IFN−γおよびCCL21とPlGF2123−144との融合物を、それぞれ配列番号31、33、35および37において設計する。これらのタンパク質は、本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号30:ヒトCXCL10
配列番号31:ヒトCXCL10−PlGF2123−144
配列番号32:ヒトCXCL11−PlGF2123−144
配列番号33:ヒトCXCL11−PlGF2123−144
配列番号34:ヒトIFN−γ
配列番号35:ヒトIFN−γ−PlGF2123−144
配列番号36:ヒトCCL21
配列番号37:ヒトCCL21−PlGF2123−144
PlGF2123−144に融合しているケモカインのエンジニアリング
フィブリン結合ケモカインは、免疫調節および免疫療法、例としてワクチン接種において有用である。ケモカインCXCL10、CXCL11、IFN−γおよびCCL21とPlGF2123−144との融合物を、それぞれ配列番号31、33、35および37において設計する。これらのタンパク質は、本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号30:ヒトCXCL10
実施例15
PlGF2123−144に融合しているペプチドおよびタンパク質抗原のエンジニアリング
L−ドーパクロムトートメラーゼは、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP−2)とも称され、ヒト黒色腫関連抗原として同定されており、ヒトおよびマウスにおけるほとんどの黒色腫および正常メラニン細胞により発現される。ヒトTRP−2タンパク質またはペプチドパルス樹状細胞は、特異的CD8+T細胞の誘導を示しており、このことは、自己反応性TRP−2CD81T細胞エピトープ180−188(trp2)特異的細胞が胸腺選択を免れ得ることを示唆する(Sierro SR,et al.,2011)。PlGF2123−144のフィブリン結合親和性を使用して抗原をワクチンとして使用されるフィブリンマトリックス中に取り込むことができる。黒色腫の治療における癌ワクチンに関連する抗原を、TRP−2からの特異的ペプチド抗原を含む配列番号39として、および完全タンパク質TRP−2を含む配列番号41として設計し、両方の場合においてPlGF2123−144に融合させる。これらの実験は、当業者がそれらの方法をいかにそれらのまたは他の抗原の使用に容易に適合させることができるかを示すように設計および提示する。
配列番号38:ヒトL−ドーパクロムトートメラーゼ180−188
配列番号39:ヒトPlGF2123−144/第X因子に由来するプラスミン開裂部位/L−ドーパクロムトートメラーゼ180−188
配列番号40:ヒトL−ドーパクロムトートメラーゼ
配列番号41:ヒトL−ドーパクロムトートメラーゼ−PlGF2123−144
PlGF2123−144に融合しているペプチドおよびタンパク質抗原のエンジニアリング
L−ドーパクロムトートメラーゼは、チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP−2)とも称され、ヒト黒色腫関連抗原として同定されており、ヒトおよびマウスにおけるほとんどの黒色腫および正常メラニン細胞により発現される。ヒトTRP−2タンパク質またはペプチドパルス樹状細胞は、特異的CD8+T細胞の誘導を示しており、このことは、自己反応性TRP−2CD81T細胞エピトープ180−188(trp2)特異的細胞が胸腺選択を免れ得ることを示唆する(Sierro SR,et al.,2011)。PlGF2123−144のフィブリン結合親和性を使用して抗原をワクチンとして使用されるフィブリンマトリックス中に取り込むことができる。黒色腫の治療における癌ワクチンに関連する抗原を、TRP−2からの特異的ペプチド抗原を含む配列番号39として、および完全タンパク質TRP−2を含む配列番号41として設計し、両方の場合においてPlGF2123−144に融合させる。これらの実験は、当業者がそれらの方法をいかにそれらのまたは他の抗原の使用に容易に適合させることができるかを示すように設計および提示する。
配列番号38:ヒトL−ドーパクロムトートメラーゼ180−188
実施例16
PlGF2123−144に融合しているToll様受容体アゴニストのエンジニアリング
危険シグナルが取り込まれたワクチンは、取り込まれた抗原に対する免疫応答を活性化させるためのシグナルを提供する。ECMタンパク質断片TNCフィブリン球状ドメイン(フィブリノーゲン球状ドメインとも称される)は、そのような危険シグナルである。危険シグナルドメインは、PlGF2123−144のフィブリンについての親和性によりフィブリンマトリックス中に取り込むことができる。TNCフィブリン球状物(配列番号42)とPlGF2123−144との融合タンパク質を配列番号43において設計する。
配列番号42:ヒトTNCフィブリノーゲン球状ドメイン
配列番号43:ヒトTNCフィブリノーゲン球状ドメイン−PlGF2123−144
PlGF2123−144に融合しているToll様受容体アゴニストのエンジニアリング
危険シグナルが取り込まれたワクチンは、取り込まれた抗原に対する免疫応答を活性化させるためのシグナルを提供する。ECMタンパク質断片TNCフィブリン球状ドメイン(フィブリノーゲン球状ドメインとも称される)は、そのような危険シグナルである。危険シグナルドメインは、PlGF2123−144のフィブリンについての親和性によりフィブリンマトリックス中に取り込むことができる。TNCフィブリン球状物(配列番号42)とPlGF2123−144との融合タンパク質を配列番号43において設計する。
配列番号42:ヒトTNCフィブリノーゲン球状ドメイン
実施例17
PlGF2123−144を含有するサイトカインの組織保持
サイトカインFGF18は、変形性関節症モデルの動物の関節中で注射された場合に改善された軟骨修復をもたらすことが示されている(Moore EE,et al.,2005)。注射部位からの消失は、このアプローチの効力を制限する。細胞外マトリックス結合FGF18バリアントを、配列番号45において設計されるFGF18とPlGF2123−144との間の融合タンパク質により提供する。このタンパク質は、他の薬剤またはサイトカインのための他の媒体と同様、本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号44:ヒトFGF18
配列番号45:ヒトFGF18−PlGF2123−144
PlGF2123−144を含有するサイトカインの組織保持
サイトカインFGF18は、変形性関節症モデルの動物の関節中で注射された場合に改善された軟骨修復をもたらすことが示されている(Moore EE,et al.,2005)。注射部位からの消失は、このアプローチの効力を制限する。細胞外マトリックス結合FGF18バリアントを、配列番号45において設計されるFGF18とPlGF2123−144との間の融合タンパク質により提供する。このタンパク質は、他の薬剤またはサイトカインのための他の媒体と同様、本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号44:ヒトFGF18
FGF−18内の天然ドメインがPlFG−2ドメインにより置き換えられている他のFGF−18バリアントを作製することができる。仮定ヘパリン結合ドメイン、すなわちKRYPKGQPELQKPFKYTTVTKRSRRIR(配列番号56)はFGF−18内に存在し、この重要なドメインはKRSRRIR(配列番号57)である。したがって、1つの置換実施は、KRSRRIRドメインをPlGF2ドメインにより置き換えることであり、例えば配列番号53である。
配列番号53:ヒトFGF18−PlGF2123−138
配列番号53:ヒトFGF18−PlGF2123−138
第2の置換例は、PlGF2119−144、すなわちMKPERRRPKGRGKRRREKQRPTDCHL(配列番号55)を使用してFGF−18内のアミノ酸により良好に一致させるようにPlGF2ドメインをそのN末端上で拡張することであり、配列番号54である。他の考えられる実施も存在する。
配列番号54:ヒトFGF18−PlGF2121−138
配列番号54:ヒトFGF18−PlGF2121−138
サイトカインTGF−β3は、皮膚瘢痕、例えば術後切開瘢痕の制限において広く調査されており、サイトカインは、そのような切開線に沿って注射された(Ferguson MW,et al.,2009)。注射部位からの消失は、このアプローチの効力を制限する。細胞外マトリックス結合TGF−β3バリアントを、配列番号47において設計されるTGF−β3とPlGF2123−144*と間の融合タンパク質により提供する。このタンパク質は、他の薬剤またはサイトカインのための他の媒体と同様、本明細書を読む当業者により容易に作製することができる。
配列番号46:ヒトTGF−β3:
配列番号47:ヒトPlGF2123−144*−TGF−β3:
配列番号46:ヒトTGF−β3:
さらなる開示
1.生物学的薬剤と、0から約15%の保存的置換を有する配列番号4および0から約15%の保存的置換を有する配列番号5からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも5または6または7残基の部分配列を含むペプチドとの分子融合物を含む、生物学的送達媒体。前記ペプチドは、フィブリノーゲンへの特異的結合を示す。2.前記ペプチドが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチン、フィブリンおよびヘパラン硫酸への特異的結合を示す、1の媒体。3.前記ペプチドが、約24、約40または約100nM未満の解離定数(Kd)でフィブリノーゲンへの特異的結合を有する、1または2の媒体。4.前記生物学的薬剤が、タンパク質、タンパク質薬物、マーカー、免疫剤、ケモカイン、サイトカインおよび細胞接着ペプチドからなる群から選択される、1〜3のいずれかの媒体。5.前記分子融合物が、生物学的薬剤およびペプチドを含む組換えタンパク質を含む、1〜4のいずれかの媒体。6.前記分子融合物が、前記薬剤および前記ペプチドと共有結合しているリンカーを含む、1〜4のいずれかの媒体。7.前記リンカーが、前記ペプチドのN末端またはC末端への第1の共有結合および前記生物学的薬剤への第2の共有結合を有するポリマーを含む、6の媒体。8.前記分子融合物が、前記生物学的薬剤および前記ペプチドに連結している粒子を含む、1〜4のいずれかの媒体。9.前記粒子が、マイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、ミセルおよびリポソームからなる群から選択される、8の媒体。10.生理学的溶液中で可溶性またはコロイドであり、全ての成分が、約500μm未満の最大寸法である、8の媒体。11.前記粒子が、前記生物学的薬剤および/または前記ペプチドへの共有結合に関与する複数のアミンおよび/またはチオールを含む、8の媒体。12.前記生物学的薬剤が、上皮成長因子(EGF)、VEGF、VEGF−A、VEGF−C、PDGF、PDGF−AB、PDGF−BB、FGF、FGF−2、FGF−18、IGF、IGF−1、BMP、BMP−2、BMP−7、TGF−β、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、神経栄養因子、NT−3およびBDNFからなる群から選択されるサイトカインを含む、1〜11のいずれかの媒体。13.前記生物学的薬剤が、インターフェロン、INF−ベータ、CXCLケモカイン、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCLケモカインおよびCCL21からなる群から選択されるケモカインを含む、1〜11のいずれかの媒体。14.前記生物学的薬剤が、免疫剤を含む、1〜11のいずれかの媒体。15.前記免疫剤が抗原を提供する、14の媒体。16.前記抗原がチロシン関連タンパク質2(TRP−2)の少なくとも一部分である、15の媒体。17.前記免疫剤が危険シグナルを含む、14の媒体。18.前記危険シグナルがテネイシンの球状ドメインまたはフィブロネクチンのEDAドメインを含む、17の媒体。19.前記生物学的薬剤が細胞接着ペプチドを含む、1〜11のいずれかの媒体。20.前記細胞接着ペプチドがインテグリンおよびカドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体についてのリガンドを含む、19の媒体。21.前記細胞接着ペプチドが、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンFN III10ドメイン、フィブロネクチンFN III9−10ドメイン、フィブロネクチンIII型リピート1から5の1つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンCの3番目のFN III型リピート、テネイシンのFN III9−10ドメイン、RGD、RGDS、RGDSP、KLDAPT、IDGIHEL、IDAPS、LDVおよびREDVからなる群から選択される細胞接着モチーフを含む、19の媒体。22.前記生物学的薬剤が、プロテアーゼ阻害剤を含む、1〜11のいずれかの媒体。
1.生物学的薬剤と、0から約15%の保存的置換を有する配列番号4および0から約15%の保存的置換を有する配列番号5からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも5または6または7残基の部分配列を含むペプチドとの分子融合物を含む、生物学的送達媒体。前記ペプチドは、フィブリノーゲンへの特異的結合を示す。2.前記ペプチドが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチン、フィブリンおよびヘパラン硫酸への特異的結合を示す、1の媒体。3.前記ペプチドが、約24、約40または約100nM未満の解離定数(Kd)でフィブリノーゲンへの特異的結合を有する、1または2の媒体。4.前記生物学的薬剤が、タンパク質、タンパク質薬物、マーカー、免疫剤、ケモカイン、サイトカインおよび細胞接着ペプチドからなる群から選択される、1〜3のいずれかの媒体。5.前記分子融合物が、生物学的薬剤およびペプチドを含む組換えタンパク質を含む、1〜4のいずれかの媒体。6.前記分子融合物が、前記薬剤および前記ペプチドと共有結合しているリンカーを含む、1〜4のいずれかの媒体。7.前記リンカーが、前記ペプチドのN末端またはC末端への第1の共有結合および前記生物学的薬剤への第2の共有結合を有するポリマーを含む、6の媒体。8.前記分子融合物が、前記生物学的薬剤および前記ペプチドに連結している粒子を含む、1〜4のいずれかの媒体。9.前記粒子が、マイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、ミセルおよびリポソームからなる群から選択される、8の媒体。10.生理学的溶液中で可溶性またはコロイドであり、全ての成分が、約500μm未満の最大寸法である、8の媒体。11.前記粒子が、前記生物学的薬剤および/または前記ペプチドへの共有結合に関与する複数のアミンおよび/またはチオールを含む、8の媒体。12.前記生物学的薬剤が、上皮成長因子(EGF)、VEGF、VEGF−A、VEGF−C、PDGF、PDGF−AB、PDGF−BB、FGF、FGF−2、FGF−18、IGF、IGF−1、BMP、BMP−2、BMP−7、TGF−β、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、神経栄養因子、NT−3およびBDNFからなる群から選択されるサイトカインを含む、1〜11のいずれかの媒体。13.前記生物学的薬剤が、インターフェロン、INF−ベータ、CXCLケモカイン、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCLケモカインおよびCCL21からなる群から選択されるケモカインを含む、1〜11のいずれかの媒体。14.前記生物学的薬剤が、免疫剤を含む、1〜11のいずれかの媒体。15.前記免疫剤が抗原を提供する、14の媒体。16.前記抗原がチロシン関連タンパク質2(TRP−2)の少なくとも一部分である、15の媒体。17.前記免疫剤が危険シグナルを含む、14の媒体。18.前記危険シグナルがテネイシンの球状ドメインまたはフィブロネクチンのEDAドメインを含む、17の媒体。19.前記生物学的薬剤が細胞接着ペプチドを含む、1〜11のいずれかの媒体。20.前記細胞接着ペプチドがインテグリンおよびカドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体についてのリガンドを含む、19の媒体。21.前記細胞接着ペプチドが、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンFN III10ドメイン、フィブロネクチンFN III9−10ドメイン、フィブロネクチンIII型リピート1から5の1つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンCの3番目のFN III型リピート、テネイシンのFN III9−10ドメイン、RGD、RGDS、RGDSP、KLDAPT、IDGIHEL、IDAPS、LDVおよびREDVからなる群から選択される細胞接着モチーフを含む、19の媒体。22.前記生物学的薬剤が、プロテアーゼ阻害剤を含む、1〜11のいずれかの媒体。
23.PlGF2ドメインを含むように誘導体化されているサイトカインを含む生体分子。24.前記サイトカインの内因性細胞外マトリックス結合ドメインが除去または不能化された、23の生体分子。25.前記誘導体化されているサイトカインが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチンおよびフィブリンからなる群から選択される細胞外マトリックス分子への特異的結合を有する、23または24の生体分子。26.前記誘導体化されているサイトカインと前記細胞外マトリックス分子との結合の解離定数が、未誘導体化サイトカインの同一の細胞外マトリックス分子への結合の解離定数の50%未満である、25の生体分子。27.前記サイトカインが、上皮成長因子(EGF)、VEGF、VEGF−A、VEGF−C、PDGF、PDGF−AB、PDGF−BB、FGF、FGF−2、FGF−18、IGF、IGF−1、BMP、BMP−2、BMP−7、TGF−β、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、神経栄養因子、NT−3およびBDNFからなる群から選択される、23〜26のいずれかの生体分子。28.生物学的薬剤をさらに含む融合タンパク質または分子融合物である、23〜27のいずれかの生体分子。
0から約15%の保存的置換を有する配列番号4および0から約15%の保存的置換を有する配列番号5からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも6残基(または少なくとも5または少なくとも7または少なくとも8)の部分配列を含み、フィブリノーゲンへの特異的結合を示す、単離されたポリペプチド。29.フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチンおよびフィブリンへの特異的結合をさらに示す、28のポリペプチド。30.フィブリノーゲンへの特異的結合が、約25nM未満の解離定数(Kd)を有する、28または29のポリペプチド。31.前記配列が、配列番号4および配列番号5からなる群から選択される、28〜30のいずれかのポリペプチド。32.28〜31のいずれかのポリペプチドを含む融合タンパク質。
33.マトリックスを含み、前記マトリックスが、0から約15%の保存的置換を有する配列番号4および0から約15%の保存的置換を有する配列番号5からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも6残基の部分配列を含むペプチドを含み、前記ペプチドが、前記マトリックスへの特異的結合を示す、生体材料。34.前記ペプチドの前記マトリックスへの特異的結合が、約100nM未満の解離定数(Kd)を有する、33の生体材料。35.前記ペプチドの前記マトリックスへの特異的結合が、約25nM未満の解離定数(Kd)を有する、33の生体材料。36.前記ペプチドが、前記マトリックスに特異的に結合しており、生体分子への結合に利用可能である、33〜35のいずれかの生体材料。37.前記ペプチドが、前記マトリックスへの共有結合を含まない、33または34の生体材料。38.前記ペプチドに特異的に結合する細胞外マトリックスドメインを含む、33〜37のいずれかの生体材料。39.前記細胞外マトリックスドメインが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチンおよびフィブリンからなる群から選択される生体分子のドメインである、38の生体材料。40.親水性ポリマーを含み、前記ペプチドが、トランスグルタミナーゼ基質を介して前記マトリックスに付着しており、結合が前記基質と前記ポリペプチドとの間でトランスグルタミナーゼ酵素により形成される、33〜39のいずれかの生体材料。41.前記ポリマーまたは前記ペプチドが、NQEQVSPL(配列番号50)を含むトランスグルタミナーゼ基質を含む、40の生体材料。42.前記ペプチドと生物学的薬剤との分子融合物をさらに含む、33〜41のいずれかの生体材料。43.前記生物学的薬剤が、上皮成長因子(EGF)、VEGF、VEGF−A、VEGF−C、PDGF、PDGF−AB、PDGF−BB、FGF、FGF−2、FGF−18、IGF、IGF−1、BMP、BMP−2、BMP−7、TGF−β、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、神経栄養因子、NT−3およびBDNFからなる群から選択されるサイトカインを含む、42の生体材料。44.前記生物学的薬剤が、インターフェロン、INF− 、CXCLケモカイン、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCLケモカインおよびCCL21からなる群から選択されるケモカインを含む生物学的薬剤を含む、42の生体材料。45.前記生物学的薬剤が免疫剤を含む、42の生体材料。46.前記免疫剤が抗原を提供する、42の生体材料。47.前記抗原がチロシン関連タンパク質2(TRP−2)の少なくとも一部分である、42の生体材料。48.前記免疫剤が危険シグナルを含む、42の生体材料。49.前記危険シグナルがテネイシンの球状ドメインまたはフィブロネクチンのEDAドメインを含む、48の生体材料。50.前記生物学的薬剤が細胞接着ペプチドを含む、42の生体材料。51.前記細胞接着ペプチドがインテグリン、カドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体についてのリガンドを含む、42の生体材料。52.前記細胞接着ペプチドが、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンFN III10ドメイン、フィブロネクチンFNIII 9−10ドメイン、フィブロネクチンIII型リピート1から5の1つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンCの3番目のFN III型リピート、テネイシンのFN III9−10ドメイン、RGD、RGDS、RGDSP、KLDAPT、IDGIHEL、IDAPS、LDVおよびREDVからなる群から選択される細胞接着モチーフを含む、42の生体材料。53.前記生物学的薬剤が、プロテアーゼ阻害剤を含む、42の生体材料。54.前記生物学的薬剤が、プロテアーゼ阻害剤を含む、28〜53のいずれかの生体材料。55.前記プロテアーゼ阻害剤が、アプロチニンを含み、前記マトリックスが、フィブリンを含む、54の生体材料。56.複数の分子融合物をさらに含み、前記複数の融合物のそれぞれが、前記ペプチドの少なくとも1つと融合している異なる生物学的薬剤を有する、28〜55のいずれかの生体材料。57.2から10の分子融合物を含み、前記融合物のそれぞれについての前記生物学的薬剤が、独立して選択される、56の生体材料。58.前記複数の分子融合物が、上皮成長因子(EGF)、VEGF、VEGF−A、VEGF−C、PDGF、PDGF−AB、PDGF−BB、FGF、FGF−2、FGF−18、IGF、IGF−1、BMP、BMP−2、BMP−7、TGF−β、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、神経栄養因子、NT−3、BDNF、インターフェロン−β、インターフェロン、CXCLケモカイン、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCLケモカインおよびCCL21、球状ドメイン、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンFN III10ドメイン、フィブロネクチンFN III9−10ドメイン、フィブロネクチンIII型リピート1から5の1つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンCの3番目のFN III型リピート、テネイシンのFN III9−10ドメイン、RGD、RGDS、RGDSP、KLDAPT、IDGIHEL、IDAPS、LDVおよびREDVからなる群から独立して選択される生物学的薬剤を有する、57の生体材料。
59.薬学的に許容可能な、1〜22のいずれかの媒体、23〜27のいずれかの生体分子、28〜31のいずれかのポリペプチド、32の融合タンパク質または33〜58のいずれかの生体材料を含む医薬品。60.疾患の病態を治療するための、創傷治癒のための、骨治癒のための、またはワクチン接種のための、59の医薬品。61.複数の分子融合物を含み、前記複数の融合物のそれぞれが、前記ポリペプチドの少なくとも1つと融合している異なる生物学的薬剤を有する、59の医薬品。62.2から10の分子融合物を含み、前記融合物のそれぞれについての前記生物学的薬剤が、独立して選択される、61の医薬品。63.薬学的に許容可能な、1〜22のいずれかの媒体、23〜27のいずれかの生体分子、28〜31のいずれかのポリペプチド、32の融合タンパク質または33〜58のいずれかの生体材料を投与することを含む、医薬品により患者を治療する方法。64.生物学的薬剤とペプチドとの薬学的に許容可能な分子融合物または生物学的薬剤とペプチドとの薬学的に許容可能な分子融合物を含む生体材料マトリックスを投与することを含み、前記ポリペプチドが、0から約15%の保存的置換を有する配列番号4および0から約15%の保存的置換を有する配列番号5からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも6残基の部分配列を含む、医薬品により患者を治療する方法。65.前記生物学的薬剤が抗原を提供し、前記患者を前記分子融合物の投与によりワクチン接種する、64の方法。66.前記薬剤が危険シグナルを含み、抗原を前記薬剤との組合せで投与する、64の方法。67.前記分子融合物が投与部位からの前記生物学的薬剤の長期放出を提供する、64の方法。68.前記生物学的薬剤がサイトカインを含み、投与部位を瘻孔、創傷および潰瘍からなる群から選択する、64の方法。69.1〜68の実施形態のいずれかを含むワクチン。70.薬物送達、ワクチン接種、創傷治癒または骨治癒のための、1〜69の実施形態のいずれかを含むマトリックスまたは系。71.1〜70のペプチドまたはタンパク質のいずれかをコードする配列を含む核酸。
参照文献:
本明細書に記載の全ての参照文献、特許、特許出願、雑誌論文および刊行物は、全ての目的のために本明細書における参照により本明細書に援用され;矛盾する場合は本出願が優先する。
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本明細書に記載の全ての参照文献、特許、特許出願、雑誌論文および刊行物は、全ての目的のために本明細書における参照により本明細書に援用され;矛盾する場合は本出願が優先する。
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Claims (71)
- 生物学的薬剤と、
0から約15%の保存的置換を有する配列番号4および0から約15%の保存的置換を有する配列番号5からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも6残基の部分配列を含むペプチドとの分子融合物
を含み、前記ペプチドが、フィブリノーゲンへの特異的結合を示す、生物学的送達媒体。 - 前記ペプチドが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチン、フィブリンおよびヘパラン硫酸への特異的結合を示す、請求項1に記載の媒体。
- 前記ペプチドが、約100nM未満の解離定数(KD)でフィブリノーゲンへの特異的結合を有する、請求項1または2に記載の媒体。
- 前記生物学的薬剤が、タンパク質、タンパク質薬物、マーカー、免疫剤、ケモカイン、サイトカインおよび細胞接着ペプチドからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれかに記載の媒体。
- 前記分子融合物が、前記生物学的薬剤および前記ペプチドを含む組換えタンパク質を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の媒体。
- 前記分子融合物が、前記薬剤および前記ペプチドと共有結合しているリンカーを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の媒体。
- 前記リンカーが、前記ペプチドのN末端またはC末端への第1の共有結合および前記生物学的薬剤への第2の共有結合を有するポリマーを含む、請求項6に記載の媒体。
- 前記分子融合物が、前記生物学的薬剤および前記ペプチドに連結している粒子を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の媒体。
- 前記粒子が、マイクロ粒子、ナノ粒子、ポリマーソーム、ミセルおよびリポソームからなる群から選択される、請求項8に記載の媒体。
- 生理学的溶液中で可溶性またはコロイドであり、全ての成分が、約500μm未満の最大寸法である、請求項8に記載の媒体。
- 前記粒子が、前記生物学的薬剤および/または前記ペプチドへの共有結合に関与する複数のアミンおよび/またはチオールを含む、請求項8に記載の媒体。
- 前記生物学的薬剤が、上皮成長因子(EGF)、VEGF、VEGF−A、VEGF−C、PDGF、PDGF−AB、PDGF−BB、FGF、FGF−2、FGF−18、IGF、IGF−1、BMP、BMP−2、BMP−7、TGF−β、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、神経栄養因子、NT−3およびBDNFからなる群から選択されるサイトカインを含む、請求項1〜11のいずれかに記載の媒体。
- 前記生物学的薬剤が、インターフェロン、INF−γ、CXCLケモカイン、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCLケモカインおよびCCL21からなる群から選択されるケモカインを含む、請求項1〜11のいずれかに記載の媒体。
- 前記生物学的薬剤が免疫剤を含む、請求項1〜11のいずれかに記載の媒体。
- 前記免疫剤が抗原を提供する、請求項14に記載の媒体。
- 前記抗原がチロシン関連タンパク質2(TRP−2)の少なくとも一部分である、請求項15に記載の媒体。
- 前記免疫剤が危険シグナルを含む、請求項14に記載の媒体。
- 前記危険シグナルがテネイシンの球状ドメインまたはフィブロネクチンのEDAドメインを含む、請求項17に記載の媒体。
- 前記生物学的薬剤が細胞接着ペプチドを含む、請求項1〜11のいずれかに記載の媒体。
- 前記細胞接着ペプチドがインテグリンおよびカドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体についてのリガンドを含む、請求項19に記載の媒体。
- 前記細胞接着ペプチドが、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンFN III10ドメイン、フィブロネクチンFN III9−10ドメイン、フィブロネクチンIII型リピート1から5の1つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンCの3番目のFN III型リピート、テネイシンのFN III9−10ドメイン、RGD、RGDS、RGDSP、KLDAPT、IDGIHEL、IDAPS、LDVおよびREDVからなる群から選択される細胞接着モチーフを含む、請求項19に記載の媒体。
- 前記生物学的薬剤がプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項1〜11のいずれかに記載の媒体。
- PlGF2ドメインを含むように誘導体化されているサイトカイン
を含む生体分子。 - 前記サイトカインの内因性細胞外マトリックス結合ドメインが除去または不能化された、請求項23に記載の生体分子。
- 前記誘導体化されているサイトカインが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチンおよびフィブリンからなる群から選択される細胞外マトリックス分子への特異的結合を有する、請求項23または24に記載の生体分子。
- 前記誘導体化されているサイトカインと前記細胞外マトリックス分子との結合の解離定数が、未誘導体化サイトカインの同一の細胞外マトリックス分子への結合の解離定数の50%未満である、請求項25に記載の生体分子。
- 前記サイトカインが、上皮成長因子(EGF)、VEGF、VEGF−A、VEGF−C、PDGF、PDGF−AB、PDGF−BB、FGF、FGF−2、FGF−18、IGF、IGF−1、BMP、BMP−2、BMP−7、TGF−β、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、神経栄養因子、NT−3およびBDNFからなる群から選択される、請求項23〜26のいずれかに記載の生体分子。
- 生物学的薬剤をさらに含む融合タンパク質または分子融合物である、請求項23〜27のいずれかに記載の生体分子。
- 0から約15%の保存的置換を有する配列番号4および0から約15%の保存的置換を有する配列番号5からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも6残基の部分配列を含み、フィブリノーゲンへの特異的結合を示す、単離されたポリペプチド。
- フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチンおよびフィブリンへの特異的結合をさらに示す、請求項29に記載のポリペプチド。
- フィブリノーゲンへの特異的結合が、約25nM未満の解離定数(KD)を有する、請求項29または30に記載のポリペプチド。
- 前記配列が、配列番号4および配列番号5からなる群から選択される、請求項29〜31のいずれかに記載のポリペプチド。
- 請求項29〜32のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
- マトリックスを含み、前記マトリックスが、
0から約15%の保存的置換を有する配列番号4および0から約15%の保存的置換を有する配列番号5からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも6残基の部分配列を含むペプチド
を含み、
前記ペプチドが、前記マトリックスへの特異的結合を示す、生体材料。 - 前記ペプチドの前記マトリックスへの特異的結合が、約100nM未満の解離定数(KD)を有する、請求項34に記載の生体材料。
- 前記ペプチドの前記マトリックスへの特異的結合が、約25nM未満の解離定数(KD)を有する、請求項34に記載の生体材料。
- 前記ペプチドが、前記マトリックスに特異的に結合しており、生体分子への結合に利用可能である、請求項34〜36のいずれかに記載の生体材料。
- 前記ペプチドが、前記マトリックスへの共有結合を含まない、請求項34または35に記載の生体材料。
- 前記ペプチドに特異的に結合する細胞外マトリックスドメインを含む、請求項37〜38のいずれかに記載の生体材料。
- 前記細胞外マトリックスドメインが、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシンC、オステオポンチンおよびフィブリンからなる群から選択される生体分子のドメインである、請求項39に記載の生体材料。
- 親水性ポリマーを含み、前記ペプチドが、トランスグルタミナーゼ基質を介して前記マトリックスに付着しており、結合が前記基質と前記ポリペプチドとの間でトランスグルタミナーゼ酵素により形成される、請求項34〜40のいずれかに記載の生体材料。
- 前記ポリマーまたは前記ペプチドが、NQEQVSPL(配列番号50)を含むトランスグルタミナーゼ基質を含む、請求項41に記載の生体材料。
- 前記ペプチドと生物学的薬剤との分子融合物をさらに含む、請求項34〜42のいずれかに記載の生体材料。
- 前記生物学的薬剤が、上皮成長因子(EGF)、VEGF、VEGF−A、VEGF−C、PDGF、PDGF−AB、PDGF−BB、FGF、FGF−2、FGF−18、IGF、IGF−1、BMP、BMP−2、BMP−7、TGF−β、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、神経栄養因子、NT−3およびBDNFからなる群から選択されるサイトカインを含む、請求項43に記載の生体材料。
- 前記生物学的薬剤が、インターフェロン、INF−γ、CXCLケモカイン、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCLケモカインおよびCCL21からなる群から選択されるケモカインを含む生物学的薬剤を含む、請求項43に記載の生体材料。
- 前記生物学的薬剤が免疫剤を含む、請求項43に記載の生体材料。
- 前記免疫剤が抗原を提供する、請求項43に記載の生体材料。
- 前記抗原がチロシン関連タンパク質2(TRP−2)の少なくとも一部分である、請求項43に記載の生体材料。
- 前記免疫剤が危険シグナルを含む、請求項43に記載の生体材料。
- 前記危険シグナルがテネイシンの球状ドメインまたはフィブロネクチンのEDAドメインを含む、請求項49に記載の生体材料。
- 前記生物学的薬剤が細胞接着ペプチドを含む、請求項43に記載の生体材料。
- 前記細胞接着ペプチドがインテグリン、カドヘリンからなる群から選択される細胞表面受容体についてのリガンドを含む、請求項43に記載の生体材料。
- 前記細胞接着ペプチドが、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンFN III10ドメイン、フィブロネクチンFN III9−10ドメイン、フィブロネクチンIII型リピート1から5の1つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンCの3番目のFN III型リピート、テネイシンのFN III9−10ドメイン、RGD、RGDS、RGDSP、KLDAPT、IDGIHEL、IDAPS、LDVおよびREDVからなる群から選択される細胞接着モチーフを含む、請求項43に記載の生体材料。
- 前記生物学的薬剤がプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項43に記載の生体材料。
- 前記生物学的薬剤がプロテアーゼ阻害剤を含む、請求項29〜54のいずれかに記載の生体材料。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がアプロチニンを含み、前記マトリックスがフィブリンを含む、請求項55に記載の生体材料。
- 複数の分子融合物をさらに含み、前記複数の融合物のそれぞれが、前記ペプチドの少なくとも1つと融合している異なる生物学的薬剤を有する、請求項29〜56のいずれかに記載の生体材料。
- 2から10の分子融合物を含み、前記融合物のそれぞれについての前記生物学的薬剤が、独立して選択される、請求項57に記載の生体材料。
- 前記複数の分子融合物が、上皮成長因子(EGF)、VEGF、VEGF−A、VEGF−C、PDGF、PDGF−AB、PDGF−BB、FGF、FGF−2、FGF−18、IGF、IGF−1、BMP、BMP−2、BMP−7、TGF−β、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、神経栄養因子、NT−3、BDNF、インターフェロン−β、インターフェロン、CXCLケモカイン、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCLケモカインおよびCCL21、球状ドメイン、フィブロネクチン細胞接着ドメイン、ビトロネクチン細胞接着ドメイン、ラミニン細胞接着ドメイン、テネイシン細胞接着ドメイン、フィブロネクチンFN III10ドメイン、フィブロネクチンFN III9−10ドメイン、フィブロネクチンIII型リピート1から5の1つ以上から取り出されるテネイシンドメイン、テネイシンCの3番目のFN III型リピート、テネイシンのFN III9−10ドメイン、RGD、RGDS、RGDSP、KLDAPT、IDGIHEL、IDAPS、LDVおよびREDVからなる群から独立して選択される生物学的薬剤を有する、請求項58に記載の生体材料。
- 薬学的に許容可能な、請求項1〜22のいずれかに記載の媒体、請求項23〜27のいずれかに記載の生体分子、請求項29〜32のいずれかに記載のポリペプチド、請求項33に記載の融合タンパク質または請求項34〜59のいずれかに記載の生体材料を含む、医薬品。
- 疾患の病態を治療するための、創傷治癒のための、骨治癒のための、またはワクチン接種のための、請求項60に記載の医薬品。
- 複数の分子融合物を含み、前記複数の融合物のそれぞれが、前記ポリペプチドの少なくとも1つと融合している異なる生物学的薬剤を有する、請求項60に記載の医薬品。
- 2から10の分子融合物を含み、前記融合物のそれぞれについての前記生物学的薬剤が、独立して選択される、請求項62に記載の医薬品。
- 薬学的に許容可能な、請求項1〜22のいずれかに記載の媒体、請求項23〜27のいずれかに記載の生体分子、請求項29〜32のいずれかに記載のポリペプチド、請求項33に記載の融合タンパク質または請求項34〜59のいずれかに記載の生体材料を投与することを含む、医薬品により患者を治療する方法。
- 生物学的薬剤とペプチドとの薬学的に許容可能な分子融合物
または生物学的薬剤とペプチドとの薬学的に許容可能な分子融合物を含む生体材料マトリックス
を投与することを含み、
前記ポリペプチドが、0から約15%の保存的置換を有する配列番号4および0から約15%の保存的置換を有する配列番号5からなる群から選択される配列またはその配列の少なくとも6残基の部分配列を含む、医薬品により患者を治療する方法。 - 前記生物学的薬剤が抗原を提供し、前記患者を前記分子融合物の投与によりワクチン接種する、請求項65に記載の方法。
- 前記薬剤が危険シグナルを含み、前記抗原を前記薬剤との組合せで投与する、請求項65に記載の方法。
- 前記分子融合物が投与部位からの前記生物学的薬剤の長期放出を提供する、請求項65に記載の方法。
- 前記生物学的薬剤がサイトカインを含み、投与部位を瘻孔、創傷および潰瘍からなる群から選択する、請求項65に記載の方法。
- 請求項1〜69に記載の実施形態のいずれかを含むワクチン。
- 薬物送達、ワクチン接種、創傷治癒または骨治癒のための、請求項1〜70に記載の実施形態のいずれかを含むマトリックスまたは系。
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