CN116390754A - 用于过继细胞治疗的可注射水凝胶 - Google Patents
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Abstract
免疫治疗递送系统包括具有免疫调节货物的水凝胶，水凝胶包括包封在水凝胶中的细胞，配置成可逆地粘附和释放细胞的水凝胶中的细胞粘附基序，以及包封在水凝胶中的免疫调节货物。水凝胶包括与多个纳米颗粒非共价交联的聚合物。
Description
相关申请引用
本申请要求于2020年10月20日提交的标题为“用于过继细胞治疗的可注射水凝胶”美国临时专利申请63/094,243号的优先权，以援引加入的方式将此申请整体并入本文。
援引加入
以援引加入的方式将本说明书中提到的所有出版物和专利申请整体并入本文中，程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出被援引加入一样。
技术领域
本文描述了利用水凝胶递送细胞和免疫调节货物的系统、方法和组合物(包括套装产品)。这些方法和组合物可特别用作治疗癌症、特别是治疗实体瘤的免疫治疗微环境。
背景技术
估计有1820万美国人或大约19人中有1人是癌症患者或癌症存活者。这些癌症中的许多是实体瘤。已经开发了细胞工程方法来将治疗细胞靶向癌症患者中的实体瘤。在一种方法中，通过输注过程将治疗细胞递送到血液中。然而，实体瘤具有带有许多检查点抑制剂的致密、严厉的环境，并且输注的治疗细胞可能无法发现并渗入这些实体瘤。
用于癌症治疗的治疗细胞可以包括来自患者的免疫细胞。过继细胞治疗(ACT)是一种有前景的癌症治疗策略。在ACT过程中，从患者收集免疫细胞，分离细胞并用受体工程化以帮助对抗癌症，扩增细胞，然后将细胞输注到患者体内作为治疗。嵌合抗原受体(CAR)T细胞是经工程改造以靶向癌细胞上过表达的抗原的免疫细胞。ACT已经广泛有效地用于治疗血液癌症(包括B细胞白血病和淋巴瘤)中，但是先前在治疗实体瘤中的成功有限。最近，美国食品与药物管理局(U.S.FDA)批准了用于治疗B细胞恶性肿瘤的几种疗法，并且已经进行了许多共同努力将这一成功转化为实体瘤应用。遗憾的是，由于例如这些治疗策略的成功通常需要大量的CAR-T细胞，这需要昂贵、复杂和劳动密集型的细胞离体扩增且耗时相对较长(例如7-10天)，因此已经取得的成功有限。此外，细胞的长时间离体扩增通常会限制被转移的CAR-T细胞的效应潜能。因此，通过减少所需的CAR-T细胞剂量来减少离体扩增时间的策略将有助于CAR-T治疗的临床转化和广泛传播。另外，减少治疗所需的细胞剂量可能减少先前与治疗相关的严重副作用，包括例如细胞因子风暴和神经毒性。
目前，CAR-T细胞通过静脉内(IV)输注通过血液递送。这在治疗血液癌症中是有效的，但对实体瘤并非如此，因为T细胞不需要发现和穿透实体瘤微环境来治疗血液癌症。遗憾的是，通过静脉内输注施用的T细胞也经常被困入肺中，并表现出不理想的实体瘤浸润。局部细胞递送方法(特别是利用生物材料支架的方法)用于在肿瘤附近递送T细胞的用途已经显示出T细胞在肿瘤部位改进的局部扩增，改善肿瘤浸润并增强实体瘤的治疗。遗憾的是，为局部ACT开发的生物材料支架具有局限性，例如需要侵袭性外科植入操作来到达肿瘤部位，这阻碍了这些方法的转化和使用。
另外，CAR-T细胞必须被活化，并且当CAR-T细胞在肿瘤部位完全活化时可能是最有效的。如果全身性递送，特定CAR-T活化所需的高局部细胞因子浓度是高度毒性的。目前，T细胞仅在递送至患者之前在高浓度的细胞因子中扩增以避免这些毒性。用于递送细胞因子的局部方法将限制全身性细胞因子暴露并降低毒性，并因此显示出在体内将过继性T细胞维持在高度活化状态的潜力。
此外，T细胞衰竭描述的是由于长时间抗原刺激(例如，被细胞因子刺激)而导致的T细胞中的效应功能的进行性丧失，并且T细胞衰竭可导致患者复发。有效T细胞活化通常需要三个信号：T细胞受体信号传导(1)、通过共刺激分子的活化(2)和免疫刺激细胞因子(3)。信号(1)和(2)已经通过一些细胞工程方法实现，但是信号(3)仍然在很大程度上不满足当前的治疗策略。T细胞持久性可能是持久应答的重要临床决定因素，并且在实体瘤的临床试验中尤其不理想。因此，已经探索了用细胞因子或细胞因子信号传导结构域补充T细胞以增加T细胞持久性的多种策略。在天然状态下，细胞因子是高度局部信号转导事件，并且如果通过血液输注以高浓度递送给患者，细胞因子可能是高度毒性的。IL-15、IL-2、IL-12和IL-7细胞因子都显示出有前景的结果，但它们辅助CAR-T治疗的机制不同。递送细胞因子的局部方法已经显示出一些功效，但是该技术需要大量的细胞因子工程化以及存在与细胞因子结合的某些生物学特征。生物材料和水凝胶提供了很好的工程化机会，从而将细胞局部暴露于刺激因子，以产生类似于通常调节细胞的淋巴结的人为环境。
因此，需要新的处理措施来克服这些和其它限制。本文描述了可能克服这些和其它限制的方法和装置。
发明概述
本文描述了利用水凝胶的系统、方法和组合物(包括套装产品)，所述水凝胶用于包封和递送免疫调节货物，例如细胞和其它货物。细胞和其它货物可以是递送给需要免疫治疗的患者的免疫调节成分。水凝胶系统可包括细胞粘附基序，细胞粘附基序被配置为可逆地粘附和释放细胞，并允许细胞移动通过和离开水凝胶。当递送至患者时，这些系统可以充当细胞微环境(niche)(例如，免疫细胞的免疫细胞微环境)，在一段时间(例如，数小时、数天、数周、数月)内向患者缓慢释放和递送细胞。水凝胶系统还可以包含用于在体内刺激细胞的第二免疫调节货物(例如，细胞因子)，并且可以在细胞从水凝胶释放之前这样做。水凝胶可以是物理交联的并且具有相对较小的孔/网目。水凝胶系统可令人惊讶地被配置为保持水凝胶中的一些货物(如细胞因子)，同时促进和控制比细胞因子因子大得多的分子(如细胞)的释放。对于一些免疫调节货物(例如细胞因子)，水凝胶的相对较小的孔/网目尺寸可以阻止免疫调节货物扩散出水凝胶(例如，甚至当免疫调节货物没有附着到水凝胶时)。由于一些分子(例如某些浓度的细胞因子)对患者可能是毒性的，并引起广泛的副作用，本文所述的水凝胶系统可以促进治疗有效量的免疫细胞的递送，而没有相关联的毒性。该系统可允许较小的营养物扩散以维持细胞。这些方法和组合物可特别用作治疗癌症，特别是治疗实体瘤的免疫治疗微环境。
除了以高数量到达肿瘤之外，来自水凝胶系统的细胞也可能需要被活化，并且活化时机和活化信号可能是重要的。T细胞衰竭描述的是由于长时间抗原刺激(例如，被细胞因子刺激)而导致的T细胞中的效应功能的进行性丧失，并且T细胞衰竭可导致复发。有效T细胞活化通常需要三个信号：T细胞受体信号传导(1)、通过共刺激分子的活化(2)和免疫刺激细胞因子(3)。信号(1)和(2)已经通过细胞工程方法实现，但是信号(3)仍然在很大程度上不满足当前的治疗策略。T细胞持久性可能是持久应答的重要临床决定因素，并且在实体瘤的临床试验中尤其不理想。因此，已经探索了用细胞因子或细胞因子信号传导结构域补充T细胞以增加T细胞持久性的多种策略。在天然状态下，细胞因子是高度局部信号转导事件，并且如果通过输注以高浓度递送给患者，细胞因子可能是高度毒性的。IL-15、IL-2、IL-12和IL-7均显示出有前景的结果，但它们辅助CAR-T治疗的机制不同。递送细胞因子的局部方法已经显示出一些功效，但是该技术需要大量的细胞因子工程化以及存在与细胞因子结合的某些生物学特征。生物材料和水凝胶提供了很好的工程化机会，从而将细胞局部暴露于刺激因子，以产生类似于淋巴结的人为环境。先前的生物材料方法的材料将活化信号与材料偶联，用于体外扩增和体内治疗，但是，发明人提出，如果水凝胶网目尺寸被设计为足够小，则可以简单地将刺激分子混合在材料中，同时仍然实现局部信号传导和减缓扩散。
本文描述了基于可注射的聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶的用于CAR-T细胞递送的新方法。这些水凝胶可有利地使用可伸缩化学技术和快速制剂，通过简单注射包封细胞和将细胞(局部)递送至肿瘤部位(参见图1E)。与大多数限制扩散的水凝胶系统相比，这些水凝胶具有更小的孔径，可以保留局部信号以通过简单混合活化过继细胞。利用这种模块化系统，可以将各种细胞因子合并到治疗中，从而实现更模块化、个性化的治疗。将水凝胶网络保持在一起的超分子瞬时相互作用可允许在注射后快速(瞬时)自愈合，并通过注射或导管递送到达身体许多部位的肿瘤。与具有本文所述的新细胞递送策略的传统方法相比，本申请证明了对抗肿瘤的效力得到提高。
通常，免疫治疗递送系统包括水凝胶，包含包封在水凝胶中的细胞的第一免疫调节货物，水凝胶中的被配置为可逆地粘附和释放细胞的细胞粘附基序，和包封在水凝胶中的第二免疫调节货物。水凝胶包括与多个纳米颗粒非共价交联的聚合物。
本实施方案和其他实施方案可以包括一个或多个以下特征。细胞粘附基序可以包括被配置为可逆地粘附和释放细胞的肽。细胞粘附基序可被配置为结合细胞上的整联蛋白。细胞粘附基序可以包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽。纳米颗粒可包含细胞粘附基序。纳米颗粒可以被配置为呈递细胞粘附基序。
本实施方案和其他实施方案可以包括一个或多个以下特征。细胞可包括过继细胞。细胞可包括嵌合抗原受体(CAR)T细胞或嵌合抗原受体(CAR)自然杀伤细胞。
本实施方案和其他实施方案可以包括一个或多个以下特征。第二免疫调节货物可包括蛋白质。第二免疫调节货物可包括细胞因子。
本实施方案和其他实施方案可以包括一个或多个以下特征。水凝胶可以包含小于5％的聚合物。水凝胶可以包含1.5％-3％的聚合物。水凝胶可包含约2％的聚合物。聚合物可以包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)。聚合物可以包括具有疏水性脂质十二烷基链的羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
纳米颗粒可包括聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)。纳米颗粒可以包括附接到聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)的细胞粘附基序。纳米颗粒包含的具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)与不具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)的比例可以为10:90至90:10。纳米颗粒包含的具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)与不具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)的比例可以为25:75至75:25。
水凝胶可以包含4-12％的纳米颗粒。水凝胶可以是剪切稀化的和自愈合的。
本实施方案和其他实施方案可以包括一个或多个以下特征。免疫治疗递送系统可包括含有水凝胶的注射器或导管。
通常，治疗疾病的方法包括将上述免疫治疗递送系统中的任一种递送至患者；以及将细胞从水凝胶释放到患者体内。
本方法和其它方法可以包括在1天至4周的持续时间内从水凝胶中释放细胞的步骤。
本方法和其它方法可包括免疫治疗递送系统在至少两周、至少三周或至少四周的时程中释放细胞。
本方法和其它方法还可以包括用第二免疫调节货物活化细胞的步骤。本方法和其它方法可进一步包括扩增水凝胶中细胞数量的步骤。
在本方法和其它方法中，疾病可以是实体瘤癌症。
在本方法和其它方法中，细胞可以是自体的(autologous)。在本方法和其它方法中，细胞可以是自体遗传的(autogeneic)。
在本方法和其它方法中，细胞可表达识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。
本方法和其它方法可进一步包括以下一个或多个步骤：从患者或供体中移除细胞；分离移除的细胞；修饰移除的细胞(例如，用受体修饰)；体外扩增细胞数；和/或在递送步骤之前将细胞包封在水凝胶中。
在本方法和其它方法中，细胞可以先后地粘附于水凝胶中的细胞粘附基序上和从水凝胶中的细胞粘附基序上脱离。
在本方法和其它方法中，递送可包括通过注射器或导管递送免疫治疗递送系统。
在本方法和其它方法中，递送可包括通过选自静脉内、腹膜内、肌内、瘤内和皮下的途径将免疫治疗递送系统递送至患者。
在本方法和其它方法中，递送可包括将免疫治疗递送系统局部递送至患者需要治疗的区域。在本方法和其它方法中，递送可包括将免疫治疗递送系统递送至患者体内的实体瘤癌症。
在本方法和其它方法中，递送可包括将免疫治疗递送系统递送至患者。在本方法和其它方法中，递送可以包括将系统递送到远离患者需要治疗的区域的位置。在本方法和其它方法中，疾病包括实体瘤癌症，将免疫治疗递送系统递送至患者可包括将所述系统递送至患者中远离实体瘤癌症的位置。在本方法和其它方法中，将免疫治疗递送系统递送给患者可以包括将系统全身性递送给患者。
附图简要说明
通过参考以下展示说明性实施例的详细描述和附图，能获得对本文描述的方法和装置的特征和优点的更好理解，其中：
图1A-1T展示聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶的形成。PNP水凝胶可以控制CAR-T细胞迁移和小细胞因子的释放。
图1A-1C展示通过生物聚合物和可降解纳米颗粒的自组装形成PNP水凝胶，以包封CAR-T细胞和刺激性细胞因子。
图1A示意性地展示了十二烷基修饰的羟丙基甲基纤维素(HPMC-C12)起始材料的形成。
图1B示意性地展示了聚(乙二醇)-嵌段聚丙交酯(PEG-b-PLA)起始材料的形成。
图1C示意性地展示了将细胞和调节剂包封在可注射水凝胶中用于免疫治疗的方法。
图1D示意性地展示了传统的静脉内(IV)输注，其显示了用于癌症治疗的细胞的全身性给药。
图1E示意性地展示了使用本文所述的免疫治疗递送系统局部施用细胞的实例，其中细胞和调节剂包封在水凝胶中以向患者进行受控递送。
图1F-1R示意性地展示了将CAR-T细胞递送至实体瘤的递送方法。
图1F显示用于所有研究的B7H3 CAR构建体的示意图。
图1G显示B7H3 CAR-T细胞被有效转导。通过B7H3-Fc染色测定B7H3 CAR-T细胞的转导效率。
图1H显示了使用luer锁混合器，通过将一个注射器(左)中的生物聚合物溶液与另一个注射器(右)中RGD修饰的纳米颗粒、细胞和细胞因子的溶液混合配制PNP水凝胶。
图1I显示了在如图1H所示的溶液温和混合30秒后，形成了均匀包封细胞的固体样PNP水凝胶(右注射器)。
图1J显示了通过26G针将加载细胞的PNP水凝胶注射到基底上。
图1K显示了在图1J所示的基底上形成稳定的固体样水凝胶贮库，并且该贮库由于重力而不显著流动。
图1L显示了评价所示制剂内PNP水凝胶内CAR-T细胞运动性的体外实验装置的示意图。
图1M-1O展示不同水凝胶组合物中迁移CAR-T细胞的轨迹。图1M显示了在PNP-1-1水凝胶中迁移CAR-T细胞的轨迹。图1N展示在PNP-1-5水凝胶中迁移CAR-T细胞的轨迹。图1O示出了在PNP-2-10水凝胶中迁移CAR-T细胞的轨迹。测试PNP-1-1、PNP-1-5、PNP-2-10水凝胶制剂，其中第一个数字是wt％HPMC-C12聚合物，第二个数字是wt％NP。在共同的原点处绘制轨迹以便于可视化，其中每个网格为50μm宽。图1P显示通过细胞迁移实验定量的不同PNP水凝胶制剂中的CAR-T细胞迁移速度(对于所有样品n>150个细胞；平均值±标准误差)。
图1Q-1T展示本文所述的PNP系统可随时间释放受控量的CAR-T细胞。图1Q示意性地示出了用于确定随时间细胞释放的测试设备。将1百万CAR-T细胞加载到三种不同的水凝胶制剂和介质弹丸组中。计数每个样品随时间释放的细胞数。图1R示出了从图1Q所示的装置随时间释放的累积细胞数量。图1S显示PNP 1-5在8天后含有最大数量的细胞。图1S显示在图1Q所示的测试装置中测试的三种不同水凝胶制剂的每一种中在第8天保留的细胞数。图1T显示在图1Q所示的测试装置中测试的三种不同水凝胶制剂中的细胞保持活力。
图2A显示使用本文所述的水凝胶递送系统用CAR-T细胞治疗动物后，提高的存活和肿瘤减小或消除。图2A显示了在用嵌合抗原受体(CAR)T细胞进行免疫治疗处理后，在具有发光成神经管细胞瘤的动物模型中，肿瘤随时间变化的全动物发光成像的结果。用具有与纳米颗粒或PBS非共价交联的聚合物的水凝胶中的嵌合抗原受体(CAR)T细胞处理后，肿瘤无法检测。未处理的动物死亡。
图2B显示使用本文所述的聚合物-纳米颗粒水凝胶递送系统递送的CAR-T细胞的稳健的嵌合抗原受体(CAR)T细胞增殖。图2B也显示CAR-T细胞迁移至靶肿瘤。在将细胞递送至动物成神经管细胞瘤模型后，对整个动物进行成像以随时间检测发光嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
图2C显示使用本文所述的聚合物-纳米颗粒水凝胶递送系统，用嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗动物消除肿瘤或将肿瘤减小至不可检测。图2C显示了不同处理的随时间肿瘤发光定量。每行代表一个单独的小鼠。图形底部的阴影表示采样期间的平均背景噪声。
图3A显示在使用本文所述的聚合物-纳米颗粒水凝胶递送系统，用嵌合抗原受体(CAR)T细胞处理动物后，水凝胶中包含IL-15细胞因子导致肿瘤减小或消除。用各种处理策略将2×106嵌合抗原受体(CAR)T细胞递送至动物模型中的成神经管细胞瘤肿瘤，并且使动物进行发光成像。
图3B显示了各种处理的随时间肿瘤发光的定量。每行代表一个单独的小鼠。图形底部的阴影表示采样期间的平均背景噪声。
图4A-图4B显示使用本文所述的聚合物-纳米颗粒水凝胶递送系统，用嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗来自动物成神经管细胞瘤模型的动物，以消除肿瘤或将肿瘤减小至不可检测。图4A显示了在用聚合物-纳米颗粒水凝胶递送全身性递送嵌合抗原受体(CAR)T细胞后，随时间变化的整体动物成像以检测肿瘤。图4B显示了用聚合物-纳米颗粒水凝胶递送全身性递送嵌合抗原受体(CAR)T细胞后，随时间肿瘤发光的定量。每行代表一个单独的小鼠。
图5A-5K显示PNP水凝胶改善治疗功效和CAR-T细胞扩增。图5A显示了用不同递送方法施用的2×106CAR-T细胞治疗小鼠中皮下人成神经管细胞瘤的癌症实验的实验时间线，包括：(i)静脉弹丸施用，(ii)皮下弹丸施用，(iii)含有0.25μg IL-15的皮下弹丸施用，(iv)PNP-1-5水凝胶，和(v)含有0.25μg IL-15的PNP-1-5水凝胶。结果如图5B-5J所示。
图5B显示所有实验组中所有时间点的肿瘤发光成像结果。图5C示出了所有实验组的成像数据的定量，其中红色阴影表示数据的背景信号(在2次实验中所有组为n＝8-10)。图5D示出了每次处理的治愈天数，定义为发光信号下降并保持在体内成像装置的背景信号以下的时间(在2次实验中对于所有组，n＝8-10；平均值±标准差)。图5E显示所有相应实验组中CAR-T细胞的发光成像结果。图5F示出了所有实验组的成像数据的定量，其中图底部的阴影表示数据的背景信号(在2次实验中对于所有组，n＝3-6)。图5G显示了21天后CAR-T细胞发光信号(在2次实验中对于所有组，n＝3-6；平均值±标准差)。图5H示出了CAR MFI结果(所有组，n＝3；平均值±标准差)。图5I显示了总体CD3+T细胞(对于所有组，n＝3个重复；平均值±标准差)。图5J显示相对CD4+和CD8+含量分析的结果(对于所有组n＝3的平均值)。图5K显示在MED8A肿瘤模型中治疗10天后，从PNP-1-5凝胶提取的离体扩增的CAR-T细胞的记忆CAR-T细胞亚组(对于所有组，n＝3个重复，平均值)的结果。
图6A-6F显示PNP水凝胶在治疗小鼠远侧皮下人髓母细胞瘤中是有效的。
图6A显示了在小鼠中皮下肿瘤和远侧皮下治疗设置的示意图。图6B示出了实验时间线和治疗设置的示意图，其中小鼠接受(i)远侧皮下弹丸注射2×106个CAR-T细胞和0.25μg IL-15，或(ii)含有2×106个CAR-T细胞和0.25μg IL-15的PNP-1-5水凝胶。
图6C-图6F示出了图6A-6B中所示的实验的结果。图6C显示了利用体内成像的肿瘤的代表性发光成像的结果(每组n＝5只小鼠)。
图6D和图6E显示了两个实验组(图6D中的远侧弹丸和图6E中的含有2×106个CAR-T细胞和0.25μgIL-15的PNP-1-5水凝胶)的成像数据的定量结果，其中图底部的阴影代表数据的背景信号(n＝5只小鼠)。
图6F示出了每个治疗的治愈天数，定义为发光信号下降到体内成像装置的背景信号以下的时间；平均值±标准差)。
图7显示十二烷基侧链与HPMC的成功偶联。迹线A显示十二烷基/异硫氰酸酯起始材料的1H-NMR(DMSO-d6)。迹线B显示羟丙甲纤维素(HPMC)起始材料的1H-NMR(DMSO-d6)。迹线C显示十二烷基修饰的HPMC(HPMC-C12)的1H-NMR(DMSO-d6)，显示在0.86ppm十二烷基侧链上的末端甲基的出现，表明十二烷基侧链与HPMC成功偶联。
图8A-图8D显示了具有不同聚合物和纳米颗粒重量百分比的PNP水凝胶制剂的流变性。第一个数字代表wt％聚合物，第二个数字代表wt％纳米颗粒。图8A示出了25℃下所有制剂的频率扫描(应变＝1％)。图8B示出了25℃下所有制剂的流动扫描，其中稳态感测高达120秒。图8C示出了在25℃下所有制剂的振幅扫描(w＝10rad/s)。图8D示出了三种制剂的流变参数的总结。
图9A-图9C显示了PNP-1-5水凝胶制剂的流变性，探索了使用RGD缀合的纳米颗粒和包封2×107个细胞/mL的效果。图9A示出了在25℃下所有制剂的频率扫描(应变＝1％)。图9B示出了在25℃下所有制剂的流动扫描。25℃下所有制剂的振幅扫描(w＝10rad/s)。图9C示出了作为应变的函数的模量。
图10显示包含RGD功能化纳米颗粒的PNP-1-1、PNP-1-5和PNP-2-10水凝胶制剂的水凝胶基质自扩散率，其中使用光漂白(FRAP)实验后的荧光恢复进行测定。
图11A-11B显示PNP水凝胶在体内条件下改善IL-15的稳定性。图11A显示了在4天的时程中检查100μL浸没在缓冲液中的PNP-1-5水凝胶中保留的0.25μg IL-15的比例的研究结果。将数据归一化为在4天内收集的总量和在4天时仍然保留在凝胶中IL-15的量。在该图中，圆点表示实验数据，平滑线表示与收集的数据的单相指数衰减拟合。图11B显示PNP水凝胶改善了体内条件下IL-15的稳定性。在这些研究中，将0.25μg IL-15加入到每个样品中，由于样品在37℃下孵育，发现在不同制剂中一定百分比的蛋白质保持活性。在37℃下在盐水中老化4天的％活性IL-15(相比于起始添加量)，在完全释放研究过程中(4天内)在37℃下收集的％活性IL-15，以及在释放研究期间的第4天从凝胶(37℃)收集的％活性IL-15显示，在释放研究期间收集的较高比例的IL-15在PNP水凝胶组中保持活性。这些研究证明PNP水凝胶对IL-15的有效稳定作用。图12显示用于评估当包封在PNP-1-5水凝胶中时IL-15对CAR-T细胞增殖的影响的WST测定的结果。将相对信号(使用读板器在OD＝450nm下读取的吸光度)报告给不含IL-15的对照。数据显示为平均值±标准差。基于该研究，将2.5μg/mL的IL-15浓度用于本文所述的体内研究。
图13A-图13C显示了PNP水凝胶结构内的纳米颗粒的RGD缀合增加了包封在这些水凝胶中的CAR-T细胞的迁移性。图13A显示了具有和不具有RGD缀合部分的PNP-1-5水凝胶制剂中的CAR-T细胞速度(数据显示为平均值/pmSEM)。图13B显示了具有RGD的PNP-1-5的水凝胶制剂内CAR-T细胞的迁移轨迹。图13C显示了不具有RGD的PNP-1-5的水凝胶制剂内CAR-T细胞的迁移轨迹。在共同的原点绘制轨迹，以便于可视化。每个网格为50μm。
图14A-图14B显示在以2×107细胞/mL包封的加载IL-15的PNP凝胶中并培养3天，线粒体生物发生的主要调节物PGC-1α的表达增加。包封在各种PNP水凝胶制剂中的CD8+T细胞(图14A)和CD4+T细胞(图14B)中的PGC-1α染色的MFI。显示的数据是平均值±标准误差。图15显示没有CAR、含有T细胞(模拟物T细胞)的对照组与以2×107个细胞/mL的含有IL-15的PNP-1-5水凝胶递送的CAR-T细胞相比的结果。使用体内成像系统的肿瘤成像。在这些研究中，对照组的一个实验的n＝5，而PNP-1-5IL-15组的两个实验的n＝8(n＝3和n＝5)。
图16A-图16D显示在PNP水凝胶和翻译相关对照中递送8×106个CAR-T细胞的体内实验的结果。图16A显示使用体内成像系统的肿瘤成像的结果(对于所有组，n＝5，来自一个实验)。图16B显示来自肿瘤成像的发光信号的相应定量结果。图16C显示使用体内成像系统的CAR-T细胞成像。图16D显示来自CAR-T细胞成像的发光信号的相应定量结果(对于所有组，n＝5，来自一个实验)。图17A-图17B显示在不同递送方法下IL-15的体内药代动力学。图17A显示通过皮下注射PNP-1-5水凝胶、皮下盐水弹丸施用和静脉内盐水弹丸施用递送的IL-15在48小时内的血清浓度的结果。在这些研究中，在所有组中施用0.25μg IL-15的剂量。数据显示为平均值±标准差。(对于所有组，一个实验，n＝3)。图17B显示了在48小时评价期间，不同递送方法的相应曲线下面积(AUC)。数据显示为平均值±标准差。(对于所有组，一个实验，n＝3)。
图18显示PNP1-5 IL-15的治疗增加治愈。图18显示在实验过程中治愈的小鼠的比例(n＝8-10只小鼠)。对于这些研究，“治愈”被定义为发光肿瘤信号的下降至体内成像装置的背景信号之下并保持。
图19A-图19F显示了由PNP-1-5IL-15治疗产生的显著增加的细胞扩增。将CAR-T细胞(2×106)与IL-15(0.25μg剂量)静脉内共递送或共包封在PNP水凝胶中。图19A显示了使用体内成像系统的肿瘤成像的结果。图19B显示来自肿瘤成像的发光信号的相应定量(PNP-1-5IL-15组，两个实验，n＝8；IV组，一个实验，n＝9)。图19C显示了由于每个治疗的急性毒性而死亡的小鼠的百分比。图19D显示了基于各组的实验数据预测的治愈天数。图19E显示使用体内成像系统的CAR-T细胞成像(对于所有组，n＝5)。图19F显示了来自CAR-T细胞成像的发光信号的相应定量(PNP IL-15组，两个实验，n＝6；IV IL-15组，一个实验，n＝5)。图19G显示每个实验组中CAR-T细胞扩增的斜率，表明由PNP-1-5IL-15治疗引起的细胞扩增显著增加。
图20A-图20B显示了在PNP水凝胶中将2×106CAR-T细胞与0.25μg/小鼠或2.5μg/小鼠剂量的IL-15共递送进行比较的体内实验结果。图20A显示使用体内成像系统的肿瘤成像的结果。图20B显示了来自肿瘤成像的发光信号的相应定量。在这些实验中，对于0.25μg组，两个实验，n＝8(n＝5和n＝3)；对于2.5μg组，一个实验，n＝5。
图21A-图21B显示了在PNP-1-5水凝胶中将0.25μg IL-2或0.25μgIL-15与CAR-T细胞(2×106)共递送进行比较的体内实验结果。图21A显示使用体内成像系统的肿瘤成像结果。图21B显示来自肿瘤成像的发光信号的相应定量(IL-15组，两个实验，n＝8；IL-2组，一个实验，n＝5)。图21C显示使用体内成像系统的CAR-T细胞成像的结果(对于所有组，n＝5)。图21D显示来自CAR-T细胞成像的发光信号的相应定量。在这些研究中，IL-15组，两个实验，n＝6(n＝3和n＝3)；IL-2组，一个实验，n＝5。图22A-22F显示移植的包含CAR-T细胞(2×106)和IL-15的PNP-1-5水凝胶在体内5天后的组织学。图22A-图22C显示在不同放大率下(如标尺表示)，苏木精和伊红染色的图像，其中最高放大率图像显示水凝胶中心的细胞具有显著基质沉积的迹象。图22D-22F显示了在不同放大率(如标尺表示)下，CD3染色(粉红色)的图像。
图23A-图23F显示了在不同递送方法中，用CAR-T细胞(2×106)处理3天后在血液中测量的小鼠炎症细胞因子水平的结果，所述结果是相对于天然小鼠(每组n＝3只小鼠)测定的值而报告的。低剂量IL-15组接受0.25μg/小鼠的IL-15(功效研究的相当剂量)。高剂量IL-15组接受2.5μg/小鼠的IL-15。图23A显示TNFα的结果。图23B显示IL-6的结果。图23C显示IL-1B的结果。图23D显示GM-CSF的结果。图23E示出了IFNg的结果。图23F显示IL-10的结果。
图24A-图24F显示了在不同递送方法中，用CAR-T细胞(2×106)处理3天后在血液中测量的人炎症细胞因子的水平，所述结果是相对于天然小鼠(每组n＝3只小鼠)测定的值而报告的。低剂量IL-15组接受0.25μg/小鼠的IL-15(功效研究的相当剂量)。高剂量IL-15组接受2.5μg/小鼠的IL-15。图24A显示TNFα的结果。图24B显示IL-6的结果。图24C显示IL-1B的结果。图24D显示GM-CSF的结果。图24E示出了IFNg的结果。图24F显示IL-10的结果。
图25A-图25C显示从PNP水凝胶提取的CAR-T细胞上T细胞活化标志物的表达分析结果。图25A显示PD1染色的MFI。图25B显示4-1BB染色的MFI。图25C显示CD39染色的PDI。上图表示CD4+PDI，下图表示CD8+PDI。在MED8A肿瘤模型中处理10天后收集CAR-T细胞。数据显示为平均值±标准误差(n＝3)。
图26A-图26D显示来自CAR-T细胞处理的小鼠的T细胞记忆亚组分析的结果。图26A(血液CD8+细胞)和图26B(血液CD4+细胞)的通过CD62L和CD45RA染色测定的T细胞记忆亚组显示来自血液样品的结果。图27C(脾CD8+细胞)和图27D(脾CD4+细胞)显示来自脾样品的结果。在MED8A肿瘤模型中CAR-T细胞给药后10天收集样品。数据显示为平均值±标准误差(n＝3)。结果从上到下依次为EM、TCM、TSCM和EF/EMRA。
图27A和图27B显示来自CAR-T细胞处理的小鼠的T细胞计数的结果。图27A(血液样品)和图27B(脾样品)显示在MED8A肿瘤模型中施用T细胞后10天收集的T细胞的定量。数据显示为平均值±标准误差(n＝3)。
图28显示在实验过程中治愈的小鼠的比例(对于两组，n＝5只小鼠)。对于这些研究，“治愈”被定义为发光肿瘤信号的下降至体内成像装置的背景信号之下并且保持。
图29A和图29B显示了比较CAR-T细胞在远离肿瘤(右皮下胁腹)的对侧(左)胁腹皮下给药时扩增的体内实验结果。在PNP-1-5水凝胶或盐水弹丸中以0.25μg/小鼠的IL-15剂量共同施用CAR-T细胞(2×106)。图29A显示使用体内成像系统的CAR-T细胞成像(对于所有组n＝5)。图29B显示来自CAR-T细胞成像的发光信号的相应定量(对于所有组n＝5)。
图30A-30E显示来自远侧治疗小鼠的CAR-T细胞计数和记忆亚组。图30A显示来自血液的总CAR-T细胞的定量结果。从血液样品(图30B和图30C)和脾样品(图30D和图30E)中，通过CD62L和CD45RA染色确定CAR-T细胞记忆亚组。在MED8A肿瘤模型中处理10天后收集CAR-T细胞。数据显示为平均值±标准误差(n＝3)。结果自上而下是EM、TCM、TSCM和EF/EMRA。
发明详细描述
过继细胞治疗(ACT)是一种有前景的癌症治疗策略。在ACT过程中，从患者收集免疫细胞，分离细胞并用受体工程化以帮助对抗癌症，扩增细胞，然后将细胞输注到患者体内作为治疗。嵌合抗原受体(CAR)T细胞经工程改造以靶向癌细胞上过表达的抗原。ACT已经广泛有效地用于治疗血液癌症(包括B细胞白血病和淋巴瘤)中，但是先前在治疗实体瘤中的成功有限。最近，美国食品与药物管理局(US FDA)批准了用于治疗B细胞恶性肿瘤的几种疗法，并且已经进行了许多共同努力将这一成功转化为实体瘤应用。遗憾的是，这些治疗策略的成功通常需要大量的CAR-T细胞，这需要昂贵、复杂和劳动密集型的细胞离体扩增7-10天。此外，长时间离体扩增通常会限制被转移的CAR-T细胞的效应潜能。因此，通过减少所需的CAR-T细胞剂量来减少离体扩增时间的策略将有助于CAR-T治疗的临床转化和广泛传播。另外，减少治疗所需的细胞剂量可能减少与治疗相关的严重副作用，包括细胞因子风暴和神经毒性。
目前，CAR-T细胞通过静脉内(IV)输注通过血管28递送，如图图1D所示。这在治疗血液癌症中是有效的，因为T细胞不需要发现和穿透实体瘤微环境。遗憾的是，通过这种方式施用的T细胞15经常被困入肺中，并表现出不理想的实体瘤浸润。局部细胞递送方法(特别是利用生物材料支架的方法)已经显示出T细胞在肿瘤部位改进的局部扩增，改善肿瘤浸润并增强实体瘤的治疗。遗憾的是，为局部ACT开发的生物材料支架需要侵袭性外科植入操作来到达肿瘤部位，这阻碍了技术转化。
当CAR-T细胞在肿瘤部位完全活化时可能是最有效的。如果全身性递送，特定CAR-T活化所需的高局部细胞因子浓度是高度毒性的。目前，T细胞仅在递送之前在高浓度的细胞因子中扩增以避免这些毒性。用于递送细胞因子的局部方法将限制全身性细胞因子暴露并降低毒性，并因此显示出在体内将过继性T细胞维持在高度活化状态的潜力。
由于来自CAR-T细胞和细胞因子递送的局部研究的这些有前景的结果，这些下一代生物材料可以改变治疗策略用于CAR-T细胞和刺激分子的受控共递送。本文描述了利用可用于包封和递送细胞和其它货物的水凝胶的系统、方法和组合物(包括套装产品)。细胞和其它货物可以是递送给需要免疫治疗治疗的患者的免疫调节成分。
定义：
过继细胞转移是指转移到患者体内的免疫细胞。过继细胞可以从患者或另一个个体中分离，进行遗传修饰、体外传代(扩增)，并转移到患者体内。可以转移的过继细胞包括淋巴细胞(T细胞)、自然杀伤细胞、树突细胞和干细胞。
自然杀伤(NK)细胞是免疫系统的细胞，其通常在没有特异性抗原刺激的情况下杀死靶细胞，并且没有根据主要组织相容性复合物(MHC)类别的限制。靶细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。在历史上，自然杀伤细胞被表征为存在CD56和缺少CD3表面标志物，其它形式的自然杀伤细胞也被表征。自然杀伤细胞通常是富含自然杀伤细胞的异质细胞群。内源NK细胞可用于患者的自体或同种异体治疗。
自体是指细胞来自具有所述细胞或将接受所述细胞的同一人。当T细胞与个体遗传匹配时，转移自体T细胞降低接受细胞的人中移植物抗宿主病(GvHD)的风险。
同种异体是指细胞来自与接受细胞的接受者不同的供体。由于T细胞与个体遗传匹配，同种异体T细胞转移可引起非常严重的并发症，称为移植物抗宿主病(GVHD)。T细胞(例如CAR-T细胞)可以经历复杂的基因编辑过程，以降低同种异体细胞转移期间GVHD的风险。尽管T细胞与个体遗传匹配，但自然杀伤细胞不是这样。因此，供体的自然杀伤细胞可以被注射到接受者中，而不不需要担心移植物抗宿主病(GvHD)。这也意味着同种异体CAR自然杀伤细胞不需要经历同种异体CAR-T细胞所做的复杂基因编辑过程。
移植物抗宿主病(GVHD)是指某些同种异体细胞转移的潜在严重并发症。移植物抗宿主病可以是轻微的、中度的、严重的或威胁生命的。接受者的身体将宿主细胞视为外来细胞并攻击它们，导致对皮肤、胃肠道或肝脏的一系列影响，例如皮疹、水疱、恶心、呕吐、腹痛、食欲丧失、腹泻、肝损伤和黄疸。
细胞因子是指在免疫系统中的细胞信号传导中一大类重要的生物分子。细胞因子最初被鉴定为由免疫系统的特定细胞分泌的大小为约5kDa至约20kDa的小蛋白。细胞因子通过其自身的受体作用于靶细胞，并且这些受体包括免疫球蛋白(Ig)超家族和肿瘤坏死因子(TNF)的成员。细胞因子是通称。其它名称是基于其假定的功能、分泌细胞或作用目标来定义的。例如，由淋巴细胞产生的细胞因子也可被称为淋巴因子。许多淋巴因子也被称为白细胞介素(IL)，因为它们不仅由白细胞分泌，而且能够影响白细胞的细胞应答。由单核细胞或巨噬细胞分泌的细胞因子被称为单核因子。趋化因子是具有趋化活性的细胞因子。细胞因子的实例包括IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。
整联蛋白是跨膜细胞表面受体，与细胞外配体、细胞配体和可溶性配体结合。整联蛋白已被表征为具有α亚基和β亚基的异二聚体蛋白，其中α亚基和β亚基具有不同的结构域结构。不同的α亚基和β亚基可以分别与不同的β亚基和α亚基异二聚化。例如，β1可以(分别地)与α1、α2、α3和α4异二聚体化。感兴趣的整联蛋白包括结合精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的那些整联蛋白。
物理交联是指交联，并且可以包括缠结链、氢键、疏水相互作用和聚合物中微晶的形成。
实体瘤是指异常的细胞实体。实体不含流体或囊。实体瘤包括肉瘤，例如发生在血管、骨、脂肪组织、韧带、淋巴管、肌肉或腱中的肿瘤，以及癌症，例如发生在上皮细胞中的肿瘤，包括皮肤、腺体和器官衬壁中的肿瘤。
瘤内指在肿瘤内。
免疫治疗是指通过包括诱导、增强、抑制或改变免疫应答的方法治疗或预防疾病或病症。
嵌合抗原受体(CAR)是指具有与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域的人工构建的杂合蛋白或多肽。细胞外抗原结合结构域可以是对抗原特异的抗体(例如单链可变片段(scFv))的抗原结合结构域。可以对scFv结构域进行工程改造以识别任何抗原，包括肿瘤特异性抗原。细胞内信号传导结构域可以与细胞信号传导或细胞活化结构域连接。利用单克隆抗体的抗原结合特性，CAR能够以非MHC限制的方式将细胞特异性和反应性重定向到选择的靶标。非MHC限制性抗原识别使表达CAR的细胞能够识别与抗原加工无关的抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。使感兴趣的CAR在T细胞或自然杀伤(NK)细胞中表达以增加细胞毒性。
肿瘤特异性抗原是指存在于癌症或肿瘤细胞上、但在来自与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞上不可检测的抗原。本文所用的肿瘤特异性抗原也指肿瘤相关抗原，即，与来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞相比，在癌细胞上以更高水平表达的抗原。对于癌症，将肿瘤细胞与来自相同组织的正常细胞区分开的表型变化通常与特定基因产物表达的一种或多种变化相关，包括正常细胞表面组分的丢失或获得其他组分(即，在相应的正常非癌组织中不可检测的抗原)。肿瘤特异性抗原可作为肿瘤表型的标志物。肿瘤特异性抗原的实例包括被指定为三个主要组的抗原：癌症/睾丸特异性抗原(例如MAGE、BAGE、GAGE、PRAME和NY-ESO-1)，黑素细胞分化抗原(例如酪氨酸酶，Melan-A/MART、gp100、TRP-1和TRP-2)和突变或异常表达的抗原(例如MUM-1,CDK4、β-连环蛋白，gp100-in4、p15和N-乙酰葡糖胺转移酶V)。
药物是指当被引入体内时具有生理作用的医疗剂或其它物质。
有效量是指足以实现期望的治疗效果的组合物或材料的量，例如，导致癌细胞或与疾病(例如，癌症)相关的一种或多种症状的改善的量。施用于个体的第一免疫调节货物(例如细胞)或第二免疫调节货物(例如细胞因子)的量可取决于癌症的类型和进展以及个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。有效量还可以取决于疾病的程度、严重性和类型。本领域技术人员能够根据这些因素和其它因素确定合适的剂量。本文描述的任何方法(包括用户界面)可以被实现为软件、硬件或固件，并且可以被描述为存储能够由处理器(例如，计算机，平板电脑，智能电话等)执行的指令集的非暂时性计算机可读存储介质，所述指令集在由处理器执行时使得处理器控制执行任何步骤，包括但不限于：显示、与用户通信、分析、修改参数(包括定时，频率，强度等)、确定、报警等。
分离细胞是指将细胞从组织样品(例如血液组织，胎盘组织)解离或以其它方式除去，并将细胞与组织中的其它细胞或非细胞分离的过程。分离的细胞通常不含其它细胞类型的污染，并且通常能够增殖和扩增。
分离的细胞，例如分离的T细胞，包括基本上与该细胞所源自的组织(例如血液或胎盘)的其它不同细胞基本相分离的细胞。如果与细胞群或细胞群所来源的细胞天然相关的细胞(即，显示不同标志物谱的细胞)中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％例如在细胞的收集和/或培养期间，从细胞中除去，则该细胞是“分离的”。在一些实施方案中，分离的细胞在不干扰用于细胞分析、产生或扩增应用的小部分其它细胞类型的存在下存在。分离的细胞群可以是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％纯，或上述的任何范围。在一个具体的实施方案中，分离的细胞群是至少98％或至少99％纯的。本文所用术语“分离的细胞群”是指细胞群体基本上与该细胞群体所来源于的组织(例如血液)的其它细胞基本相分离。
发明描述
本文描述了免疫治疗递送系统，其具有可注射的和自愈合的聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶以递送第一免疫调节货物，例如细胞，和免疫调节货物，例如细胞调节剂。聚合物-纳米颗粒水凝胶是一种超分子水凝胶，其中聚合物组分通过聚合物和纳米颗粒之间的动态非共价相互作用保持在一起。这种聚合物-纳米颗粒水凝胶可受益于传统共价交联水凝胶的许多有利特性，例如高药物加载能力，用于包封生物货物的温和条件，货物的持续递送和机械可调性。此外，与传统的共价交联水凝胶不同，聚合物-纳米颗粒水凝胶由于其剪切稀化和自愈合特性，可以容易地作为免疫疗法施用。剪切稀化包括材料(例如，流体)，其粘度取决于剪切速率(例如，在剪切应变下降低)。本文所述的聚合物-纳米颗粒水凝胶的制造方法是可规模化的，因此是高度可转化的，包括简单混合聚合物、纳米颗粒(NP)、第一免疫调节货物和第二免疫调节货物的水溶液。图1A-图1C示意性地示出了聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶的实例。聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶包括聚合物(例如图1A所示的HPMC-C1210)，纳米颗粒(例如图1B所示的PEG-PLA NP 12)、CAR-T细胞14和细胞因子16(如图1C所示)。图1C还显示了载有CAR-T细胞14和细胞因子16的PNP水凝胶18。PNP水凝胶18含有产生网状水凝胶结构的交联20。网状水凝胶结构包含并保持CAR-T细胞14。
本文所述的聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶免疫治疗递送系统包括与多个纳米颗粒非共价交联连接的聚合物，水凝胶中被配置为可逆地粘附和释放细胞的细胞粘附基序，包含包封在水凝胶中的细胞的第一免疫调节货物，其中至少一部分细胞粘附到细胞粘附基序，和包封在水凝胶中的第二免疫调节货物。
细胞粘附基序可以是被配置为可逆地粘附和释放细胞的肽。一些细胞可以通过细胞粘附基序粘附到水凝胶上，然后从水凝胶中释放出来并在体内行进，例如到达或进入实体瘤。细胞可以通过先后地粘附到多个细胞粘附基序上和从多个细胞粘附基序上释放而穿过水凝胶。细胞粘附基序可用作细胞的“握柄”。细胞和细胞粘附基序之间的吸引力可以“拉动”细胞通过水凝胶，并且该过程可以重复多次。因此，细胞可以移动通过水凝胶，而不需要断裂共价键。细胞粘附基序可以可逆地粘附和释放多种不同的细胞。细胞粘附基序可以是特异的或通用的。细胞粘附基序可被配置为结合细胞上的结合伴侣。例如，细胞粘附基序可以结合细胞上的整联蛋白(例如，特异性结合整联蛋白)或其它细胞外基质受体。细胞粘附基序可以包括细胞结合蛋白的一部分或全部。例如，细胞粘附基序可以包括纤连蛋白、玻连蛋白或另一种细胞外基质分子的部分或全部。
示例性的细胞粘附基序是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽，它是一种在细胞外基质糖蛋白纤连蛋白中发现的细胞粘附基序。T细胞和自然杀伤(NK)细胞表达整联蛋白，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽被整联蛋白识别。也可以使用其它细胞粘附基序和结合配偶体。例如，可以对细胞进行遗传修饰，以表达附接于水凝胶的细胞粘附基序的结合配偶体。
细胞粘附基序可以共价或非共价地附接到水凝胶。在一些实例中，细胞粘附基序共价附接到纳米颗粒。在一些实例中，纳米颗粒呈递细胞粘附基序。细胞粘附基序可以位于纳米颗粒的外侧。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽可以附接于纳米颗粒聚合物，例如附接于纳米颗粒上的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)分子。
图1Q-1T展示本文所述的PNP系统可随时间释放受控量的CAR-T细胞。图1Q示意性地示出了用于测定随时间细胞释放的测试设备60。将CAR-T细胞加载到水凝胶制剂18中，并将水凝胶制剂置于测试装置60中的保持器中。细胞穿过水凝胶制剂18并离开保持器的底部，如箭头所示，细胞在底部被计数。
在一些变形方案中，免疫治疗递送系统细胞粘附基序可包括多种不同类型的细胞粘附基序。
在一些实例中，免疫治疗递送系统可包括纳米颗粒，其中所述纳米颗粒中的聚合物具有的具有细胞粘附基序的聚合物和不具有细胞粘附基序的聚合物的比率为10:90至90:10或25:75至75:25。在一些具体实例中，免疫治疗递送系统可包括纳米颗粒的聚合物，其包含的具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)与不具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)的比例为10:90至90:10。在一些实例中，纳米颗粒包含的具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)与不具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)的比率为25:75至75:25。如上所述，本文所述的PNP水凝胶免疫治疗递送系统可包括第一免疫调节货物，包括细胞。第一免疫调节货物可以可逆地结合到水凝胶上。例如，细胞可以可逆地(例如，非共价地)结合至细胞粘附基序。在一些实施方案中，细胞是免疫系统的过继细胞，例如T细胞或自然杀伤细胞。感兴趣的细胞可以被遗传修饰，例如在其表面上表达嵌合抗原受体(CAR)。
如上所述，本文所述的PNP水凝胶免疫治疗递送系统可包括第二(第三，第四等)免疫调节货物。第二免疫调节货物可以是肽/蛋白，或者可以是除肽/蛋白以外的组分。第二免疫调节货物可以被配置为作用于水凝胶中的另一种成分，例如作用于包封在水凝胶中的细胞。免疫调节货物可被配置为调节细胞，例如通过活化细胞。免疫调节货物可以是，例如，细胞因子，如免疫刺激性细胞因子。水凝胶中的细胞因子可用于刺激和/或扩增水凝胶中的细胞。例如，细胞因子可以刺激水凝胶中的免疫细胞，例如T细胞或自然杀伤细胞。当细胞在水凝胶中生长和分裂时，可用的细胞因子可以活化水凝胶中的细胞，例如在细胞释放到患者体内之前。
免疫调节货物，例如细胞因子，可以帮助PNP水凝胶免疫治疗递送系统作为细胞或免疫微环境或贮库，刺激可以在数小时、数天、数周或数月内(例如至少一天，至少两天，至少三天，至少四天，至少五天。至少六天，至少一周，至少两周，至少三周或至少四周)从水凝胶释放的免疫细胞。免疫治疗可以在这些时间段内(例如2至3周)从PNP水凝胶免疫治疗递送系统递送。
PNP水凝胶免疫治疗递送系统可被配置为防止第二(第三，第四等)免疫调节货物(例如细胞因子)的实质性迁移。例如，水凝胶中的物理交联可以防止第二免疫调节货物(例如细胞因子)扩散通过水凝胶或从水凝胶大幅释放。因此，在一些实例中，水凝胶中不需要破坏共价键来用第二免疫调节货物(例如细胞因子)活化第一免疫调节货物(例如细胞)。有利的是，PNP水凝胶，当其继续包封第二免疫调节货物(例如细胞因子)时，可以保护患者身体免受该货物的影响，从而防止毒性，同时将足够高剂量的该货物递送至免疫治疗货物(例如细胞)。在一些变形方案中，第二(或额外)免疫调节货物可被配置为作用于水凝胶之外的物质，而不是被配置为作用于水凝胶中的另一组分或除了被配置为作用于水凝胶中的另一组分之外。例如，另外的免疫调节货物可以包括有效剂量的活性剂，例如药物。
本文所述的剪切稀化和自愈合聚合物纳米颗粒水凝胶具有有利的材料性质和温和的合成方法，该方法是可规模化的和通用的，能够通过简单混合加载生物货物，使得它们非常适合于过继细胞的包封和递送。加载货物的水凝胶是可注射的，并且当处于低应力下时可以保持它们的固体样结构，使得能够在体内产生新的刺激性微环境并持续递送免疫疗法。聚合物纳米颗粒水凝胶可用于例如替代磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为递送介质，并可与任何免疫疗法一起使用。这些材料中的独特的动态网络重排使得能够令人意想不到地释放更大的货物和保持更小的货物，并且更大和更小的货物在尺寸或化学组成上可以显著不同。
在一些实施方案中，本文所述的聚合物纳米颗粒水凝胶可以由一种或多种聚合物制成，例如纤维素衍生物，例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基纤维素(HEC)、甲基纤维素(MC)、羧甲基纤维素(CMC)或羟丙基纤维素(HPC)，或透明质酸(HA)，任选地，上述物质可以用疏水部分修饰，疏水部分例如己基(C6)、辛基(-C8)、癸基(-C10)、十二烷基(-C12)、苯基(Ph)、金刚烷基、十四烷基(-C14)、油烯基或胆固醇(例如，5-30％修饰，例如5-25％修饰，例如约10-15％或25％)。
在一个具体的实施方案中，用十二烷基修饰10-15％HPMC。在另一个具体的实施方案中，用十二烷基修饰25％HEC。在另一个具体的实施方案中，用胆固醇修饰10％HEC。此外，聚合物可以与纳米颗粒混合，例如直径小于100nm，例如30-50nm，例如约40nm的纳米颗粒。纳米颗粒可以是具有疏水核的核-壳纳米颗粒，例如聚(乙二醇)-嵌段-聚(乳酸)(PEG-PLA)或聚(乙二醇)-嵌段-聚(己内酯)(PEG-PCL)纳米颗粒。
此外，在一些实施方案中，PNP水凝胶可以包含大于1重量％的聚合物，例如大于1重量％且小于5重量％的聚合物，例如1.5-3重量％的聚合物，例如约2重量％的聚合物。在一些实施方案中，PNP水凝胶可包含4-12％的纳米颗粒，例如8-11％的纳米颗粒，例如10％的纳米颗粒。具有这些范围内一定百分比的纳米颗粒有助于确保PNP保持稳定。本文所用“X:Y凝胶”可指X重量％聚合物和Y重量％纳米颗粒。本文所述的PNP水凝胶被配置为通过非共价键溶解。本文所述的PNP水凝胶可额外地或替代地包括美国公开号2017/0319506和WO公开号2020/072495中所述的水凝胶的任何特性和/或特征，将上述文献的全文以援引加入的方式并入本文中。
本文还描述了治疗疾病的方法，包括将本文所述的任何PNP水凝胶免疫治疗递送系统递送至患者并从水凝胶中释放细胞。图1E示意性地展示了将PNP水凝胶免疫治疗递送系统递送至患者脑30的肿瘤22。图1E示出了使用递送装置46(例如注射器)递送的PNP水凝胶18。PNP水凝胶18被递送在肿瘤22旁边。在一些变形方案中，方法包括将PNP水凝胶(和相关的CAR-T细胞14)递送入肿瘤中、递送至肿瘤顶部、肿瘤的部分或全部的周围，或远离肿瘤。PNP水凝胶18释放CAR-T细胞18(CAR-T细胞18从PNP水凝胶18中移出)。CAR-T细胞受体15结合肿瘤细胞24上的抗原26。该方法可以进一步包括在持续一天至四周，或至少一天，至少两天，至少三天，至少四天，至少五天，至少六天，至少一周，至少两周，至少三周，或至少四周或这些之间的任何时间的时间段从水凝胶中释放细胞。本文所述的任何方法可包括用免疫调节货物活化细胞。本文所述的任何方法可包括将水凝胶中的细胞数量扩大，例如扩大2倍、3倍、5倍、10倍或100倍。本文所述的任何方法可包括治疗癌症和/或实体瘤。本文所述的任何方法可包括释放过继细胞，例如T细胞或自然杀伤细胞。本文所述的任何方法可包括释放表达识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)的细胞。本文所述的任何方法可包括释放同种异体细胞或自体细胞。本文所述的任何方法可进一步包括从患者或供体中移除细胞；分离移除的细胞；体外扩增细胞数；以及在递送步骤之前将细胞包封在水凝胶中。本文所述的任何方法可包括通过注射器或导管递送免疫治疗递送系统。本文所述的任何方法可包括通过选自静脉内、腹膜内、肌内、瘤内和皮下的途径将免疫治疗递送系统递送至患者。免疫治疗递送系统可局部递送至患者需要治疗的区域。患者需要治疗的区域可以是癌性区域、葡萄胎、息肉、实体癌肿瘤、良性生长物或非良性生长物、癌性区域或癌前区域。在一些实例中，免疫治疗递送系统可以被递送到患者体内的实体瘤癌症(脑肿瘤、乳腺肿瘤、结肠肿瘤等)，例如通过注射到实体瘤癌症中。实体瘤癌症的检测可以通过活组织检查(例如骨髓活组织检查、内窥镜活组织检查、切除或切开活组织检查、细针抽吸活组织检查、穿孔活组织检查、刮擦活组织检查、皮肤活组织检查)、内窥镜检查(例如膀胱镜检查、结肠镜检查、乙状结肠镜检查)、成像(例如透射成像(例如X射线、计算机断层摄影(CT)或计算机轴向断层摄影(CAT)扫描、荧光检查)，反射成像(例如超声)或发射成像(例如磁共振成像(MRI))、触诊或手术。
在本方法和其它方法中，递送包括将免疫治疗递送系统递送至患者。在本方法和其它方法中，递送包括将系统递送到远离患者需要治疗的区域的一个或多个位置。患者需要治疗的区域可以是癌性区域、葡萄胎、息肉、实体癌肿瘤、良性生长物或非良性生长物、癌性区域或癌前区域。在本方法和其它方法中，疾病包括实体瘤癌症，并且将免疫治疗递送系统递送至患者包括将系统递送至患者中远离实体瘤癌症的位置。如上所述，将系统递送到远离患者需要治疗的区域的位置可以包括通过诸如静脉内、腹膜内、肌内、瘤内和皮下的途径递送。在一些实例中，将免疫治疗递送系统递送至患者可包括递送至一个位置、多个位置和/或全身性递送。如果免疫疗法被递送到一个以上的位置，则这些位置可以是局部的、远离的，或局部的和远离的两者(免疫疗法可以被递送到一个或多个局部位置和一个或多个远离位置)。
本文还描述了可用于免疫治疗递送的套装产品。套装产品可以包括聚合物前体、纳米颗粒前体和/或细胞粘附基序。一些套装产品可包括免疫调节货物。在一些套装产品中，聚合物前体包括具有疏水性脂质十二烷基链的羟丙基甲基纤维素(HPMC)。一些套装产品包括第一聚合物前体和第二聚合物前体，第一聚合物前体包括没有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)，第二聚合物前体包括具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)。在一些变形方案中，细胞粘附基序可以共价或非共价地连接到第二聚合物前体。在一些变形方案中，免疫调节货物包括细胞因子，例如白介素，例如IL-15。
实验：
在本申请的水凝胶系统中，使用异氰酸酯偶联化学，用疏水性脂质十二烷基链(C12)修饰羟丙基甲基纤维素(HPMC)。使用纳米沉淀技术，制备直径为～40nm的PEG-PLA纳米颗粒(NP)，产生具有亲水性PEG基冠和疏水性PLA基核的核-壳纳米颗粒(NP)。为了促进细胞粘附和活力，在)之前通过铜催化的“点击”化学反应将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)细胞粘附基序附接到PEG-PLA共聚物的亲水端。RGD官能化的PEG-PLA聚合物(RGD-PEG-PLA)和未修饰的PEG-PLA聚合物的25:75物理混合物用于产生纳米颗粒(NP)。通过混合HPMC-C12聚合物和PEG-PLA NP的水溶液形成聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶(图1A)。在混合纳米颗粒(NP)和聚合物溶液之前，将细胞轻松地悬浮在纳米颗粒水相中。当混合这些组分时，疏水修饰的HPMC聚合物与PEG-PLA纳米颗粒(NP)的表面之间的动态多价相互作用引起物理交联和水凝胶形成。本实验中，发明人关注于含有1wt％HPMC-C12和5wt％纳米颗粒的制剂。超分子聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶平台表现出剪切稀化的行为，使得能够通过小直径针注射并保护包封的细胞免受注射器中的强烈机械力。
为了研究这种将CAR-T细胞局部递送至肿瘤部位的治疗策略的作用，在NSG小鼠中实施人成神经管细胞瘤的异种移植模型。选择该模型作为静脉内递送细胞的相对难治疗案例。B7H3 CAR 41BBZ CAR-T细胞在处理前扩增10天。对肿瘤进行工程化，以表达萤光素酶，以实现对肿瘤大小的发光监测，同时对T细胞进行工程化，以表达纳米萤光素酶。用不同治疗策略，向每只小鼠递送8×106CAR-T细胞，包括传统的IV、局部盐水(PBS)弹丸注射和包封在聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶中的细胞的局部注射(100μL注射)。随时间监测肿瘤和T细胞，以评估治疗效果(图2A-图2C)。在实验结束时，局部PBS和聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶策略在治疗肿瘤方面都是成功的。聚合物-纳米颗粒水凝胶组有趣地展示出，在稍后的时间点非常有效的T细胞扩增。这些结果证实，T细胞可以增殖并从聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶迁移至靶肿瘤。
为了进一步检验模型，在下一研究中，用不同治疗策略向每只小鼠递送较低剂量的2×106细胞。此外，在研究中还包括含有IL-15的3个组。将IL-15以一种浓度(2.5μg/mL)加入到局部PBS注射物中，并将IL-15以两种不同浓度(2.5μg/mL和25μg/mL)加入聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶制剂。随时间监测肿瘤，以评估治疗效果(图3A-3B)。在实验结束时，只有含有IL-15的聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶组完全根除肿瘤。由于在含有IL-15的PBS组中存在肿瘤，水凝胶可能局部保留IL-15，从而促进局部细胞增殖。
为了进一步确定聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶免疫疗法是否可用于治疗远离处理部位的肿瘤，将具有CAR-T细胞的聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶置于远离肿瘤部位的位置。如本文所述制备水凝胶，并将水凝胶递送至人成神经管细胞瘤的异种移植模型(例如，如图2A-2C中所述)，不同之处在于将具有CAR-T细胞的聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶注射到小鼠与肿瘤位置相对的远侧皮下空间中。通过生物发光随时间测量肿瘤。同样，与上述类似，进行CAR-T细胞的盐水(PBS)弹丸注射(见图4A的左侧和图4B的顶部)。图4A和图4B显示，相对于使用盐水(PBS)弹丸注射治疗的小鼠，接受水凝胶治疗的小鼠显示治疗提高。从第2天到第34天对小鼠进行成像的结果如图4A所示。图4B上的生物发光成像标度(y轴)与图2C和图3B中所示的相似，并且示出了在感兴趣区域(ROI)中随时间的总通量(以天为单位)(x轴)。
总的来说，本文公开了用于癌症治疗的递送策略。有利的是，本文所述的PNP水凝胶免疫治疗递送系统可有效地用于癌症治疗。在一些实施方案中，这种水凝胶系统使用最小的化学技术，使得能够快速配制，并且允许用于治疗的细胞因子的模块化个性化并入。在一些实例中，可以在肿瘤部位用简单的注射进行治疗。该方法可应用于CAR-T细胞和其它过继细胞递送应用，例如递送内源性或修饰的自然杀伤细胞。
为了解决这些挑战，发明人设计了基于可注射的聚合物-纳米颗粒(PNP)水凝胶的用于CAR-T细胞递送的生物材料平台(图1A-1T)。这些水凝胶利用了可高度规模化的化学技术，并且可以在温和的条件和设施下配制，从而有利于治疗细胞的包封，同时水凝胶的可注射性使得能够将细胞局部递送至肿瘤(图1C)。为了制备这些水凝胶，将十二烷基修饰的羟丙基甲基纤维素(HPMC-C12；图1A)的溶液与包含聚(乙二醇)-b-聚(乳酸)(PEG-PLA NP)的生物可降解纳米颗粒(NP)的溶液混合。在混合后，HPMC-C12聚合物和PEG-PLA NP之间的动态多价相互作用引起物理交联并形成稳定的水凝胶(图1C)。PNP水凝胶在一定温度范围内保持它们的性质，它们的物理交联使得能够容易地通过针或导管注射，并且可以在较长和受控的时间范围内保持局部信号转导。为了促进细胞运动性和活力，在纳米沉淀之前，使用“点击”化学反应将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)细胞粘附基序附接到PEG-PLA共聚物的亲水端。发明人以前已经证实，在与HPMC-C12混合之前，细胞可以容易地悬浮在RGD-PEG-PLA NP溶液中。
在缓慢递送免疫刺激分子同时改造将能保持T细胞活力的基质方面，存在固有的材料设计挑战。尽管先前报道的生物材料需要将活化信号缀合到材料支架上用于体外扩增和体内治疗，但是发明人最近已经证实，PNP水凝胶内的动态聚合物网可以被改造得足够小以提供蛋白质的长时间保留，同时仍然能够实现细胞运动。因此，发明人假设，免疫刺激信号(如增殖细胞因子)与CAR-T细胞的共包封将增强T细胞的体内扩增。
发明人试图确定水凝胶制剂如何影响材料性质和包封后的CAR-T细胞运动性(图1O-图1P，图8A-图10)。发明人制备了3种硬度渐增的PNP水凝胶制剂：PNP-1-1、PNP-1-5、PNP-2-10，其中第一个数字表示重量％HPMC-C12，第二个数字表示重量％NP(剩余的重量％是盐水)。增加制剂中聚合物和NP的浓度降低了基质的动态网目尺寸，增加了凝胶硬度并降低了基质的自扩散性(图8A-图10)。由于先前的研究表明包封在水凝胶环境中的T细胞的迁移很大程度上取决于凝胶的网目大小和硬度，发明人进行细胞迁移实验以理解PNP水凝胶的动态材料性质如何影响包封的CAR-T细胞的运动(图1L-1P)。图1L显示了用于测试细胞运动性的具有顶部56的测试装置50。将具有CAR-T细胞14的PNP水凝胶置于测试装置50中。照明器52递送辐射，检测细胞的运动(由箭头40指示，插图)。RGD与PNP水凝胶结构的缀合提高了T细胞运动性(图13A-13C)，并且随着水凝胶网目尺寸和基质自扩散率的降低，细胞迁移速度降低(图1O)。基于这些研究，选择PNP-1-5制剂用于继续研究，这是由于其生理上相关的硬度和中等的细胞迁移和基质自扩散特性。
发明人相信，CAR-T细胞和刺激性细胞因子(如IL-15(一种有效的T细胞活化剂，其也被发现支持T细胞记忆的维持))的共包封改善水凝胶内的CAR-T增殖。此外，由于IL-15是小分子(<15kDa)且不稳定，所以遗憾的是IL-15在人中仅显示出1.5小时的短消除半衰期，正因为如此IL-15将受益于持续递送。发明人首先试图确定PNP-1-5水凝胶是否能够提供IL-15的长时间保留以提高CAR-T活化。体外释放研究表明，IL-15在PNP-1-5水凝胶中保持4天以上，显示2.6天的释放半衰期(图11A-11B)。发明人还发现，PNP水凝胶包封显著增强了IL-15的稳定性，证实了先前的发现，即，PNP水凝胶可以改善包封的生物制剂的稳定性。此外，体外实验证明，CAR-T细胞和IL-15在PNP-1-5水凝胶中的共包封增强了水凝胶内的T细胞增殖(图12)和PGC-1α的表达(图14A-14B)，PGC-1α是线粒体生物发生的主要调节物，其可以增加它们的代谢适合度。
为了评估PNP水凝胶改善实体瘤的CAR-T细胞治疗的能力，将人B7H3 CAR-T细胞在PNP水凝胶中经肿瘤周递送至NSG小鼠，并与皮下人成神经管细胞瘤实体瘤模型中的治疗相关对照进行比较(图5A)。这种皮下实体瘤模型代表身体的开放的、可接近的和可推广的位置，这与在最近局部递送研究中使用的脑或眼肿瘤模型相反，脑或眼肿瘤模型是无法接近的。使用双荧光素酶体内成像系统平行跟踪和定量肿瘤和CAR-T细胞。与弹丸施用和静脉内治疗相比，PNP水凝胶改善了治疗(图5B-5C，图15)。在每次处理中具有更多CAR-T细胞的研究中，弹丸施用和IV对照仍显示出无法治愈或以较慢的速率治愈，这表明剂量节约效应，其中PNP水凝胶组的细胞比这些对照少，而表现更好(图16A-16D)。
在PNP水凝胶中并入IL-15改善了治疗(图5B-5C)。共同递送的IL-15剂量低于近来与小鼠成比例的人类临床试验中rhIL-15的最大耐受皮下剂量(补充讨论1)。与弹丸施用和静脉内给药相比，当从凝胶释放时，全身性IL-15水平在体内保持升高(图17A-17B)。动物模型的副作用主要是NSG小鼠中出现对人T细胞的ACT常见的移植物抗宿主病(GVHD)，因此将研究的时间限制为30天。总之，具有IL-15的PNP-1-5水凝胶改善了治疗的治愈率和一致性，所有小鼠在第12天完全治愈(图5C-5D，图18)。所有其它组显示出较低的功效和更不一致的结果。还研究了包括静脉内施用IL-15的治疗。功效最初与具有IL-15的PNP-1-5水凝胶相当，但20％的小鼠在治疗后的前3天内未能存活，这可能是由于血液中的细胞因子浓度峰值。几只存活的小鼠也显示肿瘤复发(图19A-19G)。当在PNP水凝胶中共递送高浓度的IL-15和CAR-T细胞时(图20A-20B)以及当与在PNP水凝胶中共递送IL-15相似地在PNP水凝胶中共递送IL-2(另一种常见的活化细胞因子)与CAR-T细胞时(图21A-21D)，观察到类似的有效结果。
当在PNP水凝胶中递送CAR-T细胞时，特别是当与IL-15共递送时，也观察到增强的T细胞扩增(图2E-2G)。与IV对照相比，含有IL-15的PNP-1-5导致T细胞扩增增加超过100倍(图2G)。当递送更高剂量的T细胞以及当在PNP水凝胶中与CAR-T细胞共递送IL-2时，观察到扩增增加的类似结果(图16A-16D，图21A-21D)。凝胶在稍后的时间点表现出显著增加的T细胞扩增，可能导致GVHD的发生。成像数据显示，在第10天和第21天之间，T细胞信号的主要位置从右侧皮下侧腹的凝胶移动到脾，与肿瘤清除的时间相符。组织学证实，对这种生物材料没有不利的免疫应答，并且在注射后几天，CAR-T细胞仍然存在于凝胶内和凝胶的外周(图22A-22F)。另外，炎性细胞因子分析证实该治疗方法不引起小鼠或人细胞因子中的激增(图23-图24)。
为了更好地理解在PNP-1-5凝胶中共递送的CAR-T+IL-15中观察到的增强功效的机制，在治疗后10天进行T细胞的离体分析。该分析揭示，增强的CAR表达(图5H)、增强的持久性(图5I)以及来自与IL-15共包封的T细胞的更大比例的CD8+(图5J)和TSCM亚组(图5K)。尽管所有CAR-T组具有相似水平的活化标志物4-1BB、LAG-3和PD-1，但IL-15的共递送导致CD39的表达增强，CD39最近作为肿瘤反应性T细胞的标志物出现(图25A-25C)。共递送的IL-15增加了PNP CAR-T处理的小鼠的血液和脾样品中的T细胞数目，而在这些部位的所有组之间的记忆亚组是类似的(图26A-26D和27A-27B)。
除了经肿瘤周递送水凝胶外，还进行了其他实验，其中水凝胶在小鼠的远侧腹部皮下递送，使得从凝胶释放的T细胞不会直接释放至肿瘤(图6A-6F和图28)。成像研究表明，含有IL-15的水凝胶实现的肿瘤清除超过远侧弹丸对照，即使这两种治疗在血液和脾中表现出相似的总T细胞扩增和相似的T细胞亚组分布(图29A-29B和图30)。这些研究比以前的研究具有更长的持续时间，因为小鼠经历显著延迟的GVHD。此外，虽然远侧水凝胶治疗与肿瘤周围水凝胶治疗相比显示出延迟的功效，但是所有小鼠最终都被治愈。这些有前景的结果表明，这种水凝胶治疗可以在治疗转移性癌症或不可接近的肿瘤中具有未来应用。
除非另有直接说明或通过上下文指出，否则使用下文所述的材料和方法进行本文所述的实验。
材料：所有化学品、试剂和溶剂均以试剂级购自Sigma-Aldrich、Acros或AlfaAesar，除非另有说明，否则原样使用。将玻璃器皿和搅拌棒在180℃烘箱干燥。当指定时，通过冷冻、泵动和解冻的三个循环将溶剂脱气。HPMC-C12、PEG-PLA和RGD-PEG-PLA如之前技术所述合成和表征。通过根据文献操作的纳米沉淀，使用RGD-PEG-PLA:PEG-PLA聚合物的50:50混合物，制备NP，并且通过动态光散射(直径＝35nm、PDI＝0.02)表征NP尺寸和分散性。
水凝胶制剂和细胞包封：按照之前技术所述实施方法并进行分析。将HPMC-C12以6wt％溶解于磷酸盐缓冲盐水中，并加载到1mL luer锁注射器中。将含有达到最终水凝胶中所需浓度的细胞数的细胞团悬浮在磷酸盐缓冲盐水中。然后，将配制于PBS中的20wt％纳米颗粒溶液加入到细胞悬浮液中。RGD与无修饰NP的20:80混合物用于形成用于含有RGD的研究用水凝胶，在凝胶中产生0.5mM浓度的缀合RGD。将CAR-T细胞/纳米颗粒溶液加载到1mLluer锁注射器中。然后将细胞/纳米颗粒注射器连接到阴-阴混合肘管，将溶液移入肘管直至通过肘管的另一端可见。然后，将含有HPMC-C12聚合物的注射器连接到肘管的另一端。然后，将两种溶液通过肘管轻轻地反复混合30秒至1分钟，直到溶液完全混合并形成均匀的加载细胞的PNP水凝胶。在水凝胶配制期间，IL-15(R&D Systems)与纳米颗粒结合。
水凝胶的流变学表征：在应力受控的TA Instruments DHR-2流变仪上，使用20mm直径的锯齿状平行板在600μm间隙下进行流变测试。所有实验在25℃下进行。频率扫描在1％的应变下进行。振幅扫描以10rad/s的频率进行。从高剪切速率到低剪切速率进行流动扫描，其中在120秒内用10％内的5个点进行稳态感测。
细胞系：MED8A由S.Chesier(Stanford University，Stanford，CA)馈赠。在补充有20％ FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES(Gibco)的DMEM中培养MED8A-GFP-Fluc细胞。每年进行一次STR DNA图谱分析(Genetica Cell Line测试)并常规测试支原体。在5％ CO2环境中在37℃下培养细胞系。
质粒构建和病毒生产：通过将MGA271 scFv与CD8α铰链和跨膜区、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域、猪特克斯病毒-1 2A(P2A)核糖体跳跃序列和MSGV逆转录病毒载体中的nanoluc融合，构建B7H3CAR-P2A-Nluc质粒。通过将P2A序列和mNeonGreen融合到Antares的c末端而构建Antares-P2A-mNG。如前所述，使用用RD114包膜质粒和相应的质粒构建体转染的293GP包装细胞产生逆转录病毒上清液。
CAR-T细胞分离：T细胞从Stanford Blood Center购买的血沉棕黄层中分离，采用免受IRB方案。使用RosetteSep Human T cell Enrichment试剂盒(Stem CellTechnologies)和SepMate-50管进行阴性选择，以纯化原代人T细胞。在CryoStor CS10培养基中以1-2×107细胞/mL的浓度冷冻T细胞。
CAR-T制备：在第0天解冻原代人T细胞，并用抗CD3/CD28Dynabeads(ThermoFisher)以3:1的珠与T细胞比例进行活化，并在AIM V+5％热灭活FBS、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES和100U/mL rhIL-2中培养。在第2天，在12孔非tc、Retronectin包被的平板上(Takara/Clontech)，通过以3200rpm旋转1mL相应的病毒2小时，制备病毒包被的孔。然后在这些平板上培养T细胞24小时。转导过程在第3天后进行。在第4天磁性移除珠子，并且将细胞扩增直到第10天用于体内实验和第10-14天用于体外实验。对于双重病毒共转导，在第2天用Antares-P2A-MNG转导T细胞，在第3天用B7H3 CAR-P2A-Nluc转导细胞。
离体CAR-T细胞分析：对于转移的T细胞的离体分析，在施用T细胞10天后对小鼠实施安乐死。收集凝胶，并通过机械离解(gentleMACS离解器，Miltenyi)提取T细胞。将单细胞悬浮液过滤并染色用于流式细胞术。
流式细胞术：使用用DyLight 650Microscale Antibody Labeling Kit(ThermoFisher)荧光标记的重组B7H3-Fc(RD Systems)检测B7H3 CAR。下列抗体用于染色T细胞：BUV395小鼠抗人CD4(Clone SK3，BD)、BUV805小鼠抗人CD8(Clone SK1，BD)、BV605小鼠抗人CD62L(Clone DREG-56，BD)和BV711小鼠抗人CD45RA(Clone HI100，BD)。使用CountBrightAbsolute Counting Beads(Thermo Fisher)进行CAR-T细胞定量。在BD Fortessa上进行流式细胞术，并在FlowJo版本10.7.1上进行分析。
WST增殖测定：以0.5×106细胞/mL的浓度，将100μL的PNP-1-5水凝胶加载到96孔板的孔中，孔具有不同浓度的IL-15(0、0.25μg/mL和2.5μg/mL)。将100μL的CAR-T细胞培养基置于各凝胶的顶部并在37℃和5％CO2下培养。1天后，除去培养基，并将100μL的新培养基和10μL的WST试剂加入每个孔中(WST-1Cell Proliferation Reagent，ab155902)。在WST溶液中孵育2小时后，摇动10秒，然后使用读板器在OD＝450nm下读取吸光度。
CAR-T细胞迁移研究：用装配有适于活成像(37℃，5％ CO2)的温度/培养箱控制的激光扫描共聚焦显微镜(Leica SP8)进行活细胞成像。使用20×空气物镜，NA＝0.75，在5小时(以10分钟间隔)获得约60μm的堆叠图像。调节成像参数以最小化光漂白并避免细胞死亡。在完成迁移研究之后，使用Imaris(Bitplane)中的斑点检测功能跟踪mCherry标记的细胞的质心。从分析中排除分割不佳的细胞和细胞碎片，并在适当时进行漂移校正。使用自定义的MATLAB脚本重构细胞迁移轨迹。
光漂白后的荧光恢复：用不同的HPMC-C12和NP浓度(PNP-2-10、PNP-1-5和PNP-1-1)制备三种不同的PNP水凝胶制剂。根据文献方案21将异硫氰酸荧光素偶联至HPMC-C12。将凝胶置于载玻片上并用共焦LSM780显微镜成像。使用低强度激光对样品成像以观察初始荧光水平。然后将激光切换至全强度并聚焦在具有25μm直径的感兴趣区域(ROI)上持续10秒以漂白圆形区域。然后记录荧光数据4分钟以产生指数荧光恢复曲线。样品取自每种凝胶的不同区域(n＝5-9)。根据以下等式计算扩散系数：
常数D＝τD，其中τ1/2是恢复的半时长，τD是特征扩散时间，两者都由ZEN软件产生，并且ω是漂白的ROI的半径(12.5μm)。
体内实验方法：所有实验遵循批准的方案。在处理前5天，将5×105MED8A-GFP-Fluc细胞皮下注射到NSG小鼠的右胁腹，以50:50比率的Matrigel(Cultrex Pathclear)与磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行处理。在治疗前一天，对小鼠进行成像并将小鼠分布到大致相等的肿瘤负荷的组中。如前所述，在注射前1小时，在组织培养罩中，将CAR-T细胞包封在1mL注射器中的磷酸盐缓冲盐水或PNP水凝胶中。在研究中为每个实验组制备一个注射器。在每个注射器中制备300μL额外的凝胶。制备两倍体积的弹丸和静脉内对照。将注射器在冰上运输至动物设施。将100μL的磷酸盐缓冲盐水或PNP水凝胶递送至每只小鼠。皮下注射在21Gluer锁注射器中递送。
体内成像：为了肿瘤成像，向小鼠腹膜内注射150mg/kg(配制于磷酸盐缓冲盐水中)的D-萤光素钾盐(Goldbio)。5分钟后，用异氟烷气体麻醉小鼠，并用体内成像系统(Spectral Imaging Instruments Lago-X)以30秒的暴露时间成像。将信号定量为在峰值强度下感兴趣区域中光子/秒的总通量。感兴趣的区域被定义为围绕整个小鼠的大小一致的矩形框。用于定量的背景信号被定义为在没有发光信号的相同尺寸的矩形框中通过所有成像实验观察到的最大信号。为了肿瘤成像，向小鼠腹膜内注射配制于磷酸盐缓冲盐水中的40x稀释液的纳米荧光素(NanoLuc，Promega)。5分钟后，用异氟烷气体麻醉小鼠，并在体内成像系统(Spectral Imaging Instruments Lago-X)中以30秒的暴露时间成像。将信号定量为在峰值强度下感兴趣区域中光子/秒的总通量。感兴趣的区域被定义为围绕整个小鼠的大小一致的矩形框。
组织学：在治疗的第5天通过解剖从小鼠中取出凝胶，并在最佳切割温度化合物(OCT)中冷冻。所有样品都用Stanford Animal Histology Services处理和染色。从含有IL-15的PNP-1-5水凝胶收集两个重复，并且收集两个重复用于PNP-1-5水凝胶。
体外细胞因子释放：毛细管加载100μL含有0.25μgIL-15的PNP水凝胶。将300μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)加载到每个凝胶的顶部。将样品在37℃保存以模拟生理环境。在每个时间点，使用长针完全除去PBS，并在-80℃保存用于随后的分析。然后更换PBS。根据制造商的说明书(R&DSystems Human IL-15Quantikine Assay)，通过ELISA测定IL-15浓度。在450nm下、在Synergy H1 Microplate Reader(BioTek)中测量吸光度。在4天结束时，稀释凝胶并分析剩余的细胞因子。从标准曲线计算细胞因子浓度。凝胶中的质量计算为在研究期间释放到释放缓冲液中的总质量和在研究结束时留在凝胶中的细胞因子的倒数。通过拟合指数衰减来计算半衰期。
体内细胞因子释放：通过尾静脉血液采集在指定时间采集血清并保存在-80℃。根据制造商的说明书(R&D Systems Human IL-15Quantikine Assay)通过ELISA测定血清IL-15浓度。在450nm下、在Synergy H1Microplate Reader(BioTek)中测量吸光度。从标准曲线计算细胞因子浓度。
炎性细胞因子分析：48小时后从每只小鼠收集60μL血液(每组n＝3)。由StanfordHuman Immune Monitoring Center处理和分析样品。相对于自然小鼠报告样品。
治愈率分析：为了验证治疗之间的治愈时间是否不同，发明人使用了SASUniversity Edition的截尾数据的最大似然参数回归(PROC LIFEREG)。如果小鼠的信号达到1.5×106p/s之下并保持，则将该小鼠计数为治愈。由于移植物抗宿主病、肿瘤大小或由于COVID-19停机而导致的早期研究终止而被安乐死的小鼠被右删失(right-censored)。IV处理组中的小鼠在实验结束之前没有被治愈并且全部被删失(censored)，因此IV处理被排除在该分析之外。由于在多个实验运行中评价了一些组，因此在模型中包括实验队列作为固定的块(对照)因子。模型中还包括初始肿瘤大小作为块因子(blocking factor)。用最小二乘平均值比较各个处理之间的治愈时间，用Tukey-Kramer事后检验校正多重比较。
CAR-T细胞扩增分析：对于统计分析，T细胞发光读数需要额外的log10转化以满足方差齐性的假设。为了测试CAR-T细胞群生长在不同处理之间是否不同，发明人使用了SASUniversity Edition中的限制最大似然(REML)混合模型。小鼠被包括作为随机效应个体，实验队列被包括作为固定块(对照)因子。治疗和时间之间的相互作用检验处理是否随时间改变肿瘤生长。Bonferroni校正用于调整多重比较(α＝0.0033)。
统计方法：除非另外说明，否则所有误差均以标准偏差报告。
人类中rhIL-15等同剂量的计算：虽然许多CAR-T疗法需要淋巴细胞耗竭，但关于淋巴细胞耗竭如何影响rhIL-15的最大耐受剂量的研究却很少，因此发明人的研究中的剂量是基于可获得的文献。在最近的人类临床试验中，每天的最大耐受皮下剂量为2μg/kg/天。发明人可以通过乘以12.3将该剂量换算至小鼠，得到24.6μg/kg/天。假设小鼠体重约0.02kg，则在小鼠中以一个剂量给予0.492g。发明人选择在发明人的研究中皮下施用约一半的该剂量，即，0.25μg。需要注意，该剂量超过在人中静脉内递送的rhIL-15的最大耐受剂量，0.3μg/kg/天，2等于0.073μg。
虽然CAR-T治疗已经在B细胞恶性肿瘤中产生了显著的抗肿瘤作用，但在实体瘤中的临床活性是有限的。部分原因是不利的实体瘤微环境，其可含有抑制T细胞活化和持续性并促进功能障碍的因子。发明人的新的基于凝胶的递送方法提供了局部微环境，其有助于扩增和维持转移的T细胞的贮库并提高功效。未来需要研究包含另外的因子(如免疫刺激剂和检查点抑制剂)的制剂，这些因子可以帮助募集内源性免疫细胞以进一步放大应答并促进表位扩散。
如本文所述，在PNP水凝胶中CAR-T细胞和细胞因子的共递送提供了治疗实体瘤的策略。这种可规模化和可注射的材料提供了CAR-T细胞的微创递送，以改善实体瘤的治疗并减少有效治疗所需的细胞数量，并进而降低与长生产周期相关的成本。体外研究阐明了水凝胶制剂的设计标准。PNP水凝胶可同时缓慢释放CAR-T细胞和细胞因子，增强细胞因子的稳定性，并改善局部T细胞扩增，实现改善的功效。PNP水凝胶改善了肿瘤局部和远侧的CAR-T细胞治疗。PNP水凝胶解决了有效CAR-T细胞递送治疗局部和远侧实体瘤的未满足的需要。
当特征或元件在本文中被称为在另一特征或元件“上”时，其可直接在另一特征或元件上，或者也可存在居间特征和/或元件。相反，当特征或元件被称为“直接”在另一特征或元件“上”时，不存在中间特征或元件。还应当理解，当特征或元件被称为“连接”、“附接”或“偶联”到另一特征或元件时，它可以直接连接、附接或偶联到另一特征或元件，或者可以存在居间特征或元件。相反，当特征或元件被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接偶联”到另一特征或元件时，不存在居间特征或元件。尽管关于一个实施方案进行了描述或说明特征和元件，但是这样描述或说明的特征和元件可以应用于其它实施方案。本领域的技术人员还应了解，提及一个结构或特征“邻近”另一特征设置，该结构或特征可具有与邻近特征重叠的部分或位于邻近特征下方的部分。
本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而不旨在限制本发明。例如，如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”也旨在包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示并非如此。本领域的技术人员应进一步理解，当在本说明书中使用时，术语“包括”和/或“包含”指定所陈述的特征、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但不排除一个或多个其它特征、步骤、操作、元件、组件和/或它们组成的组的存在或添加。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合，并且可以简写为“/”。
空间相对术语，例如“下方”、“低于”、“更低”、“上方”等，可以在本文用于便于描述，以描述一个元件或特征与另一个元件或特征如图所示的关系。应当理解，空间相对术语旨在包括除了图中所示的定向之外的使用或操作中的装置的不同定向。例如，如果图中的装置被倒置，则被描述为在其它元件或特征的“下方”或“之下”的元件将被定向在其它元件或特征的“上方”。因此，示例性术语“下方”可以包括上方和下方的定向。装置可以另外定向(旋转90度或在其它方向)，并且本文使用的空间相对描述相应地解释。类似地，术语“向上地”、“向下地”、“垂直”、“水平”等在本文中仅用于解释的目的，除非另有具体说明。
虽然术语“第一”和“第二”在本文可以用来描述不同特征/元件(包括步骤)，但是这些特征/元件不应受这些术语的限制，除非上下文另有说明。这些术语可用于将一个特征/元件与另一个特征/元件区分开。因此，下面讨论的第一特征/元件可以被称为第二特征/元件，并且类似地，下面讨论的第二特征/元件可以被称为第一特征/元件，这不脱离本发明的教导。
在本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”和变形词诸如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”意指各种组分可以共同用于方法和制品(例如，包括装置和方法的组合物和装置)。例如，术语“包含”被理解为暗示包括任何所述的元件或步骤，但不排除任何其它元件或步骤。
通常，本文描述的任何装置和方法应该被理解为包括性的，但是所有组件和/或步骤或组件和/或步骤亚集可以是排除的，并且可以被表示为“由各种组件、步骤、子组件或子步骤组成”或“基本上由各种组件、步骤、子组件或子步骤组成”。
在本说明书和权利要求书中使用的，包括在实施例中使用的，除非另有明确说明，所有的数字都可以被理解为以词语“大约”或“约”作为前缀，即使该术语没有明确出现。当描述量值和/或位置以指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内时，可以使用短语“约”或“近似”。例如，数值可以具有所述值+/-0.1％的值(或值范围)、所述值+/-1％的值(或值范围)、所述值+/-2％的值(或值范围)、所述值+/-5％的值(或值范围)、所述值+/-10％的值(或值范围)等。除非上下文另有说明，否则本文给出的任何数值也应理解为包括约或近似该值。例如，如果公开了值“10”，则相当于还公开了“约10”。本文所述的任何数值范围旨在包括其中包含的所有子范围。还应理解，当公开一个值时，相当于还公开了“小于或等于”值、“大于或等于该值”和值之间的可能范围，如本领域技术人员适当理解的。例如，如果公开了值“X”，也相当于公开了“小于或等于X”以及“大于或等于X”(例如，其中X是数值)。还应当理解，在整个申请中，数据以多种不同的格式提供，并且该数据表示端点和起始点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果特定数据点“10”和特定数据点“15”被公开，则应当理解，大于10和15、大于或等于10和15、小于10和15、小于或等于10和15、等于10和15以及在10至15也被认为是公开的。还应理解，还公开了两个具体单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则相当于还公开了11、12、13和14。
尽管上面描述了各种说明性实施方案，但是在不脱离权利要求所述的发明范围的情况下，可以对各种实施方案进行多种改变中的任何一种。例如，在替换实施方案中，执行各种所述方法步骤的顺序通常可以改变，并且在其它替换实施方案中，可以完全跳过一个或多个方法步骤。各种设备和系统实施方案的可选特征可以包括在一些实施方案中，而不包括在其它实施方案中。因此，前面描述主要是为了示例的目的而提供的，而不应被解释为限制发明范围，发明范围在权利要求中阐述。
本文所包括的实施例和说明通过说明而非限制的方式示出了可以实践本申请主题的具体实施方案。如上所述，可以利用和从中导出其它实施方案，使得可以在不脱离本申请的范围的情况下进行结构和逻辑替换和改变。发明主题的这样的实施方案在本文可以单独地或共同地由术语“发明”来表示，这仅仅是为了方便，并且如果实际上公开了一个以上的发明或发明概念，则并不主动希望将本申请的范围限制到任何单个发明或发明概念。因此，尽管本文已经说明和描述了具体实施方案，但是可以用任何被计算来实现相同目的的设置来代替所示的具体实施方案。本申请旨在覆盖各种实施方案的任何和所有修改或变化。在阅读以上描述之后，以上实施方案的组合和本文中未具体描述的其它实施方案对于本领域技术人员是清晰可见的。
Claims (40)
1.免疫治疗递送系统，其包含：
水凝胶，所述水凝胶包含与多个纳米颗粒非共价交联的聚合物；
第一免疫调节货物，所述第一免疫调节货物包含包封在所述水凝胶中的细胞；
所述水凝胶中的细胞粘附基序，所述细胞粘附基序被配置为可逆地粘附和释放所述细胞；和
包封在所述水凝胶中的第二免疫调节货物。
2.如权利要求1所述的免疫治疗递送系统，其中所述细胞粘附基序包含被配置为可逆地粘附和释放所述细胞的肽。
3.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述细胞粘附基序被配置为结合所述细胞上的整联蛋白。
4.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述细胞粘附基序包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽。
5.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述纳米颗粒包含所述细胞粘附基序。
6.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述纳米颗粒被配置为呈递所述细胞粘附基序。
7.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述细胞包括过继细胞。
8.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述细胞包括嵌合抗原受体(CAR)T细胞或自然杀伤细胞。
9.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述第二免疫调节货物包含蛋白质。
10.如权利要求1-8中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述第二免疫调节货物包含细胞因子。
11.如权利要求1-10中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述水凝胶包含少于5％的聚合物。
12.如权利要求1-10中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述水凝胶包含1.5％-3％的聚合物。
13.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述水凝胶包含约2％的聚合物。
14.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述聚合物包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
15.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述聚合物包含具有疏水性脂质十二烷基链的羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
16.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述纳米颗粒包含聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)。
17.如权利要求16所述的免疫治疗递送系统，其中所述纳米颗粒包含附接于所述聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)的所述细胞粘附基序。
18.如权利要求17所述的免疫治疗递送系统，其中所述纳米颗粒包含的具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)与不具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)的比例为10:90至90:10。
19.如权利要求17所述的免疫治疗递送系统，其中所述纳米颗粒包含的具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)与不具有细胞粘附基序的聚(乙二醇)-b聚(乳酸)(PEG-PLA)的比例为25:75至75:25。
20.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述水凝胶包含4-12％的纳米颗粒。
21.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，其中所述水凝胶是剪切稀化和自愈合的。
22.如前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统，所述免疫治疗递送系统还包括含有所述水凝胶的注射器或导管。
23.治疗疾病的方法，所述方法包括：
将前述权利要求中任一项所述的免疫治疗递送系统递送至患者；和
使所述细胞从所述水凝胶释放到所述患者体内。
24.如权利要求23所述的方法，所述方法还包括在1天至4周的持续时间内，使所述细胞从所述水凝胶释放。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述免疫治疗递送系统在至少2周、至少3周或至少4周的时程中释放细胞。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，所述方法还包括用所述第二免疫调节货物活化所述细胞。
27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，所述方法还包括扩增所述水凝胶中的细胞的数目。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述疾病是实体瘤癌症。
29.如权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述细胞是自体的(autologous)。
30.如权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述细胞是自体遗传的(autogeneic)。
31.如权利要求23-30中任一项所述的方法，其中所述细胞表达识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。
32.如权利要求23-31中任一项所述的方法，所述方法还包括：
从所述患者或供体移除所述细胞；
分离移除的细胞；
体外扩增细胞的数目；
修饰移除的和/或扩增的细胞；和/或
在递送步骤之前，将所述细胞包封在所述水凝胶中。
33.如权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述细胞先后地粘附于所述水凝胶中的细胞粘附基序和从所述水凝胶中的细胞粘附基序脱离。
34.如权利要求23-33中任一项所述的方法，其中所述递送包括通过注射器或导管递送所述免疫治疗递送系统。
35.如权利要求23-34中任一项所述的方法，其中所述递送包括通过选自静脉内、腹膜内、肌内、瘤内和皮下的途径将所述免疫治疗递送系统递送至所述患者。
36.如权利要求23-35中任一项所述的方法，其中将所述免疫治疗递送系统递送至所述患者包括将所述系统局部递送至所述患者需要治疗的区域。
37.如权利要求23-36中任一项所述的方法，其中将所述免疫治疗递送系统递送至所述患者包括将所述系统递送至所述患者的实体瘤癌症。
38.如权利要求23-35中任一项所述的方法，其中将所述免疫治疗递送系统递送至所述患者包括将所述系统递送至远离所述患者需要治疗的区域的位置。
39.如权利要求23-35或权利要求37中任一项所述的方法，其中所述疾病包括实体瘤癌症，并且将所述免疫治疗递送系统递送至所述患者包括将所述系统递送至所述患者中远离所述实体瘤癌症的位置。
40.如权利要求23-35或权利要求37-39中任一项所述的方法，其中将所述免疫治疗递送系统递送至所述患者包括将所述系统全身性递送至所述患者。
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