JP5992529B2 - ポリペプチド、足場組成物、軟骨組織修復用組成物、軟骨細胞培養用組成物及びグリコサミノグリカン産生促進用組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリペプチド、足場組成物、軟骨組織修復用組成物、軟骨細胞培養用組成物及びグリコサミノグリカン産生促進用組成物に関する。
現在、機能障害又は機能不全に陥った生体組織又は臓器の再生を計る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織を、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態又は機能を有するように、再び作り出す新たな医療技術である。
再生医療の分野では、細胞による組織の修復又は再生を補うなどの目的で、生体親和性の高いコラーゲン又はゼラチンを利用することがある。特に、骨又は皮膚などの三次元構造の組織の再生にコラーゲン又はゼラチンが用いられることがあり、より良好な組織の再生を目的として、コラーゲン又はゼラチンに対する種々の改良が行われている。
再生医療の分野では、細胞による組織の修復又は再生を補うなどの目的で、生体親和性の高いコラーゲン又はゼラチンを利用することがある。特に、骨又は皮膚などの三次元構造の組織の再生にコラーゲン又はゼラチンが用いられることがあり、より良好な組織の再生を目的として、コラーゲン又はゼラチンに対する種々の改良が行われている。
軟骨、例えば関節軟骨は、ごくわずか（２％程度）の軟骨細胞と、細胞外基質からなる組織であり、その細胞外基質は、約７０％の水分、約２０％のコラーゲン、約１０％のプロテオグリカンで構成されていることが知られている。細胞外基質のうちプロテオグリカンは、約９５％のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と呼ばれる多糖類と、約５％のタンパク質で構成された糖タンパク質である。このような軟骨では、軟骨細胞が、自ら産生したコラーゲン又はプロテオグリカンによって、周囲を取り囲まれて支持されている。特に、グリコサミノグリカンは、軟骨基質内に水分を保つ役割を持ち、軟骨の退化抑制又は修復に係わる物質であると考えられている。このため、軟骨細胞の足場材料として、軟骨細胞による基質産生が良好となる足場材料の開発が検討されている。
軟骨細胞の足場材料としては、従来、天然II型コラーゲンが使用されている。
また、特表２００７−５２８６９９号公報には、細胞結合性を強化したＲＧＤエンリッチゼラチン様タンパク質をコートしたセルサポートが開示されており、このようなセルサポートは、例えば皮膚移植、創傷治癒又は骨若しくは軟骨の成長（再生）を増強するときに使用できることが記載されている。
国際公開第２００８／１３３１９６号には、細胞接着シグナルとしてＲＧＤ配列を有する遺伝子組換えゼラチンが開示されており、細胞接着性マトリックスとして利用可能であることが記載されている。また国際公開第２００８／１３３１９６号では、細胞治療の場合には、一般に細胞の足場となる細胞接着性のマトリックス材料が好ましいと記載されているが、軟骨再生では、強度に耐えうるマトリックスが望ましいと記載されている。
また、特表２００７−５２８６９９号公報には、細胞結合性を強化したＲＧＤエンリッチゼラチン様タンパク質をコートしたセルサポートが開示されており、このようなセルサポートは、例えば皮膚移植、創傷治癒又は骨若しくは軟骨の成長（再生）を増強するときに使用できることが記載されている。
国際公開第２００８／１３３１９６号には、細胞接着シグナルとしてＲＧＤ配列を有する遺伝子組換えゼラチンが開示されており、細胞接着性マトリックスとして利用可能であることが記載されている。また国際公開第２００８／１３３１９６号では、細胞治療の場合には、一般に細胞の足場となる細胞接着性のマトリックス材料が好ましいと記載されているが、軟骨再生では、強度に耐えうるマトリックスが望ましいと記載されている。
しかしながら、上述の通り、細胞外基質のうちＧＡＧは、軟骨細胞の代謝に大きく関与する基質物質であるが、現在使用されている天然II型コラーゲンでは、細胞外基質の産生促進の点で充分ではない。また、軟骨細胞による基質産生を促進させる足場材料については、従来、知られていない。更には、細胞外基質産生の観点から軟骨組織修復を促進させ得る軟骨組織修復用組成物及び軟骨細胞培養用組成物、並びに、細胞外基質の中でもグリコサミノグリカンの細胞における産生を良好に促進させ得る組成物についても、未だに提供されていない。
従って本発明は、軟骨細胞の細胞外基質産生促進に優れた足場組成物、軟骨組織修復用組成物、軟骨細胞培養用組成物及びグリコサミノグリカン産生促進用組成物、並びにそれらのための材料を提供することを課題とする。
本発明は以下のとおりである。
［１］
（Ａ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカン産生促進能を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカン産生促進能を有するポリペプチド、又は
（Ｄ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列との配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．２０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であり、かつグリコサミノグリカン産生促進能を有するポリペプチド。
［２］ 前記（Ｄ）のポリペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなる、［１］に記載のポリペプチド。
［３］ ［１］又は［２］に記載のポリペプチドを含む足場組成物。
［４］ ［１］又は［２］に記載のポリペプチドを含む軟骨組織修復用組成物。
［５］ ［１］又は［２］に記載のポリペプチドを含む軟骨細胞培養用組成物。
［６］ ［１］又は［２］に記載のポリペプチドを含むグリコサミノグリカン産生促進用組成物。
［１］
（Ａ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカン産生促進能を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカン産生促進能を有するポリペプチド、又は
（Ｄ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列との配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．２０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であり、かつグリコサミノグリカン産生促進能を有するポリペプチド。
［２］ 前記（Ｄ）のポリペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなる、［１］に記載のポリペプチド。
［３］ ［１］又は［２］に記載のポリペプチドを含む足場組成物。
［４］ ［１］又は［２］に記載のポリペプチドを含む軟骨組織修復用組成物。
［５］ ［１］又は［２］に記載のポリペプチドを含む軟骨細胞培養用組成物。
［６］ ［１］又は［２］に記載のポリペプチドを含むグリコサミノグリカン産生促進用組成物。
本発明によれば、軟骨細胞の細胞外基質産生促進に優れた足場組成物、軟骨組織修復用組成物、軟骨細胞培養用組成物及びグリコサミノグリカン産生促進用組成物、並びにそれらのための材料を提供することができる。
本発明におけるポリペプチドは、分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．１５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
本発明では、上記構成とすることにより、軟骨細胞が本発明に係るポリペプチドと接触したときに軟骨細胞による細胞外基質、特にグリコサミノグリカン（以下、ＧＡＧを称する場合がある。）の産生が促進される。
即ち、ＧＡＧの産生を、例えば天然II型コラーゲンよりも促進させるには、ＲＧＤ配列及びＧＦＰＧＥＲ配列がそれぞれ上述した所定の含有数以上存在することが必要であり、その一方で、ＧＶＭＧＦＰ配列は、ポリペプチドの全体において分子量１０ｋＤａあたり０又は０．３０個を超えないことが必要である。また、本発明では、ＲＧＤ配列、ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＭＧＦＰ配列の含有数の上述した関係が満たされることにより、軟骨細胞によるＧＡＧ産生が促進される。また、本発明に係るポリペプチドと接触後の軟骨細胞の周辺にはＧＡＧが豊富に存在することとなり、軟骨細胞の優れた増殖又は成長も得られると推測される。ただし、本発明は、これらの理論に拘束されない。
本発明に係るポリペプチドを、以下、「特定ポリペプチド」と称する場合がある。
以下、本発明について説明する。
即ち、ＧＡＧの産生を、例えば天然II型コラーゲンよりも促進させるには、ＲＧＤ配列及びＧＦＰＧＥＲ配列がそれぞれ上述した所定の含有数以上存在することが必要であり、その一方で、ＧＶＭＧＦＰ配列は、ポリペプチドの全体において分子量１０ｋＤａあたり０又は０．３０個を超えないことが必要である。また、本発明では、ＲＧＤ配列、ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＭＧＦＰ配列の含有数の上述した関係が満たされることにより、軟骨細胞によるＧＡＧ産生が促進される。また、本発明に係るポリペプチドと接触後の軟骨細胞の周辺にはＧＡＧが豊富に存在することとなり、軟骨細胞の優れた増殖又は成長も得られると推測される。ただし、本発明は、これらの理論に拘束されない。
本発明に係るポリペプチドを、以下、「特定ポリペプチド」と称する場合がある。
以下、本発明について説明する。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本発明において、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基の場合は「Ｇｌｙ」）を用いて表現する場合がある。
本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸（又はイミノ酸）残基の個数を基準とする。
本発明において、ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「％」は、特に断らない限り、アミノ酸（又はイミノ酸）残基の個数を基準とする。
本明細書において、アミノ酸配列の特定のアミノ酸残基について使用される「対応するアミノ酸残基」等の表現は、対比する２つ以上のアミノ酸配列を、当該技術分野で周知のやり方で、挿入、欠失、及び置換を考慮に入れたうえで、同一となるアミノ酸残基が最も多くなるように整列（アライメント）させたときに、基準となるアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基の位置に一致する、他方のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を示すことを意味する。
本発明において、対比される２種のポリペプチドのアミノ酸配列に関する「同一性」とは、以下の式で計算される値を指す。なお、複数のポリペプチドの対比（アライメント）は、同一となるアミノ酸残基の数が最も多くなるように常法に従って行うものとする。
なお、リコンビナントのポリペプチドについての同一性の判断としては、同一性が最も高くなるように、対比される２種類のポリペプチドを、１０アミノ酸残基以上となる任意のフラグメントにそれぞれ分けて、一方のポリペプチドに由来するフラグメントと、対比される他方のポリペプチドに由来するフラグメントの間で対応付けを行い、対応付けされたフラグメント間でアミノ酸配列を比較し、総合して、同一性を求めるものとする。また、繰り返し配列（１０アミノ酸残基以上の配列）を複数含むものは、２つ目以上の繰り返しの部分を除いて、対応する部分の同一性（％）を求めるものとする。
同一性（％）
＝［（同一となるアミノ酸残基の数）／（アラインメント長）］×１００
なお、リコンビナントのポリペプチドについての同一性の判断としては、同一性が最も高くなるように、対比される２種類のポリペプチドを、１０アミノ酸残基以上となる任意のフラグメントにそれぞれ分けて、一方のポリペプチドに由来するフラグメントと、対比される他方のポリペプチドに由来するフラグメントの間で対応付けを行い、対応付けされたフラグメント間でアミノ酸配列を比較し、総合して、同一性を求めるものとする。また、繰り返し配列（１０アミノ酸残基以上の配列）を複数含むものは、２つ目以上の繰り返しの部分を除いて、対応する部分の同一性（％）を求めるものとする。
同一性（％）
＝［（同一となるアミノ酸残基の数）／（アラインメント長）］×１００
［特定ポリペプチド］
本発明に係る特定ポリペプチドは、分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．１５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であるアミノ酸配列を有する。
特定ポリペプチドは、ＲＧＤ配列、ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＢＭＧＦＰ配列がそれぞれ所定の含有数となるアミノ酸配列を有するので、軟骨細胞による基質の産生を促進させる良好な足場として作用することができる。
本発明に係る特定ポリペプチドは、分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．１５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であるアミノ酸配列を有する。
特定ポリペプチドは、ＲＧＤ配列、ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＢＭＧＦＰ配列がそれぞれ所定の含有数となるアミノ酸配列を有するので、軟骨細胞による基質の産生を促進させる良好な足場として作用することができる。
ＲＧＤ配列は、インテグリンの結合部位又は細胞接着機能を有する配列（モチーフ）として既知の配列である。特定ポリペプチドにおけるＲＧＤ配列の含有数は、特定ポリペプチドの分子量１０ｋＤａあたり０．３０個以上であり、０．３０個未満では、軟骨細胞の基質産生の促進が充分ではない。特定ポリペプチド中のＲＧＤ配列の含有数は、０．３５個以上としてもよく、０．４０個以上としてもよい。また、特定ポリペプチドにおけるＲＧＤ配列の含有数の上限は、特定ポリペプチドの全長によって異なるが、例えば、１０ｋＤａあたり２．０個以下とすることが好ましく、１．０個以下とすることがより好ましく、０．５以下とすることが更に好ましい。
特定ポリペプチド中にＲＧＤ配列を複数有する場合には、特定ポリペプチドの全体の長さによっても異なるが、ＲＧＤ間のアミノ酸残基数が０〜１００であることが好ましく、２５〜６０であることが更に好ましい。また、ＲＧＤ配列は、このようなアミノ酸残基数の範囲内で、特定ポリペプチド中に不均一に配置されていることが好ましい。
ＧＦＰＧＥＲ配列は、インテグリンのα２β１の結合部位又は細胞接着機能を有する配列として既知の配列である。特定ポリペプチドにおけるＧＦＰＧＥＲ配列の含有数は、特定ポリペプチドの分子量１０ｋＤａあたり０．１５個以上であり、０．１５個未満では、軟骨細胞の基質産生の促進が充分ではない。特定ポリペプチド中のＧＦＰＧＥＲ配列の含有数は、０．２０個以上としてもよく、０．３０個以上としてもよい。また、特定ポリペプチドにおけるＧＦＰＧＥＲ配列の含有数の上限は、特定ポリペプチドの全長によって異なるが、例えば、１０ｋＤａあたり１．０個以下とすることが好ましく、０．５個以下とすることがより好ましい。
ＧＦＰＧＥＲ配列における「Ｐ」（プロリン残基）は、オキシプロリン残基であってもよい。
ＧＦＰＧＥＲ配列における「Ｐ」（プロリン残基）は、オキシプロリン残基であってもよい。
ＧＶＭＧＦＰ配列は、繊維性コラーゲンに共通して見いだされる配列であり、ＤＤＲ−２（Discoidin domain receptor-2）の認識部位として既知の配列である。また、ＧＶＭＧＦＰ配列は細胞の増殖に関与していることも知られている。特定ポリペプチドにおけるＧＶＭＧＦＰ配列の含有数は、特定ポリペプチドの分子量１０ｋＤａあたり０．３０個未満であり、０．３０個以上では、軟骨細胞の基質産生の促進が充分ではない。特定ポリペプチド中のＧＶＭＧＦＰ配列の含有数は、存在する場合、当該ポリペプチドの分子量１０ｋＤａあたり、０．２８個以下としてもよく、０．２５個以下としてもよい。また特定ポリペプチド中、ＧＶＭＧＦＰ配列の含有数の下限値は、当該ポリペプチドの分子量１０ｋＤａあたり、例えば、０．２個以上であってもよく、０個であってもよい。
また、基質産生促進の点で、ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＭＧＦＰ配列の含有数の合計に対するＲＧＤ配列の含有数の比、即ち、［ＲＧＤ配列の含有数／（ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＭＧＦＰ配列の含有数の合計）］が、０．８〜１．２であることが好ましく、１であることがより好ましい。
ＲＧＤ配列、ＧＦＰＧＥＲ配列、及びＧＶＭＧＦＰ配列は、それぞれの前述した所定の割合でポリペプチド中に存在していれば、ポリペプチド全体中での互いの配置関係について特に制限はない。例えば、ＧＶＭＧＦＰ配列は、ＧＦＰＧＥＲ配列よりもＮ末端側に配置されていてもよく、Ｃ末端側に配置されていてもよい。ＲＧＤ配列は、複数存在する場合に、ＧＶＭＧＦＰ配列とポリペプチドのＣ末端との間にすべてのＲＧＤ配列が配置されていてもよく、ＧＦＰＧＥＲ配列が複数存在する場合に、最もＮ末端側のＧＦＰＧＥＲ配列と最もＣ末端側のＧＦＰＧＥＲ配列との間にすべてのＲＧＤ配列が配置されていてもよく、最もＮ末端側のＧＦＰＧＥＲ配列よりもＮ末端側又は最もＣ末端側のＧＦＰＧＥＲ配列よりもＣ末端側に少なくとも１つのＲＧＤ配列が配置されていてもよい。
特定ポリペプチドは、ＲＧＤ配列、ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＭＧＦＰ配列に加えて、他の既知の配列（モチーフ）を含むことができる。
例えば、特定ポリペプチドは、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有していてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙが複数個存在する場合、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、それぞれ同一であってもよく、異なってもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−ＹにおいてＧｌｙはグリシン残基、Ｘ及びＹは、グリシン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。Ｘ及びＹとしては、イミノ酸残基、即ちプロリン残基又はオキシプロリン残基が多く含まれることが好ましい。このようなイミノ酸残基の含有率は、特定ポリペプチド全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。特定ポリペプチド中のＧｌｙ−Ｘ−Ｙの含有率としては、全体の８０％以上であることが好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
例えば、特定ポリペプチドは、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有していてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙが複数個存在する場合、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、それぞれ同一であってもよく、異なってもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−ＹにおいてＧｌｙはグリシン残基、Ｘ及びＹは、グリシン残基以外の任意のアミノ酸残基を表す。Ｘ及びＹとしては、イミノ酸残基、即ちプロリン残基又はオキシプロリン残基が多く含まれることが好ましい。このようなイミノ酸残基の含有率は、特定ポリペプチド全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。特定ポリペプチド中のＧｌｙ−Ｘ−Ｙの含有率としては、全体の８０％以上であることが好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
特定ポリペプチドは、生体親和性の点で、他の細胞接着シグナルを含んでいてもよい。このような細胞接着シグナルとしては、例えば、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の各配列を挙げることができ、好ましくは、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列を挙げることができる。他の細胞接着シグナルは１種単独又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
特定ポリペプチドは、上述した３種の配列を所定の割合で含むものであれば、その全長のアミノ酸残基数には制限はない。特定ポリペプチドの全長のアミノ酸残基数としては、３００〜１４００であることが好ましく、４００〜１０００であることがより好ましく、５００〜８００であることが更に好ましい。アミノ酸残基数が３００以上であれば軟骨細胞による基質産生促進効果がより確実に発揮される傾向があり、１４００以下であれば、ポリペプチドの水への溶解性を大きく損なうことがなく、取り扱いに優れる傾向がある。
特定ポリペプチドの分子量は、３０ｋＤａ〜８０ｋＤａであることが好ましく、４０ｋＤａ〜７０ｋＤａであることがより好ましい。分子量を３０ｋＤ以上とすることにより、軟骨細胞による基質産生促進効果がより確実に発揮される傾向があり、８０ｋＤａ以下とすることにより、ポリペプチドの水溶性を大きく損なうことがなく、取り扱いにより優れる傾向がある。なお、本発明において、特定ポリペプチドの分子量は、常法に従って、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）（Ｗａｔｅｒｓ製Ｑ−ＴＯＦ Ｐｒｅｍｉｅｒ機）によって測定した値とする。
特定ポリペプチドは、ＲＧＤ配列、ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＭＧＦＰ配列の含有数がそれぞれ所定の含有数となるアミノ酸配列を有するものであれば、その他の部分のアミノ酸配列については特に制限はない。軟骨細胞の増殖促進等の観点から、天然コラーゲンのアミノ酸配列に対する同一性が、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９８％以上であることが更により好ましい。
なお、同一性の基準となる天然コラーゲンとしては、Ｉ型、II型、III型、IV型及びＶ型が挙げられる。軟骨基質産生促進の観点から、好ましくは、天然ヒトII型コラーゲンのアミノ酸配列に対する同一性が８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９８％以上であることが更により好ましいとすることができる。
また、ここでの同一性の基準となる天然コラーゲンの由来としては、好ましくは、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラット等を挙げることができ、ヒトであることがより好ましい。
同一性の基準となる天然コラーゲンとしては、天然ヒトII型コラーゲンであることが更に好ましい。例えば、天然ヒトII型コラーゲンの配列は、以下の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するものとして既知である。天然ヒトII型コラーゲンのアミノ酸配列を表１に示す。表１においてＲＧＤ配列、ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＭＧＦＰ配列については太字で示す
また、ここでの同一性の基準となる天然コラーゲンの由来としては、好ましくは、ヒト、ウマ、ブタ、マウス、ラット等を挙げることができ、ヒトであることがより好ましい。
同一性の基準となる天然コラーゲンとしては、天然ヒトII型コラーゲンであることが更に好ましい。例えば、天然ヒトII型コラーゲンの配列は、以下の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するものとして既知である。天然ヒトII型コラーゲンのアミノ酸配列を表１に示す。表１においてＲＧＤ配列、ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＭＧＦＰ配列については太字で示す
特定ポリペプチドの等電点（ｐＩ）については、特に制限はなく、例えば１０．０以下とすることができ、軟骨細胞の増殖促進の観点から、９．２以下であることが好ましく、７．０以下であることがより好ましく、６．０以下であることが更に好ましい。等電点の下限値は、例えば、５．０以上とすることができる。ポリペプチドのｐＩの調整方法は、常法によって行うことができ、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基として、中性アミノ酸残基（例えば、グリシン残基、アラニン残基等）又は酸性アミノ酸残基（グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基）の含有率を上げる、あるいは、塩基性アミノ酸残基（リジン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基）の含有率を下げることにより、ｐＩを下げることができる。なお、本発明において、特定ポリペプチドのｐＩは、常法に従って、等電点電気泳動法によって測定した値とする。
特定ポリペプチドの抗原性の観点から、セリン残基又はスレオニン残基を他のアミノ残基に置換することが好ましい。セリン残基又はスレオニン残基と置換される他のアミノ酸残基としては、リジン残基を用いることができる。リジン残基をセリン残基又はスレオニン残基に代えて用いることにより、例えば、特定ポリペプチドにアミノ基が導入されて、架橋点を増やすことができる。これにより、ポリペプチドの安定性が向上して分解しにくくなり、製剤適正が高くなる傾向がある。
特定ポリペプチドは、抗原性の低減、大量製造、安全性などの観点から、リコンビナントペプチドであることが好ましい。本明細書において、「リコンビナントペプチド」とは、大腸菌、酵母、培養細胞などを宿主として、遺伝子組換え技術を用いて人工的に作製したポリペプチドを意味する。
特定ポリペプチドは、製剤適性の観点から、水への溶解性が２質量％以上であることが好ましい。本発明における水への溶解性は、常圧下かつ２５℃の水に対する溶解性を意味する。
特定ポリペプチドは、軟骨細胞における基質産生促進能の観点から、例えば、以下のものを挙げることができる。
（１） 分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．１５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であるアミノ酸配列を有し、分子量が３０ｋＤａ〜８０ｋＤａであり、ｐＩが５．０〜１０．０であるポリペプチド：
（２）分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．１５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であり、３００〜１４００のアミノ酸残基数からなるアミノ酸配列を有し、ｐＩが５．０〜１０．０であるポリペプチド：
（３）分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．１５個以上であり、ＧＶＭＧＦＰ配列を含まないアミノ酸配列を有し、分子量が３０ｋＤａ〜８０ｋＤａであり、ｐＩが５．０〜１０．０であるポリペプチド：
（４） 分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．２０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であるアミノ酸配列を有し、分子量が４０ｋＤａ〜７０ｋＤａであり、ｐＩが５．０〜１０．０であるポリペプチド。
（５） 分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．２０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であり、３００〜１４００のアミノ酸残基数からなるアミノ酸配列を有し、ｐＩが５．０〜１０．０であるポリペプチド。
（１） 分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．１５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であるアミノ酸配列を有し、分子量が３０ｋＤａ〜８０ｋＤａであり、ｐＩが５．０〜１０．０であるポリペプチド：
（２）分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．１５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であり、３００〜１４００のアミノ酸残基数からなるアミノ酸配列を有し、ｐＩが５．０〜１０．０であるポリペプチド：
（３）分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．１５個以上であり、ＧＶＭＧＦＰ配列を含まないアミノ酸配列を有し、分子量が３０ｋＤａ〜８０ｋＤａであり、ｐＩが５．０〜１０．０であるポリペプチド：
（４） 分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．２０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であるアミノ酸配列を有し、分子量が４０ｋＤａ〜７０ｋＤａであり、ｐＩが５．０〜１０．０であるポリペプチド。
（５） 分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３５個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．２０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であり、３００〜１４００のアミノ酸残基数からなるアミノ酸配列を有し、ｐＩが５．０〜１０．０であるポリペプチド。
本発明における特定ポリペプチドは、ＧＡＧの産生促進能の高さから、下記配列番号１〜３に示すポリペプチドであることが好ましい。各配列においてＲＧＤ配列、ＧＦＰＧＥＲ配列及びＧＶＭＧＦＰ配列はそれぞれ太字で示す。なお、配列番号１〜３では、天然ヒトII型コラーゲンのアミノ酸配列と対比した場合にすべてのセリン残基又はスレオニン残基に対応する塩基は、グリシン残基、アラニン残基又はリジン残基等に置換されている。
なお、本発明のポリペプチドは、好ましくは、（Ａ）配列番号１〜３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、（Ｂ）配列番号１〜３に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＡＧ産生促進能を有するポリペプチド、又は、（Ｃ）配列番号１〜３に示すアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列を有し、かつＧＡＧ産生促進能を有するポリペプチドである。（Ｃ）のポリペプチドは、より好ましくは、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列との配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列を有し、かつＧＡＧ産生促進能を有するポリペプチドであり、更に好ましくは、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上のアミノ酸配列を有し、かつＧＡＧ産生促進能を有するポリペプチドである。
また、本発明のポリペプチドは、好ましくは、（Ａ１）配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、（Ｂ１）配列番号１〜３に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＡＧ産生促進能を有するポリペプチド、（Ｃ１）配列番号１〜３に示すアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＧＡＧ産生促進能を有するポリペプチドである。（Ｃ１）のポリペプチドは、より好ましくは、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列との配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつＧＡＧ産生促進能を有するポリペプチドであり、更に好ましくは、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつＧＡＧ産生促進能を有するポリペプチドである。
ここで、（Ｂ）のポリペプチドおよび（Ｂ１）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸残基数としては、１個又は数個であればよく、特定ポリペプチドの総アミノ酸残基数によって異なるが、例えば、２個〜１５個、好ましくは２個〜５個とすることができる。
ここで、（Ｂ）のポリペプチドおよび（Ｂ１）のポリペプチドのアミノ酸配列において、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸残基数としては、１個又は数個であればよく、特定ポリペプチドの総アミノ酸残基数によって異なるが、例えば、２個〜１５個、好ましくは２個〜５個とすることができる。
特定ポリペプチドは、当業者に公知の遺伝子組換え技術によって製造することができ、例えば、ＥＰ０９２６５４３Ａ１、ＥＰ１０１４１７６Ａ２、ＵＳ６９９２１７２、ＷＯ０１／３４６４６、ＷＯ２００４／８５４７３、ＷＯ２００８／１０３０４１等記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、目的とするポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、目的とするポリペプチドが産生されるので、培養物から産生されたポリペプチドを回収することにより、本発明にかかる特定ポリペプチドを得ることができる。
ＧＡＧの産生促進能の評価は、軟骨細胞にポリペプチドを接触させて所定時間後にＧＡＧの産生を測定することにより評価することができる。
具体的な評価方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
具体的な評価方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
対象となるポリペプチドを、所定量、例えば、０μｇ／ｍｌ、０．２μｇ／ｍｌ、及び２０μｇ／ｍｌとなるように、注射用水（ポリペプチド溶解用）に溶解させて試料液を調製する。得られた各試料液を、２４ウェルプレート（24 well non-treated plate, ＢＤ社）の各ウェルに６２５μｌずつ添加し、２５℃で風乾させてウェル内に固定し、試験用プレートを準備する。
試験用プレートに、日本白色家兎軟骨細胞を、２００００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％（v/v）ＣＯ２という条件で培養を行い、２時間、１日、２日、３日及び７日に培養上清を回収し、培養上清中のＧＡＧの定量を行う。
試験用プレートに、日本白色家兎軟骨細胞を、２００００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％（v/v）ＣＯ２という条件で培養を行い、２時間、１日、２日、３日及び７日に培養上清を回収し、培養上清中のＧＡＧの定量を行う。
ＧＡＧの定量は、「硫酸化グリコサミノグリカン定量キット」（生化学バイオビジネス株式会社）を用いて行う。
定量は、試験用プレートのウェル内の培地を捨て、１ウェルあたり１ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄を行う。洗浄後のウェルに対して、キットに付属のプロテアーゼ液１５０μｌを添加し、プレートシェーカーにて攪拌し、その後、５０℃、２時間処理し、さらに１００℃、１０分処理を行う。各試料５０μｌに対して、キットに付属されている反応緩衝液ＩＩを５０μｌ添加、混合し、さらに、１５０μｌのＤＭＭＢ（ジメチルメチレンブルー）色素液を添加する。ＧＡＧ標準液についても同様の操作を行う。５分間の反応後に、プレートリーダーにて、波長５３０ｎｍでの吸光度を測定し、ＧＡＧの定量を行う。同様の操作を天然II型コラーゲンについても行う。対象となるポリペプチドを用いた場合のＧＡＧの量と、天然II型コラーゲンを用いた場合のＧＡＧの量とを比較し、天然II型コラーゲンを用いた場合のＧＡＧの量よりも多い場合に、ＧＡＧ産生促進能があると評価する。なお、ＧＡＧの定量には、上記の定量キットと同等品を使用することができ、例えば、Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit (120 assays)（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社、B1000)を同等品として挙げることができる。
定量は、試験用プレートのウェル内の培地を捨て、１ウェルあたり１ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄を行う。洗浄後のウェルに対して、キットに付属のプロテアーゼ液１５０μｌを添加し、プレートシェーカーにて攪拌し、その後、５０℃、２時間処理し、さらに１００℃、１０分処理を行う。各試料５０μｌに対して、キットに付属されている反応緩衝液ＩＩを５０μｌ添加、混合し、さらに、１５０μｌのＤＭＭＢ（ジメチルメチレンブルー）色素液を添加する。ＧＡＧ標準液についても同様の操作を行う。５分間の反応後に、プレートリーダーにて、波長５３０ｎｍでの吸光度を測定し、ＧＡＧの定量を行う。同様の操作を天然II型コラーゲンについても行う。対象となるポリペプチドを用いた場合のＧＡＧの量と、天然II型コラーゲンを用いた場合のＧＡＧの量とを比較し、天然II型コラーゲンを用いた場合のＧＡＧの量よりも多い場合に、ＧＡＧ産生促進能があると評価する。なお、ＧＡＧの定量には、上記の定量キットと同等品を使用することができ、例えば、Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit (120 assays)（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社、B1000)を同等品として挙げることができる。
［足場組成物］
本発明に係る足場組成物は、上述した特定ポリペプチドを含むものである。上述したように足場組成物に含まれる特定ポリペプチドは、軟骨細胞と接触することにより軟骨細胞による基質産生を促進することができるので、足場組成物は、軟骨細胞による基質産生を促進することができる。
足場組成物は、特定ポリペプチドに加えて、基質産生を促進することが既知の他の因子等を含んでもよい。このような他の因子としては、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）等を挙げることができる。他の因子は１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
本発明に係る足場組成物は、上述した特定ポリペプチドを含むものである。上述したように足場組成物に含まれる特定ポリペプチドは、軟骨細胞と接触することにより軟骨細胞による基質産生を促進することができるので、足場組成物は、軟骨細胞による基質産生を促進することができる。
足場組成物は、特定ポリペプチドに加えて、基質産生を促進することが既知の他の因子等を含んでもよい。このような他の因子としては、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）等を挙げることができる。他の因子は１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
［ＧＡＧ産生促進用組成物］
本発明に係るＧＡＧ産生促進用組成物は、上述した特定ポリペプチドを含むものである。上述したように、特定ポリペプチドは、細胞と接触することにより細胞によるＧＡＧの産生を促進することができるため、ＧＡＧの産生促進が求められる用途にＧＡＧ産生促進用組成物として好適に用いることができる。
本発明に係るＧＡＧ産生促進用組成物によりＧＡＧの産生が促進されうる細胞としては、軟骨細胞、血管内皮細胞、角膜内皮細胞等を挙げることができる。なかでも、軟骨細胞に対してＧＡＧ産生促進用組成物を用いることが好ましい。
本発明に係るＧＡＧ産生促進用組成物は、上述した特定ポリペプチドを含むものである。上述したように、特定ポリペプチドは、細胞と接触することにより細胞によるＧＡＧの産生を促進することができるため、ＧＡＧの産生促進が求められる用途にＧＡＧ産生促進用組成物として好適に用いることができる。
本発明に係るＧＡＧ産生促進用組成物によりＧＡＧの産生が促進されうる細胞としては、軟骨細胞、血管内皮細胞、角膜内皮細胞等を挙げることができる。なかでも、軟骨細胞に対してＧＡＧ産生促進用組成物を用いることが好ましい。
ＧＡＧ産生促進用組成物は、特定ポリペプチドに加えて、基質産生を促進することが既知の他の因子等を含んでもよい。このような他の因子としては、ｂＦＧＦ、副甲状腺ホルモン、ＴＧＦβ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ等を挙げることができる。他の因子は１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
［軟骨組織修復用組成物及び軟骨細胞培養用組成物］
本発明に係る特定ポリペプチド、足場組成物及びＧＡＧ産生促進用組成物は、上述したように、特定の細胞と接触させることにより当該細胞による所定の基質の産生を促進させるため、種々の用途への適用が可能である。このような用途としては、例えば、組織、例えば軟骨の損傷の修復又は再生が挙げられる。
本発明に係る特定ポリペプチド、足場組成物及びＧＡＧ産生促進用組成物は、上述したように、特定の細胞と接触させることにより当該細胞による所定の基質の産生を促進させるため、種々の用途への適用が可能である。このような用途としては、例えば、組織、例えば軟骨の損傷の修復又は再生が挙げられる。
即ち、本発明では、特定ポリペプチドを含む軟骨組織修復用組成物及び軟骨細胞培養用組成物も包含する。この場合の軟骨としては、関節軟骨（膝、肩、又は股）、脊椎軟骨、耳介軟骨、鼻中隔軟骨等を挙げることができる。なかでも、特定ポリペプチドを含む軟骨組織修復用組成物及び軟骨細胞培養用組成物は、関節における軟骨の損傷修復又は再生用の組成物として用いられることが特に好ましい。これにより、軟骨細胞を増殖させ、又は軟骨組織を良好に修復することが可能となる。また、本発明は、軟骨組織修復用組成物を、軟骨の損傷部位に投与することを含む軟骨の損傷の修復又は再生方法も包含する。
［その他用途］
更には、本発明は、特定基質産生ポリペプチドの、足場組成物、軟骨組織修復用組成物、軟骨細胞培養用組成物、又は、グリコサミノグリカン産生促進用組成物の各製造における使用も包含する。
また、ＧＡＧ産生能を有する細胞、例えば軟骨細胞の機能、性状を解析するため、又はこれらの細胞の機能又は性状を利用した試験研究を行うために、ＧＡＧ産生促進ポリペプチド、足場組成物及びＧＡＧ産生促進用組成物を使用することもできる。
更には、本発明は、特定基質産生ポリペプチドの、足場組成物、軟骨組織修復用組成物、軟骨細胞培養用組成物、又は、グリコサミノグリカン産生促進用組成物の各製造における使用も包含する。
また、ＧＡＧ産生能を有する細胞、例えば軟骨細胞の機能、性状を解析するため、又はこれらの細胞の機能又は性状を利用した試験研究を行うために、ＧＡＧ産生促進ポリペプチド、足場組成物及びＧＡＧ産生促進用組成物を使用することもできる。
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
［実施例１〜３］
配列番号１〜配列番号３に示すアミノ酸配列を有するＧＡＧ産生促進ポリペプチドＲＣＰ＃４〜ＲＣＰ＃６を製造するために、配列番号１〜配列番号３のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するポリヌクレオチド（配列番号５〜配列番号７）を、常法によって合成した。得られた各ポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られた増幅産物を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、タンパク質を分泌するためのα−ｆａｃｔｏｒシグナルと選別用のゼオシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にそれぞれ導入した。
得られたプラスミドをエレクトロポレーション法により、Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞に形質転換し、抗生物質ゼオシンに対する耐性により、形質転換した酵母株を選択した。
配列番号１〜配列番号３に示すアミノ酸配列を有するＧＡＧ産生促進ポリペプチドＲＣＰ＃４〜ＲＣＰ＃６を製造するために、配列番号１〜配列番号３のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するポリヌクレオチド（配列番号５〜配列番号７）を、常法によって合成した。得られた各ポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られた増幅産物を、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、タンパク質を分泌するためのα−ｆａｃｔｏｒシグナルと選別用のゼオシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にそれぞれ導入した。
得られたプラスミドをエレクトロポレーション法により、Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞に形質転換し、抗生物質ゼオシンに対する耐性により、形質転換した酵母株を選択した。
導入したポリヌクレオチドに基づくポリペプチドの製造は、ＥＰ−Ａ−０９２６５４３、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６及びＷＯ０１／３４６４６に開示された方法に準拠して行った。
具体的には、上記で得られた酵母株を、ＹＮＢ（Yeast Nitrogen Base w/o amino acids）培地（ＢＤ社）を用いて増殖させた後、３Ｌのジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社）で培養を行った。具体的には、はじめに炭素源としてグリセロールを含む培地で酵母株を増殖させ、グリセロールの添加の終了１時間前から、炭素源のメタノールを加えて培養する。９６時間培養後に、培養上清を回収し、回収後の培養上清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことで、目的とするポリペプチドの発現を確認した。
具体的には、上記で得られた酵母株を、ＹＮＢ（Yeast Nitrogen Base w/o amino acids）培地（ＢＤ社）を用いて増殖させた後、３Ｌのジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社）で培養を行った。具体的には、はじめに炭素源としてグリセロールを含む培地で酵母株を増殖させ、グリセロールの添加の終了１時間前から、炭素源のメタノールを加えて培養する。９６時間培養後に、培養上清を回収し、回収後の培養上清を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことで、目的とするポリペプチドの発現を確認した。
目的とするポリペプチドの発現が確認された培養上清から、Ｃａｐｔｏ−Ｓ；陽イオン交換クロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア）とＣａｐｔｏ−Ｑ；陰イオン交換クロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア）を使用し、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥヘルスケア）により精製を行い、目的とするポリペプチドＲＣＰ＃４〜ＲＣＰ＃６を得た。
各ポリペプチドの性状を表４に示す。なお、等電点（ｐＩ）は、計算値である。分子量は、ＥＳＩ−ＭＳ（Waters製Q-TOF Premier機）により測定した。また各ポリペプチドの水への溶解性は、常圧下かつ２５℃において２質量％以上であった。
表４中、リジン量に関する「ｎｏｒｍａｌ」とは、天然ヒトII型コラーゲンのアミノ酸配列と対比したときに対応するセリン残基又はスレオニン残基をグリシン残基又はアラニン残基と置換していることを意味し、「ｈｉｇｈ」とは、天然ヒトII型コラーゲンのアミノ酸配列と対比したときに対応するセリン残基又はスレオニン残基をリジン残基に置換していることを意味する。
同一性は、天然ヒトII型コラーゲンのアミノ酸配列に対する同一性を示す。また表４中「＊」は、繰り返し配列を含むものは、繰り返しの部分を除いた残りの配列について、対応する部分の同一性（％)を求めたものであることを意味する。
表４中、リジン量に関する「ｎｏｒｍａｌ」とは、天然ヒトII型コラーゲンのアミノ酸配列と対比したときに対応するセリン残基又はスレオニン残基をグリシン残基又はアラニン残基と置換していることを意味し、「ｈｉｇｈ」とは、天然ヒトII型コラーゲンのアミノ酸配列と対比したときに対応するセリン残基又はスレオニン残基をリジン残基に置換していることを意味する。
同一性は、天然ヒトII型コラーゲンのアミノ酸配列に対する同一性を示す。また表４中「＊」は、繰り返し配列を含むものは、繰り返しの部分を除いた残りの配列について、対応する部分の同一性（％)を求めたものであることを意味する。
［比較例１〜４］
比較用のポリペプチドとして、ポリペプチドＲＣＰ＃７、ＲＣＰ＃２、Ｒ−IIコラーゲン及び天然ヒトII型コラーゲンを準備した（比較例１〜４）。
表３及び表４に示すように、ポリペプチドＲＣＰ＃７（配列番号８）は、ＧＶＭＧＦＰ配列が１０ｋＤａあたり０．３個以上となるアミノ酸配列を有する。また表３及び表４に示すように、ポリペプチドＲＣＰ＃２（配列番号９）は、ＧＦＰＧＥＲ配列を含まないアミノ酸配列を有する。Ｒ−IIコラーゲン及び天然ヒトII型コラーゲン（配列番号４）は、ＧＦＰＧＥＲ配列が１０ｋＤａあたり０．１５個以下となるアミノ酸配列を有する。
比較用のポリペプチドとして、ポリペプチドＲＣＰ＃７、ＲＣＰ＃２、Ｒ−IIコラーゲン及び天然ヒトII型コラーゲンを準備した（比較例１〜４）。
表３及び表４に示すように、ポリペプチドＲＣＰ＃７（配列番号８）は、ＧＶＭＧＦＰ配列が１０ｋＤａあたり０．３個以上となるアミノ酸配列を有する。また表３及び表４に示すように、ポリペプチドＲＣＰ＃２（配列番号９）は、ＧＦＰＧＥＲ配列を含まないアミノ酸配列を有する。Ｒ−IIコラーゲン及び天然ヒトII型コラーゲン（配列番号４）は、ＧＦＰＧＥＲ配列が１０ｋＤａあたり０．１５個以下となるアミノ酸配列を有する。
ポリペプチドＲＣＰ＃７及びＲＣＰ＃２は、それぞれ、対応するポリヌクレオチド（配列番号１０及び１１）を用いた以外は、実施例１〜３と同様にして得た。
Ｒ−IIコラーゲンは、配列番号４に示すアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するポリヌクレオチドを準備し、実施例１〜３と同様にして得た。ただし、セリン残基とスレオニン残基は他のアミノ酸残基に変更しておらず、天然のヒトII型コラーゲンとの同一性は１００％である。
Ｒ−IIコラーゲンは、配列番号４に示すアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するポリヌクレオチドを準備し、実施例１〜３と同様にして得た。ただし、セリン残基とスレオニン残基は他のアミノ酸残基に変更しておらず、天然のヒトII型コラーゲンとの同一性は１００％である。
各ポリペプチドの性状を表３及び表４に示す。表４中「Ｒ−II」はＲ−IIコラーゲンを意味する。また表４中「＊」は、繰り返し配列を含むものは、繰り返しの部分を除いた残りの配列について、対応する部分の同一性（％)を求めたものであることを意味する。表４中「天然II型コラーゲン」は、天然ヒトII型コラーゲンであることを意味する。
＜評価＞
上記で得られた各ポリペプチドの軟骨細胞増殖能及び細胞外基質産生能について以下のように評価した。また、評価に先立ち、試験用のプレートを以下のようにして作製した。
上記で得られた各ポリペプチドの軟骨細胞増殖能及び細胞外基質産生能について以下のように評価した。また、評価に先立ち、試験用のプレートを以下のようにして作製した。
（１） ＧＡＧ産生促進ポリペプチドコーティングプレートの作製
本発明の実施例に相当するＲＣＰ＃４〜＃６と、本発明の比較例に相当するＲＣＰ＃７、ＲＣＰ＃２、Ｒ−IIコラーゲン及び天然ヒトII型コラーゲンの各ポリペプチドを、０．２μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、及び２０μｇ／ｍｌとなるように、ＲＣＰ＃４〜＃７、＃２、Ｒ−IIコラーゲン溶解用液（注射用水）又は、天然ヒトII型コラーゲン溶解用液（蒸留水を１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ３に調整した酸性液）にそれぞれ溶解させて試料液を調製した。得られた各試料液を、２４ウェルプレート（24 well non-treated plate, ＢＤ社）の各ウェルに６２５μｌずつ添加し、２５℃で風乾させてウェル内に固定し、試験用プレートを作製した。
本発明の実施例に相当するＲＣＰ＃４〜＃６と、本発明の比較例に相当するＲＣＰ＃７、ＲＣＰ＃２、Ｒ−IIコラーゲン及び天然ヒトII型コラーゲンの各ポリペプチドを、０．２μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、及び２０μｇ／ｍｌとなるように、ＲＣＰ＃４〜＃７、＃２、Ｒ−IIコラーゲン溶解用液（注射用水）又は、天然ヒトII型コラーゲン溶解用液（蒸留水を１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ３に調整した酸性液）にそれぞれ溶解させて試料液を調製した。得られた各試料液を、２４ウェルプレート（24 well non-treated plate, ＢＤ社）の各ウェルに６２５μｌずつ添加し、２５℃で風乾させてウェル内に固定し、試験用プレートを作製した。
（２） 軟骨細胞増殖評価
軟骨細胞増殖評価には、株式会社プライマリーセルから購入した軟骨細胞培養キット（コード：ＣＨＣ０２）を使用した。
上記で作製した各試験用プレートに、キットに含まれる日本白色家兎軟骨細胞を、２００００ｃｅｌｌ／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％（v/v）ＣＯ２という条件で培養を行った。培養には、キット付属の培地「分化用メディウム」（ＲＰＭＩ１６４０、血清、アスコルビン酸、その他）を用いた。培養開始後２時間、１日、２日、３日、及び７日に、ウェル内の軟骨細胞を回収し、軟骨細胞数の定量を行った。
具体的には、各試験用プレートに入っている培地を捨て、１ウェルあたり１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、１５０μｌのトリプシン−ＥＤＴＡを添加し、１分間静置することにより、試験用プレートに接着した細胞をはがした。ウェル内に、上述した培地を１５０μｌ加え、細胞懸濁液を作製し、トリパンブルー液を加え、血球計算盤にて生細胞数をカウントした。得られた生細胞数に基づいて軟骨細胞増殖促進能を、以下のように評価した。結果を表４に示す。なお、表４中、軟骨細胞増殖評価欄の「−」は、未実施であることを意味する。
Ｓ：細胞数が、天然ヒトII型コラーゲンを添加して培養した場合の細胞数に対して１２５％を超える
Ａ：細胞数が、天然ヒトII型コラーゲンを添加した培養した場合の細胞数に対して１００％を超え１２５％以下
Ｂ：細胞数が、天然ヒトII型コラーゲンを添加した培養した場合の細胞数に対して７５％を超え、１００％以下
Ｃ：細胞数が、天然ヒトII型コラーゲンを添加した培養した場合の細胞数に対して７５％以下
軟骨細胞増殖評価には、株式会社プライマリーセルから購入した軟骨細胞培養キット（コード：ＣＨＣ０２）を使用した。
上記で作製した各試験用プレートに、キットに含まれる日本白色家兎軟骨細胞を、２００００ｃｅｌｌ／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％（v/v）ＣＯ２という条件で培養を行った。培養には、キット付属の培地「分化用メディウム」（ＲＰＭＩ１６４０、血清、アスコルビン酸、その他）を用いた。培養開始後２時間、１日、２日、３日、及び７日に、ウェル内の軟骨細胞を回収し、軟骨細胞数の定量を行った。
具体的には、各試験用プレートに入っている培地を捨て、１ウェルあたり１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、１５０μｌのトリプシン−ＥＤＴＡを添加し、１分間静置することにより、試験用プレートに接着した細胞をはがした。ウェル内に、上述した培地を１５０μｌ加え、細胞懸濁液を作製し、トリパンブルー液を加え、血球計算盤にて生細胞数をカウントした。得られた生細胞数に基づいて軟骨細胞増殖促進能を、以下のように評価した。結果を表４に示す。なお、表４中、軟骨細胞増殖評価欄の「−」は、未実施であることを意味する。
Ｓ：細胞数が、天然ヒトII型コラーゲンを添加して培養した場合の細胞数に対して１２５％を超える
Ａ：細胞数が、天然ヒトII型コラーゲンを添加した培養した場合の細胞数に対して１００％を超え１２５％以下
Ｂ：細胞数が、天然ヒトII型コラーゲンを添加した培養した場合の細胞数に対して７５％を超え、１００％以下
Ｃ：細胞数が、天然ヒトII型コラーゲンを添加した培養した場合の細胞数に対して７５％以下
（３）軟骨基質産生評価
上記（２）と同様に、上記（１）で作製した各試験用プレートにて日本白色家兎軟骨細胞と共に、各ポリペプチドを培養し、培養開始後、２時間、１日、２日、３日、及び７日に、基質であるＧＡＧの定量を行った。ＧＡＧの定量は、「硫酸化グリコサミノグリカン定量キット」（生化学バイオビジネス株式会社）を用いて行った。
具体的には、試験用プレートのウェル内の培地を捨て、１ウェルあたり１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄を行った後、キットに付属のプロテアーゼ液１５０μｌを添加し、プレートシェーカーにて攪拌した。次いで、５０℃、２時間反応させ、更に１００℃、１０分反応させた。各試料５０μｌに対して、キットに付属されている反応緩衝液ＩＩを、５０μｌ添加、混合し、更に、１５０μｌのＤＭＭＢ色素液を添加した。キットに付属のＧＡＧ標準液についても同様の操作を行った。それぞれ５分間の反応後に、プレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ（商品名）サンライズ レインボーサーモＲＣ［型番］、ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、波長５３０ｎｍでの吸光度を測定し、ＧＡＧの定量を行った。結果を図１に示す。またＧＡＧ量に基づいて軟骨基質産生促進能を、以下のように評価した。結果を表４に示す。
Ｓ：ＧＡＧ産生量が、天然ヒトII型コラーゲンを添加して培養した場合のＧＡＧ産生量の１２５％を超える
Ａ：ＧＡＧ産生量が、天然ヒトII型コラーゲンを添加して培養した場合のＧＡＧ産生量の１００％を超え、１２５％以下
Ｂ：ＧＡＧ産生量が、天然ヒトII型コラーゲンを添加して培養した場合のＧＡＧ産生量の７５％を超え、１００％以下
Ｃ：ＧＡＧ産生量が、天然ヒトII型コラーゲンを添加して培養した場合のＧＡＧ産生量の７５％以下
上記（２）と同様に、上記（１）で作製した各試験用プレートにて日本白色家兎軟骨細胞と共に、各ポリペプチドを培養し、培養開始後、２時間、１日、２日、３日、及び７日に、基質であるＧＡＧの定量を行った。ＧＡＧの定量は、「硫酸化グリコサミノグリカン定量キット」（生化学バイオビジネス株式会社）を用いて行った。
具体的には、試験用プレートのウェル内の培地を捨て、１ウェルあたり１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄を行った後、キットに付属のプロテアーゼ液１５０μｌを添加し、プレートシェーカーにて攪拌した。次いで、５０℃、２時間反応させ、更に１００℃、１０分反応させた。各試料５０μｌに対して、キットに付属されている反応緩衝液ＩＩを、５０μｌ添加、混合し、更に、１５０μｌのＤＭＭＢ色素液を添加した。キットに付属のＧＡＧ標準液についても同様の操作を行った。それぞれ５分間の反応後に、プレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ（商品名）サンライズ レインボーサーモＲＣ［型番］、ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、波長５３０ｎｍでの吸光度を測定し、ＧＡＧの定量を行った。結果を図１に示す。またＧＡＧ量に基づいて軟骨基質産生促進能を、以下のように評価した。結果を表４に示す。
Ｓ：ＧＡＧ産生量が、天然ヒトII型コラーゲンを添加して培養した場合のＧＡＧ産生量の１２５％を超える
Ａ：ＧＡＧ産生量が、天然ヒトII型コラーゲンを添加して培養した場合のＧＡＧ産生量の１００％を超え、１２５％以下
Ｂ：ＧＡＧ産生量が、天然ヒトII型コラーゲンを添加して培養した場合のＧＡＧ産生量の７５％を超え、１００％以下
Ｃ：ＧＡＧ産生量が、天然ヒトII型コラーゲンを添加して培養した場合のＧＡＧ産生量の７５％以下
表４及び図１に示されるように、本発明の実施例であるＲＣＰ＃４〜＃６のポリペプチドはいずれも、天然のヒトII型コラーゲンよりも、有意にＧＡＧの産生を促進させていることがわかった。また、本発明の実施例であるＲＣＰ＃４〜＃６のポリペプチドはいずれも、比較例１〜３となる各ポリペプチドと同等又はそれよりも、軟骨細胞を増殖させることができる。
このことから、ＲＣＰ＃４〜＃６のポリペプチドは、軟骨基質の産生促進に優れ、軟骨細胞の増殖促進にも優れた足場組成物であることがわかった。
また、ｐＩが６．０以下の場合には、細胞増殖能が更に向上することがわかった（ＲＣＰ＃４参照）。
更に、ＲＣＰ＃４〜＃６のポリペプチドは、グリコサミノグリカンの産生に優れ、軟骨細胞を増殖させることから、軟骨組織修復用組成物、軟骨細胞培養用組成物及びグリコサミノグリカン産生促進用組成物として使用できることもわかった。
このことから、ＲＣＰ＃４〜＃６のポリペプチドは、軟骨基質の産生促進に優れ、軟骨細胞の増殖促進にも優れた足場組成物であることがわかった。
また、ｐＩが６．０以下の場合には、細胞増殖能が更に向上することがわかった（ＲＣＰ＃４参照）。
更に、ＲＣＰ＃４〜＃６のポリペプチドは、グリコサミノグリカンの産生に優れ、軟骨細胞を増殖させることから、軟骨組織修復用組成物、軟骨細胞培養用組成物及びグリコサミノグリカン産生促進用組成物として使用できることもわかった。
従って、本発明によれば、軟骨細胞の細胞外基質産生促進に優れた足場組成物、軟骨組織修復用組成物、グリコサミノグリカン産生促進用組成物、軟骨細胞培養用組成物及びそのための材料を提供することができる。
２０１２年９月２６日に出願された日本国特許出願第２０１２−２１３１１０号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
Claims (6)
- （Ａ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカン産生促進能を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカン産生促進能を有するポリペプチド、又は
（Ｄ）配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列との配列同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、分子量１０ｋＤａあたりのＲＧＤ配列の含有数が０．３０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＦＰＧＥＲ配列の含有数が０．２０個以上であり、分子量１０ｋＤａあたりのＧＶＭＧＦＰ配列の含有数が０．３０個未満であり、かつグリコサミノグリカン産生促進能を有するポリペプチド。 - 前記（Ｄ）のポリペプチドが、配列番号１〜３のいずれかに示すアミノ酸配列との配列同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
- 請求項１又は請求項２記載のポリペプチドを含む足場組成物。
- 請求項１又は請求項２記載のポリペプチドを含む軟骨組織修復用組成物。
- 請求項１又は請求項２記載のポリペプチドを含む軟骨細胞培養用組成物。
- 請求項１又は請求項２記載のポリペプチドを含むグリコサミノグリカン産生促進用組成物。
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