KR20160010212A - 항노화 및 창상 치료용 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

항노화 및 창상 치료용 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 텔로머라제로부터 유래된 피부의 항노화 및 창상 치유에 효능을 갖는 펩티드, 그 펩티드를 포함하는 창상 치료 또는 피부 개선을 위해 사용되는 약학 조성물 및 그 조성물을 사용하는 창상 치료 또는 피부 개선 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 본 발명의 항노화 및 창상 치유 효능 펩티드 및 그를 포함하는 조성물을 피부에 적용하면, 섬유모세포의 이동이 증가하고, 콜라겐 생성이 촉진되며, 상피세포가 무결성을 가지며 증가 및 분화하게 되어 피부 상태를 호전 시키는데 있어서, 신속하고 뛰어난 효과를 얻을 수 있다.

Description

항노화 및 창상 치료용 펩티드 및 이를 포함하는 조성물{Anti-aging and wound-healing peptide and composition comprising the same}
본 발명은 텔로머라제로부터 유래된 항노화 및 창상 치유에 효능을 갖는 펩티드, 그 펩티드를 포함하는 피부의 항노화 및 창상 치료용 약학 조성물 및 그 조성물을 사용하는 창상 치유 및 피부 개선 방법에 관한 것이다.
사람의 피부는 외부 환경에 의해 다양하게 손상될 수 있다. 예를 들어, 뜨거운 열, 강한 자외선 노출, 물리적 마찰(외상), 산성 물질에 의한 손상 등에 의해 피부 조직이 파괴되면 상처 및 노화가 된다. 이를 치유하기 위해 몸의 내부에서는 치유 작용이 일어나게 되는데, 이때 중요하게 작용하는 것이 세포 이동이다. 특히, 섬유모세포(fibroblast cells)가 상처 및 노화 조직의 내부로 이동하는 속도에 따라 치유 속도가 결정되게 된다. 즉, 섬유모세포를 얼마나 많이 빠르게 이동시키느냐에 따라 얼마나 상처를 빠르고 적절하게 치유하는지가 결정되며, 섬유모세포의 이동을 촉진하는 것이 상처 치료 및 항노화 작용을 연구하는 것의 중요한 관점이라 할 수 있을 것이다.
창상 치유 과정은 크게 염증기(inflammation), 육아기 (granulation), 상피화기(epithelialization) 및 섬유증식기(fibroplasia) 의 4단계로 나뉜다. 염증기에서는 필요한 세포들(섬유모세포, 상피세포 등)을 활성화 시킨다. 이어 육아기에서는 섬유모세포가 콜라겐을 증착(deposit)시키며, 이에 콜라겐이 증가하게 되고 창상이 성숙(mature)하게 된다. 또한 창상 부위의 각질세포(keratinocyte) 변화가 일어나게 되고, 결손부위 표피(epidermis)가 두꺼워지고 표피 아래의 기저세포로부터 표피까지 상피세포(epithelial cells)가 이동하게 되는 상태로 점차 나아가게 되는데 이를 상피화기라고 하며, 상피화기를 거쳐 섬유 증식기로 나아가 콜라겐 섬유(collagen fibers)들이 콜라겐 기질(collageneous matrix)를 형성하여 창상 결손부위를 메우게 되고, 이것이 장기간 이루어지다 종료되면 치유가 되는 것이다. 따라서 상피세포의 증식과 콜라겐의 생성 또한 상처 치료 및 항노화 작용의 중요한 기전(mechanism) 중 하나라고 할 수 있을 것이다.
텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제(telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다. 따라서, 세포 증식 및 사멸과 관련하여 텔로머라제에 대한 연구가 진행 되어, 다양하게 응용 및 개발 되고 있다.
텔로머라제로부터 유래된 펩티드로부터 섬유모세포 이동의 효과, 상피세포의 증식 및 콜라겐 합성 활성화의 효과를 확인하는 것은 피부의 항노화 및 창상 치유 연구분야에 중요한 연구 과제가 될 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
US 6174541 B1 US 7638484 B2
DIEGELMANN et al., 'Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing', Frontiers in Bioscience, Vol.9, pp.283-289 (2004)
항노화 및 창상 치료는 피부의 조직손상에 의해 일어나는 피부 상태 개선을 목적으로 이루어지게 된다. 이때, 피부 조직손상이 일어나면, 신체 내부에서 이를 치유하기 위하여 여러 가지 작용이 일어나게 되는데 가장 중요한 작용들 중에 섬유모세포의 세포이동, 콜라겐의 생성 증대 및 상피세포의 증가가 포함된다.
이에, 피부 조직손상의 효과적인 회복을 위해 섬유모세포 및 상피세포의 세포이동을 촉진하고 콜라겐 형성을 증대시키는 물질 및 이를 사용하여 피부를 치유 또는 회복 하는 방법에 대한 필요성이 제기되고 있다.
본 발명의 목적은 피부의 항노화 및 창상 치료에 효과가 있는, 텔로머라제로부터 유래된 펩티드를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 피부의 항노화 및 창상 치료에 효과적인 수단으로서 텔로머라제로부터 유래된 펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 섬유모세포 이동 촉진에 효과적인 수단으로서 텔로머라제로부터 유래된 펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 콜라겐 생성 증가에 효과적인 수단으로서 텔로머라제로부터 유래된 펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상피세포 증가에 효과적인 수단으로서 텔로머라제로부터 유래된 펩티드 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 측면에 따라, 텔로머라제로부터 유래된 피부의 항노화(anti-aging) 및 창상 치유(wound-healing)에 효능을 갖는 펩티드로서, 상기 펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 가지는 펩티드를 포함하며, 창상 치료 또는 피부 개선을 위해 사용되는 약학 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 피부 주름, 피부 마름, 피부 패임, 표피 화상, 표피 열상, 표피 창상 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 피부 질환의 치료, 개선, 또는 예방을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 텔로머라제-유래 펩티드를 포함하는 조성물; 및 상기 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 횟수 및 적응증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포함하는 창상 치료 또는 피부 개선용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 텔로머라제-유래 펩티드를 항피부노화 또는 창상치유가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 창상 치료 또는 피부노화 개선방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면에 따른 창상 치료 또는 피부노화 개선 방법에서, 상기 방법은 상기 텔로머라제-유래 펩티드를 대상의 외피에 적용하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 텔로머레이즈로부터 유래된 펩티드를 이용하여, 항노화 및 창상 치료에 효과적인 조성물 및 치료 방법을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명의 텔로머레이즈 유래 펩티드 및 펩티드를 포함한 조성물을 통하여 섬유모세포의 이동, 콜라겐 생성 및 상피세포 증식 및 무결성 분화를 촉진하고, 이를 통하여, 신속하고 뛰어난 항노화 및 창상 치료 효과를 얻을 수 있다.
도 1 은 본 발명에 따른 펩티드의 투여 농도에 따른 정상 인간 각질세포에 대한 세포독성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 펩티드의 투여 농도에 따른 정상 인간 섬유모세포에 대한 세포독성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 펩티드의 투여 농도에 따른 정상 인간 섬유모세포에 대한 증식률 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4(a)는 본 발명에 따른 펩티드의 투여 농도에 따른 정상 인간 섬유모세포의 이동 속도를 비교한 것으로서, 무혈청 조건에서의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4(b)는 본 발명에 따른 펩티드의 투여 농도에 따른 정상 인간 섬유모세포의 이동 속도를 비교한 것으로서, 혈청 조건에서의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 펩티드의 투여 농도에 따른 정상 인간 섬유모세포의 동일 시간 동안 세포 이동 정도를 무혈청 및 혈청 조건 별로 나타낸 결과 사진이다.
도 6은 본 발명에 따른 펩티드의 투여 농도에 따라 형성된 상피세포의 두께를 비교하여 나타낸 결과 사진이다.
도 7은 본 발명에 따른 펩티드의 투여 농도에 따른 콜라겐 형성 정도를 나타낸 결과 사진이다.
도 8은 본 발명에 따른 펩티드의 투여 농도에 따른 상피줄기세포 발현 정도를 마커들을 통하여 나타낸 결과 사진이다.
도 9는 본 발명에 따른 펩티드의 투여 농도에 따른 상피세포의 무결성 분화 정도를 마커를 통하여 나타낸 결과 사진이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
창상 치유는 염증기, 육아기, 상피화기 및 섬유증식기로 이루어지나, 각각이 순차적으로 진행된다기 보다는 동시적으로 일어나는 것이라 할 수 있다. 조직의 손상이 일어난 후 최초 반응인 염증기가 일어 나고 치유의 과정이 거의 마무리(성숙) 되는 섬유증식기로 나아가는 일련의 과정이라고 할 수 있는 것이다. 각각의 과정에서 사이토카인(cytokine), 섬유모세포, 콜라겐, 상피세포 등이 주요소로 활성화 되어 치유가 진행되게 된다.
사이토카인은 폴리펩타이드로서 세포간 상호 작용을 위한 전달물질이며, 염증기에서 창상 치유 활성 단계의 신호물질 역할을 담당한다. 예를 들어, 창상 치유 과정에서는, IGF-1(Insulin-like growth factor-1), TGF-β(Transforming growth factor beta) 등이 있다.
섬유모세포는 세포외기질(extracellular matrix) 과 콜라겐을 합성(synthesize)하는 세포의 일종으로 동물세포의 구조적 뼈대를 생성하는 중요한 역할과 창상 치유에 매우 중요한 역할을 한다. 섬유모세포가 창상으로 이동하고 증식하여 새로운 세포외기질을 합성하는 시기에 콜라겐 양이 증가하면서 창상이 성숙(mature)된다.
콜라겐은 세포외 기질성분의 주된 성분이며, 트리플 헬릭스(triple-helix)의 구조를 가지는 단백질로 구성되며 여러 종류(type)가 있다. 섬유모세포의 리보솜(ribosome)에서 콜라겐 전구체(procollagen) 기본단위(peptide-chain)가 합성되는 것을 시작으로 섬유모세포 내부에서 여러 단계를 거쳐 전구체(알파 트리플 헬릭스 구조)가 세포 밖으로 배출되면, 배출된 전구체들이 모여 고분자화(polymerization)되고 또 조밀하게 응축되어 콜라겐이 형성되게 된다. 이와 같이 섬유모세포가 콜라겐을 합성함에 따라 창상이 더욱 성숙하게 되고, 창상 성숙이 경과(진행) 됨에 따라 새로운 타입의 콜라겐 섬유들이 생성, 증식되어 창상 부위에 섬유증식기가 일어나게 된다. 이후 증식에 의한 반흔(scar)생성 및 수축 등을 거쳐 피부가 치유 된다.
상피세포는 창상이 일어난 부위의 표면 쪽인 각질세포 표피(epidermis)가 두꺼워지고 창상 기저 세포(marginal basal cells)가 커져서 결손부로 이동하기 시작할 때, 증식하여 창상 기질 위로 이동하게 된다. 이러한 상피세포의 계속적인 증식 및 이동을 상피화라고 하며 상피화가 이루어지면서 창상 치유가 성숙(진행)되게 된다.
본 발명에 따른 텔로머레이즈 유래 펩티드를 이용하면 피부의 항노화 및 창상 치료에 효과적인 수단을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명에 따른 텔로머레이즈 유래 펩티드를 제조하여 섬유모세포 이동, 콜라겐 형성, 상피세포 증식 및 이동 촉진 효과를 얻을 수 있다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열 번호 1의 서열을 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제, 구체적으로 인간(Homo sapiens) 텔로머라제에서 유래한 펩티드를 포함한다.
본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.
원래 아미노산 예시적인 잔기 치환 바람직한 잔기 치환
Ala (A) val; leu; ile Val
Arg (R) lys; gln; asn Lys
Asn (N) gln; his; asp, lys; arg Gln
Asp (D) glu; asn Glu
Cys (C) ser; ala Ser
Gln (Q) asn; glu Asn
Glu (E) asp; gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) asn; gln; lys; arg Arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucine Leu
Leu (L) norleucine; ile ; val; met; ala; phe Ile
Lys (K) arg; gln; asn Arg
Met (M) leu; phe; ile Leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) tyr; phe Tyr
Tyr (Y) trp; phe ; thr; ser Phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine Leu
펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다
펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.
펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 핵산 분자로서 자연발생적 또는 인공적 DNA 또는 RNA 분자일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상일 수 있는데, 동일한 유형의 (예컨대, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는) 핵산 분자일 수도 있고, 다른 유형으로 핵산 분자들일 수 도 있다. DNA, cDNA, decoy DNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, 안티센스 올리고머(antosense oligomer), 플라스미드(plasmid) 및 그 외 변형된 핵산 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 그 단편인 펩티드를 항노화 및 창상 치유가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 항노화 및 창상 치유 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 항노화 및 창상 치유에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 그 단편인 펩티드의 항노화 및 창상 치유 효과에 대한 용도가 제공된다.
본 발명에서의 서열번호 1(이하 'pep-1'은 텔로머라제 유래 펩티드로서 하기와 같이 16개의 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.
서열번호 1: EARPALLTSRLRFIPK
서열 번호 1에 기재된 펩티드는 아래 표 2과 같다. 아래 표 2의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1에 기재된 펩티드는 인간 텔로머라제의 전체 펩티드를 나타낸다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 서열번호 2는 전체 텔로머라제의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
서열번호 이름 텔로머라제 상 위치 서열 길이
1 pep1 [611-626] EARPALLTSRLRFIPK 16 aa
2 [1-1132] MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRR
GAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRDCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGT TLTALEAAANPALPSDFKTILD		 1132 aa
또한 본 발명에 따른 서열 번호 1의 서열을 갖는 펩티드, 서열 번호 1의 서열의 단편인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 세포 내 독성이 낮아 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함하여 항노화 및 창상 치유에 효과가 있는 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드, 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 항노화 및 창상 치유용 펩티드와 그 조성물을 포함하여 항노화 및 창상 치유에 효과가 우수한 약학 또는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는(comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.1 ㎍/㎎ 내지 1 ㎎/㎎, 구체적으로 1 ㎍/㎎ 내지 0.5 ㎎/㎎, 더 구체적으로 10 ㎍/㎎ 내지 0.1 ㎎/㎎의 함량으로 포함할 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명에 있어서, 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학 조성물의 유효 성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 ㎍/kg/일 내지 1 g/kg/일, 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 액제, 고형 제제 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).
수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 것 이며, 다른 언급이 없는 한, 각 수치는 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것과 동일하게 본 명세서에 적용된다. 모든 범위의 한계 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.
본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명의 기재를 용이하게 하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석 되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다 .
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 펩티드의 합성
서열번호 1의 펩티드(이하 "pep-1"이라 함)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Ala-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin
펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH
커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 레진에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H2O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.
아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.
본 실시예에 사용된 펩티드에 대해 고성능 액체 크로마토 그래피 결과, 모든 펩티드의 순도는 95% 이상이었다.
pep-1 제조에 관한 구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.
1) 커플링
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl 레진(Resin) 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc 탈보호
20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응시키고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격 (NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-chloro-Trityl Resin)을 만들었다.
4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 레진에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 레진에서 분리하였다.
5) 얻어진 혼합물(mixture)에 냉각 다이에틸 에테르(Cooling diethyl ether)를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시킨다.
6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 파우더(powder)로 제조하였다.
실시예 1과 같은 방법으로 제조된 pep-1을 이용하여 항노화 및 창상 치유 효과 실험을 진행하였다.
실시예 2: 세포의 배양
정상 각질형성세포 및 섬유모세포를 포경수술로부터 얻은 피부에서 추출하여 배양하였다.
정상 각질형성세포는 각질형성세포 성장 배지 (KGM, keratinocyte growth media)에서 10% FBS를 첨가하여 배양하였다.
섬유모세포는 듈베코의 변형 이글 배지(DMEM, dulbecco's modified eagle? medium)에서 10% FBS를 첨가하여 배양하였다.
상기 실시예 2에 따른 방법으로 배양된 정상 각질형성세포 및 섬유모세포에 대하여, 대조군 및 상기 실시예 1에서 제조된 pep-1을 농도별로 투여하여, 이하 실시예 3 내지 5와 같은 독성 및 증식, 항노화 및 창상 치유 효과에 대한 실험을 진행하였다.
실시예 3: MTT 어세이를 통한 세포 독성 및 증식 실험
(1) 측정방법 :
세포 독성 및 증식은 아래와 같은 단계를 거쳐 측정되었다.
1) 실시예 2에서 배양된 정상 각질형성세포 및 섬유모세포 각각 40000개의 세포를 배양용기에 뿌려주고 24시간 후 혈청을 제거한 배지로 바꾸어 주었다.
2) 1)에서 얻어진 배양 배지에 MTT용액 (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 100μl of 5 mg/m)을 넣고 4시간 추가 배양하였다. 이 때, 미토콘드리아 탈수소효소 작용에 의해 포마잔 결정(formazan crystals)로 환원 되었다.
3) 2)에서 얻어진 포마잔 결정을 DMSO로 처리하여 용해하였다.
4) ELISA 측정기 (TECAN, Salzburg, Austria에서 구입)를 사용하여, 흡광 파장 540nm로 측정하였다.
(2) 세포 독성 측정 :
배양단계에서, 대조군(CTL)에는 증류수(DW)를 투여하고 실시예 1에서 얻은 pep-1를 각각 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50 μM 농도로 투여한 뒤 독성 정도(cytotoxicity) 결과를 측정하였다. 독성 정도는 %로 나타내었다.
세포독성의 결과를 도 1 및 도2에 나타내었다.
도 1에서와 같이, 정상 각질형성세포 (Normal Human Keratinocytes)의 pep-1(GV1001로 표기, 이하 같음) 농도에 따른 세포 독성 결과가 나왔다. pep-1 0.1-5 μM까지는 대조군 보다 약간 높은 경향을 보이나 통계적으로 의미가 없는 정도의 차이였다.
도 2에서와 같이, 정상 섬유모세포의 pep-1 농도에 따른 세포 독성 결과가 나왔다. pep-1의 농도 2 μM를 제외하고는 대조군 보다 높은 세포독성을 보이지 않았으며, 2 μM의 경우에도 통계적으로 의미가 없는 정도의 차이였다.
따라서 세포 독성 정도가 대조군 과의 차이가 없는 것으로 볼 때, 본 발명에 따른 펩티드(pep-1)는 세포 독성에 영향을 거의 주지 않으며, 안전한 것이라 할 수 있다.
(3) 세포 증식 측정:
세포 독성 측정 때와 마찬가지로, 배양단계에서 대조군에는 증류수를 투여하고, 실시예 1에서 얻은 pep-1를 각각 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 50 μM 농도로 투여한 뒤 증식 정도(proliferation) 결과를 측정하였다.
세포증식정도의 결과를 도 3에 나타내었으며, 증식 정도는 %로 표시하였다.
도 3에서와 같이, 정상 섬유모세포의 pep-1 농도에 따른 세포 증식 결과가 나왔다. pep-1을 투여한 모든 그룹에서 대조군에 비하여 높은 증식 정도를 보였다.
따라서, 섬유모세포의 증식이 대조군 보다 높게 나타나는 것으로 볼 때, 본 발명에 따른 펩티드(pep-1)는 섬유모세포 증식에 영향을 주는 효과를 가지는 것이라 할 수 있다.
실시예 4: 섬유모세포의 이동 실험
(1) 실험방법:
상처 환경(섬유모세포가 이동을 시작하는 환경조건)에서 섬유모세포의 이동을 측정하였다. 이 때, 혈청이 있을 때와 없을 때의 차이를 두어 실험 하였으며, 시간 별 이동 정도는 IncuCyteTM Live-Cell Imaging System (Essen BioScience Inc., Arbor, MI, USA)을 사용하여 측정하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
1) 1일차 : 실시예 2에서 배양된 섬유모세포를 웰(well)당 10000세포 씩 96웰 플레이트에 플레이팅 하였다.
2) 2일차 : 상처 환경을 만들고, 실시예 1에서 얻은 pep-1을 투여하였다.
3) 2-4일차 : 매 1시간마다, 2일 동안 이미지(사진)을 얻었다.
4) 4일차 : 얻은 이미지를 정량화 하였다.
(2) 섬유모세포의 시간에 따른 이동 정도의 비교:
상처가 일어나고 나아감에 따라 섬유모세포가 이동을 하는 정도를 상처 봉합도(wound confluence) %로 나타내었으며, pep-1의 농도를 0 (대조군), 0.01, 0.1, 1, 10 μM로 다르게 투여한 것을 비교 하였다. 혈청 조건과 무혈청 조건(혈청이 없을 때)을 나누어 실험하였다.
도 4(a)에서와 같이, 무혈청 조건 (상단 그래프)일 때, 모든 농도에서 시간에 따른 섬유모세포 이동이 대조군 보다 높게, 즉 빠르게 이동하는 것으로 나왔다. 특히, 24시간 경과 지점에서 대조군 (0μM)일 때는 60% 이나, pep-1 투여 농도 10μM에서는 80%에 가까울 정도로 높게 나타났으며 다른 농도들에서도 대조군 보다 높게 나타났다.
도 4(b)에서와 같이, 혈청 조건 (하단 그래프)일 때에도, pep-1 투여 농도 0.01μM를 제외하고는 모두 대조군 보다 높게 나타났다. 특히, 24시간 경과 지점에서 대조군(0μM)일 때는 60% 이나, pep-1 투여 농도 10μM에서는 80%에 다다를 정도로 높게 나타났다.
따라서, 시간에 따른 섬유모세포 이동이 대조군 보다 높게 일어 나는 것으로 볼 때, 본 발명에 따른 펩티드(pep-1)가 섬유모세포 이동속도를 증가 시키는 효과가 있다고 할 수 있다.
(3) 섬유모세포의 24시간 지점에서의 이동 정도의 비교
섬유모세포의 pep-1 농도에 따른 이동 정도를 보다 상세히 비교하기 위하여 24시간 경과 지점에서 각 세포의 이동 정도 이미지를 얻고 이를 정량화 하였다. 이 때도, 혈청 조건과 무혈청 조건을 나누어 비교하여 보았다.
도 5에서와 같이, 혈청이 없을 때(상단 사진), 대조군의 이동 정도인 60%에 비하여 pep-1 투여 시 모든 농도에서 70 내지 75%로 비교적 높은 이동 정도를 보였다. 또한, 혈청이 있을 때(하단 사진)에도, pep-1 투여 농도 0.01일 때를 제외하고는 모든 농도에서 대조군의 이동 정도인 60%보다 높은 67 내지 79%의 비교적 높은 이동 정도를 보였다.
따라서, 거의 모든 농도에서 대조군 보다 이동 정도가 높게 나타나는 결과를 볼 때, 본 발명에 따른 펩티드(pep-1)가 저농도 또는 고농도, 즉 어느 농도를 투여하여도 섬유모세포의 이동 정도를 증가 시키는 효과가 있다고 할 수 있다.
실시예 5: 입체 피부 모델을 통한 창상 치유 기전 관련 작용
(1) 실험방법:
입체 피부 모델을 통하여, 창상 치료에서 일어나는 작용 중 일부인 상피층 생성, 콜라겐 생성, 상피 줄기 세포 발현, 상피세포 분화 무결성 정도를 측정하였다. 진피 대체물로는 쥐 꼬리에서 추출한 제1형 콜라겐을 이용하였다. 구체적인 실험 방법은 아래와 같다.
1) 제1형 콜라겐 용액의 제조: 10배의 DME 중화 버퍼 (0.05N NaOH, 0.26mM NaHCO, neutralization buffer를 각각 8:1:1의 비율로 혼합)에 추출한 콜라겐을 섞어 제1형 콜라겐 용액을 제조하였다.
2) 1)의 용액에 500,000개의 섬유모세포를 섞은 후 젤을 만들어 굳혔다.
3) 2)의 굳힌 젤 위에 1,000,000개의 각질형성세포를 뿌려주고 하루 동안 배양액에서 배양한 수 12일간 공기에 노출시켜 배양하였다.
4) 배양액 조성: DMEM 과 햄스 영양 믹스(Ham's nutrient mixture) F12를 3:1의 비율로 혼합하여 배양액으로 사용 하였으며, 여기에 5% FBS, 0.4μg/mL 하이드로코르티손(hydrocortisone), 1μM 이소프로테레놀 (isoproterenol), 25 μg/mL 아스코르빅산(ascorbic acid) 및 5 μg/mL 인슐린(insulin)을 배양액에 섞어주었다.
5) 배양 초기에는 낮은 농도의 EGF (1ng/mL, Invitrogen Co., Carlsbad CA)를 사용하고, 공기 노출 후에는 높은 농도의 EGF (10ng/mL)을 사용하였다.
6) 배지는 주 3회 바꾸어 주었다.
7) 13일 후에는 배양한 삼차원 모델을 카노이 용액(Ethanol/ chloroform/ acetic acid 를 6:3:1 비율로 섞은 것) 에 30분간 고정 시키고 이후 파라핀 고정하였다.
8) 4내지 6 μM 두께의 조직절편을 만든 다음 헤마토자일린 과 이오신 (hematoxylin and eosin, H&E) 으로 염색하였으며, 이러한 면역 조직 화학 염색을 위해 아비딘-바이오틴-퍼록시데이즈-복합체 기술(avidin-biotin-peroxidase-complex technique, Dako)을 사용하였다.
(2) 상피세포 증가( Epithelialization ) 측정
창상 치유 기전에서 상피세포의 두께가 증가하는 것은 중요한 치유 지표가 될 수 있다. 이에 실시예 5의 (1)에 따라 제조된 입체 피부 모델에서 실시예 1에 따라 제조된 pep-1의 농도 (0, 0.1, 1, 10 μM) 에 따른 상피세포 두께(ephidermal thickness)변화 정도를 이미지를 통해 비교하였다.
도 6에서와 같이, 입체 피부 모델에서 대조군 (0 μM) 에 비하여 pep-1을 투여한 쪽이 농도 의존적으로 상피세포 두께가 증가함이 나타났다.
따라서, 상피세포 두께 증가가 대조군 보다 높게 나타나는 결과를 볼 때, 본 발명에 따른 펩티드(pep-1)가 상피세포 두께 증가에 효과를 나타냄을 알 수 있다.
(3) 콜라겐 형성 측정
창상 치유 기전에서 피부의 콜라겐 형성 증가 또한 치유 지표로 사용될 수 있다. 이에 실시예 5의 (1)에 따라 제조된 입체 피부 모델에서 실시예 1에 따라 제조된 pep-1의 농도(0, 0.1, 1, 10 μM) 에 따른 콜라겐 형성 정도를 이미지(사진) 및 이미지의 정량화를 통해 비교하였다. 이 때, 조직 염색 법은 메송 트리크롬 염색(Masson's trichrome stain)법을 사용하였다.
도 7에서와 같이, 입체 피부 모델에서 대조군(0 μM) 에 비하여 pep-1을 투여한 쪽이 농도 별로 (0.1, 1, 10 μM) 각각 288%(대조군 100% 기준), 198%, 156%로 콜라겐 형성 정도가 크게 증가함이 나타났다 (통계 p값은 각각 p<0.02, p<0.005, p<0.00005).
따라서, 콜라겐 형성 정도가 대조군 보다 높게 나타나는 비교 결과를 볼 때, 본 발명에 따른 펩티드 (pep-1)가 콜라겐 형성 증가에 효과를 나타냄을 알 수 있다.
(4) 상피 줄기세포 발현 증가 측정
상피 줄기세포는 상피세포 증가를 위한 전구세포로, 상피 줄기세포가 많아 질수록 상피세포가 증가하게 된다. 이는 창상 치유 기전에서 상피세포가 치유 지표로 사용될 수 있는 것과 관련이 있다. 이에 실시예 5의 (1)에 따라 제조된 입체 피부 모델에서 실시예 1에 따라 제조된 pep-1의 농도(0, 0.1, 1, 10 μM) 에 따른 상피 줄기세포 증가 정도를 이미지(사진)을 통해 비교하였다. 상피 줄기세포의 증가 마커(marker)로는 p63과 α6 인테그린(integrin)을 사용하였고, 염색법은 면역형광법(immunofluorescent stain)을 사용하였다.
도 8에서와 같이, 입체 피부 모델에서 대조군(0 μM) 에 비하여 pep-1을 투여한 쪽이 농도 의존적으로 마커들의 발현 정도가 증가함이 사진으로 나타났다 (화살표로 표시된 부위가 마커들의 발현부위, merge는 두 개의 마커 사진을 합친 것).
따라서, 상피 줄기세포 마커들의 발현 증가 정도가 대조군 보다 높게 나타나는 비교 결과를 볼 때, 본 발명에 따른 펩티드(pep-1)가 상피 줄기세포 증가에 효과를 나타냄을 알 수 있다.
(5) 상피세포 분화 측정
상피 줄기세포가 상피세포로 분화 될 때 무결성이 중요한데, 이때, 무결성이란, 줄기세포가 종양의 형태가 아닌 정상적인 세포로 분화 하는 것을 말한다. 이를 상피세포 무결성(epidermal integrity)라고 하며, 이러한 무결성을 통하여 창상 치유 과정이 올바르게 이루어 지는 가를 측정해 볼 수 있다. 이에 실시예 5의 (1)에따라 제조된 입체 피부 모델에서 실시예 1에 따라 제조된 pep-1의 농도(0, 0.1, 1, 10 μM) 에 따른 상피세포의 무결성 분화 정도를 이미지(사진)를 통해 비교하였다. 무결성 분화 정도를 나타내는 마커로 케라틴 10(keratin 10)을 사용하였고, 염색법은 면역형광법을 사용하였다.
도 9에서와 같이, 입체 피부 모델에서 대조군(0 μM) 에 비하여 pep-1을 투여한 쪽이 농도 의존적으로 마커(케라틴 10)의 발현 정도가 증가함이 사진으로 나타났다 (점선을 기준으로 상단의 밝은 부분이 케라틴 10의 발현 부위를 나타내며(회색 포함), merge는 배경 색을 통한 보정 후 사진).
따라서, 상피세포 분화 무결성 정도가 대조군 보다 높게 나타나는 비교 결과를 볼 때, 본 발명에 따른 펩티드(pep-1)가 상피세포 분화 무결성 증가에 효과를 나타냄을 알 수 있다.
결론적으로, 상기 실시예들을 통하여 볼 때, 본 발명에 따른 펩티드(pep-1)가 항노화 및 창상 치유 기전(피부의 회복 기전) 에서 중요한 작용들 중에 섬유모세포의 이동, 콜라겐 생성, 상피세포 증가, 및 상피세포 분화의 무결성 증가에 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 펩티드와 이를 포함한 조성물은 피부의 항노화 및 상처 치유에 다양하게 응용되어 사용될 수 있음을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> KAEL-GemVax Co., Ltd. <120> 항노화 및 창상 치료용 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 <130> 2014PCT01 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15

Claims (6)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 텔로머라제-유래 펩티드를 포함하는, 창상 치료 또는 피부노화 개선용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편인 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약학 조성물은 피부 주름, 피부 마름, 피부 패임, 표피 화상, 표피 열상, 표피 창상 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 피부 질환 또는 악화의 치료, 개선, 또는 예방을 위한 것인 약학 조성물.
  4. 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 텔로머라제-유래 펩티드를 포함하는 조성물; 및 상기 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 횟수 및 적응증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포함하는 창상 치료 또는 피부 개선용 키트.
  5. 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 텔로머라제-유래 펩티드를 항피부노화 또는 창상치유가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는 창상 치료 또는 피부노화 개선방법.
  6. 제 5항에 있어서,상기 방법은 상기 텔로머라제-유래 펩티드를 대상의 외피에 적용하는 것인, 창상 치료 또는 피부 개선방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174541B1 (en) 1998-06-30 2001-01-16 Jin Song Skin aging and wound treatment using cell migration agents
US7638484B2 (en) 2003-08-07 2009-12-29 Healor Ltd. Methods for accelerating wound healing by administration of adipokines

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102106756B1 (ko) * 2012-12-13 2020-05-06 주식회사 젬백스앤카엘 자외선에 의한 피부 손상 예방 또는 치료용 조성물
KR102093093B1 (ko) * 2012-12-13 2020-03-25 주식회사 젬백스앤카엘 피부 노화 개선용 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174541B1 (en) 1998-06-30 2001-01-16 Jin Song Skin aging and wound treatment using cell migration agents
US7638484B2 (en) 2003-08-07 2009-12-29 Healor Ltd. Methods for accelerating wound healing by administration of adipokines

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIEGELMANN et al., 'Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing', Frontiers in Bioscience, Vol.9, pp.283-289 (2004)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4272829A3 (en) * 2016-04-07 2024-01-17 Gemvax & Kael Co., Ltd. Peptide having effects of increasing telomerase activity and extending telomere, and composition containing same

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