JP4761968B2 - 新規な分泌タンパク質とその製造法及び用途 - Google Patents
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Description
ChM1Lは腱や靭帯に特異的に発現することから、これらの組織の損傷あるいは修復を評価するマーカー分子として利用できると考えられる。また、ChM1Lの活性を制御することにより、腱や靭帯の損傷を治療できる可能性がある。
本発明は、血管新生抑制活性ならびに破骨細胞による骨吸収を抑制する活性を有する可溶性ポリペプチドに関する。
本発明の可溶性ポリペプチドの発現及び精製は、典型的には、同ポリペプチドをコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換え体DNAを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、形質転換体を培養することにより行われる。ここで宿主細胞としては、真核性宿主細胞及び原核性宿主細胞のいずれを用いることもできる。
本発明の可溶性ポリペプチドを取得する方法としては、化学合成的に該ポリペプチドを合成する方法を挙げることができる。
本発明の可溶性ポリペプチドに対する抗体は、骨・関節疾患の診断・治療に用いることができる。例えば、診断においては、抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ELISA法などを利用することができる。
本発明の診断方法については、通常、被験者から採取された生体試料を試料とする。生体試料としては、血液試料が望ましい。血液試料とは、全血、あるいは全血から得られた血漿や血清を用いることができる。また本発明における生体試料としては、血液のほか、関節液、バイオプシーにより採取された関節軟骨片、滑膜組織、腱組織、靭帯組織、筋組織、泪液なども用いることができる。これらの生体試料の採取方法は公知である。
血管新生を伴う疾患及びChM1Lの活性が減弱あるいは亢進した疾患、例えば癌、関節リウマチ及び腱炎(乾癬、血管腫、糖尿病性網膜症、角膜損傷若しくは角膜移植時の血管新生など)に対する治療薬は、本発明の可溶性ポリペプチドを有効成分として含み、生理学的に許容される担体、賦活剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明の治療薬は、症状の改善を目的として、経口あるいは非経口的に投与することができる。
以下の実施例中、COS7細胞とはアフリカミドリザル腎臓由来の細胞でATCC(アメリカンタイプカルチャーコレクション)より入手可能な細胞(No.CRL−1651)であり、293T細胞とはヒト胎児腎臓由来の細胞でGeneHunter Co.より入手可能な細胞(Cat.No.Q401)であり、MRC−5細胞とはヒト胎児正常繊維芽細胞由来の細胞で理研バイオリソースセンターより入手可能な細胞(No.RCD0211)であり、B16F10細胞はマウス黒色細胞腫由来の細胞でATCCより入手可能な細胞(No.CRL-6475)であり、Lewis Lung carcinomas(LLC)細胞はマウス肺癌由来細胞でATCCより入手可能な細胞(No.CRL-1642)である。また、実施例中、HUVECs細胞(ヒト臍帯静脈内皮細胞)及びHMVECs(ヒト皮膚微静脈内皮細胞)は、Clontics社より、またNHDFs細胞は三光純薬より、それぞれ入手可能である。
<方法> ヒトChM1L(アミノ酸1-317)のC末端にFLAGタグが融合したタンパク質をコードするcDNA(配列番号1)をPCR法により増幅し、pCAGGSベクター(Miwa等 ジーン(Gene)(Netherlands)1991年12月15日発行 108巻2号 p193-200)にクローニングした(pCAGGS-hChM1L-FLAG)。尚、本実施例で述べるFLAGタグ(Sigma社)とは、8アミノ酸からなる親水性のマーカーペプチド(Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys)である。リポフェクトアミンプラス試薬(Life technologies社)を用いて、製品説明書に従い、pCAGGS及びpCAGGS-hChM1L-FLAGをCOS7細胞及び293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトしてから約48時間後に培養上清を回収し、抗FLAG M2アガロース(Sigma社)で免疫沈降を行った。免疫沈降後のサンプルを15%ゲルでSDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)を行い、ニトロセルロース膜にトランスファーした。一次抗体は抗ChM1Lポリクローナル抗体(非特許文献5)、二次抗体はホースラディッシュパーオキシダーゼ(horseradish peroxdase)で標識された抗ウサギIgG抗体(Dako社)を用い、ECLplus試薬(Amersham pharmacia biotech社)により製品説明書に従って発色反応を行った。
<方法> リポフェクトアミンプラス試薬(Life technologies社)を用いて、製品説明書に従い、pCAGGS-hChM1L-FLAGを293T細胞にトランスフェクトし、約48時間後に培養上清を回収した。抗FLAG M2アガロース(Sigma社)を用いて、アフィニティーカラムを作製し、培養上清をカラムにアプライした。25mM トリス塩酸緩衝液、 150mM NaCl(pH7.4)でカラムを洗浄後、0.1M グリシン-HCl(pH3.5)を用いて溶出し、1/20容量の1M Tris-HCl(pH9.5)を用いて溶出液を中和した。溶出液を用いて15%ゲルでSDS-PAGEを行い、Sequi-BlotTM PVDF膜(Bio-Rad社)にトランスファーした後、GelCode Bluestain reagent(Pierce社)で染色した。約15kDaのバンドを切り出し、ピログルタメートアミノペプチダーゼ(pyroglutamate aminopeptidase、Takara社)で処理した後、エドマン分解法でN末端アミノ酸配列を解析した。
<方法> ヒトChM1Lの237-317番目の部分アミノ酸配列に、N末端にメチオニンを有するHisタグおよびFLAGタグが融合したタンパク質をコードするcDNA(配列番号5)をPCR法により増幅し、pETベクター(Novagen社)にクローニングした(pET-shChM1L)。pET-shChM1Lを大腸菌Origami B (DE3) pLysS(Novagen社)に形質転換した。大腸菌をLB培地中で1晩培養し、その一部を約3時間再培養した後、最終濃度1mMになるようにイソプロピル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside、IPTG)を添加して組換えタンパク質の発現を誘導後、さらに4時間培養した。培養液を5000×gで遠心して大腸菌をペレット化し、6 M グアニジン、 0.1 M NaH2PO4, 0.01 M トリス塩酸緩衝液 pH 8.0で可溶化後、遠心分離により不溶性画分を除去し、nickel nitrilotriacetic アガロース(Qiagen社)カラムにアプライした。カラムを8 M 尿素、 0.1 M NaH2PO4, 0.01 M トリス塩酸緩衝液 pH 8.0で洗浄し、イミダゾール濃度を徐々に上昇させたバッファーでさらに洗浄した後、200 mMイミダゾール入りのバッファーで組換えタンパク質を溶出した。溶出画分をPD-10カラム(Amersham pharmacia biotech社)にアプライし、25 mM HEPES, 0.15M NaCl, pH8.3にバッファー交換した。組換えタンパク質溶液中のエンドトキシンは、Triton X-114を用いてAidaらの方法(Aida等 ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ(Journal of Immunological Methods)(Netherlands) 1990年9月14日発行 132巻2号 p191〜195)を一部改変した以下に示す方法により除去した。組換えタンパク質溶液中に、最終濃度が1%になるようにTriton X-114を加えて、氷上で30分、37℃で10分インキュベートした後、2000×g、25℃で10分間遠心し上清を回収した。この上清に最終濃度が1%となるようにTriton X-114を加えて、上記の操作をもう一度繰り返した。PD-10カラムを1% デオキシコール酸ナトリウムで洗浄してカラム内のエンドトキシンを除去した後、ポジダインフィルター(Pole社)でエンドトキシンを除去した25 mM HEPES, 0.15 M NaCl, pH8.3に置換した後、組換えポリペプチド溶液をアプライして、残存しているTriton X-114を除去した。エンドトキシン濃度は、Limulus amebocyte lysate assay(Biowhittacker社)で測定した。タンパク質濃度は、牛血清アルブミン(BSA)をスタンダードに用いて、BCA protein assay reagent(Pierce社)で測定した。精製した組換えポリペプチドを15%ゲルでSDS-PAGEを行い、GelCode Bluestain reagent(Pierce社)で染色した。
<方法> 細胞増殖の解析はDNA合成(細胞内へのBrdUの取り込み)を指標にして行った。細胞を96穴プレートに3,000個/wellの濃度で培養し、その後、血清非存在下で24時間インキュベートした(37℃、CO2存在下)。各ウェルを洗浄後、様々な濃度のMS-ChM1Lの存在下、10 ng/mL FGF-2(繊維芽細胞増殖因子2)、10ng/mL VEGF(血管内皮増殖因子)、10ng/mL HGF(肝細胞増殖因子)、10% FBS(ウシ胎児血清)で24時間(図4B - 4E)もしくは48時間(図4A)、細胞を刺激した。BrdUは培養の最後の3時間、細胞に取り込ませた。
<方法> 24穴プレートに、Growth factor reduced Matrigel(Becton Dickinson社)を320uL/ウェルで加えて、37℃で30分間インキュベートした。EGM-2培地(Clonetics社)をEBM-2培地(Clonetics社)で1/8に希釈した培地を用いて、50,000 個/mLのHUVECsを含む細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液1mL(50,000個)に100, 25, 12.5 μg/mLの組換えMS-ChM1Lあるいはバッファー(25 mM HEPES, 0.15 M NaCl, pH8.3)を加えて、Growth factor reduced Matrigelでコートした24穴プレートにシーディングし、6時間後に管腔形成を観察して写真を撮影した。
<方法> 血管内皮細胞の遊走実験は1μg/mLのvitronectin (Sigma社) でフィルターの上層および下層をコートしたポアサイズ8mmのtranswell (Coster社)を用いて行った。すなわち、24穴プレートの各ウェルに0.1%の血清を含む培地、10ng/mLのVEGFを含む培地、もしくは10ng/mLのFGF-2を含む培地を600μLずつ加えた。プレートの各ウェルにフィルターを装着後、24時間血清非存在下で培養したヒト臍帯静脈内皮細胞(human umbilical vein endothelial cells:HUVECs、Clonetics社)を様々な濃度のMS-ChM1Lが存在する培地に懸濁し、50,000個/wellとなるようにフィルターの上層に添加した。37℃、CO2存在下で細胞を4時間インキュベートした後、フィルターを取り外し、メタノールで細胞を固定した。Diff-Quick染色液(Dade Behring社)でフィルターを染色後、綿棒でフィルターの上層の細胞を除去した。フィルターをカッターで切り取り、スライドグラスに封入後、顕微鏡下で遊走細胞数を数えた。遊走細胞数は、1視野あたりの細胞数として求めた。
<方法> 96穴プレートを1μg/mLのfibronectin(Sigma社)、1μg/mLのvitronectin(Sigma社)、1μg/mLのtype I collagen(Sigma社)でコートした。各ウェルを洗浄後、1% BSAを含むPBSでブロッキングを行った。HUVECsを1,000,000個/mLの濃度で血清を含まない培地に懸濁し、calcein AM(Molecular Probes社)で蛍光ラベルした。細胞を洗浄後、100,000個/wellとなるように各ウェルに添加し、100μg/mL の濃度になるようにMS-ChM1Lを添加した。37℃、CO2存在下で細胞を1時間インキュベートした後、各ウェルを洗浄し、蛍光プレートリーダーで蛍光強度を測定した。
<方法> 細胞周期の解析は、フローサイトメーター(flow cytometer)により細胞のDNA量をモニターすることによって行った。細胞はM期→G1期→S期→G2期→(M期)と規則的に移行していくため、DNA量を調べることによって細胞周期のどの段階にいるのか同定できる。HUVECsを10 cm ディッシュに1,000,000 個/ウェルの濃度で培養し、その後、血清非存在下で24時間インキュベートした(37℃、CO2存在下)。洗浄後、100 μg/mLのMS-ChM1Lの存在下、EGM-2培地で24時間、細胞を刺激した。Triton-X100、RNaseで細胞を処理した後、PI(propidium iodide)で染色を行い、フローサイトメーターにより解析を行った。
<方法> HUVECsを24穴プレートに培養し、その後、血清非存在下で24時間インキュベートした(37℃、CO2存在下)。洗浄後、100μg/mLのMS-ChM1Lの存在下、未刺激、もしくは10 ng/mL TNF-αで24時間、細胞を刺激した。全 RNAはRNeasy Mini Kit(Qiagen社)およびDNase Iを用いて抽出し、Omniscript RT Kit(Qiagen社)を用いた逆転写反応によりcDNAを合成した。リアルタイムPCRは、センスプライマー、アンチセンスプライマーをそれぞれ0.1μM、5μLの2×SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems社)、2μLのcDNAを含む総量10μLの反応液より行った。反応条件としては、1)変性(95℃で15秒間)、2)アニーリングおよび伸長反応(60℃で1分間)のサイクルを行った。各標的遺伝子の発現量の定量化は、GeneAmp 5700 Sequence Detection Systemソフトウェア(アプライドバイオシステムズ社)を用いて行った。
<方法> MS-ChM1Lのインビボでの血管新生抑制作用を、FGF-2誘発スポンジ血管新生モデル(Br J Pharmacol. 2000, 399, 2-3, 233-237)を用いて検討した。雄性SDラット(7週令)にサーキュラースポンジディスク(Circular sponge disk、厚さ 5 mm ×直径15 mm)を背部側皮下に移植し、翌日から1日1回3日間、ヒト組換えFGF-2(500ng/50μL/site)をスポンジ内に投与して血管新生を誘導した。MS-ChM1L(5μg/50μL/site)は1日1回3日間スポンジ内に投与した。4日目のスポンジ及び周辺組織を摘出し、肉眼観察及び組織学的な検討を実施した。
<方法> M-CSF(Macrophage colony stimulating factor)依存性の骨髄マクロファージを用いた破骨細胞の形成は、東らの方法(東等 ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of Biologocal Chemistry)(USA) 2000年2月18日発行 275巻7号 p4858〜4864 )を一部改変して実施した。7-8週令の雄ddYマウス(日本エスエルシー社)の大腿骨及び脛骨より骨髄細胞を取り出し、赤血球をバーストした後、α-MEM, 10% FBS, 100 ng/mL ヒトM-CSF(Pepro-Tech EC Ltd社)を含む培地で培養し、2回継代培養を行い、M-CSF依存的に増殖する骨髄由来のマクロファージを得た。この細胞を48ウェルプレートに10,000個/ウェルで撒きこみ、約6時間後(生着確認後)に、100 ng/mL ヒトM-CSF、50 ng/mL ヒトsRANKL(可溶性RANK ligand, Pepro-Tech EC Ltd社)及びMS-ChM1LあるいはChM-Iを添加した。5日後に酒石酸抵抗性フォスファターゼ(TRAP)染色を行った。
<方法> 9-10週令の雄ddYマウス(日本エスエルシー社)の大腿骨及び脛骨より骨髄細胞を取り出し、赤血球をバーストした後、α-MEM, 10% FBSを含む培地に懸濁し、48ウェルプレートに500,000個/ウェルで撒きこみ、24時間後に、破骨細胞の形成を誘導することが知られている1,25(OH)2D3(Nature, 2003, May 15;423(6937):337-42, Review)及びMS-ChM1LあるいはChM-Iを添加した。8日後にTRAP染色を行った。
<方法> 実施例11と同様の方法で調製したM-CSF依存性の骨髄マクロファージ細胞を96ウェルプレートに10,000個/ウェルで撒きこみ、約6時間後(生着確認後)に、100 ng/mL ヒトM-CSF、50 ng/mL ヒトsRANKL(可溶性RANK ligand, Pepro-Tech EC Ltd社)及びMS-ChM1Lを添加した。MS-ChM1Lは、Day0-5、Day0-3、Day3-5の3通りの期間で処理した。5日後に酒石酸抵抗性フォスファターゼ(TRAP)染色により破骨細胞を同定し、形成数を検討した。MS-ChM1L処理前、処理後1、3、5日に培地を取り除き、Rneasy Mini Kit(QIAGEN社)、Rnase-Free DNase Set (QIAGEN社)を用いて全 RNAを抽出した。つづいて、Omniscript RT Kit (QIAGEN社)を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。リアルタイムPCRは、SYBR-TM Green PCR Master Mix(Applied Biosystems社)及び以下に示すプライマーを用いてABI PRISM-TM 7000(Applied Biosystems社)で実施した。PrimerRodent GAPDH primerはApplied Biosystems社より購入した。
CTR
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F5'-AGGCTGGTCTTCCGAGTTCA
R5'-ACCGCTGGGAACACTCGAT
<方法> C57BL6/Jマウス(オス、6週齢)の背部皮下にB16F10細胞を500,000個/匹で移植して、3日後に腫瘍サイズを測定し群分けを行った。群分けを行った後、1日1回、MS-ChM1L(3mg/mL)またはビークル(25mM HEPES, 0.15M NaCl, pH8.3)を50μL/siteで癌細胞周辺の皮下に投与した。癌細胞の大きさを毎日キャリパー(caliper)で測定した(Length×width2×0.52)。インビトロ(in vitro)でのB16F10細胞の増殖解析はDNA合成(細胞内へのBrdUの取り込み)を指標にして行った。細胞を96穴プレートに3,000個/wellの濃度で培養し、その後、血清非存在下で24時間インキュベートした(37℃、CO2存在下)。各ウェルを洗浄後、様々な濃度のMS-ChM1Lの存在下、10% FBSで24時間細胞を刺激した。BrdUは培養の最後の3時間、細胞に取り込ませた。
<方法> C57BL6/Jマウス(オス、6週齢)にB16F10細胞を50,000個/匹で静脈内投与し、1日1回、MS-ChM1L(3mg/mL)またはビークル(25mM HEPES, 0.15M NaCl, pH8.3)を50μL/site(150μg/site)で背部皮下に投与した。移植後、21日目に肺を取り出し、顕微鏡下で転移した細胞のコロニー数を数えた。
<方法> アポトーシスの初期において細胞膜構造が変化し, 正常細胞では脂質二重膜の内側に局在するホスファチジルセリンが細胞膜の外側に露出することが知られている。したがって、アポトーシス誘導作用の解析はホスファチジルセリンに アネクチンV(Annexin V)が結合することを利用した手法を用いて行った。具体的には、human dermal micro vascular endothelial cells(HMVECs)を6穴プレートに100,000個/wellの濃度で培養し、その後、血清非存在下で24時間インキュベートした(37℃、CO2存在下)。各ウェルを洗浄後、様々な濃度のMS-ChM1Lの存在下、10 ng/mL FGF-2で細胞を刺激した。48時間後、細胞をトリプシン-EDTAで剥離し、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BioVision社)で染色後、フローサイトメーターにより解析した。
<方法> DBA1/Jマウス(オス、13週齢)からアキレス腱、眼球、腎臓、肝臓を取り出し、液体窒素で凍結した後、乳棒及び乳鉢で粉砕した。粉砕した組織を4M グアニジン、 50mM 酢酸ナトリウムpH5.8及びホモジナイザーで可溶化、超音波処理した後、15,000rpm、10分間遠心分離を行った。遠心後の上清に9倍量の100%エタノールを加え、-80℃で5分間放置した後、15,000rpmで10分間遠心分離を行った。上清を捨て、沈渣を50mM 酢酸ナトリウム pH5.8で懸濁した後、9倍量の100%エタノールを加えてさらに15,000rpmで10分間遠心分離を行った。沈渣を8M 尿素、 20mM トリス pH8.0で可溶化した。タンパク質濃度は、牛血清アルブミンンをスタンダードに用いて、BCA protein assay reagent(Pierce社)で測定した。。サンプルを35μg/laneで10-20%ゲルを用いてSDS-PAGEを行い、ニトロセルロース膜にトランスファーした。一次抗体は抗ChM1Lポリクローナル抗体(非特許文献6)、二次抗体はホースラディッシュパーオキシダーゼで標識された抗ウサギIgG抗体(Dako社)を用い、ECLplus試薬(Amersham pharmacia biotech社)により製品説明書に従って発色反応を行った。
<方法> ChM1L mRNA発現の組織特異性については、マウスの各組織からtotal RNAを抽出後、real-time PCRを行うことによって解析した。すなわち、以下に示す操作により実施した。total RNAはC57/BL6マウスの各組織からISOGEN(ニッポンジーン製)を用いて抽出後、RNeasy Mini Kit(キアゲン製)およびRNase-Free DNase Set(キアゲン製)によりクリーンアップした。cDNAの合成は、Omniscript RT Kit(キアゲン製)、RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor(インビトロジェン製)、およびRandom Primer(タカラバイオ製)を用いた逆転写反応により行った。Real-time PCRは、mouse ChM1L遺伝子に対するセンスプライマー、アンチセンスプライマー、SYBR Green PCR Master Mix、cDNAを含む反応液を用いて行った。プライマーは、mouse ChM1L mRNAの測定用として(センスプライマー)5’- AAACACTTCTGGCCCGAGGTAT-3’、(アンチセンスプライマー)5’- AGTGTGCTCCATGTCATAGGTTTTC -3’を用いた。また、mouse GAPDH mRNAの測定用のセンスプライマー、アンチセンスプライマーはアプライド バイオシステムズ株式会社から購入したものを用いた。PCR反応は、1)変性(95℃で15秒間)、2)アニーリングおよび伸長反応(60℃で1分間)の条件で40サイクルまで行った。各標的遺伝子の発現量の定量化は、GeneAmp 5700 Sequence Detection Systemソフトウェア(アプライド バイオシステムズ株式会社)を用いて行った。すなわち、増幅されたPCR産物に結合したSYBR Greenの蛍光シグナル強度をPCRサイクル毎に経時的に測定し、サイクル数に対するPCR産物の増幅曲線を作成後、この増幅曲線と任意の閾値(増幅曲線の指数増幅領域の中点付近を選択)の交わるThreshold cycle(Ct)値を算出することにより行った。内部標準であるGAPDHに対するChM1L mRNAの相対的な発現量は、以下に示す計算式によりそれぞれ算出した。
<結果> ChM1L mRNAの発現はアキレス腱において最も高かった(図19)。目、脳、肺、胸腺、横隔膜、胃、膵臓、筋肉、皮膚、肋骨においてもChM1L mRNAの発現が見られたが、アキレス腱と比べるとはるかに低かった。また、脾臓、心臓、肝臓、腎臓、小腸、脂肪組織においてChM1L mRNAの発現は検出されなかった。これらのことから、ChM1Lは腱特異的に発現していることが示唆された。
<方法> マウスの腱細胞は以下に示す操作により単離した。すなわち、マウスのアキレス腱を皮膚、筋肉、脂肪が混入しないように摘出し、2 mg/mLのコラゲナーゼを含むDMEM/10% FBS中で3時間消化した(37℃、5% CO2)。遠心後、得られた細胞ペレットをDMEM/10% FBSに懸濁し、10 cmシャーレ内で培養した(37℃、5% CO2)。7日後、培養細胞の十分な増殖が観察されたため、継代培養を行い、これをマウス腱細胞とした。
<結果> マウス腱細胞におけるChM1L mRNAの発現は、他の間葉系由来の細胞株と比べてはるかに高かった(図20)。これらのことから、ChM1Lは腱細胞特異的に発現していることが示唆された。
<方法>腫瘍血管新生に対する可溶性MS-ChM1Lの作用については、実施例14で記したB16-F10細胞を移植したマウスから癌組織を摘出後、免疫染色により血管内皮細胞を検出することによって解析した。すなわち、以下に示す操作により実施した。vehicleおよび可溶性MS-ChM1Lを投与したマウスから癌組織を摘出し、4%パラホルムアルデヒドで固定した。これらを定法によりパラフィン包埋後、切片を作成した。血管内皮細胞を検出するために、1次抗体としてrabbit anti-von Willebrand factor (vWF) Ab (CHEMICON製)、 rat anti-mouse CD34 mAb (Hycult Biotechnology製)を用いた。切片をキシレン・アルコール系列で脱パラフィン後、1次抗体、ビオチン標識2次抗体、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを添加した。最後に、3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) (Nichirei製)を加え、ヘマトキシリンで対比染色を行い、典型像について写真撮影を行った。
<方法> C57BL6/Jマウス(オス、6週齢)の背部皮下にLLC細胞(ATCC No. CRL-1642)を500,000個/匹で移植して、3日後に腫瘍サイズを測定し群分けを行った。群分けを行った後、1日1回、recombinant human MS-ChM1L(3mg/mL)またはvehicle(25mM HEPES, 0.15M NaCl, pH8.3)を50μL/siteで癌細胞周辺の皮下に投与した。癌細胞の大きさを毎日caliperで測定した(Length×width2×0.52)。in vitroでのLLC細胞の増殖解析はDNA合成(細胞内へのBrdUの取り込み)を指標にして行った。細胞を96穴プレートに3,000個/wellの濃度で培養し、その後、血清非存在下で24時間インキュベートした(37℃、CO2存在下)。各ウェルを洗浄後、様々な濃度のMS-ChM1Lの存在下、10% FBSで24時間細胞を刺激した。BrdUは培養の最後の3時間、細胞に取り込ませた。
<方法> カスパーゼはシステイン残基を活性中心に持つシステインプロテアーゼで、アポトーシスではキーとなるメディエーターであることが知られている。カスパーゼを介したアポトーシス誘導作用の解析はCaspACE FITC-VAD-FMK In Situ Marker(Promega製)を用いて実施した。CaspACE FITC-VAD-FMK In Situ Markerは細胞透過性のFITC標識カスパーゼ阻害剤VAD-FMK(FITC-VAD-FMK)で、細胞の内外を自由に移動でき、活性化カスパーゼに不可逆的に結合することにより、アポトーシス細胞にのみ留まることが知られている。したがって、カスパーゼを介してアポトーシスを起こしている細胞は、フローサイトメーターによる解析でFITCの蛍光強度が強く観察される。6穴プレートにHUVECsを155,000個/wellの濃度で、MRC-5 cells(理化学研究所バイオリソースセンター No. RCD02111)を100,000個/wellの濃度でそれぞれ培養し、その後、血清非存在下で24時間インキュベートした(37℃、CO 2 存在下)。各ウェルを洗浄後、25μg/mLのMS−ChM1Lの存在下、10ng/mL FGF−2で細胞を刺激した。48時間後、10μMとなるようにFITC-VAD-FMKを添加し、30分間インキュベートした(37℃、CO 2 存在下)。細胞をトリプシン−EDTAで剥離し、フローサイトメーターにより解析した。
<方法> ヒトChM-IのN末端にメチオニン、6残基のヒスチジン(Hisタグ)およびFLAGタグが融合したタンパク質をコードするcDNA(配列番号7)をPCR法により増幅し、pETベクター(Novagen社)にクローニングした(pET-shChM-I)。pET-shChM-Iを大腸菌OrigamiB (DE3) pLysS(Novagen社)に形質転換した。大腸菌をLB培地中で1晩培養し、その一部を約3時間再培養した後、最終濃度1mMになるようにIPTGを添加して組換えタンパク質の発現を誘導後、さらに4時間培養した。培養液を5000×gで遠心して大腸菌をペレット化し、6 M グアニジン、0.1 M NaH2PO4, 0.01 M トリス塩酸緩衝液 pH 8.0で可溶化後、遠心分離により不溶性画分を除去し、nickel nitrilotriacetic アガロース(Qiagen社)カラムにアプライした。カラムを8 M 尿素、 0.1 M NaH2PO4, 0.01 M トリス塩酸緩衝液 pH 8.0で洗浄し、イミダゾール濃度を徐々に上昇させたバッファーでさらに洗浄した後、200 mMイミダゾール入りのバッファーで組換えタンパク質を溶出した。溶出画分をPD-10カラム(Amersham pharmacia biotech社)にアプライし、25 mM HEPES, 0.15 MNaCl, pH8.3にバッファー交換した。組換えタンパク質溶液中のエンドトキシンは、Triton X-114を用いてAidaらの方法(Aida等 ジャーナル・オブ・イミュノロジカル・メソッズ(Journal of Immunological Methods)(Netherlands) 1990年9月14日発行 132巻2号 p191〜195 )を一部改変した以下に示す方法により除去した。組換えタンパク質溶液中に、最終濃度が1%になるようにTriton X-114を加えて、氷上で30分、37℃で10分インキュベートした後、2000×g、25℃で10分間遠心し上清を回収した。この上清に最終濃度が1%となるようにTriton X-114を加えて、上記の操作をもう一度繰り返した。PD-10カラムを1% デオキシコール酸ナトリウムで洗浄してカラム内のエンドトキシンを除去した後、ポジダインフィルター(Pole社)でエンドトキシンを除去した25 mM HEPES, 0.15 M NaCl, pH8.3に置換した後、組換えChM-Iタンパク質溶液をアプライして残存しているTriton X-114を除去した。エンドトキシン濃度は、Limulus amebocyte lysate assay(Biowhittacker社)で測定した。タンパク質濃度は、牛血清アルブミンをスタンダードに用いて、BCA protein assay reagent(Pierce社)で測定した。精製した組換えChM-Iタンパク質を15%ゲルでSDS-PAGEを行い、GelCode Bluestain reagent(Pierce社)で染色した。
Claims (16)
- 配列番号9に記載のアミノ酸配列、又は配列番号9に記載のアミノ酸配列と少なくとも90%以上の同一性を持つアミノ酸配列からなり、血管新生抑制活性及び/又は骨吸収抑制活性を有する、可溶性ポリペプチド。
- 可溶性ポリペプチドのN末端に、グルタミン又はピログルタミンがさらに付加されてなる、請求項1に記載の可溶性ポリペプチド。
- 可溶性ポリペプチドのN末端及び/又はC末端に、連続した6から8個のヒスチジンタグ配列及び/又はFLAGタグ配列からなるアミノ酸配列がさらに付加されてなる、請求項1又は2に記載の可溶性ポリペプチド。
- 可溶性ポリペプチドのN末端及び/又はC末端に、オワンクラゲ由来蛍光タンパク質、又は分泌型アルカリフォスファターゼのアミノ酸配列がさらに付加されてなる、請求項1又は2に記載の可溶性ポリペプチド。
- 請求項1から4の何れかに記載の可溶性ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子。
- ヌクレオチド配列が、配列番号3に記載のヌクレオチド配列である請求項5に記載の核酸分子。
- 請求項5又は6に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項7のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項8の形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び生成されたポリペプチドを回収する工程を含む、請求項1〜4の何れかに記載の可溶性ポリペプチドの製造方法。
- タンパク質変性剤の存在下で形質転換された宿主細胞からポリペプチドを含む抽出液を回収する工程を含む、請求項9に記載の可溶性ポリペプチドの製造方法。
- 宿主細胞から回収された抽出液をTritonX−114で処理した後に遠心分離処理を行って発熱物質を除去する工程を含む、請求項9又は10に記載の可溶性ペプチドの製造方法。
- 宿主細胞からポリペプチドを含む抽出液の回収以降のすべての工程において、該ポリペプチドを含む溶液のpHをpH8.0から8.5の範囲に調整することを特徴とする、請求項9〜11の何れかに記載の可溶性ポリペプチドの製造方法。
- 請求項1から4の何れかに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
- 医薬組成物が、血管新生抑制剤及び/又は破骨細胞活性化抑制剤である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 請求項1又は2に記載の可溶性ポリペプチドを認識する抗体を含む、被験者から採取された生体試料中の配列番号9に記載のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドを測定するための診断用組成物。
- 請求項5又は6に記載の核酸分子を含むように遺伝子操作を受けたトランスジェニック非ヒト動物。
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