JP5555176B2 - 医薬組成物及びその使用方法 - Google Patents

Description

（関連出願の説明）
この出願は、発明の名称「血管形成および炎症に関連した病気を治療するための組成および方法」として２００７年１２月２４日に出願された、米国特許出願第１１／９６３，９１２の優先権を主張するものである。なお、この米国特許出願は、Ｃｈｉｗｅｎ Ｃｈａｎｇによる発明の名称「血管形成および炎症の阻害剤としての可溶性ＣＤ２６の使用」として２００５年８月１８日に出願された、継続中の米国特許出願第１１／２０８，２８８の一部継続出願であり、その優先権を主張するものである。そして、上記出願の開示はその全てを参照して、本出願に含まれる。米国特許出願第１１／２０８，２８８は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の規定によって、２００４年８月２６日に出願された米国仮出願第６０／６０５，０１３の優先権を主張するものであり、その全てを参照して、本出願に含まれるものである。

本発明は、一般的に、血管形成および炎症性サイトカインの阻害に関し、より具体的には、血管形成および炎症に関連した病気または疾患を治療するための医薬組成物に関する。

血管形成は、既存の血管から生じることによる、新しい血管の形成である（Weinstate-Saslow, The FASEB Journal ８：４０２−４０７，１９９４年； Folkmanら, Science ２３５：４４２−４４７,１９８７年）。新しい血管の形成は、血管内皮細胞の組織内への遊走、そしてそれに続く、そのような内皮細胞の血管内への濃縮を含む、多段階プロセスを伴う。血管形成は、血管形成剤によって誘発され得るもの、または自然な状態の結果であるかもしれない。その過程は、胚着床；胚形成および成長；ならびに創傷治癒のような、様々な標準的な普通の身体活動に不可欠なものである。その過程は、内皮細胞や毛細血管の初代細胞の成長および遊走を、刺激する分子および阻害する分子の複雑な相互作用を伴う（Folkman and Shing, J. Biol. Chem., ２６７（１６）：１０９３１−３４，１９８９年； Folkman and Klagsbrun, Science, ２３５，４４２−４７，１９８７年）。

いくつかの血管形成剤が確認されている（Hanahan and Folkman, Cell, ８６（３）：３５３−３６４，１９９６年）。例えば、血管形成する内皮細胞を促進／活性化する多くの成長因子が確認された。これらは、例として、そして制限するものとしてではなく、次のものを含む；すなわち、血管内皮細胞増殖（成長）因子（ＶＥＧＦ）；形質転換増殖因子（ＴＧＦβ）；酸性および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）；および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）である（Ferrara and Davis-Smyth, Endocr Rev. １８（１）：４−２５，１９９７年）。ＶＥＧＦは、血管形成の主要な仲介物質（メディエーター）であると信じられている。ＶＥＧＦに直接的に抗する抗体は、インビボで、腫瘍増殖を抑制すること、および実験的腫瘍において血管の密度を減少させることが示され（Kimら, Nature ３６２：８４１−８４４，１９９３年）、ＶＥＧＦ拮抗剤は、腫瘍誘発血管形成の阻害剤として治療的適用し得ることを示した。

通常の血管形成活性は、健康な成人では低く、そして、妊娠期間中の子宮または激しく運動している骨格筋のようなある特定の器官に限定されている。しかしながら、血管形成活性は、損傷および癌、網膜症または関節炎のような病気の罹患中に増加し、それは病的変化の一因となる。それゆえ、血管形成は、創傷治癒を促進するような有益な効果と、例えば関節リウマチ、黄斑変性症、乾癬および糖尿病性網膜症のような炎症性疾患を引き起こす有害な効果の両方の効果を持ち得る。

さらに、血管形成は固形腫瘍の成長および腫瘍の転移にとって不可欠であることが示された（Bouckら、Adv Cancer Res.；６９：１３５−７４，１９９６年； Yancopoulosら、Nature ４０７（６８０１）：２４２−８，２０００年）。腫瘍によって誘発される血管形成は、腫瘍から、または炎症細胞浸潤から放出される成長因子およびサイトカインによって開始される（Brownら、Am. J. Path. １４３：１２５５，１９９３年； Brownら、Human Path. ２６：８６，１９９５年； Leekら、J. Leukocyte Biol. ５６：４２３，１９９４年； Hatvaら、Am. J. Path. １４６：３６８，１９９５年；およびPlateら、Nature ３５９：８４５，１９９２年）。腫瘍細胞によって発現される成長因子およびサイトカインは、ヒヨコ絨毛尿膜モデルを含む多くの動物モデル、角膜ポケット血管形成モデル、および野生を含むモデルで血管形成を刺激し、ならびに異種移植された腫瘍の成長を刺激する（Brooksら、Cell ７９：１１５７，１９９４年； Brooksら、Science ２６４：５６９，１９９４年； Brooksら、J. Clin. Invest. ９６：１８１５，１９９５年；およびFriedlanderら、Science ２７：１５００，１９９５年）。したがって、血管形成は腫瘍の成長だけではなく腫瘍の転移に関係しているため、腫瘍関連血管形成は、腫瘍増殖、浸潤および転移を阻害する治療のための潜在的な標的である（Liottaら、Cell ６４：３２７，１９９１年； Weinstat-Saslowら、FASEB J ８：４０１，１９９４年；Bloodら、Biochim、Biophys. Acta １０３２：８９，１９９０年； Folkman、Semin. Cancer Biol. ３：６５，１９９２年；およびWeidnerら、N. Engl. J. Med. ３２４：１，１９９１年）。

血管形成は、さまざまな病気または疾患に関与し、そのような病気または状態を血管形成阻害薬の投与によって治療され得ることは、よく認識されていた。血管形成が関与する病的な状態の例は、次のものを含むがこれらに制限されない。その例として、黄斑変性症、眼球の血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、角膜移植拒絶反応、ビタミンＡ欠乏症、Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ病、酒さ、マイコバクテリウム感染症、細菌性および真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、全身性狼瘡、関節リュウマチ、変形性関節症、乾癬、慢性炎症性疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ Ｒｅｎｄｕ病のような遺伝病、および出血性の毛細血管拡張症が挙げられる。

これらの病気または状態を治療する目的で、多くの血管形成阻害薬が発見された。例として、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）（O'Reillyら、Cell ８８：２７７，１９９７年）、アンギオスタチン（O'Reillyら、Cell ７９：３１５，１９９４年）、ペプチドＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ（Arapら、Science ２７９：３７７，１９９８年）、環状ペプチドＲＧＤｆＶ（Friedlanderら、Science ２７０：１５００，１９９５年）、ならびにモノクローナル抗体ＬＭ６０９およびＰ１Ｆ６（Friedlanderら、Science ２７０：１５００，１９９５年）を含む。これらの薬は、前記病気の発症に関連付けられる、または関与する他の付加的な発症機序を処置することなく、前記病気の血管形成の側面のみを標的としているように思われる。

Weinstate-Saslow, The FASEB Journal ８：４０２−４０７，１９９４年 Folkmanら, Science ２３５：４４２−４４７,１９８７年 Folkman and Shing, J. Biol. Chem., ２６７（１６）：１０９３１−３４，１９８９年 Folkman and Klagsbrun, Science, ２３５，４４２−４７，１９８７年 Hanahan and Folkman, Cell, ８６（３）：３５３−３６４，１９９６年 Ferrara and Davis-Smyth, Endocr Rev. １８（１）：４−２５，１９９７年 Kimら, Nature ３６２：８４１−８４４，１９９３年 Bouckら、Adv Cancer Res.；６９：１３５−７４，１９９６年 Yancopoulosら、Nature ４０７（６８０１）：２４２−８，２０００年 Brownら、Am. J. Path. １４３：１２５５，１９９３年 Brownら、Human Path. ２６：８６，１９９５年 Leekら、J. Leukocyte Biol. ５６：４２３，１９９４年 Hatvaら、Am. J. Path. １４６：３６８，１９９５年 Plateら、Nature ３５９：８４５，１９９２年 Brooksら、Cell ７９：１１５７，１９９４年 Brooksら、Science ２６４：５６９，１９９４年 Brooksら、J. Clin. Invest. ９６：１８１５，１９９５年 Friedlanderら、Science ２７：１５００，１９９５年 Liottaら、Cell ６４：３２７，１９９１年 Weinstat-Saslowら、FASEB J ８：４０１，１９９４年 Bloodら、Biochim、Biophys. Acta １０３２：８９，１９９０年 Folkman、Semin. Cancer Biol. ３：６５，１９９２年 Weidnerら、N. Engl. J. Med. ３２４：１，１９９１年 O'Reillyら、Cell ８８：２７７，１９９７年 O'Reillyら、Cell ７９：３１５，１９９４年 Arapら、Science ２７９：３７７，１９９８年

それゆえに、前記の欠如および不足に対して技術的に対処するため、特に、癌、炎症性疾患および／または血管形成に関連した病気を治療するための薬剤候補の識別方法に関連付けられる、これまで取り組まれていない要求が存在する。

本発明の一側面は、そこから利益を得るであろう哺乳類の被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）における、ＶＥＧＦ関連血管形成および／または炎症性サイトカイン関連炎症に関連付けられる病気を治療する医薬組成物に関し、その医薬組成物は：（ａ）治療に有効な量のｓＣＤ２６；（ｂ）治療に有効な量のｓＦｌｔ−１；および（ｃ）製薬的に受容できる担体、を含有する。本発明の一実施形態において、炎症性サイトカインは、Ｘがアミノ酸で、Ｐがプロリンである、Ｎ−末端モチーフＸＰを含んでいる。例えば、サイトカインはＩＬ−２であり得る。

本発明の他の側面は、細胞でのＶＥＧＦおよび／または炎症性サイトカインの生物活性を阻害する組成物に関し、その組成物は：（ａ）有効量のｓＣＤ２６；および（ｂ）有効量のｓＦｌｔ−１を含有している。

本発明の一実施形態において、その細胞は、ＶＥＧＦおよび／または炎症性サイトカインの生物活性の阻害からの利益を得るであろう哺乳類の被験体に存在する。本発明の他の実施形態において、哺乳類の被験体は、ＶＥＧＦおよび／または炎症性サイトカインの生物活性に関連付けられる、および／または該生物活性によって進行させられる病気に苦しんでいる。本発明の一実施形態において、その病気は増加したインターロイキン活性に関連している。例えば、その病気は、増加したＩＬ−２活性に関連付けられ得る。

本発明の他の側面は、そこから利益を得るであろう哺乳類の被験体における、炎症性サイトカインの生物活性に関連付けられる、および／または該生物活性によって進行させられる病気を治療する医薬組成物に関し、その医薬組成物は：（ａ）治療に有効な量のｓＣＤ２６；（ｂ）治療に有効な量のｓＦｌｔ−１；および（ｃ）製薬的に受容できる担体、を含有する。

本発明の一実施形態において、その病気は腫瘍および炎症性疾患からなる群から選択される。当該炎症性疾患は、関節リウマチ、黄斑変性症、乾癬および糖尿病性網膜症を含み得る。当該腫瘍性疾患は、固形腫瘍、腫瘍進行、腫瘍転移および血管形成前（ｐｒｅｖａｓｃｕｌａｒ ｐｈａｓｅ）の潜伏性腫瘍を含み得る。

本発明のさらに他の側面は、（ａ）治療に有効な量のｓＣＤ２６；（ｂ）治療に有効な量のｓＦｌｔ−１；および（ｃ）製薬的に受容できる担体、を含有する医薬組成物に関する。

本発明の他の側面は、ＶＥＧＦ関連血管形成および／または炎症性サイトカイン関連炎症に関連付けられる病気を治療する方法に関する。その方法は、そこから利益を得るであろう哺乳類の被験体に、（ａ）治療に有効な量のｓＣＤ２６；（ｂ）治療に有効な量のｓＦｌｔ−１；および（ｃ）製薬的に受容できる担体、を含有する医薬組成物を投与するステップ（段階）を含んでいる。

本発明のさらに他の側面は、細胞でのＶＥＧＦおよび／または炎症性サイトカインの生物活性を阻害する方法に関する。その方法は、細胞に、（ａ）有効量のｓＣＤ２６；および（ｂ）有効量のｓＦｌｔ−１、を含有する組成物を投与するステップを含んでいる。

本発明のさらにまた他の側面は、そこから利益を得るであろう哺乳類の被験体における、炎症性サイトカインの生物活性に関連付けられる、および／または該生物活性によって進行させられる病気を治療する方法に関する。その方法は、その被験体に、（ａ）治療に有効な量のｓＣＤ２６；（ｂ）治療に有効な量のｓＦｌｔ−１；および（ｃ）製薬的に受容できる担体、を含有する医薬組成物を投与するステップを含んでいる。

本開示の新概念の精神および範囲から逸脱しない範囲で、ここに示されるものの変形および変更が影響され得るけれども、これらのおよび他の側面は、以下の図面と結び付けて、次に示される好ましい実施形態の記載から明らかになるであろう。

添付した図面は、本発明の一つまたはそれ以上の実施形態を例示し、そして明細書の記載と共に本発明の原理を説明する働きをする。可能な限り、実施形態の同じまたは同様の要素を参照するための図面において、同じ参照番号が使用される。

図１は、脱落膜（ｄｅｃｉｄｕａｌ）白血球によって生産されたＶＥＧＦの検出に対する、栄養膜（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）共培養または栄養膜培養上清（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）の効果を説明する図である。レーン１：白血球のみ；レーン２：白血球＋栄養膜；レーン３：白血球＋ＪＥＧ；レーン４：白血球＋栄養膜上清（上澄み）。 図２Ａは、特異的にｓＦｌｔ−１に抗する抗体によって検出される、栄養膜培養上清のウエスタンブロット分析の結果を説明する図である。レーン１：栄養膜培養上清；レーン２：１ｎｇのｓＦｌｔ−１；レーン３：１０ｎｇのｓＦｌｔ−１。 図２Ｂは、栄養膜細胞培養上清中のｓＦｌｔ−１のエライザ（ＥＬＩＳＡ）検出の結果を説明する図である。レーン１：栄養膜培養上清；レーン２：培地のみ。 図３Ａは、ＶＥＧＦエライザ分析において、様々な量のｓＦｌｔ−１でインキュベーションした後のＶＥＧＦの検出濃度を説明する図である。ＶＥＧＦとのインキュベーションで使用されたｓＦｌｔ−１の量は、レーン１〜６のそれぞれが１０，３，１，０．３，０．１および０ｎｇである。 図３Ｂは、ＨＵＶＥＣｓのＶＥＧＦ依存増殖が、ｓＦｌｔ−１でのＶＥＧＦの前処理によって消失することを説明する図である。ＨＵＶＥＣｓは、基礎培地のみ（レーン１）、ＶＥＧＦ含有培地（レーン２）、ｓＦｌｔ−１処理されたＶＥＧＦ含有培地（レーン３）、または抗ＶＥＧＦ抗体処理されたＶＥＧＦ含有培地（対照、レーン４）、で培養された。 図４は、栄養膜培養上清中で、胎盤ｓＣＤ２６の存在を確認するためのステップを説明する図である。 図５Ａは、膜結合性ＣＤ２６および可溶性ＣＤ２６、ならびに可溶性ＣＤ２６によるＸＰモチーフの認識を説明する概略図である。 図５Ｂは、ＩＬ−２がモチーフＸＰを含有することを説明する図である。 図６は、ＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激において、ＩＬ−２活性が、ｓＣＤ２６での前処理によって消失することを説明する図である。細胞株ＣＴＬＬ−２が、ＩＬ−２含有培地（レーン１）、ＩＬ−２無し培地（レーン２）、またはｓＣＤ２６前処理されたＩＬ−２含有培地（レーン３）、で培養された。 図７は、エライザでの、妊婦からの血清によるＶＥＧＦの中和を説明する図である。 図８Ａは、各々の試験群での、５検体の血清試料からのｓＦｌｔ−１の平均量を説明する図である：妊婦（レーン１）、非妊娠女性（レーン２）および男性（レーン３）。 図８Ｂは、妊娠２０週（レーン１）、妊娠３０週（レーン２）および出産後１０週（レーン３）の、妊婦の血清中のｓＦｌｔ−１濃度（レベル）を説明する図である。

本明細書中で使用される用語は、本発明の文脈の中で、および各用語が使用される具体的な文脈中で、一般的に、技術上の通常の意味を有している。本発明を記述するために使用される特定の用語は、本発明の記載に関する実行者に追加の案内を提供するために、以下に、または本明細書の他の場所に記載されている。便宜のために、特定の用語は、例えば、イタリック体および／または引用符を使用して強調されているかもしれない。強調表示の使用は、用語の範囲および意味に何ら影響を与えない；用語の範囲および意味は、強調されているか否かにかかわらず、同じ文脈の中では同じである。同じことが二つ以上の方法で述べられ得ることが理解されるであろう。したがって、別の言語および同義語が、ここで論じられるどの一つまたはそれ以上の用語ために使用され得、そして、ここで用語が詳述される、または論じられるか否かにかかわらず、いかなる特別に重要な意味も課せられていない。特定の用語のために同義語が提供される。一つ以上の同義語の詳述は、他の同義語の使用を除外しない。ここで論じられるどの用語例も含めて、本明細書中のどこにおいてもその使用例は一例にすぎず、本発明の、または例示された用語の範囲および意味を決して制限しない。同様に、本発明は、本明細書中で示された種々の実施形態に限定されない

別段の定義がない限り、ここで使用されるすべての専門用語および科学用語は、本発明に関係する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有している。矛盾する場合には、定義を含めて本文書が制御する。

ここにおいては、「およそ」、「約」または「おおよそ」は、一般に、与えられた値または範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。ここで与えられる数量は概算であり、特に述べられない限り、用語「およそ」、「約」または「おおよそ」が推論されることを意味する。

ここにおいては、「ＶＥＧＦＲ１」、「ｓＶＥＧＦＲ１」または「ｓＦｌｔ−１」は、タンパク質、ペプチドもしくはポリペプチド受容体、選択的に接合（スプライス）された型、またはその生物学的に活性な誘導体を意味し、血管内皮増殖因子受容体タイプ１（Ｆｌｔ）活性、例えば、血管内皮増殖因子を結合する能力を有する。ｓＦｌｔ−１ポリペプチドの生物活性は、どの様な標準法を使用しても、例えば、ＶＥＧＦに結合しているｓＦｌｔ−１の分析によっても分析され得る。可溶性Ｆｌｔ−１は、Ｆｌｔ−１受容体の膜貫通領域および細胞質チロシンキナーゼ領域を欠いている。可溶性Ｆｌｔ−１は、高親和性で、ＶＥＧＦとＰｌＧＦに結合できるが、増殖または血管形成を誘発することはできず、そのために、機能上、Ｆｌｔ−１およびＫＤＲ受容体と異なっている。ここにおいては、Ｆｌｔ−１は、どんなＦｌｔ−１ファミリーメンバーまたはアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）も含む。可溶性Ｆｌｔ−１は、Ｆｌｔ−１受容体の酵素開裂から生じ、そしてＦｌｔ−１生物活性を維持する、分解生成物または断片（フラグメント）もまた意味し得る。可溶性Ｆｌｔ−１は、ＶＥＧＦ機能を無効にするために使用することができる

ここにおいては、用語「ｓＦｌｔ−１の生物学的に活性な誘導体」とは、ヒトｓＦｌｔ−１から修飾された（変性された）アミノ酸配列を有する、生物学的に活性なタンパク質またはペプチド断片をいうものとする。

ここにおいては、用語「ヒトｓＦｌｔ−１」は、ヒト起源のｓＦｌｔ−１のアミノ酸配列を有する、生物学的に活性なタンパク質またはペプチド断片をいうものとする。

ここにおいては、「可溶性ＣＤ２６」または「ｓＣＤ２６」は、ＤＰＰＩＶ酵素活性を持つタンパク質、ペプチド、選択的に接合（スプライス）された型、またはその生物学的に活性な誘導体をいうものとする。ＣＤ２６の可溶型は、プロリンまたはアラニン残基で、最後から２番目の位置でポリペプチドからＮ−末端ジペプチドを開裂することができる。ｓＣＤ２６の酵素活性は、通常、市販の化学的に合成された基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ニトロアニリン（Sigma、カタログ番号 Ｇ２９０１）の消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって分析される。

ここにおいては、用語「ｓＣＤ２６の生物学的に活性な誘導体」は、ヒトｓＣＤ２６から修飾された（変性された）アミノ酸配列を有する、生物学的に活性なタンパク質またはペプチド断片をいうものとする。

ここにおいては、用語「ヒトｓＣＤ２６」は、ヒト起源のｓＣＤ２６のアミノ酸配列を有する、生物学的に活性なタンパク質またはペプチド断片をいうものとする。

ここにおいては、用語「ＶＥＧＦの中和」は、ＶＥＧＦがその受容体と結合するのを阻止し、その結果、ＶＥＧＦ依存細胞増殖のようなＶＥＧＦ活性を消失することをいうものとする。

ここにおいては、「哺乳類の被験体」は、哺乳類の動物および人間を含む。

本発明の範囲を制限することを意図するものではないが、本発明の実施形態に係る例示の機器、装置、方法およびそれらに関連した結果を以下に示す。題または副題は、読者の便宜のために例として使用され得るものであり、決して本発明の範囲を制限するものではないことに留意すべきである。さらに、ここに特定の理論が提案および開示される；しかしながら、それらの正否にかかわらず、どの様な特定の理論または実行計画であるかを問わず、本発明が本発明に従って実行される限り、それらは決して本発明の範囲を制限するものではない。

物質および方法
組織試料が、Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅｓ病院（ケンブリッジ、英国）からの、妊娠第１期（妊娠第１三半期）の選択的中絶から入手された。

脱落膜白血球の単離
妊婦の脱落膜白血球の調製は、キングら（Hum. Immunol., ２４（３）；１９５−２０５、１９８９年）によって述べられている方法をわずかに修正して実行された。脱落組織の試料は、肉眼的試験によって選別され、外科用ナイフ（ブレイド）で小片に刻まれる前に、１０−２０分間、冷ＲＰＭＩ１６４０（Invitrogen、米国、カタログ番号 ２１８７５−０３４）中で洗浄された。約１０ｇの刻まれた組織が、３７℃下、３０分間、回転インキュベーターにより、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Harlan Sera-Lab, 英国、カタログ番号 Ｓ−０００１Ａ）、２ｍＬのコラゲナーゼ（１０μｇ／ｍＬ、Sigma, 米国、カタログ番号 Ｃ５１３８）、および０．５ｍＬのデオキシリボヌクレアーゼＩ（３μｇ／ｍＬ、Sigma Ｄ５０２５）を含む、２５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０中で、消化された。試料管が短時間遠心分離され、数片の組織のペレット（沈殿物）を得て、細胞を含有する上清が１００μｍフィルター（Becton Dickinson、米国、カタログ番号 ３５２３６０）を通してろ過された。フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）が、細胞をペレット化（沈殿）するために、６５０×ｇで５分間遠心分離された。さらに組織を分割するために、上清が、数回１０ｍＬのピペットを通された組織に戻された。その混合物は、３７℃でさらに１０分間インキュベートされた。試料管はそれから、短時間遠心分離され、組織のペレット（沈殿物）を得て、上清が１００μｍフィルターを通してろ過された。ろ過された上清が、細胞をペレット化（沈殿）するために、６５０×ｇで５分間遠心分離された。その細胞ペレットは、ヒト単核細胞（Axis-Shield Diagnostics、ノルウェー、カタログ番号 １１１４５４５）の精製に適した、既製の、殺菌済みの、そして内毒素検査された溶液である、１５ｍＬのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ^ＴＭの上を覆うように加えられる前に、２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）および０．１％アジドを含む、１５ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, ｐ４．２．３、１９９６年）に再懸濁された。その試料管は、制動無しに７１０×ｇで２０分間遠心分離され、細胞は界面に集められ、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳ）で洗浄された。この方法で調製された脱落膜白血球は、約６０％のナチュラルキラー細胞（ＣＤ５６^＋，ＣＤ１６⁻）、１５−２０％のマクロファージ（ＣＤ１４^＋）、１０％のＴ細胞および他の間質細胞からなっていた。

胎児栄養膜細胞の単離
胎盤組織の断片が肉眼的に確認され、ＲＰＭＩ１６４０培地で数分間洗浄された。その組織は外科用メスの刃でこすり落とされ、次に、０．０２％のＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有する、２０ｍｌの前加熱された（３７℃）０．２５％トリプシン（Becton Dickinson、米国、カタログ番号 ２１５２４０）溶液中で、８−９分間、ホットプレート上で攪拌しながら消化された。２０ｍＬのＨＡＭＳ Ｆ１２（LIFE Technologies、米国、カタログ番号 ０７４−９０５８７）（２０％ＮＣＳ（Invitrogen、米国、カタログ番号 １６０１０−１６７））が、トリプシン処理を停止させるためにその溶液に添加された。つづいて、その溶液はガーゼを通してろ過され、細胞をペレット化（沈殿）するために、５０ｍＬ管、４５０×ｇで遠心分離された。その細胞ペレットは１０ｍＬのＨＡＭＳ Ｆ１２中で再懸濁され、その細胞溶液は、ヒト単核細胞（Axis-Shield Diagnostics、ノルウェー、カタログ番号 １１１４５４５）の精製に適した、既製の、殺菌済みの、そして内毒素検査された溶液である、１０ｍＬのＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ^ＴＭの上を覆うように加えられ、２０分間、７１０×ｇで遠心分離された。界面の細胞は回収され、１０ｍＬのＨＡＭＳ培地で一度洗浄された。胎盤マクロファージを使い果たすために、その細胞ペレットは３ｍＬのＨＡＭＳ中に再懸濁され、ペトリ皿の上に播種され、そして３７℃で２０分間インキュベートされた。上清中の胎児栄養膜細胞は、６００×ｇで５分間の遠心分離により回収された。

胎児栄養膜細胞培養上清の濃度
上記のようにして単離した胎児栄養膜細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０培地＋１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中、１×１０^６細胞／ｍＬ濃度、３７℃で一晩培養された。その上清は回収され、細胞残屑をペレット化（沈殿）するために、遠心ろ過装置ＣＥＮＴＲＩＣＯＮＲ（Millipore, YM-10）に装着される前に１０００×ｇで５分間遠心分離され、そして、２０００ｒｐｍで約１時間遠心分離された。その容積は、通常、１０倍濃度の上清を得るために、原容積の１：１０（１／１０）に減少させられた。

実施例１
脱落膜白血球によって隠されたＶＥＧＦの検出を阻害した胎盤栄養膜細胞の共培養
胎盤栄養膜細胞との脱落膜白血球の共培養
脱落膜白血球および胎盤栄養膜細胞が、上記のようにして単離された。ＲＰＭＩ−１６４０（１０％ＦＣＳ）培地中で培養された、栄養膜（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）腫瘍細胞株ＪＥＧが、陰性対照として使用された。１００μＬの白血球（３×１０^６細胞／ｍＬ）が、１００μＬの単離された栄養膜有り、もしくは無しで、または陰性対照細胞ＪＥＧ（１×１０^６細胞／ｍＬ）有りで、９６ウェル型Ｕ底プレートのそれぞれのウェルに播種された。一晩のインキュベーションの後、培養上清が採取され、後のエライザ（ＥＬＩＳＡ）分析のために−７０℃で貯蔵された。貯蔵された各々１００μＬの上清が解凍され、製造者の取扱説明書に従って、ＶＥＧＦエライザ分析（Ｒ＆Ｄ、米国、カタログ番号 ＤＹ２９３）に使用された。

図１は分析結果を示す：レーン１は、脱落膜白血球によって産生され、ＶＥＧＦエライザ分析によって培養上清中に検出されたＶＥＧＦの濃度を示す。レーン２は、脱落膜白血球が同じ皿（ｄｉｓｈ）で、単離された栄養膜と共に共培養されたときの、培養上清中のＶＥＧＦの消失を示す。陰性対照として、レーン３は、脱落膜白血球が細胞株ＪＥＧと共に共培養されたときの、ＶＥＧＦの存在を説明している。ＪＥＧ共培養は同じ効果を生じさせないので、ＶＥＧＦ検出の阻害は共培養それ自体によって誘発された作為的な結果ではないことを、これらのデータは示している。その代わりに、それは、単離された栄養膜との共培養に特異的に起因するものである。ＶＥＧＦの検出に対するこの栄養膜の効果は、また、栄養膜のみの細胞培養からの培養上清を添加することによっても、繰り返すことができた。分析結果は、数種類の可溶性因子が栄養膜による培養上清中に隠され、エライザ分析でのＶＥＧＦ検出の破壊を引き起こす可能性があることを示した。

実施例２
栄養膜細胞培養の上清中での胎盤可溶性Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦｌｔ１）の検出
ｓＦｌｔ−１、それは最初にヒトの臍帯内皮細胞から精製されたものであるが、それは、インビボ（生体内）で栄養膜細胞によって産生されることが知られている。一例として、胎盤から放出された特定のメタロプロテイナーゼは、Ｆｌｔ−１のＮ末端部分を血液循環中に放出させるために、Ｆｌｔ−１受容体の細胞外領域を開裂するかもしれない。Ｆｌｔ−１の可溶型（すなわちｓＦｌｔ−１）は末梢血中で検出することができ、それはＶＥＧＦに対して高親和性を持つ配位子である。ｓＦｌｔ−１は、栄養膜共培養によって培養上清中に隠された因子であるのかどうか、そして、図１に示すＶＥＧＦ検出の破壊を引き起こすのかどうか、を調べるために、次の実験が行われた。

ウエスタンブロット分析
２０μＬの栄養膜上清または純粋なｓＦｌｔ−１（Ｒ＆Ｄ Systems、カタログ番号 ３２１−ＦＬ）が、染料を取り込んだ４μＬの６ＸＳＤＳゲルと混合され、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad、カタログ番号 １６１−１１０１）中に取り込まれる前に、５分間沸騰された。ゲル化は１００Ｖで１．５時間行われ、１００Ｖで１時間、ＰＶＤＦ膜上にブロットされた。そのブロット（ｂｌｏｔ）は、０．１μｇ／ｍＬポリクローナルヤギ抗ｓＦｌｔ−１抗体（Ｒ＆Ｄ Systems、カタログ番号 ＡＦ３２１）を含有する、１０％ミルク／ＴＢＳＴ緩衝液中、室温で２時間インキュベートされた。ＴＢＳＴ緩衝液中で３回洗浄した後、第２抗体、ウサギ抗ヤギＨＲＰ接合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体（Dako Cytomation、カタログ番号 Ｐ０４９９）が、１０％ミルク／ＴＢＳＴ中、１：２０００の希釈度で１時間、ブロットで使用された。３回洗浄後、バンドが、製造者の取扱説明書に従って、ＥＣＬキット（GE Healthcare、カタログ番号 ＲＰＮ２１０６）を使用して検出された。

図２Ａは、抗ｓＦｌｔ−１抗体を使用して示す、約１１０Ｋｄのタンパク質バンドが栄養膜上清中で検出された（レーン１）、ウエスタンブロットである。同じ分子量のバンドもまた、陽性対照中に検出された（レーン２および３、各々異なる量の純粋なｓＦｌｔ−１タンパク質を取り込んだ）。その結果は、可溶性Ｆｌｔ−１は栄養膜上清中に存在したことを示す。

可溶性Ｆｌｔ−１エライザ分析
栄養膜細胞培養からの１００μＬの上清が、製造者の取扱説明書に従った、ｓＦｌｔ−１エライザキット（Ｒ＆Ｄ Systems、カタログ番号 ＤＶＲ１００Ｂ）の使用による、栄養膜培養物中に存在する可溶性Ｆｌｔ−１の分析のために使用された。図２Ｂは、栄養膜細胞培養物の上清中の、ｓＦｌｔ−１のエライザ検出結果を示す。レーン１：栄養膜培養物の上清；レーン２：培地のみ。結果は、大量の可溶性ｓＦｌｔ−１が、エライザによって、栄養膜培養物の上清中に検出されたことを示した。

実施例３
ｓＦｌｔ−１によるＶＥＧＦの中和
ＶＥＧＦのエライザ分析
純粋なｓＦｌｔ−１（１μｇ／ｍＬ）が、ＰＢＳ緩衝液で連続的に希釈（希釈度 １：３）された。１０μＬの各希釈ｓＦｌｔ−１が、９０μＬのＶＥＧＦ（１．１ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Systems、ＭＮ、米国）と混合されて、３７℃で１時間インキュベートされた。インキュベーションの後に、１００μＬの混合物がＶＥＧＦエライザに使用された。図３Ａは、ＶＥＧＦエライザ分析における、さまざまな濃度のｓＦｌｔ−１でのインキュベーション後のＶＥＧＦの検出濃度を示す。ＶＥＧＦとのインキュベーションに使用されたｓＦｌｔ−１の量は、レーン１〜６それぞれ、１０，３，１，０．３，０．１および０ｎｇであった。可溶性ｓＦｌｔ−１は、１ｎｇのＶＥＧＦとのインキュベーションの前に１０ｎｇ〜０．１ｎｇまで連続的に希釈されたので、結果は、十分な濃度のｓＦｌｔ−１はすべてのＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦがエライザ分析で検出されるのを阻止することを示している。ｓＦｌｔ−１によるＶＥＧＦの中和は用量依存的であった。３ｎｇのｓＦｌｔ−１が使用されたとき、溶液中のほとんどすべての１ｎｇのＶＥＧＦが中和された（レーン２）。

実施例４
ＶＥＧＦ依存ＨＵＶＥＣｓ増殖で破壊された可溶性Ｆｌｔ−１
ヒト臍帯静脈内皮細胞の単離（ＨＵＶＥＣｓ）
ＨＵＶＥＣｓは、Ｊａｆｆｅ，Ｅ．Ａ．ら（J. Clin. Invest. ５２（１１）：２７４５−２７５６，１９７３年）によって述べられているものにわずかな修正を加えて単離された。手短に、ヒト臍帯が、１μｇ／ｍＬのフンギゾーネ（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（Gibco、米国、カタログ番号 １５２９５−０１７）を含有する１５０ｍＬのＰＢＳ緩衝液に集められた。その臍帯は、殺菌したＰＢＳで洗浄され、損傷を受けた端部が外科用ナイフで切除された。静脈は、臍帯の両端で見つけられ、殺菌したＫｗｉｌｌ充填管（Avon Medicals、英国、カタログ番号 Ｅ９１０）でカニューレを挿入された。その臍帯は、カニューレ挿入された領域において、殺菌した糸で固く縛られた。臍帯血は、その後、１００ｍＬのＰＢＳで洗い流され、そして、２０ｍＬのＰＢＳが、二つの２０ｍＬシリンジ（注射器）（Becton Dickinson、米国、カタログ番号 ３００６１３）間を往復させられて、ゆっくりと洗い流された。臍帯を徹底的に洗い流した後、過剰のＰＢＳが取り除かれた。１０ｍＬのコラゲナーゼ溶液（１０μｇ／ｍＬ）が添加され（Sigma、米国、カタログ番号 Ｃ−９８９１）、カニューレの端部が塞がれた。その後、臍帯は、ＰＢＳの入った予熱されたビーカーに１０分間静置された。臍帯中のコラゲナーゼ溶液は、二つのシリンジ（注射器）間を往復させて、ゆっくりと洗い流され、その洗い流し液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）が５０ｍＬの遠心分離管に集められた。次に、臍帯が１０ｍＬのメディウム（Ｍｅｄｉｕｍ）−１９９培地（Sigma、米国、カタログ番号 Ｍ−７５２８）で洗浄され、同じ分離管に入れられた。その分離管は、ＨＵＶＥＣｓを集めるために、２００×ｇで５分間遠心分離された。細胞が、１０ｍＬの内皮細胞成長培地（PromoCell、米国、カタログ番号 Ｃ２２０１０）中に再懸濁され、さらなる実験のために、インキュベーター中３７℃で培養された。

ＶＥＧＦ依存ＨＵＶＥＣ増殖に対するｓＦｌｔ−１の効果
上記のように単離されたＨＵＶＥＣｓが、２×１０^５細胞／ｍＬでメディウム−１９９（Sigma、米国、カタログ番号 Ｍ−７５２８）に再懸濁させられ、９６ウェルの平底プレート（Becton Dickinson、米国、カタログ番号 ３５３０７２）に、１ウェル当り５０μＬ入れられた。ＶＥＧＦは、１μｇ／ｍＬとなるようにメディウム−１９９培地で希釈された。ｓＦｌｔ−１によるＶＥＧＦの中和は、ＶＥＧＦ（１μｇ／ｍＬ）を等量のｓＦｌｔ−１（５μｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Systems、ＭＮ、米国）と、３７℃で１時間インキュベートすることによって達成された。中和後、溶液中のＶＥＧＦは、分析培地（Ｍ−１９９＋１０％ＦＣＳおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）で、２０ｎｇ／ｍＬに希釈された。ｓＦｌｔ−１前処理、および希釈されたＶＥＧＦが、５０μＬ／ウェルでＨＵＶＥＣ培養物中に添加された。対照として、ＶＥＧＦ（１μｇ／ｍＬ）が、抗ＶＥＧＦ抗体（Ｒ＆Ｄ ＭＡＢ２９３、１０μｇ／ｍＬ）と、室温下１時間インキュベートされた。対照ＶＥＧＦまたはｓＦｌｔ−１前処理ＶＥＧＦのＨＵＶＥＣｓ培養物中への添加の後、プレートが、テトラゾリウムベース（ｂａｓｅｄ）分析キット（Promega カタログ番号 Ｇ３５８０）を使用して細胞増殖を測定する前に、３７℃で３日間インキュベートされた。

ＨＵＶＥＣｓの増殖は、ＶＥＧＦによる刺激への応答を反映する。ＶＥＧＦの供給がなければ、ＨＵＶＥＣ培養物は成長が止まり、次第に死滅するであろう。ＶＥＧＦ刺激に応答するＨＵＶＥＣ増殖は、インビボ（生体内）での血管形成に不可欠であるので、本分析においてＶＥＧＦ活性の阻害をもたらす試験化合物または組成物は、抗血管形成性性質を有していると考えられ得る。

図３Ｂに示されるように、ＶＥＧＦを含有する培地で培養されたＨＵＶＥＣｓ（レーン２）は、ＶＥＧＦのない基本培地で培養されたＨＵＶＥＣｓ（レーン１）と比較して、細胞成長の増加を示した。その結果は、培地中に存在するＶＥＧＦがＨＵＶＥＣｓの増殖を刺激することを示した。ｓＦｌｔ−１前処理ＶＥＧＦ（すなわち、中和されたＶＥＧＦ）を含有する培地で培養されたＨＵＶＥＣｓは、しかしながら、細胞成長の増加を示さなかった。このことは、ＶＥＧＦが、ＨＵＶＥＣｓ培養物に添加される前に、ｓＦｌｔ−１での前処理によって中和されるために、ＨＵＶＥＣｓ増殖を刺激する活性を失ったことを示した。ＶＥＧＦ刺激に応答するＨＵＶＥＣ増殖は、血管形成に不可欠であるので、ＨＵＶＥＣｓ増殖の刺激において、ＶＥＧＦを阻害または破壊することによって、ｓＦｌｔ−１は抗血管形成性質を有することを証明した。

実施例５
栄養膜培養上清中で単離された胎盤ｓＣＤ２６
図４は、免疫沈降実験におけるモノクローナル抗体ＣＨ１５の産生、および産生されたＣＨ１５の使用を説明する。

栄養膜培養上清で抗タンパク質モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株の生成
上記のように準備された、１０倍に濃縮された栄養膜培養上清が、Ｂａｌｂ／ｃマウスに免疫を与えるために使用された。免疫を与えられたマウスからの脾臓細胞が、ハイブリドーマ（StemCell Technologies、ＣＬＯＮＡＣＥＬＬ^ＴＭ−ＨＹ、カタログ番号 ０３８００）の生成のために、製造者の取扱説明書に従って、ＳＰ２／０細胞に融合された。ＩｇＧ抗体ＣＨ１５を産生するハイブリドーマ細胞クローンが識別（同定）された。

ハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体ＣＨ１５の精製
ハイブリドーマ細胞培養上清中のモノクローナル抗体ＣＨ１５が、タンパク質−Ａカラムによって精製された。０．５ｇのタンパク質−Ａセファロース粉体（Sigma、米国、カタログ番号 Ｐ３３９１）が、手短に、１ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）中で水和され、プラスチックカラム（Bio-Rad、米国、カタログ番号 ７３２−１０１０）に装着された。そのカラムは、１０ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ８）で洗浄された。次に、抗体がタンパク質−Ａカラムに結合するように、ハイブリドーマ上清が、ゆっくりとタンパク質−Ａカラムを通された。その後、タンパク質−Ａカラムが、緩衝溶液および１００ｍＭのグリシン（ｐＨ ３）（Antibodies, Harlow, E. and Lane, D., Cold Springs Harbor Lab Press、ｐ３１０、１９８８年）でカラムから溶出された抗体で、数回洗浄された。

ＣＨ１５のアガロースゲルへの固定化
上記の精製されたモノクローナル抗体ＣＨ１５（２００μｇ）が、免疫沈降のために、製造者の取扱説明書（ＳＥＩＺＥ^ＴＭ primary immunoprecipitation kit、Pierce カタログ番号 ４５３３５）に従ってアガロースゲルに固定化された。図４は、モノクローナル抗体ＣＨ１５（Ｍａｂ ＣＨ１５、カラムの隣）がカラムに固定化されたことを説明する。

栄養膜培養上清中のＣＨ１５特定化タンパク質の免疫沈降
図４に示されるように、１０倍濃縮栄養膜上清（図４では、Troph supと省略されている）がカラムに取り込まれ、ＣＨ１５抗体を上清中のＣＨ１５特定化因子に結合させるために、４℃で一晩、上述したＣＨ１５抗体接合アガロースゲルとインキュベートされた。その後、アガロースゲルが緩衝液で数回洗浄され、溶出緩衝液でタンパク質が抗体接合アガロースゲルから溶出された。

ＣＨ１５免疫沈降タンパク質のポリアクリルアミドゲル上への視覚化
上記の溶出された試料（２０μＬ）が、染料を取り込んだ（ｌｏａｄｉｎｇ）ゲル（５μＬ）と混合され、５分間沸騰させられた。次に、試料が１０％ＳＤＳポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルに取り込まれ、２ｍＭのメルカプト酢酸（Sigma、米国、カタログ番号 Ｔ−６７５０）を含むトリス−グリシンン緩衝液（Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Press、ｐ Ａ．２．５、１９９６年）中で、１００Ｖで１．５時間、電気泳動が行われた。ゲル電気泳動の後に、ゲル中のタンパク質が、ＣＡＰＳ緩衝液（１９ｍＭ ＣＡＰＳ（Sigma、米国、カタログ番号 Ｃ−４１４２）、５ｍＭ ＤＴＴ（Sigma、米国、カタログ番号 Ｄ９１６３）、１０％メタノール、（ｐＨ１１））中で、５０Ｖで１時間、ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad、米国、カタログ番号 １６２−０１８５）にブロットされた。ブロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）の後に、その膜は、ＣＨ１５によって免疫沈降されたタンパク質を視覚化するために、製造者の取扱説明書に従って、クマシーブルーＲ−２５０（Bio-Rad、米国、カタログ番号 １６１−０４３５）で染色されるか、または銀染色（Bio-Rad、米国、カタログ番号 １６１−０４４９）によって染色された。

図４は銀染色によって視覚化されたタンパク質バンドを説明している。レーン１〜３は抗体接合アガロースゲルからの溶出留分である。レーン４〜６は陰性対照からの溶出留分である。染色後、約１１０ｋＤａ（レーン１−３、９７Ｋｄ標識バンドのわずかに上に位置する）のタンパク質バンドが、切り取られて、配列が決定された。１１０Ｋｄまでの免疫沈降バンドのアミノ酸配列（ＮＫＧＴＤＤＡＴＡＤＳＲ・・・）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）はｓＣＤ２６の配列と一致した。

栄養膜上清中に存在する胎盤ｓＣＤ２６の同定
アミノ酸配列データは、免疫沈降タンパク質が胎盤ＣＤ２６の可溶型であったことを示す。その結果は、胎盤ｓＣＤ２６は培養された栄養膜細胞の上清中に存在し、ＳＤＳページ（ＰＡＧＥ）ゲルのＣＨ１５によって免疫沈降されたことを示した。

上記開示は、ヒト胎盤栄養膜細胞からｓＣＤ２６の一つの形をどの様に得てそして同定するかを説明している。可溶性ＣＤ２６の異なる形もまた報告された。例えば、正常なヒト血液中に見い出されるｓＣＤ２６は、その胎盤対応物より１０残基短いアミノ酸配列を有する。組み換えタンパク質型中の可溶性ＣＤ２６は、Ｒ＆Ｄシステムズ（ミネアポリス、米国）のような商業的供給源から得られ得る。

ヒト血液ＣＤ２６は、二つの１２０ｋＤａサブユニット（Mentlein, R., International Review of Cytology、２３５：１６５−２１３、２００４年）からなる、２４０ｋＤａのホモ２量体タイプＩＩ膜糖タンパク質である。それはまた、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）としても知られている。膜結合性糖タンパク質として、それは、種々の生物学的に重要なペプチドの活性の調節を含む、種々の機能的性質を有する（Dangら、Histol. Histopathol.、１７：１２１３−１２２６、２００２年）。ＣＤ２６は、種々の細胞型、特に、メラニン細胞、上皮細胞、内皮細胞およびリンパ球に発現されて見い出された。

ヒト血液ｓＣＤ２６、それは、その対応物の膜結合性ＣＤ２６と比較して最初の３８残基が欠如しており、膜ＣＤ２６からの開裂生成物であると仮定された（Iwaki-Egawaら、J. Biochem.（東京）１２４；４２８−４３３（１９９８年））。

ヒト胎盤ｓＣＤ２６も同様に、胎盤膜ＣＤ２６からの開裂生成物で、胎盤膜結合性ＣＤ２６と比較して最初の２８残基が欠如している。そのために、ヒト胎盤ｓＣＤ２６は、ヒト血液ｓＣＤ２６と比較して、そのＮ末端において追加の10アミノ酸を持っている。図5Ａは、ホモ２量体膜結合性タンパク質としての胎盤膜ＣＤ２６を説明しており、それは、開裂されて（二つの矢印で示されるように）、ホモ２量体胎盤ｓＣＤ２６を生じさせ得る。

文献調査によって、最後から2番目の位置にＬ−プロリンまたはＬ−アラニンを持つポリペプチドにおいて、ｓＣＤ２６はＮＨ_２末端ジペプチドを開裂することが報告されていることが見い出された（Fleischer, Immunol Today １５；１８０−１８４（１９９４年））。多くの生物学的に活性なポリペプチドがこの配列を持っている。例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦのような多くのサイトカインにおいて、プロリン残基は最後から2番目の位置に存在する（Ansorgeら、Biomed Biochim Acta ５０；７９９−８０７（１９９１年））。図5Ａは、最後から2番目の位置にＬ−プロリンを持つポリペプチドにおいて、ｓＣＤ２６がアミノ末端ジペプチドを開裂することを説明している。

研究は、免疫調節におけるＴ細胞活性化信号を伝達することができる構造としての役割、およびその生物学的因子の開裂を通した生物学的過程の調節因子としての役割を含む、多くの生理学的役割をｓＣＤ２６は持つことを示した。Ｔ細胞の活性化は、局所的な化学伝達物質として働く種々の分泌型インターロイキンを含む複雑な過程である。活性化は、Ｔ細胞が未知の手段により、一つまたはそれ以上のインターロイキンを分泌するための抗原提示細胞によって刺激されたとき、始まると考えられている。インターロイキン２（ＩＬ−２）は、抗原によって活性化されたＴリンパ球により産生されるタンパク質である。ＩＬ−２は、活性化し、そして区別するために他のリンパ球を刺激する。ＩＬ−２は、Ｔ、Ｂおよびナチュラルキラー細胞の活性化のために必要とされる中心的なサイトカインである（Tenbrockら、Int Rev Immunol.、２３（３−４）；３３３−３４５、２００４年）。

ヒトＩＬ−２は、いかなる他の因子に対しても配列相同性を示さない、わずかに塩基性のｐＩを持つ、アミノ酸１３３（１５．４ｋＤａ）のタンパク質である。マウスおよびヒトのＩＬ−２は、約６５％の相同性（相同関係）を持つ。ＩＬ−２は、疎水性分泌シグナル配列として機能する最初の２０アミノ末端アミノ酸を持つ、アミノ酸１５３の前駆体タンパク質として合成された。そのタンパク質は、Ｃｙｓ５８およびＣｙｓ１０５の位置に、生物活性に必須の単一のジスルフィド結合を含んでいる。

ＩＬ−２は、ヒト免疫システムにおける、炎症促進（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）サイトカインであることが技術的に良く知られている。炎症性疾患及び免疫病において、ＩＬ−２が果たす病理学上の多数の例が存在する。例えば、ＩＬ−２産生のレベルは、多発性硬化症を患う患者で変化し、全身紅斑性狼瘡（全身性ループスエリテマトーデス）を患う患者で減少する（Dejica D.、Rorum Arch Microbiol Immunol.、６０（３）：１８３−２０１，２００１年； Herndonら、Clin. Immunol.、１０３（２）、１４５−５３，２００２年； Tenbrockら、Int Rev Immunol.、２３（３−４）：３３３−４５，２００４年）。ＩＬ−２活性を変化させることができる分子の開発は、自己免疫疾患及び炎症性疾患の治療に有用であろう。多くのサイトカインが、最後から２番目の位置でプロリン残基を含むため、ＩＬ−２上の胎盤ｓＣＤ２６は、さらに研究され、実験が次のように説明された。

実施例６
ＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激におけるｓＣＤ２６が破壊したＩＬ−２活性
胎盤可溶性ＣＤ２６の精製
ＰＢＳで洗浄された胎盤組織のすべてのグラム（ｇｒａｍ）に対して、４ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０（ｗ／ｏ ＦＣＳ）が添加され、その組織は、上清が採取される前に、３７℃で３−４日間、インキュベーターでインキュベートされた。崩壊物を取り除くために、上清が、７００×ｇで５分間、遠心分離された。溶液中の可溶性ＣＤ２６が、公開された方法（de Meesterら、J Immunol Methods.；１８９（１）：９９−１０５，１９９６年１月１６日）にしたがって、ＡＤＡ（Sigma カタログ番号 Ａ６６４８）カラムを通して精製された。精製されたｓＣＤ２６は、３０ｍＬの２ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ８）でカラムから溶出され、セントリコン プラス−７０（Centricon Plus−７０）（Amicon、カタログ番号 ＵＦＣ７０１００８）装置を使用して３ｍＬまで濃縮され、そして、次の使用のために、一定分量が４℃で貯蔵された。精製および濃縮されたｓＣＤ２６は、その後、次の試験のために使用された。

天然（ｎａｔｉｖｅ）Ｎ末端を持つヒトＩＬ−２の産生
商業的に利用可能なＩＬ―２の大部分はバクテリアから生産され、そのため、タンパク質のＮ末端は、その上を、余分なアミノ酸メチオニン（Ｍ）で変性される。メチオニン−Ｎ末端ＩＬ−２は、ｓＣＤ２６はタンパク質の正確なＮ末端アミノ酸配列を認識するだけであるので、可溶性ＣＤ２６の機能の研究に対して理想的な基質ではない。したがって、我々は、後の精製目的のために、ヒトＩＬ−２遺伝子を、Ｃ末端にフラッグタグ（Ｆｌａｇ−ｔａｇ）でプラスミドベクター中にクローンし、組み換えベクターを真核細胞株ＢａＦ３中へトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）した。ＩＬ−２を生産した安定なクローンが同定され、大量に成長させられた。ＩＬ−２は、上清中で生産および濃縮され、その後、次の実験で使用された。

ＣＴＬＬ−２細胞増殖分析
ＣＴＬＬ−２（ＡＴＣＣ，ＴＩＢ２１４）細胞株は、構成的にＩＬ−２受容体を発現し、細胞成長に対して、外因性ＩＬ−２の存在に完全に依存する。ＣＴＬＬ−２細胞が、ＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激における、ＩＬ−２活性へのｓＣＤ２６の効果を分析するために使用された。ＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激におけるＩＬ−２活性が、ＯＤ_４９０で吸光度を測定するための細胞増殖キットを使用することによって、分析された。実験の前に、ＣＴＬＬ−２細胞（０．１×１０^６細胞／ｍＬ）がＲＰＭＩ−１６４０で２度洗浄され、９６ウェルプレートに５０μＬ／ウェルで、採取された。上記のように生産されたＩＬ−２は、１μＬの濃縮ＩＬ−２上清と、２０μＬの精製、濃縮されたｓＣＤ２６とを混合することによって、上述した胎盤細胞培養上清から精製されたｓＣＤ２６で、１時間３７℃で前処理された。処理の後、ＩＬ−２は、５０μＬに調整され、５０μＬ／ウェルで０．１×１０^６／ｍＬのＣＴＬＬ−２細胞と混合された。細胞培養物は、ＯＤ_４９０（Promega、カタログ番号 Ｇ３５８０）で細胞増殖を測定する前に、３７℃で３日間インキュベートされた。

図５Ａは、可溶性ＣＤ２６が、モチーフＸＰを含むポリペプチドを認識でき、その後、ペプチド結合を開裂できることを説明する。図５Ｂは、ＩＬ−２が、ｓＣＤ２６によって認識されることができるモチーフＡＰ（アラニン−プロリン）と共に、アミノ酸配列ＡＰＴＳＳＳＴＫＫ．．．（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含むことを説明する。

図６は、細胞株ＣＴＬＬ−２の増殖が、増殖培地においてＩＬ−２に依存したことを説明する。外因性ＩＬ−２の供給が無いと、ＩＬ−２を含む培地と比較して（レーン１）、ＣＴＬＬ−２細胞株は成長を止め、急速に死滅した（レーン２）。上述した精製および濃縮ｓＣＤ２６でのＩＬ−２の前処理は、ＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激において活性を失ったように、ＩＬ−２不活性を生じさせた（図６、レーン３）。ヒト免疫システムにおいて、ＩＬ−２は炎症促進（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）サイトカインであるので、可溶性ＣＤ２６は、そのＩＬ−２活性阻害により、炎症抑制剤として有用であり得る。

実施例７
妊婦からの血清によるＶＥＧＦの中和
７人の妊婦からの血清が前述のように集められた。１００μＬの血清が、ＶＥＧＦエライザ分析（図７、群３）を行う前に、１ｎｇのＶＥＧＦと３７℃で２時間インキュベートされた。７人の男性および５人の非妊娠女性からの血清が同様に集められ、同じ実験で対照群として使用された（図７、各々群１および２）。図７に示すように、妊婦の血清のみが、溶解性因子（すなわちｓＦｌｔ−１）の存在のためにＶＥＧＦの検出を妨害した。

実施例８
妊娠中の血中ｓＦｌｔ−１濃度（レベル）の増加
血清ｓＦｌｔ−１濃度（レベル）の測定
１０ｍＬの血液が、各ボランティアの献血者から採取された。血液は、３ｍＬのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ^ＴＭ（Axis-Shield 英国、カタログ番号 １１１４５４５）の上を覆うように加えられ、７００×ｇで２０分間、遠心分離された。最上層の血清が採取され、一定分量が、その後のエライザ分析のために−７０℃で貯蔵された。血清中の可溶性Ｆｌｔ−１の量が、ｓＦｌｔ−１エライザキット（Ｒ＆Ｄ Systems、カタログ番号 ＤＶＲ１００Ｂ）を使用し、製造者の取扱説明書に従って測定された。

図８Ａは、５被検者の血清試料からのｓＦｌｔ−１の平均量を説明する。レーン１：妊婦；レーン２：非妊娠女性；レーン３：男性。その結果は、非妊娠女性および男性の血清（レーン２および３）と比較して、妊婦の血清（レーン１）のみから顕著な量の可溶性Ｆｌｔ−１が検出されたことを示す。

図８Ｂは、妊娠２０週（レーン１）、妊娠３０週（レーン２）および出産後１０週（レーン３）の妊婦からの血清中のｓＦｌｔ−１濃度（レベル）を説明する。その結果は、血清中の可溶性Ｆｌｔ−１の濃度（レベル）は、妊娠期間中に増加し、出産後約３ヶ月で消滅したことを示す。

血管形成は、炎症性関節炎、乾癬、アテローム性動脈硬化症、ならびに腫瘍増殖および転移の進行にも関係していた。病理学上の血管形成は、癌、種々の虚血性疾患および炎症性疾患の顕著な特徴である。血管形成は、腫瘍増殖および転移において極めて重要である（Keith Dredgeら、Current Opinion in Investigational Drugs. ４（６）：６６７−６７４、（２００３年））。新血管の成長は腫瘍進行の重要なプロセスである。それは、過形成から新生組織形成への遷移、すなわち、腫瘍細胞の細胞増殖の状態から非制御の増殖特性の状態への経過に、有利に働く。新血管形成もまた、結局は転移形成に至る、全身至る所への癌細胞の播種に影響を与える。すべての癌の９０％は、固形腫瘍であり、それゆえ、それらの増殖を支える血管形成に依存する。原発腫瘍の切除は、しばしば、体の血管形成バランスの全身的障害によって引き起こされた転移に付随して起こることが同様に示された。これらすべての標準的な治療は、前血管相（ｐｒｅｖａｓｃｕｌａｒ ｐｈａｓｅ）において潜伏期の腫瘍を制限するであろう併用療法から利益を得ることができた。

がんと闘う方法として、新血管形成を阻害することが示唆された。悪性組織は、酸素と栄養の供給を奪われ、および代謝廃棄物を排除することもできなくなると考えられる。このことがひいては、ほとんどの進行癌を伴う腫瘍進行および転移進行を阻害するであろう。血管形成過程を中断することができる５つの主要なステップがある：（１）ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）およびＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）の様な内因性血管新生因子の阻害；（２）血管の基底膜の分解に関与する分解酵素（マトリクスメタロプロテイナーゼ）の阻害；（３）内皮細胞増殖の阻害；（４）内皮細胞遊走の阻害；および（５）内皮細胞の活性化と分化の阻害。

ＶＥＧＦの中和は、癌治療のための戦略として使用された。例えば、モノクローナル抗体である新薬ＡＶＡＳＴＩＮ^ＴＭは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と結合し、その血管内皮増殖因子の活動を阻害することによって効く。ＶＥＧＦは、新血管形成を刺激するある細胞上の、その受容体に結合する物質である。ＶＥＧＦがＡＶＡＳＴＩＮ^ＴＭによって束縛されるとき、それは、新血管の形成と増殖（成長）（血管形成）を刺激することができない。ＡＶＡＳＴＩＮ^ＴＭは、化学療法の効果を増進するが、結腸直腸癌患者にそれ単独で与えられるときは、それほど効果的であるとは思われない。

本発明は、とりわけ、可溶性Ｆｌｔ−１がＶＥＧＦを中和できることを開示する。抗ＶＥＧＦまたは抗血管形成は、血管形成に依存する癌の治療に有用であることが証明されたので、ｓＦｌｔ−１は、そのＶＥＧＦ中和活性によって、その増殖が血管形成に依存する癌または腫瘍の治療に役立ち得る。

炎症もまた、癌に関与していた。慢性炎症は癌の発現に関連付けられた。初期のおよび持続性の炎症反応は 腫瘍発現の多くの局面を制御する新生物の発現で、または発現中に観察された（Leon C.L.ら、“Inflammation, proteases and cancer.” European Journal of Cancer, Vol.４２，Issue ６、ｐ．７２８−７３４）。腫瘍発現のすべての３段階での炎症作用：開始、進行および転移。炎症は、血管系に、炎症細胞および因子の組織環境への開放を警告する種々のサイトカインおよびケモカインの開放を引き起こすことによる開始に寄与し、それによって、微小環境における酸化的損傷、ＤＮＡ突然変異および他の変化を生じさせ、生存と増殖が増加した細胞形質転換をより一層促す。さらに、慢性炎症と癌の間には強い関連性がある。炎症の重要性の認識は、すでに、癌予防と治療のために抗炎症薬（例えば、ＣＯＸ−２阻害剤）の臨床試験につながった（（米）国立癌研究所、癌生物学部、“Executive Summary of Inflammation and Cancer Think Tank.”［２００７−１１−１７から検索された］。インターネットから検索された：＜URL:
http://dcb.nci.nih.gov/thinktank/Executive_Summary_of_Inflammation_and_Cancer_Think_Tank.cfm＞）。

血管形成はまた、炎症または炎症性疾患に関連付けられる。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、関節リウマチ（ＲＡ）の血管形成過程において、中心的な関与を持つことが示された。ＶＥＧＦの血管透過性因子としての付加的な活性はまた、関節リウマチで浮腫、したがって関節膨張を増加させるかもしれない。いくつかの研究が、関節炎の動物モデルにおいて、血管形成を標的とすることにより病気が改善することを示した（Paleolog EM. Arthritis Res. ；４ Suppl ３：Ｓ８１−９０，２００２年）。ｓＦｌｔ−１は抗血管形成／抗ＶＥＧＦ活性を有するので、それはまた、癌に関連付けられる、関節リウマチ含む炎症性疾患および慢性炎症において、血管形成の度合いを減少させるのに有用であり得る。

妊娠が、免疫学的変化を誘発することが報告された。種々のホルモン変化および免疫学的変化が、拒絶から半同種異系（ｓｅｍｉ−ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）胎児を保護するために、妊娠によって誘発された。妊娠によって誘発された、変化した免疫調整の全身的な効果は、関節リウマチおよび他の自己免疫疾患の活性に影響を与える。妊娠は、関節リウマチ患者の７５％において、病気活性の改善または鎮静さえ誘導する。妊娠中に生じる炎症性サイトカイン阻害剤の循環の増加は、関節の炎症において有効な抗炎症薬としての役割を果たすことができる。炎症性サイトカインの中和が鎮静の鍵であり得るということはありそうなことである（Ostensn M., Villiger PM, "Immunology of Pregnancy-pregnancy as a remission inducing agent in rheumatoid arthritis." Transpl Immunol.；９（２−４）：１５５−６０，２００２年５月）。

本発明は、とりわけ、可溶性Ｆｌｔ−１が妊娠中にのみ大量に検出されたことを記載する。ＶＥＧＦが関節リウマチに関与し、ｓＦｌｔ−１がＶＥＧＦを中和できるので、妊娠中の血清ｓＦｌｔ−１濃度（レベル）の増加は、妊娠中に関節リウマチの鎮静に寄与する一つの因子である可能性が高い。さらに、ｓＣＤ２６は栄養膜細胞によって生産され、それは、インターロイキンの様な炎症性サイトカインを順番に中和し得、それによって、妊娠中の関節リウマチの鎮静にさらに寄与する。

可溶性ＣＤ２６／ＤＰＰＩＶは、Ｔ細胞活性化分子およびケモカイン機能調整剤として、免疫調整において必須の役割を有する。ｓＣＤ２６が、抗原提示細胞へのその効果を経て、リコール抗原へのＴ細胞応答の増進効果を発揮し得ることが示唆された。研究は、ｓＣＤ２６が単球中に運ばれ、タンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方において、そのＤＰＰＩＶ活性を通して単球上にＣＤ８６の発現を上方に調節することを示した。したがって、ｓＣＤ２６、特にそのＤＰＰＩＶ酵素活性は、抗原提示細胞へのその直接効果を通して、リコール抗原へのＴ細胞免疫応答を増進することが示唆された（Dang and Morimato, Histol Histopathol. １７：１２１３−１２２６（２００２年））。臨床研究は、関節リウマチ患者のＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６の血漿中濃度（レベル）は、変形性関節症患者のそれと比較したとき、顕著に減少したことを示した（Nathalie Bussoら、American Journal of Pathology, Vol.１６６、No.２，４３３−４４２（２００５年））。

本発明は、とりわけ、ｓＣＤ２６が栄養膜細胞によって産生されることを開示する。さらに、本発明は、ｓＣＤ２６がＩＬ−２の様なインターロイキンを阻害できることを開示する。それゆえに、ｓＣＤ２６は、癌、関節リウマチおよび他の炎症性疾患を含む病気の抗炎症に対して、それに加えて、上述したそのＴ細胞活性化活性に対して有用であり得る。

引用されたすべての参考文献は、参照することによりその全部がここに含まれる。

本発明の例示的な実施形態の上記記述は、説明および記述の目的のためにのみ提示され、それが網羅的であること、または本発明が開示された正確なその形に制限されることを意図するものではない。上記教示を考慮して、多くの変更および変化（バリエーション）が可能である。

この実施形態および実施例は、他の当業者が本発明および種々の実施形態を、意図された特定の使用に適するように種々変更して利用できるように、本発明の本質とそれの実用的な応用を説明するために選択され、そして記述された。他の実施例は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明の分野と関係のあるこれらの当業者に明白になるであろう。したがって、本発明の範囲は、上記の記述、およびそこに記載された例示的な実施形態よりむしろ添付の特許請求の範囲によって定義される。

特許、特許出願および種々の出版物を含み得るいくつかの参考文献は、本発明の記載に引用され、論述される。そのような参考文献の引用および／または論述は、ただ単に、本発明の記載を明確にするために提供されたものであり、そのいずれの参考文献も、ここに記載した本発明が従来技術であると自白するものではない。本明細書で引用および論述されたすべての参考文献は、参照することによりその全部がここに含まれ、各参考文献が個々に参照することにより援用されるように、その同じ範囲で含まれる。

Claims (3)

1. 治療に有効な量のｓＣＤ２６と、
   治療に有効な量のｓＦｌｔ−１と、および
   製薬的に受容できる担体と、を有する、
   関節リウマチの治療に用いられる医薬組成物。
2. 関節リウマチの治療のための薬剤の製造における医薬組成物の使用方法であって、前記医薬組成物は、
   治療に有効な量のｓＣＤ２６と、および
   治療に有効な量のｓＦｌｔ−１と、を有する、使用方法。
3. 前記医薬組成物は、製薬的に受容できる担体をさらに有する、
   請求項２に記載の使用方法。

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