JP2002020311A - 新規な軟骨形成促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規な軟骨細胞の分化促進および動物由来の
コナカバリン様機序を持つ薬剤の提供 【解決手段】 配列表：配列番号２および／または４に
示すポリペプチドである軟骨細胞の分化促進および動物
由来のコナカバリン様機序を示すMTf結合タンパク質（M
Tf-BP）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規な軟骨形成促進
剤に関する。さらに詳しくは、新たに発見された軟骨細
胞の分化を促進するタンパク質（MTf-BP）を含む軟骨形
成促進剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】動物の軟骨組織は軟骨細胞（chondrocyt
es）と細胞間基質（matrix）により構成されている。軟
骨組織は胎生期の骨格の大部分を占めており、出生後は
軟骨性骨化により、骨組織に置き換わってゆく。軟骨性
骨化を開始するにあたって、軟骨細胞は静止軟骨細胞か
ら増殖軟骨細胞となり、ついで肥大性軟骨細胞に分化し
ていく（文献；津田ら編集「骨の科学」1982年、東京医
歯薬出版、p.11〜29 ）。このように軟骨細胞は特に成
長期の骨組織形成にとって必須な細胞であることがよく
知られてきた。しかし軟骨細胞の分化や軟骨性骨化につ
いてはまだ未解明の領域が多い。

【０００３】軟骨細胞膜には独自の糖蛋白が存在し、そ
の膜蛋白が他の結合組織の細胞とは異なる軟骨細胞の特
徴（球形の細胞形態、軟骨マトリックスの大量分泌、軟
寒天内での生存、増殖など）に寄与している可能性があ
る。この仮説に基づいて、ヤン（Yan）ら（Yan et al .
; J. Biol. Chem., vol.265, p.10125〜10131, 199
0）及び加藤ら（加藤ら、日本骨代謝学会雑誌vol.1.No.
2,p. 187〜192,1992）は種々のレクチンの軟骨細胞の分
化、増殖に対する効果を調べ、中でもタチナタマメレク
チンでありα−Ｄ−マンノース残基およびα−Ｄ−グル
コース残基に親和性を有するコンカナバリンA（concana
valin A：以下においてCon Aということもある）が軟骨
細胞の分化を強く促進することを、プロテオグリカン
（proteoglycan）の合成を増大させることなどを指標と
して明らかにしている。Con Aで処理された軟骨細胞
は、未熟な扁平形態から分化した球形に変化し、軟骨分
化マーカーであるプロテオグリカン及びII型コラーゲン
産生、アルカリホスファターゼなどの発現、さらには石
灰化を誘導する。このような分化・誘導作用は、Con A
以外の現在知られている動物性・植物性レクチンでは見
い出されていない。

【０００４】河本ら（Kawamoto et al., Eur. J. Bioch
em. Vol. 256, p. 503-509, 1998）はさらに、Con Aの
作用を仲介するレセプターを探索する試みの中で、軟骨
細胞上に存在する約２０種類のCon A結合蛋白のうち
で、レチノイン酸処理した軟骨細胞（脱分化し、Con A
反応性を消失する）において発現が低下する７６ｋＤａ
の蛋白（ｐ７６）に注目した。ウサギ軟骨細胞膜分画よ
りCon Aアフィニティーカラムクロマトグラフィーにて
ｐ７６を精製した後、Ｎ末部分アミノ酸配列を決定、遺
伝子をクローニングした。アミノ酸配列及びそのｃＤＮ
Ａの核酸配列から、ｐ７６は、ヒトのメラノーマなどの
腫瘍に高発現されている腫瘍抗原として知られていたメ
ラノトランスフェリン（ｐ９７）と８７％のアミノ酸相
同性を示し、そのカウンターパートであると考えられ
た。従来、ｐ９７の生理的機能は不明であり、その発現
も腫瘍細胞でのみ高く、正常組織ではほとんど検出され
ないと報告されていた。

【０００５】ｐ７６はCon Aとの結合性から軟骨細胞の
分化あるいはその機能発現に関与していることが推定さ
れた。そこで本発明者らは、ｐ７６の構造の中にある膜
結合型トランスフェリン様タンパク質（membrane-bound
transferrin-like protein：以下においてMTfというこ
ともある）をコードする遺伝子をクローニングし、該遺
伝子を軟骨細胞への分化能を保持しているが無刺激では
ほとんど分化しないマウスＡＴＤＣ５細胞株に導入した
ところ、軟骨への分化を箸しく誘導することを見出し
た。すなわちMTfの軟骨細胞又はその前駆細胞の分化を
促進する機能を発見して、先の特許出願（特願平11-232
966号）の明細書において開示した。

【０００６】ところでCon Aは植物由来のレクチンであ
り、人体を含め動物体内には全く存在しないレクチンで
ある。先に述べたようにMTfの軟骨分化を促進するレク
チンはCon A以外に発見されていない。また先の出願に
開示しかつ後述する参考例２に示したように、ウサギ軟
骨細胞の培養上清の添加がMTfによる軟骨細胞分化を著
しく促進したことから、動物由来でMTfの軟骨修復作用
をさらに強化する物質があるのではないかと考えた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、更に
軟骨細胞の分化に関与する物質を見出すことである。さ
らにはこれを用いた新規な軟骨形成促進剤を提供するこ
とである。これにより、軟骨細胞の機能の制御、骨形成
を促進する薬剤を提供することであり、新しいタイプの
軟骨代謝性疾患および骨代謝性疾患の治療、予防、診断
に有用な薬剤を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、上記の
課題を解決するために、鋭意研究した結果、MTfと強く
結合する動物由来のタンパク質（MTf - binding protei
n：以下においてMTf-BPということもある）をコードす
る遺伝子をクローニングして遺伝子配列を決定し、本発
明を完成した。すなわち、本発明の第１は、MTf結合タ
ンパク質（MTf-BP）を含む軟骨形成促進剤である。好ま
しくは、MTf結合タンパク質は、配列表：番号２および
／または４に示すポリペプチドによって構成されること
を特徴とする前記軟骨形成促進剤である。本発明の第２
は、上記MTf-BPと膜結合型トランスフェリン様タンパク
質（MTf）を併用する軟骨形成促進剤である。本発明の
第３は、上記MTf-BPに特異的な抗体である。本発明の第
４は、準備された生体試料に対して、配列表：番号１お
よび／または３に示すヌクレオチド配列のレクチン様領
域に対応する部分との結合を検出することを特徴とす
る、生体防御・細胞分化・細胞増殖・細胞外マトリック
ス構築の疾患の診断方法である。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明をより詳細に説明する。本
発明において、MTf結合タンパク質（MTf-BP）とは、動物
由来のタンパク質であって、レクチン様アミノ酸配列を
有し、MTfに結合して軟骨分化誘導を仲介する機能を有
するタンパク質をいう。MTf-BPの例としては、配列表：
配列番号２に示すポリペプチドがあげられる。その塩基
配列を配列表の配列番号：１に示す。配列番号２のポリ
ペプチドは、ヒト由来の物としてGenBank AF132963（L
in,W.-C26-APR-1999）に掲載されているものであって、
物質としては既知のものに属し、人体の各種組織に存在
していることが知られているが、これまでその機能は不
明であった物質である。配列番号２に示すポリペプチド
は、発明者らがMTfとの結合機能物質を探索する中で同
定したタンパク質である。前記機能を解明したポリペプ
チド及び前記同定したタンパク質のMTfとの結合（作用
を）機能の特徴から、その機能を持つ物質を総称してMT
f結合タンパク質（MTf−Binding Protain）と命名し
た。

【００１０】また発明者らは、AF132963の２４２アミノ
酸配列内に配列表の以下の（）内で示されるC-typeレク
チン様領域（“RHGVYVWGETWEKAKTMC”）を持っているこ
とを初めて明らかにした。このことは、配列番号２のポ
リペプチドが、Con Aと同様にMTfに対して強い結合作用
をもつことの根拠を示している。もう一つのMTf-BPの例
としては、配列番号４のポリペプチドがあげられる。そ
の塩基配列を配列表の配列番号：３に示す。配列番号４
のポリペプチドは、マウス由来の物としてGenBank AB0
28863（Sha,S. 他17-JUN-1999）に掲載されているもの
であって、上記のAF132963ときわめて類似のアミノ酸配
列となっている。また、AB028863は、AF132963と同様
に、その機能はこれまで知られていなかった。かつC-ty
peレクチン領域を含有することは今回初めて確認され
た。なお、MTf-BPは上記２例に限定されるものではな
い。

【００１１】本発明において、膜結合型トランスフェリ
ン様タンパク質（MTf）とは、Con Aと結合する軟骨細胞
膜上のタンパク質であって、かつトランスフェリンのよ
うな鉄結合サイトを有するタンパク質をいう。さらに好
ましくは、Con Aによる軟骨分化誘導を仲介する機能を
有するタンパク質をいう。MTfという用語は従来、メラ
ノーマなどの腫瘍に高発現されている腫瘍抗原として知
られていたメラノトランスフェリン（ｐ９７）の略語と
して使用されていたが、ｐ９７が癌組織以外に軟骨で特
に高レベルで発現しており、癌組織に特異的でないこと
が判明したので、本発明者らはMTfという用語を膜結合
型トランスフェリン様タンパク質を意味する略号として
再命名した。本発明において、MTf活性とは、未分化な
細胞に対して軟骨分化を誘導し、軟骨細胞に対してその
機能発現を促進する活性をいう。MTfの例としては、ウ
サギｐ７６タンパク質、ウサギｐ７６タンパク質のヒト
相同体タンパク質であるｐ９７タンパク質、ならびにこ
れらのタンパク質のアミノ酸の一部を欠失、置換、付加
したものであって、 MTf活性を有するタンパク質が挙げ
られるが、これに限定されない。

【００１２】ウサギｐ７６タンパク質は、ヒトｐ９７タ
ンパク質と相同であり、ウサギｐ９７と称されることも
ある（Kawamoto et al., Eur. J. Biochem. vol. 256,
p. 503-509,1998）。その塩基配列及びアミノ酸配列を
配列表の配列番号：５及び６に示す。ヒトＰ９７タンパ
ク質の塩基配列及びアミノ酸配列も公知である（Rose,
T.M. et al., Pro NAS 83, 1261-65, 1986）。その塩基
配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号：７及び８に
示す。Ｐ７６／Ｐ９７タンパク質は、Ｃ末端アミノ酸の
カルボキシル基に糖脂質ＧＰＩ（グリコシルホスファチ
ジルイノシトール）を結合し、これをアンカーとして膜
につなぎ止められている、ＧＰＩアンカー型タンパク質
である（ｐ７６については、尾田 良、広島大学歯学雑
誌、29巻、 1号、 40-57， 1997;ｐ９７についてはAlem
any, R. et al., J. Cell Science, 104, 1155-62, 199
3）。

【００１３】本発明で使用するMTf-BPおよびMTfは天然
型であっても組換え型であってもよく、それぞれ当業界
に公知の方法で入手できる。以下に例示する。天然型MTf-BP 天然型MTf-BPは例えば以下の方法によって取得すること
ができる： １）軟骨細胞培養系の培養上清から精製する； ２）MTfと結合するタンパク質のｃＤＮＡを軟骨細胞ｃ
ＤＮＡライブラリーからクローニングする； ３）yeast two hybrid法でMTfと結合するタンパク質の
ｃＤＮＡをクローニングする。 最後の方法３）で取得する時の具体例を実施例１に示し
た。前記１）〜３）のいずれの方法によってもMTf結合
物質タンパク質を採取できる。

【００１４】天然型MTf 天然型MTfを得るには、例えば特開平７−８２２９７号
に記載の方法により軟骨細胞から得ることができる。簡
単に述べると、軟骨細胞の材料としては、種々の動物の
軟骨組織を使うことができるが、例えばウサギの肋軟骨
成長板を材料として、加藤らの方法（Kato et al., ;J.
Cell Biol. vol. 100, p. 477〜485, 1985）に従い、
プロテアーゼ及びコラゲナーゼ処理により軟骨細胞を得
ることができる。この分離された軟骨細胞は培養皿でウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地で５％ＣＯ₂、９５％
空気の環境下で３７℃で培養できる。この軟骨培養細胞
を回収しホモジナイサーで砕砕し、１７％／４０％のシ
ョ糖平衡密度勾配による沈降平衡遠心により、膜タンパ
クを分取することができる。得られた膜タンパク画分を
直接にコン力ナバリンＡ‐アフィニティカラムに展開す
るか、または、あらかじめコンカナバリンＡ以外のレク
チンに結合する膜タンパクを除くために、例えば、代表
的なレクチンである小麦胚芽レクチン（Wheat germlect
in）のアフィニティカラムに一旦展開した後、コンカナ
バリンＡ‐アフィニティカラムに展開する等の方法を使
うことにより、コンカナバリンＡ結合タンパク分画をさ
らに分取することができる。種々の濃度のレチノイン酸
で誘導した脱分化型軟骨細胞を作成し、これら脱分化型
細胞からもコンカナバリンＡ結合タンパク分画を分取す
る。この得られたコンカナバリンＡ結合タンパクの軟骨
細胞に対する特異性は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、これらの分画
を比較することで検討できる。目的とする軟骨細胞に特
異的な糖タンパク質が特定できたらゲルから目的のバン
ドを切り出し、エレクトロエリューション等により抽出
精製し、エンドグリコシダーゼを用いて糖タンパク質の
糖質を分析できる。

【００１５】組換え型MTf-BP 、組換え型MTf 組換え型MTf-BP およびMTfは、本発明の実施例に記載の
方法あるいはこれに準じた方法を用いて、MTf-BP また
はMTf遺伝子を組み込んだプラスミドを宿主細胞にトラ
ンスフェクションして、それぞれMTf-BP 、MTfタンパク
質を発現させることにより得ることができる。しかし、
これに限定されることなく、当業界で公知の種々の形質
転換方法、宿主細胞を使用することができる。例えば、
MTf-BP またはMTfをコードする遺伝子を適当なベクター
に組み込むことにより、原核細胞または真核細胞の宿主
細胞を形質転換することができる。さらに、これらのベ
クターに適当なプロモーターや形質発現にかかわる配列
を導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺
伝子を発現することが可能である。また、目的とする遺
伝子に他のポリペプチドをコードする遺伝子を連結し
て、融合タンパク質として発現させ、精製を容易にした
り、発現量を上げたり、また精製工程において適当な処
理を施すことにより、目的タンパク質を切り出すことも
可能である。一般に、真核生物の遺伝子はヒトインター
フェロン遺伝子で知られているように、多型現象を示す
と考えられ、この多型現象によって１個またはそれ以上
のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化
はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。

【００１６】また、配列表の配列番号２または４（MTf-
BP ）ないし６又は８（MTf）のアミノ酸配列中の１個ま
たはそれ以上のアミノ酸を欠くかまたは付加したポリペ
プチド、あるいはアミノ酸が１個またはそれ以上のアミ
ノ酸で置換されたポリペプチドでも細胞周期調節活性を
有することがある。例えば、ヒトインターロイキン２
（ＩＬ−２）遺伝子のシステインに相当する塩基配列を
セリンに相当する塩基配列に変換して得られたポリペプ
チドがＩＬ−２活性を保持することも既に公知になって
いる（Wang et al.,Science 224:1431,1984）。これら
のMTf-BP またはMTfタンパク質をコードする遺伝子の改
変体を作製する技術は当業者には公知である。また、真
核細胞で発現させた場合、その多くは糖鎖が付加され、
アミノ酸を１個ないしそれ以上変換することにより糖鎖
付加を調節することができるが、この場合でも軟骨細胞
分化誘導活性を有することがある。それゆえ、本発明で
はMTf-BP またはMTfタンパク質をコードする遺伝子を人
工的に改変したものを用いて、得られたポリペプチドが
軟骨細胞分化誘導活性を有する限り、それらのポリペプ
チドをコードする遺伝子はすべて本発明に使用できる。

【００１７】発現ベクターは、複製起源、選択マーカ
ー、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニ
ル化シグナルなどを含むことができる。発現系に用いる
宿主のうち原核生物宿主細胞としては、例えば、大腸
菌、枯草菌などが挙げられる。また、真核生物のうち、
真核微生物の宿主細胞としては、例えばイースト、粘菌
が挙げられる。あるいは、Ｓｆ９細胞（カイコの細胞
株）などの昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよい。
さらに、動物細胞由来の宿主細胞としては、例えば、Ｃ
ＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。

【００１８】以上のようにしてMTf-BP またはMTfタンパ
ク質をコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培
養することにより産生されたタンパク質は細胞内または
細胞外から分離し、精製することができる。なお、上述
した配列表の配列番号２または４（MTf-BP ）ないし６
又は８（MTf）に示すアミノ酸配列をコードする塩基配
列を含む遺伝子で得られたタンパク質のみならず、配列
表の配列番号２または４（MTf-BP ）ないし６又は８（M
Tf）に示すアミノ酸配列の一部を置換、欠失もしくは付
加したアミノ酸配列をコードする塩基配列、あるいはこ
れらにハイブリダイズする塩基配列を含む遺伝子を用い
て得られたタンパク質であってもMTf-BPまたはMTfタン
パク質の生物学的機能、即ち軟骨細胞分化誘導活性を有
する限りは本発明の軟骨形成促進剤に使用できる。な
お、MTf-BP またはMTfタンパク質の分離、精製には通常
のタンパク質で用いられる分離、精製方法を使用するこ
とができる。例えば、各種クロマトグラフィー、限外濾
過、塩析、透析などを適宜選択、組み合わせて使用する
ことができる。本発明の軟骨形成促進剤は、上述したMT
f-BP またはMTfをタンパク質の形で投与できる。

【００１９】本発明の軟骨形成促進剤が適用できる疾患
には以下のものが挙げられる： １）ＯＡ（変形性関節症） ２）ＲＡ（リウマチ様関節炎） ３）外傷による関節軟骨損傷 ４）自家軟骨細胞移植における軟骨細胞の形質維持 ５）耳、気管、鼻の軟骨の再建 ６）離断性骨軟骨炎 ７）椎間板、半月板の再生 ８）骨折など骨の再生 MTf-BP はConAに相当する軟骨分化の促進効果があると
期待される。さらに参考例２にウサギ軟骨細胞の培養上
清を添加したMTf過剰細胞が軟骨分化の速度を著しく向
上させたこと示す。また、今回培養上清からMTf-BPを選
択してその軟骨形成促進効果を調べたところ有効である
ことを確認した。MTfと併用することによって、更に軟
骨形成促進の高度化が期待できる。

【００２０】本発明で使用するMTf-BP抗体は、配列番号
２又は４に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも５個の
連続するアミノ酸を有するペプチドを認識する抗体であ
り、定法（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質
Ｉ、p.389〜397,1992参照）を用いて、抗原となる配列
表の配列番号２又は４に示すアミノ酸配列のうち、少な
くとも５個の連続するアミノ酸を有するペプチドを動物
に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製するこ
とによって得ることができる。抗体にはポリクローナル
及びモノクローナル抗体を含み、これらの作製方法も当
業者に公知である。本発明の診断方法は、ヒトの各種組
織から準備された生体試料に対してMTf-BPを特定するヌ
クレオチド配列のレクチン様領域との結合を検出するこ
とによって行われる。本発明のMTf-BPは動物レクチン様
アミノ酸配列を持ち、生物防御に動物レクチンが係わっ
ていることが知られているので、MTf-BPの過剰な発現は
生体防御の異常を反映するから、該異常をレクチン様領
域を有するＤＮＡを用いて診断できる。また、軟骨・骨
細胞以外の細胞にも動物レクチンが作用することが考え
られる。また細胞外マトリックスの構築にも動物レクチ
ンの作用が考えられる。したがって、MTf-BPは軟骨に対
する分化促進作用以外にもレクチン様の多様な作用を持
つことが考えられる。更に、ＭＴｆは軟骨以外にも、
癌、発育中の小腸、分化段階の好酸球、脳の一部（E.J.
Biochem,のイントロン考察）にも発現しているので、Ｍ
Ｔｆ−ＢＰは軟骨分化の薬剤として以外にも薬剤として
使用が期待できる。

【００２１】本発明を以下の参考例１，２、および実施
例１によって、ＭＴｆおよびＭＴｆ−ＢＰの作用効果に
ついてさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定さ
れない。当業者には種々の変更、修飾が可能であり、こ
れらも本発明の範囲に含まれる。 参考例 実験材料および方法（１）ウサギ軟骨細胞の培養 軟骨細胞は加藤らの方法（Kato et al., ;J. Cell Bio
l. vol. 100, p. 477〜485, 1985）に準じてウサギ肋軟
骨から単離した。すなわち、生後４週齢の雄性日本白色
家兎（広島実験動物）の肋骨の静止軟骨部を分離し、メ
スにて細切した後、8mg/mL アクテテーゼＥ（科研製
薬）と5％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル
培地（DMEM 、Flow Laboratories社）にてｌ時間、0.15
％コラゲナーゼ（Worthington Biochemical社）を含むD
MEMにて3時間インキュベートした後、120μmナイロンフ
ィルターを通過する細胞を回収した。本細胞を細胞培養
用プラスチックシャーレ（Corning社）に播種し、37
℃、 5%CO₂気相下にて10％ウシ胎児血清（三菱化
成）、50μg /mLアスコルビン酸、50U/mLペニシリンGカ
リウム、60μg /mLカナマイシン（以上、明治製菓）を
含むアルファ変法イーグル培地（α-MEM、三光純薬）
（medium A）または、無血清のDMEM（medium B）中で培
養した。

【００２２】（２）マウス軟骨前駆細胞株ATDC5の培養 ATDC5は理研細胞銀行（筑波、日本）より購入した。細
胞は5%ウシ胎児血清（FCS三菱化成）、10μg/mLヒトト
ランスフェリン（Boehringer Mannheim社）および0.3nm
ol/mL亜セレン酸ナトリウム（和光純薬）を含むハムF-1
2培地（Flow Laboratories社）とダルベッコ変法イーグ
ル培地（DMEM、 Flow Laboratories社）を1:1で混合し
た培地（維持培地）にて、37℃、5%CO₂気相下で培養し
た。軟骨分化を誘導する場合は、この維持培地に10μg/
mLウシインスリン（Sigma社）を加えた培地（分化培
地）でATDC5細胞を培養した。

【００２３】（３）ウサギMTfのcDNAクローニングと塩
基配列の決定 コンフルエントに達して3日後のウサギ軟骨細胞からグ
アニジンチオシアネート法によってtotal RNAを抽出し
た。このtotal RNA 1μgからreverse transcription p
olymerase chain reaction(RT-PCR)法によって2本鎖のc
DNAを合成した。そしてヒトMTf（Rose, T.M. et al.,Pr
o NAS 83, 1261-65, 1986）の塩基配列に基づいて5'-GG
CTGGAACGTGCCCGTGGGCTA-3'(forward)（配列番号：
９）、5'-GTCCTGGGCCTTGTCCAGCAGTC-3'(revers)（配列
番号：１０）のプライマー対を設計し、このプライマー
を用いて2本鎖のcDNAより1.5kbのMTf cDNA断片を増幅し
た。得られたcDNA断片をpBluescript II SKベクター（S
tratagene社）のSmaI切断部に組み込んでクローン化
し、Sequenase7-deaza-dGTP DNA sequencing kit(USB
社）を用いて塩基配列を決定した。次に完全長のcDNAを
得るためにMarathon cDNA ampliｆication kit (Clont
ech社）を用いてrapid amplification of cDNA end (RA
CE)を行った。具体的にはウサギ軟骨細胞の2本鎖total
cDNAにMarathon cDNAアダプターをライゲーションし
て、アダプタープライマーと上記で判明したMTfの塩基
配列より設計した特異的プライマー（5'-AGAGGGACTCCGA
GTATCTGGTCTC-3'(forward)（配列番号：１１）と5'-GTC
CGGCCCGACACCAACATCTTC-3'(revers)（配列番号：１
２））を用いてRACEを行った。この増幅されたcDNAサン
プルを4.5%アクリルアミドゲルにて分離して、そのcDNA
の主要バンドをゲルから抽出し、pBluescript II SKベ
クターに組み込んでクローン化した。それらをテンプレ
ートとしてSequenase7-deaza-dGTP DNA sequencing kit
およびABI autosequencer (ABI社)を用いて、MTf全長の
塩基配列を決定した。

【００２４】（４）MTf強制発現ATDC5変異株の作製 ウサギMTf cDNA (Kawamoto T. et al., EJB 1998)の全
長あるいはＣ−末端のGPIアンカー結合に必要な２８残
基に対応する部位を削除したものをpcDNA3.1/Zeo(+)プ
ラスミド発現ベクター（サイトメガロウイルス極初期プ
ロモーター／エンハンサーを含む：Invitrogen社、San
Diego, CA）に組み込んだ。すなわち、全長を含むEcoRI
-NotIフラグメントをベクターより切り出し、pcDNA3.1/
Zeo(+)のEcoRI-NotI部位に組み込んだ。また、GPIアン
カー結合部位を欠失した変異株を作製するには、PCR法
によりＣ−末端の２８アミノ酸手前にストップコドンを
挿入したフラグメントを作製し、配列の確認を行った
後、pcDNA3.1/Zeo(+)のEcoRI-NotI部位に組み込んだ。
このようにして全長のMTf cDNA(MTf Full)とGPIアンカ
ーの欠失したMTf cDNA(MTf (-)GPI)を挿入したプラスミ
ド(pMTf FullあるいはpMTf (-)GPI)を作製し、それぞれ
ATDC5細胞（理研、筑波、日本）にトランスフェクショ
ンした。トランスフェクションにはSuperFect Transfec
tion Reagent(QIAGEN)を用いた。ゼオシン（Zeocin:Inv
itrogen社）により選択し、安定なトランスフォーマン
トを作製した。具体的には、ATDC5細胞を10cmシャーレ
に2x10⁵個の細胞を播種して、翌日、導入するプラスミ
ドDNAを各2μg(pMTf Full及びpMTf (-)GPI)とSuperFect
Transfection Reagent溶液〜40μLをそれぞれ個別に無
血清培地に溶解した後、速やかに混合して、無血清培地
にて洗浄した細胞に添加した。37℃ 5%CO₂気相下で1時
間培養後、血清培地を添加してさらに1日間培養した。
なお、対照としてベクターのみをトランスフェクション
した群も作製した。トランスフェクション1日後、ゼオ
シンを50μg/mL含んだ血清添加培地で選択を開始し、2
日おきに培地交換を行いながら2週間培養した。その結
果、MTf FullおよびMTf (-)GPIを安定に発現するATDC5
細胞変異株を得て、以後はゼオジンを50μg/mL含んだ血
清添加培地で継代した。

【００２５】（５）ATDC5細胞変異株のウサギMTf遺伝子
の発現 ATDC5細胞変異株のウサギMTf遺伝子の発現はNorthern b
lottingにて確認した。具体的にはATDC5変異株よりグア
ニジンチオシアネート法によってtotal RNAを調製し、t
otal RNA 10μgを2.2mol/Lホルムアルデヒドを含有する
1%アガロースゲル中にて電気泳動した後、Hybond-N mem
brane(Amersham社）に転写した。このメンブレンを³²P
でラベルした2.2kbのウサギMTf cDNAプローブで42℃、1
6時間パイプリダイズした。メンブレンを洗浄後、BioMa
x X-ray film(Kodak社)）に-80℃で露光してシグナルを
検出した。その結果、MTf Full株においてはクローンナ
ンバー１、４および５においてウサギMTf遺伝子が強発
現していることを確認した。また、MTf (-)GPI株におい
てはクローンナンバー３、３Ｎ、８、９および１０にお
いてウサギMTf遺伝子が強発現していることを確認し
た。実施例では(-)GPI-3を使用した。

【００２６】（６）ATDC5細胞変異株のウサギMTfタンパ
クの発現 ATDC5細胞変異株のウサギMTfタンパクの発現はWestern
Blottingにて確認した。具体的にはATDC5変異株より膜
画分タンパクを調製して、10μg/laneでSDS-PAGEを行
い、polyvinylidene difluoride membraen(Milipore社)
に転写した。転写したメンブレンは4%スキムミルクてブ
ロッキングした後、抗MTf血清(1:500希釈;Eur. J. Bioc
hem. 256, 503-509(1998)で4℃、14時間反応させた後、
¹²⁵Iヒツジ抗マウスIgG(Fab')2フラグメント（Amersham
社）で室温、2時間反応させた。メンブレンを洗浄後、B
ioMax X-ray filmに- 80℃でエクスポーズして解折を行
った。その結果、MTf Full株においてはクローンナンバ
ー１および５においてウサギMTfタンパクが強発現して
いることを確認した。これらのクローンをMTf過剰発現
株（Full-1およびFull-5）と命名した。

【００２７】参考例１：MTf過剰発現株における軟骨分
化 MTf過剰発現株を6穴マルチウエルプレートに4.0×10⁴個
の細胞を播種して、維持培地にて37℃ 5%CO₂気相下で
培養した。MTf過剰発現株はMTf Full株においてMTfの
遺伝子とタンパクの発現を確認したFull-1およびFull-5
株について検討した。MTf (-)GPI株においては、MTfの
遺伝子の発現を確認したGPI-3株について検討した。対
照細胞として、ATDC5細胞及びpC-1（ベクターのみ）を
同様に調製し、顕微鏡で形態学的特徴を観察した。な
お、細胞形態は、オリンパス位相差顕微鏡を用いて観察
した。一つの培養系から２視野を写真にとり、少なくと
も２００個の細胞を数えて、球形化した細胞の割合を算
定した。インスリン非存在下では対照細胞（pC-1）は軟
骨細胞に分化しないのに対して、MTf過剰発現株（Full-
1およびFull-5）及びMTf (-)GPI株（(-)GPI-3）は20日
以内に分化を開始し、細胞播種29日目には細胞のほぼ全
域が軟骨細胞に分化した。さらに、インスリン(10(g/m
L)存在下(Day 0より添加)で、同様の試験を行った。イ
ンスリン非存在下のときと同様な結果が得られたが、MT
f過剰発現株では、インスリン非存在下よりもさらに分
化が誘導された。すなわち、インスリン非存在下よりも
多くの細胞の細胞形態が軟骨細胞様に"round"してい
た。これらの結果から、MTfは軟骨の分化誘導を促進す
る効果があることが明らかとなり、その効果はインスリ
ンの非存在下でも示された。

【００２８】実施例２：ウサギ軟骨細胞の培養上清添加
の効果 ウサギ軟骨細胞の培養上清は静止軟骨細胞1x10⁶個の細
胞を10cmカルチャーディシユに播種し、medium A (10m
L)にて37℃ 5%CO₂気相下で培養した。コンフルエント
後2日目に無血清のmedium B (5mL)に交換して24時間後
に、培養上清（CM）を回収して実験に供した。なお、CM
は回収後5%になるようにウシ胎児血清を添加した。MTf
過剰発現株（Full-5）および対照株（pC-1）の細胞を、
6穴マルチウエルプレートに各8.0×10⁴個／wellになる
ように細胞を播種して、維持培地にて37℃、5% CO₂気相
下で培養した。コンフルエントに達した3日後（Day 7）
より、先に回収したCMを全体の培養液の60%になるよう
に添加し、同時に10μg/mLウシインスリンを添加して37
℃、5% CO₂気相下でさらに48時間培養した。CM添加開始
48時間後、CMを添加したMTf過剰発現株（Full-5(+)CM）
はほぼすべての細胞が軟骨細胞に分化し、基質合成の盛
んな敷石状の軟骨細胞の形態を示した。これに対し、CM
非添加のMTf発現株（Full-5(-)CM ）は、対照細胞であ
るべクターのみを発現させた細胞株（Pc-2(+)CMおよび
(-)CM）とほぼ同じ細胞形態を示した。ベクターのみを
発現させた細胞株ではCM添加による軟骨細胞の分化誘導
は認められなかった。

【００２９】実施例１：酵母２ハイブリッド法（yeast
two hybrid法）によるMTf-BPの同定MTfと相互作用する
タンパク質をクローニングするためにyeast two-hybrid
system (Chen,C.T.et.a1.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 199
1,Fields,S.and Song,O.K.Nature 1989)を用いた。本実
験ではMATCHMAKER Two-Hybrid System 2 (CLONTECH社)
を使用した。このシステムではpAS2-1ベクターでGAL4の
DNA結合部位と目的タンパク質(MTf)の融合タンパク質を
発現させ、pACT2でGAL4の転写活性化領域とcDNAlibrary
の融合タンパク質を発現させ、両者の相互作用を転写活
性を指標にして検出する。両者が相互作用する場合には
GAL4結合領域の下流にあるレポーター遺伝子(LacZある
いはHIS3)の転写翻訳が起こる。ウサギMTf cDNAのN-末
端のシグナルペプチド(19アミノ酸残基)およびC-末端の
GPIアンカー結合部位(28アミノ酸残基)に対応する塩基
配列を削除したcDNAフラグメントをPCRにより増幅、回収
し、GAL4のDNA結合部位の読み枠に合うようにpAS2-1ベク
ターに組み込んだ(pAS2MTF(-)MTf)。そしてhuman chond
rocyte cDNA libraryを組み込んだpACT2ベクター(CLONT
ECH社)とpAS2MTF(-)MTfをSaccharomyces cerevisiae Y1
90に同時にトランスフェクションした。 MTfと相互作
用するタンパク質を発現しているクローンを選択するた
めに、ヒスチジン(-)培地での生育実験とβ-ガラクトシ
ダーゼプレートアッセイを行った。 その結果、2.1×10
⁶個のクローンから119個の陽性クローンが得られた。
さらに偽陽性のクローンを除くために接合（mating）実
験を行った。 各陽性クローンのpAS2MTF(-)MTfベクタ
ーを取り除いたpACT2-libraryベクターのみを含むY190
細胞をコントロールベクターおよびpAS2MTF(-)MTfを組
み込んだSaccharomyces cerevisiae Y187と接合（matin
g）させた。β-ガラクトシダーゼプレートアッセイの結
果、119個のクローンのうち5個のみが陽性で残りは偽陽
性であった。 5個の陽性クローンからプラスミドを精
製し、 ABI autosequencer(ABI社)を用いてpACT2ベクタ
ーに組み込まれているcDNAの塩基配列を決定した。 そ
の結果、これらのクローンはすべて同じcDNAを含んでお
り、このcDNAがコードすると予想されるタンパク質をMTf
結合タンパク質(MTf-BP)と名付けた。また、コナカバリ
ンＡ（ＣｏｎＡ）とMTf-BPの薬剤としての機序は同等で
あることを確認できた。

【００３０】

【発明の効果】以上述べたように、本発明のＭＴｆ−Ｂ
Ｐは単独で軟骨細胞の分化の促進する機能を持つと同時
に、ＭＴｆと併用することにより、植物由来のＣｏｎＡ
と同様の機序を示し、動物に用いる薬剤として改善され
たものが提供できるという優れた作用効果がもたらされ
る。

【配列表】 <110> 科学技術振興事業団 <120> 新規な軟骨形成促進剤 配列表１ <210> 1 <211> 1226 <212> DNA <213> Human <400> 1 gctgccgcat cccaggctaa gcgccgcgcc gaaagccgtg cggagattgg aggccgcgcg 60 ggtccctggt ctgggccatg tctggctgtg atgctgggga gggagactgt tgttcccgga 120 gatgcggcgc gcaggacaag gagcatccaa gatacctgat cccagaactt tgcaaacagt 180 tttaccattt aggctgggtc actgggactg gaggaggaat tagcttgaag catggcgatg 240 aaatctacat tgctccttca ggagtgcaaa aggaacgaat tcagcctgaa gacatgtttg 300 tttgtgatat aaatgaaaag gacataagtg gaccttcgcc atcgaagaag ctaaaaaaaa 360 gccagtgtac tcctcttttc atgaatgctt acacaatgag aggagcaggt gcagtgattc 420 atacccactc taaagctgct gtgatggcca cacttctctt tccaggacgg gagtttaaaa 480 ttacacatca agagatgata aaaggaataa agaaatgtac ttccggaggg tattatagat 540 atgatgatat gttagtggta cccattattg agaatacacc tgaggagaag accctcaaag 600 atagaatggc tcatgcaatg aatgaatacc cagactcctg tgcagtactg gtcagacgtc 660 atggagtata tgtgtggggg gaaacatggg agaaggccaa aaccatgtgt gagtgttatg 720 actatttatt tgatattgcc gtatcaatga agaaagtagg acttgatcct tcacagctcc 780 cagttggaga aaatggaatt gtctaagcca aaagaaagtc taattatata cagagataaa 840 gctaaacgta attattattt aaatgaaagc tattttttta aatgaattga aatttttcat 900 gatgctacta atttgccact aaatactgca aatggtcacc ctgaatctct tctgacattg 960 gatgttattt gcttatattc ttataatttt aaatgagggc acagtgaaat gaaaatttta 1020 tactctatgt ttctgtttat ttttaaatcc ttaacagcaa aatatttgcc tttaatttct 1080 tttttatata tactctcgag agaattcctc ttaattttta aagatgctgg tgataataaa 1140 attcattaga aaatttcctc attgtggaat gagcattctc ttgttttaat gttggtgtca 1200 gaaaataaat atgaaacatt aagtcc 1226 配列表２ <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Human <400> 2 Met Ser Gly Cys Asp Ala Gly Glu Gly Asp Cys Cys Ser Arg Arg Cys 1 5 10 15 Gly Ala Gln Asp Lys Glu His Pro Arg Tyr Leu Ile Pro Glu Leu Cys 20 25 30 Lys Gln Phe Tyr His Leu Gly Trp Val Thr Gly Thr Gly Gly Gly Ile 35 40 45 Ser Leu Lys His Gly Asp Glu Ile Tyr Ile Ala Pro Ser Gly Val Gln 50 55 60 Lys Glu Arg Ile Gln Pro Glu Asp Met Phe Val Cys Asp Ile Asn Glu 65 70 75 80 Lys Asp Ile Ser Gly Pro Ser Pro Ser Lys Lys Leu Lys Lys Ser Gln 85 90 95 Cys Thr Pro Leu Phe Met Asn Ala Tyr Thr Met Arg Gly Ala Gly Ala 100 105 110 Val Ile His Thr His Ser Lys Ala Ala Val Met Ala Thr Leu Leu Phe 115 120 125 Pro Gly Arg Glu Phe Lys Ile Thr His Gln Glu Met Ile Lys Gly Ile 130 135 140 Lys Lys Cys Thr Ser Gly Gly Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Met Leu Val 145 150 155 160 Val Pro Ile Ile Glu Asn Thr Pro Glu Glu Lys Thr Leu Lys Asp Arg 165 170 175 Met Ala His Ala Met Asn Glu Tyr Pro Asp Ser Cys Ala Val Leu Val 180 185 190 Arg Arg His Gly Val Tyr Val Trp Gly Glu Thr Trp Glu Lys Ala Lys 195 200 205 Thr Met Cys Glu Cys Tyr Asp Tyr Leu Phe Asp Ile Ala Val Ser Met 210 215 220 Lys Lys Val Gly Leu Asp Pro Ser Gln Leu Pro Val Gly Glu Asn Gly 225 230 235 240 Ile Val 配列表３ <210> 3 <211> 840 <212> DNA <213> Mouse <400> 3 gaaccatgtc tggctgtcaa gctcaaggag actgttgctc gcggccgtgt ggcgcgcagg 60 acaaggagca cccccgattc ctgatcccag aactttgcaa acagttttac catctgggct 120 gggtcactgg cactggaggg ggaatcagct tgaagcatgg caatgaaatc tacattgctc 180 cctcaggcgt gcaaaaggag cgcattcagc cagaagacat gtttgtgtgt gacattaatg 240 agcaggacat aagcgggcct ccagcatcta agaagctgaa aaaaagccag tgcactcctc 300 ttttcatgaa tgcttatacc atgagaggag ctggcgcagt gattcatacc cactctaaag 360 ctgctgtgat ggctaccctt ctgtttccag gacaggagtt taaaattaca catcaagaga 420 tgatcaaagg aataaggaaa tgtacctcag gaggctatta cagatacgat gatatgttag 480 tggtacctat tattgagaac actcctgaag agaaggatct caaagaaagg atggctcatg 540 ccatgaatga gtacccagac tcctgtgcgg ttcttgtccg gcgtcatggg gtgtacgtgt 600 ggggagaaac atgggagaaa gcaaaaacca tgtgtgagtg ttatgactac ctgtttgaca 660 ttgctgtctc catgaagaag atgggactcg atccaacaca gctcccagtt ggagaaaatg 720 gaattgtgta agccaagtgg atgcctaagc atctccaaca ataaaacaaa ctcaattatg 780 ccttaaataa aactcagctg cttttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 配列表４ <210> 4 <211> 241 <212> PRT <213> Mouse <400> 4 Met Ser Gly Cys Gln Ala Gln Gly Asp Cys Cys Ser Arg Pro Cys Gly 1 5 10 15 Ala Gln Asp Lys Glu His Pro Arg Phe Leu Ile Pro Glu Leu Cys Lys 20 25 30 Gln Phe Tyr His Leu Gly Trp Val Thr Gly Thr Gly Gly Gly Ile Ser 35 40 45 Leu Lys His Gly Asn Glu Ile Tyr Ile Ala Pro Ser Gly Val Gln Lys 50 55 60 Glu Arg Ile Gln Pro Glu Asp Met Phe Val Cys Asp Ile Asn Glu Gln 65 70 75 80 Asp Ile Ser Gly Pro Pro Ala Ser Lys Lys Leu Lys Lys Ser Gln Cys 85 90 95 Thr Pro Leu Phe Met Asn Ala Tyr Thr Met Arg Gly Ala Gly Ala Val 100 105 110 Ile His Thr His Ser Lys Ala Ala Val Met Ala Thr Leu Leu Phe Pro 115 120 125 Gly Gln Glu Phe Lys Ile Thr His Gln Glu Met Ile Lys Gly Ile Arg 130 135 140 Lys Cys Thr Ser Gly Gly Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Met Leu Val Val 145 150 155 160 Pro Ile Ile Glu Asn Thr Pro Glu Glu Lys Asp Leu Lys Glu Arg Met 165 170 175 Ala His Ala Met Asn Glu Tyr Pro Asp Ser Cys Ala Val Leu Val Arg 180 185 190 Arg His Gly Val Tyr Val Trp Gly Glu Thr Trp Glu Lys Ala Lys Thr 195 200 205 Met Cys Glu Cys Tyr Asp Tyr Leu Phe Asp Ile Ala Val Ser Met Lys 210 215 220 Lys Met Gly Leu Asp Pro Thr Gln Leu Pro Val Gly Glu Asn Gly Ile 225 230 235 240 Val 配列表５ <210> 5 <211> 2388 <212> DNA <213> Rabbit <400> 5 gccgccgctc actcgttcgc actcggactc agacccagtc cgaccccctg gactgcgcca 60 tgcggtgccg aagcgcggct atgtggatct tcctggccct gcgcaccgca ctcggcagcg 120 tggaggtgcg gtggtgcacc gcgtccgagc ccgagcagca gaagtgcgag gacatgagcc 180 aggccttccg cgaagccggc ctccagcccg ccctgctgtg cgtgcagggc acctcggccg 240 accactgcgt ccagctcatc gcggcccacg aggccgacgc catcactctg gacggaggag 300 ccatttacga ggcggggaag gaacacggcc tgaagcccgt ggtgggcgaa gtgtatgacc 360 aagaggtggg cacctcctac tacgctgtgg ccgtggtcaa gaggagctcc aacgtgacca 420 tcaacaccct gagaggcgtg aagtcctgcc acacgggcat caaccgcacg gtgggctgga 480 acgtgcctgt gggctacctg gtggacagcg gccgcctctc agtgatgggc tgtgacgtgc 540 tcaaagcggt cagcgagtac ttcgggggca gctgcgtccc tggggcagga gagaccagat 600 actcggagtc cctctgtcgc ctctgccggg gcgacacctc cggggagggg gtgtgtgaca 660 agagccccct ggagcggtac tacgactaca gcggggcctt ccggtgcctg gcagaaggcg 720 caggggacgt ggcctttgtg aagcacagca cggtgctgga gaacacggat gggagaacac 780 tgccctcctg gggccacatg ctgatgtcac gggactttga gctgctgtgc cgggacggca 840 gccgggccag cgtcaccgag tggcagcact gccacctggc ccgggtgccc gcccacgccg 900 tggtggtccg ggccgacacc gacgcaggcc tcatcttccg gcttctcaat gagggccagc 960 ggctgttcag ccacgagggc agcagcttcc agatgttcag ctcggaggcc tacggccaga 1020 agaacctgct gttcaaagac tccacgctgg agctggtgcc catcgccaca cagacctacg 1080 aggcctggct gggccccgag tacctgcacg ccatgaaggg tctgctctgt gaccccaacc 1140 ggctgccccc atacctgcgc tggtgcgtgc tgtccacccc cgagatccag aagtgtggag 1200 acatggccgt ggccttcagc cggcagaggc tcaagccgga gatccagtgt gtctcggcgg 1260 agtcccccca gcactgcatg gagcagatcc aggctgggca catcgatgct gtgaccctga 1320 acggggagga cattcacaca gcggggaaga cttatgggct gatcccggct gccggggagc 1380 tgtatgccgc ggacgacagg agtaactcgt acttcgtggt ggccgtggtg aagcgagaca 1440 gcgcctacgc cttcaccgtg gacgagctgc gcgggaagcg ctcctgccac cccggcttcg 1500 gcagcccggc cggctgggac gtcccggtgg gcgccctcat ccactggggc tacatccggc 1560 ccaggaactg cgacgtcctc acagcggtgg gtcagttctt caacgccagc tgtgtgccgg 1620 tgaacaaccc caagaagtac ccctcctcgc tgtgcgcact ctgcgtgggt gacgagcagg 1680 gccgcaacaa gtgcactggc aacagccagg agcggtacta tggcgacagt ggcgccttca 1740 ggtgcctggt ggagggtgca ggggacgtgg ccttcgtcaa gcacacgacc atctttgaca 1800 acacaaatgg ccacaatccc gagccgtggg ctgcccatct gaggagccag gactacgagc 1860 tgctgtgccc caacggcgcg cgagctgagg cgcaccagtt tgccgcctgc aacctggccc 1920 agattccgtc ccacgccgtc atggtgcggc ccgacaccaa catcttcacc gtttacggac 1980 tgctggacaa ggcccaggac ctgtttggag acgaccacaa caagaacggg ttcaagatgt 2040 tcgactcctc cagctaccac ggccgagacc tgctcttcaa ggacgccacg gtgcgcgctg 2100 tgcctgtggg cgagaggacc acctaccagg actggctggg gccggactac gtggcggctc 2160 tggaagggat gcagtcacag cggtgctcag gggcagccgt cggcgccccc ggggcctcgc 2220 tgctgccgct gctgcccctg gctgcgggcc tcctgctgtc ttcgctctga gagcagcccc 2280 gggcagcctc ggccccggca ggggagcctg cgcggaagct tcctgaacga gcccgcgccc 2340 tggctggatg tggttacctc ggcgagccgc ggggccgcgc ttcccccg 2388 配列表６ <210> 6 <211> 736 <212> PRT <213> Rabbit <400> 6 Met Arg Cys Arg Ser Ala Ala Met Trp Ile Phe Leu Ala Leu Arg Thr 1 5 10 15 Ala Leu Gly Ser Val Glu Val Arg Trp Cys Thr Ala Ser Glu Pro Glu 20 25 30 Gln Gln Lys Cys Glu Asp Met Ser Gln Ala Phe Arg Glu Ala Gly Leu 35 40 45 Gln Pro Ala Leu Leu Cys Val Gln Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val 50 55 60 Gln Leu Ile Ala Ala His Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Ile Tyr Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly 85 90 95 Glu Val Tyr Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val 100 105 110 Val Lys Arg Ser Ser Asn Val Thr Ile Asn Thr Leu Arg Gly Val Lys 115 120 125 Ser Cys His Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val 130 135 140 Gly Tyr Leu Val Asp Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val 145 150 155 160 Leu Lys Ala Val Ser Glu Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala 165 170 175 Gly Glu Thr Arg Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp 180 185 190 Thr Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr 195 200 205 Asp Tyr Ser Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val 210 215 220 Ala Phe Val Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Arg Thr 225 230 235 240 Leu Pro Ser Trp Gly His Met Leu Met Ser Arg Asp Phe Glu Leu Leu 245 250 255 Cys Arg Asp Gly Ser Arg Ala Ser Val Thr Glu Trp Gln His Cys His 260 265 270 Leu Ala Arg Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp 275 280 285 Ala Gly Leu Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser 290 295 300 His Glu Gly Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln 305 310 315 320 Lys Asn Leu Leu Phe Lys Asp Ser Thr Leu Glu Leu Val Pro Ile Ala 325 330 335 Thr Gln Thr Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Pro Glu Tyr Leu His Ala Met 340 345 350 Lys Gly Leu Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp 355 360 365 Cys Val Leu Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val 370 375 380 Ala Phe Ser Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala 385 390 395 400 Glu Ser Pro Gln His Cys Met Glu Gln Ile Gln Ala Gly His Ile Asp 405 410 415 Ala Val Thr Leu Asn Gly Glu Asp Ile His Thr Ala Gly Lys Thr Tyr 420 425 430 Gly Leu Ile Pro Ala Ala Gly Glu Leu Tyr Ala Ala Asp Asp Arg Ser 435 440 445 Asn Ser Tyr Phe Val Val Ala Val Val Lys Arg Asp Ser Ala Tyr Ala 450 455 460 Phe Thr Val Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Pro Gly Phe 465 470 475 480 Gly Ser Pro Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile His Trp 485 490 495 Gly Tyr Ile Arg Pro Arg Asn Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Gly Gln 500 505 510 Phe Phe Asn Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Lys Tyr Pro 515 520 525 Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys 530 535 540 Cys Thr Gly Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Asp Ser Gly Ala Phe 545 550 555 560 Arg Cys Leu Val Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Thr 565 570 575 Thr Ile Phe Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Pro Glu Pro Trp Ala Ala 580 585 590 His Leu Arg Ser Gln Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg 595 600 605 Ala Glu Ala His Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Ser 610 615 620 His Ala Val Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly 625 630 635 640 Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn 645 650 655 Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser Ser Ser Tyr His Gly Arg Asp Leu Leu 660 665 670 Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu Arg Thr Thr 675 680 685 Tyr Gln Asp Trp Leu Gly Pro Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met 690 695 700 Gln Ser Gln Arg Cys Ser Gly Ala Ala Val Gly Ala Pro Gly Ala Ser 705 710 715 720 Leu Leu Pro Leu Leu Pro Leu Ala Ala Gly Leu Leu Leu Ser Ser Leu 725 730 735 配列表７ <210> 7 <211> 2368 <212> DNA <213> Human <400> 7 gcggacttcc tcggacccgg acccagcccc agcccggccc cagccagccc cgacggcgcc 60 atgcggggtc cgagcggggc tctgtggctg ctcctggctc tgcgcaccgt gctcggaggc 120 atggaggtgc ggtggtgcgc cacctcggac ccagagcagc acaagtgcgg caacatgagc 180 gaggccttcc gggaagcggg catccagccc tccctcctct gcgtccgggg cacctccgcc 240 gaccactgcg tccagctcat cgcggcccag gaggctgacg ccatcactct ggatggagga 300 gccatctatg aggcgggaaa ggagcacggc ctgaagccgg tggtgggcga agtgtacgat 360 caagaggtcg gtacctccta ttacgccgtg gctgtggtca ggaggagctc ccatgtgacc 420 attgacaccc tgaaaggcgt gaagtcctgc cacacgggca tcaatcgcac agtgggctgg 480 aacgtgcccg tgggctacct ggtggagagc ggccgcctct cggtgatggg ctgcgatgta 540 ctcaaagctg tcagcgacta ttttgggggc agctgcgtcc cgggggcagg agagaccagt 600 tactctgagt ccctctgtcg cctctgcagg ggtgacagct ctggggaagg ggtgtgtgac 660 aagagccccc tggagagata ctacgactac agcggggcct tccggtgcct ggcggaaggg 720 gcaggggacg tggcttttgt gaagcacagc acggtactgg agaacacgga tgggaagacg 780 cttccctcct ggggccaggc cctgctgtca caggacttcg agctgctgtg ccgggatggt 840 agccgggccg atgtcaccga gtggaggcag tgccatctgg cccgggtgcc tgctcacgcc 900 gtggtggtcc gggccgacac agatgggggc ctcatcttcc ggctgctcaa cgaaggccag 960 cgtctgttca gccacgaggg cagcagcttc cagatgttca gctctgaggc ctatggccag 1020 aaggatctac tcttcaaaga ctctacctcg gagcttgtgc ccatcgccac acagacctat 1080 gaggcgtggc tgggccatga gtacctgcac gccatgaagg gtctgctctg tgaccccaac 1140 cggctgcccc cctacctgcg ctggtgtgtg ctctccactc ccgagatcca gaagtgtgga 1200 gacatggccg tggccttccg ccggcagcgc ctcaagccag agatccagtg cgtgtcagcc 1260 aagtcccccc aacactgcat ggagcggatc caggctgagc aggtcgacgc tgtgacccta 1320 agtggcgagg acatttacac ggcggggaag aagtacggcc tggttcccgc agccggcgag 1380 cactatgccc cggaagacag cagcaactcg tactacgtgg tggccgtggt gagacgggac 1440 agctcccacg ccttcacctt ggatgagctt cggggcaagc gctcctgcca cgccggtttc 1500 ggcagccctg caggctggga tgtccccgtg ggtgccctta ttcagagagg cttcatccgg 1560 cccaaggact gtgacgtcct cacagcagtg agcgagttct tcaatgccag ctgcgtgccc 1620 gtgaacaacc ccaagaacta cccctcctcg ctgtgtgcac tgtgcgtggg ggacgagcag 1680 ggccgcaaca agtgtgtggg caacagccag gagcggtatt acggctaccg cggcgccttc 1740 aggtgcctgg tggagaatgc gggtgacgtt gccttcgtca ggcacacaac cgtctttgac 1800 aacacaaacg gccacaattc cgagccctgg gctgctgagc tcaggtcaga ggactatgaa 1860 ctgctgtgcc ccaacggggc ccgagccgag gtgtcccagt ttgcagcctg caacctggca 1920 cagataccac cccacgccgt gatggtccgg cccgacacca acatcttcac cgtgtatgga 1980 ctgctggaca aggcccagga cctgtttgga gacgaccaca ataagaacgg gttcaaaatg 2040 ttcgactcct ccaactatca tggccaagac ctgcttttca aggatgccac cgtccgggcg 2100 gtgcctgtcg gagagaaaac cacctaccgc ggctggctgg ggctggacta cgtggcggcg 2160 ctggaaggga tgtcgtctca gcagtgctcg ggcgcagcgg ccccggcgcc cggggcgccc 2220 ctgctcccgc tgctgctgcc cgccctcgcc gcccgcctgc tcccgcccgc cctctgagcc 2280 cggccgcccc gccccagagc tccgatgccc gcccggggag tttccgcggc ggcctctcgc 2340 gctgcggaat ccagaaggaa gctcgcga 2368 配列表８ <210> 8 <211> 738 <212> PRT <213> Human <400> 8 Met Arg Gly Pro Ser Gly Ala Leu Trp Leu Leu Leu Ala Leu Arg Thr 1 5 10 15 Val Leu Gly Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu 20 25 30 Gln His Lys Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile 35 40 45 Gln Pro Ser Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val 50 55 60 Gln Leu Ile Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Ile Tyr Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly 85 90 95 Glu Val Tyr Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val 100 105 110 Val Arg Arg Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys 115 120 125 Ser Cys His Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val 130 135 140 Gly Tyr Leu Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val 145 150 155 160 Leu Lys Ala Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala 165 170 175 Gly Glu Thr Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp 180 185 190 Ser Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr 195 200 205 Asp Tyr Ser Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val 210 215 220 Ala Phe Val Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr 225 230 235 240 Leu Pro Ser Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu 245 250 255 Cys Arg Asp Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His 260 265 270 Leu Ala Arg Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp 275 280 285 Gly Gly Leu Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser 290 295 300 His Glu Gly Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln 305 310 315 320 Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala 325 330 335 Thr Gln Thr Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met 340 345 350 Lys Gly Leu Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp 355 360 365 Cys Val Leu Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val 370 375 380 Ala Phe Arg Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala 385 390 395 400 Lys Ser Pro Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp 405 410 415 Ala Val Thr Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Lys Tyr 420 425 430 Gly Leu Val Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser 435 440 445 Asn Ser Tyr Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala 450 455 460 Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe 465 470 475 480 Gly Ser Pro Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg 485 490 495 Gly Phe Ile Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu 500 505 510 Phe Phe Asn Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro 515 520 525 Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys 530 535 540 Cys Val Gly Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe 545 550 555 560 Arg Cys Leu Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr 565 570 575 Thr Val Phe Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala 580 585 590 Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg 595 600 605 Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro 610 615 620 His Ala Val Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly 625 630 635 640 Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn 645 650 655 Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu 660 665 670 Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr 675 680 685 Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met 690 695 700 Ser Ser Gln Gln Cys Ser Gly Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ala Pro 705 710 715 720 Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ala Leu Ala Ala Arg Leu Leu Pro Pro 725 730 735 Ala Leu 配列表９ <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificial Sequence: <400> 9 ggctggaacg tgcccgtggg cta 23 配列表１０ <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificial Sequence: <400> 10 gtcctgggcc ttgtccagca gtc 23 配列表１１ <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificial Sequence: <400> 11 agagggactc cgagtatctg gtctc 25 配列表１２ <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificial Sequence: <400> 12 gtccggcccg acaccaacat cttc 24

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ０７Ｋ 14/42 33/566 14/51 // Ｃ０７Ｋ 14/42 14/79 14/51 Ａ６１Ｋ 37/02 14/79 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 GA11 HA12 HA15 4B063 QA19 QQ02 QQ79 QQ96 QR08 QR42 QR55 QR62 QS25 QS32 QS33 QX02 4C084 AA01 BA01 BA08 BA22 BA24 CA56 MA01 NA14 ZA962 ZC751 4H045 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 DA80 EA28 EA50 FA74

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 MTf結合タンパク質（MTf-BP）を含む軟
   骨形成促進剤。
2. 【請求項２】 MTf結合タンパク質が配列表：配列番号
   ２および／または４に示すポリペプチドである請求項１
   記載の軟骨形成促進剤。
3. 【請求項３】 MTf結合タンパク質（MTf-BP）と膜結合
   型トランスフェリン様タンパク（MTf）を併用すること
   を特徴とする軟骨形成促進剤。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のタンパク質に対して特
   異的な抗体。
5. 【請求項５】 準備された生体試料に対して、配列表：
   配列番号１および／または３に示すヌクレオチド配列の
   レクチン様領域に対応する部分との結合を検出すること
   を特徴とする、生体防御・細胞分化・細胞増殖・細胞外
   マトリックス構築の疾患の診断方法。