CN113368305A - 一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用 - Google Patents

一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113368305A
CN113368305A CN202110558714.4A CN202110558714A CN113368305A CN 113368305 A CN113368305 A CN 113368305A CN 202110558714 A CN202110558714 A CN 202110558714A CN 113368305 A CN113368305 A CN 113368305A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bmp
dopa
dbco
peg
tio
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110558714.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113368305B (zh
Inventor
崔文国
王涛
潘国庆
齐进
邓廉夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI INSTITUTE OF TRAUMATOLOGY AND ORTHOPEDICS
Original Assignee
SHANGHAI INSTITUTE OF TRAUMATOLOGY AND ORTHOPEDICS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI INSTITUTE OF TRAUMATOLOGY AND ORTHOPEDICS filed Critical SHANGHAI INSTITUTE OF TRAUMATOLOGY AND ORTHOPEDICS
Priority to CN202110558714.4A priority Critical patent/CN113368305B/zh
Publication of CN113368305A publication Critical patent/CN113368305A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113368305B publication Critical patent/CN113368305B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/04—Metals or alloys
    • A61L27/06—Titanium or titanium alloys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/30—Inorganic materials
    • A61L27/306—Other specific inorganic materials not covered by A61L27/303 - A61L27/32
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/02—Inorganic materials
    • A61L31/022—Metals or alloys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/08—Materials for coatings
    • A61L31/082—Inorganic materials
    • A61L31/088—Other specific inorganic materials not covered by A61L31/084 or A61L31/086
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/08—Materials for coatings
    • A61L31/10—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L31/16—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/10—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing inorganic materials
    • A61L2300/102—Metals or metal compounds, e.g. salts such as bicarbonates, carbonates, oxides, zeolites, silicates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/602—Type of release, e.g. controlled, sustained, slow
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2420/00—Materials or methods for coatings medical devices
    • A61L2420/02—Methods for coating medical devices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2420/00—Materials or methods for coatings medical devices
    • A61L2420/04—Coatings containing a composite material such as inorganic/organic, i.e. material comprising different phases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明提供了一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合方面的应用。本发明提供的方法是借助贻贝分子介导金属‑酚配位化学和生物正交反应策略，设计了一种具有免疫调节活性和骨诱导的双效涂层的骨内植物。通过贻贝分子表面粘附化学、离子配位和生物正交反应将具有免疫活性的Zn2+和骨诱导性能的BMP‑2肽共同修饰在骨内植物的表面，发现该Zn/BMP‑2双效应涂层可以更好地改善骨内植物的生物相容性，促进巨噬细胞向抗炎M2表型的极化，协同改善骨‑内植物界面的免疫微环境诱导骨‑内植物界面的最佳成骨性能和骨整合效应，从而提高体内的机械稳定性。

Description

一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用
技术领域
本发明属于医用植入材料表面处理技术领域，具体涉及一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用。
背景技术
金属、聚合物或陶瓷等生物材料作为骨替代物广泛应用于骨折内固定、关节置换术、脊柱重建等临床手术治疗中。然而，这些外源性生物植入材料很难完全适应组织损伤引起的组织反应，并在骨-内植物界面创造利于骨整合的生理微环境，究其主要原因在于骨整合过程的复杂性。组织再生的研究表明，骨整合的过程也涉及三个不可或缺的阶段：(1)组织炎症反应阶段；(2)成骨细胞增殖和新骨组织形成阶段；(3)骨的重塑和成熟阶段。然而，以往对生物材料的设计为了尽可能地避免宿主的炎症免疫反应，或者在骨植入材料表面更好地诱导成骨，这种单一方面的考虑并不能完全适应生物材料植入后的体内微环境的变化，从而导致体外和体内的结果并不完全一致。
近年来，随着骨免疫学的深入研究，除了内植物表面的直接诱导成骨的能力以外，骨-内植物界面的免疫微环境在骨整合的过程中也起着非常重要作用。通过调节材料表面物理性质(例如，形貌、亲/疏水性、电荷等)、结合细胞因子(例如，白介素-4(IL-4)、LipoxinA4(LxA4等)或负载无机金属活性离子(例如， Ca2+，Zn2+，Sr2+等)，均可调控周围组织的免疫微环境达到增强体内骨整合效应的作用。以上研究均表明了免疫调节的双重性：一方面，巨噬细胞和其他免疫细胞可以清除细胞碎片，对抗微生物，激活炎症和促进纤维化；另一方面，巨噬细胞还可以通过激活干细胞/祖细胞和重塑细胞外基质来协同促进组织愈合过程。因此，新一代骨内植物的设计应该考虑直接诱导成骨和免疫调节的双重生物学功能，以精确地适应骨组织再生的复杂过程，并在骨-种植体界面实现更加满意的骨整合效应。
理想的骨植入材料应具备良好的骨诱导性能和骨免疫调节活性功能。表面生物工程策略代表一类通过简单的方法可赋予各种生物材料表面活性及多重生物学功能，能够满足生物功能多样性的要求。因此，能够共同调节干细胞/祖细胞和免疫细胞的多功能骨内植物可以很容易地通过表面生物工程策略对生物材料表面共修饰获得，进而可营造利于内植物-骨界面骨整合的微环境。
迄今为止，各种物理或化学手段已被广泛用于表面生物工程策略的开发。例如，层层自组装和Langmuir-Blodgett沉积硅烷化、阳极氧化、酸蚀和离子掺杂等技术广泛应用于不同生物活性基团(例如肽、蛋白质甚至离子)来功能化修饰骨内植物表面，使其具有独特的生物活性。由于物理方法存在不同程度的分子泄漏和缺乏长期的生物活性，因此目前骨内植物表面生物工程策略主要依赖于化学结合的方法。然而，这些传统的化学方法大多涉及繁琐的化学反应以及复杂的表面处理技术。除了对生物活性分子存在潜在的损伤外，复杂的过程也使得它们可控性低和操作性差而难以应用于多组分的表面修饰。在这种情况下，寻求一种简单且生物相容性好的表面工程化策略能够有效地结合多种生物学功能，特别是对于适应骨组织再生复杂的生理过程而设计的具有免疫调节和直接诱导成骨的双重生物学功能的仿生涂层具有重要的临床意义。
中国专利文献CN 112073648A公开了一种医用金属表面抗感染-促进骨整合的涂层，其中内层为纳米结构层，外层为磷酸钙盐层，内、外层中均掺杂有生理必需多功能性无机金属离子，无机金属离子的含量水平自内层到外层呈逐渐下降的梯度分布。该抗感染-促进骨整合涂层用于医用金属表面可适用于牙种植体、骨连接板、骨重建多孔支架、髓内假体、内固定支架、外固定支架或关节假体等，具备长效抗感染并能促进骨整合的功效，但该专利文献中主要对涂层的抗感染能力进行了评价，未对涂层的复杂表面共修饰和调节免疫反应与直接诱导新生组织形成进行双重考虑，未涉及双重生物学功能仿生涂层的研究。
中国专利文献CN 102327645 A公开了一种负载生物活性因子的仿生涂层的制备方法，其是通过在碳化二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺催化体系下，将含双硫键的RGD多肽链段接枝到聚电解质上，再配制成RGD接枝的聚阴离子电解质溶液和RGD接枝的负载生物活性因子聚阳离子电解质溶液，将聚阴离子电解质溶液和负载生物活性因子的聚阳离子电解质溶液组合，利用静电自组装技术，在种植体表面构建负载有生物活性因子的有机复合涂层，但是其制备方法复杂，涂层与金属材料表面的粘附性差，涂层应用效果有待进一步提高。
2007年，Lee等人通过多巴胺聚合的方式开发了一种新型的表面生物工程化策略。受海洋贻贝足蛋白(Mfps)分子粘附机制的启发，其中儿茶酚氨基酸(3， 4-二羟基-L-苯丙氨酸，DOPA)重复单元具有多重邻苯二酚基团，可通过共价和非共价的方式介导分子粘附。同样，富含儿茶酚的聚多巴胺可以在几乎所有的生物材料表面实现稳健的分子粘附。此外，表面邻苯二酚残基不仅通过迈克尔加成或希夫碱反应使含氨基硫醇的生物分子易于结合，而且与生物活性无机金属离子可发生自发配位组装。这一优点预示着贻贝启发的表面工程策略能够将骨诱导的生物分子和免疫调节活性金属活性离子共同修饰在骨内植物的表面。但是，目前这种策略的主要问题在于随机性消耗生物活性分子中的活性基团(例如氨基和硫醇)，这将对共轭偶联生物活性分子的功能产生不利影响，甚至失活，从而影响其免疫反应和新组织形成，而这一问题亟待解决。
中国专利文献CN 111643732 A公开了一种具有二氧化钛金属卟啉涂层的医用植入材料制备方法，其是在预处理后的医用钛或钛合金样品表面通过微弧氧化技术制备TiO2纳米涂层，然后将样本材料在多巴胺溶液中聚合一层聚多巴胺，再将样本置于金属卟啉有机框架合成的前驱体溶液中，在多孔的表面上通过 PDA的诱导原位生长金属卟啉有机框架涂层，最后将所获得的样品材料浸泡于骨活性因子材料溶液中进行负载。该专利方法中应用了多巴胺的超强粘附性和金属卟啉有机框架的生物可降解性、光敏性和抗菌性，并在金属卟啉有机框架的微孔上负载活性因子，从而解决医疗器械植入细菌感染与骨诱导的问题，该涂层不仅与基地结合牢固，生物相容性好，还具有良好的光动力抗菌作用以及骨诱导再生的效果，能够克服钛及其钛合金医疗器械植入细菌感染与骨生长缺陷。但是该专利方法制备工艺复杂，需要利用微弧氧化技术来制备TiO2纳米涂层，需要在 TiO2材料上面原位生长金属卟啉有机框架，而且需要复杂的工艺步骤来制备金属卟啉有机框架，且制备时间长，制备条件苛刻，需要在高温和超声条件下处理，并需要使用聚四氟乙烯高压反应釜。另一方面，该制备方法所获得的涂层材料结构并未实现金属离子与骨活性因子的有效表面负载，并不能充分发挥金属离子和骨活性因子材料的双效功能，仅仅是依赖于负载在金属卟啉有机框架微孔内的骨活性因子发挥骨整合的作用，无法充分发挥出金属离子的免疫活性功能和骨活性因子的诱导新生组织生成的功能，该涂层结构仍有待进一步改进和研究。
因此，如何提供一种策略来改进上述表面仿生工程的缺点，以实现具有免疫调节和骨诱导双重生物学效应的骨内植物的仿生表面改性材料，极大地提高其可制备性和粘附性，提升其使用性能，并能获得最佳成骨性能和骨整合效应，提高金属材料在体内的机械稳定性，成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用。本发明通过贻贝分子介导的金属-酚配位化学与生物正交点击反应相结合的方式来实现现有表面仿生材料的改性。基于生物正交点击化学的特异性分子修饰策略和贻贝灵感通用性表面粘附机制，实现了生物活性分子和金属活性离子的共同负载，获得了一种具有免疫调节和骨诱导双重生物学效应的骨内植物的仿生表面涂层。该涂层材料具备优良的可制备性和高效的粘附性，提升其在金属植入材料中的使用性能，并能获得最佳成骨性能和骨整合效应，大大提高了金属材料在体内的机械稳定性。
本发明的目的之一是提供一种骨诱导和免疫双效涂层的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用固相多肽合成法得到贻贝衍生肽，记为(DOPA)6-PEG5-DBCO，该贻贝衍生肽含多重儿茶酚氨基酸(DOPA)结构单元，并具有可生物点击的二苯基环辛炔(DBCO)基团；
(2)将金属离子Zn2+与步骤(1)的贻贝衍生肽的儿茶酚表面残基配位螯合，获得具有免疫活性的生物活性表面；
(3)将BMP-2衍生肽进行叠氮耦联，获得叠氮修饰的BMP-2衍生肽，记为(2-Azido)-PEG5-BMP-2；
(4)将步骤(2)和步骤(3)所得物通过叠氮与二苯基环辛炔(DBCO) 基团之间的环加成生物正交点击化学反应实现BMP-2肽的特异性携载，得到具有骨诱导和免疫功能的双效涂层。
本发明提供的上述涂层的制备方法，是通过贻贝分子表面粘附化学、离子配位和生物正交反应将具有免疫活性的金属离子和骨诱导性能的生长因子共同修饰在骨内植物的表面，能够得到一种具有协同增效作用的免疫调节活性和骨诱导的双效涂层的骨内植物，其制备方法简单，反应条件温和，适合工业生产，且本发明方法所制备得到的该双效应涂层表现出更好地改善骨内植物的生物相容性，促进巨噬细胞向抗炎M2表型的极化，改善界面周围的免疫微环境，协同促进骨 -内植物界面获得最佳的骨整合效应，从而提高骨内植物在体内的机械稳定性。实验结果进一步证明，该双效涂层具备的免疫活性和骨诱导性双重性能，能够精确适应体内骨组织再生的生物学机制并创造了良好的生理微环境，其中的金属离子与骨诱导生长因子共修饰表面能够诱导巨噬细胞向M2表型极化效果最好，这可能是由于骨诱导生长因子在这种结合中表现出了潜在的免疫调节功能，激活和增强了金属离子的免疫活性，进而协同促进骨整合效应。
进一步的是，所述步骤(1)中(DOPA)6-PEG5-DBCO的合成方法为：使用丙酮保护的Fmoc-DOPA-OH，采用固相多肽合成法，合成含一个氨基酸间隔的六重儿茶酚氨基酸单元与聚乙二醇长链间隔的二苯基环辛炔基团的贻贝衍生肽，其结构简式为： Ac-(DOPA)-G-(DOPA)-G-(DOPA)-K[(PEG5)-(Mpa)-(Mal-DBCO)]-(DOPA)-G-(DOP A)-G-(DOPA)。
进一步的是，所述步骤(3)中BMP-2衍生肽是从BMP-2蛋白核心序列73-92 个氨基酸片段中提取得到，其氨基酸序列为KIPKASSVPTELSAISTLYL。
进一步的是，所述步骤(3)中(2-Azido)-PEG5-BMP-2是将BMP-2衍生肽分别与2-叠氮乙酸和PEG5羧基耦联得到。
进一步的是，步骤(4)中是在骨内植物材料表面制备Zn2+和BMP-2肽共修饰的双效表面涂层。
进一步的是，所述的骨内植物材料包括医用金属基质、聚合物或陶瓷等生物材料，所述的医用金属基质包括钛或钛合金、316L不锈钢。
进一步的是，所述双效涂层的具体制备步骤如下：
S1：将贻贝衍生肽(DOPA)6-PEG5-DBCO溶于PBS缓冲液中，得到 (DOPA)6-PEG5-DBCO多肽溶液，将TiO2的石英片浸没在上述多肽溶液中，得到 (DOPA)6-PEG5-DBCO修饰TiO2，标记为DBCO-TiO2；
S2：将DBCO-TiO2浸泡在醋酸锌溶液中，利用DBCO-TiO2表面的邻苯二酚残基与Zn2+之间的配位螯合作用，制备得到含Zn的TiO2，标记为Zn；
S3：将叠氮修饰的BMP-2衍生肽(2-Azido)-PEG5-BMP-2通过生物正交点击化学与金属-酚配位化学的方式制备Zn2+和BMP-2肽共修饰TiO2表面的双效涂层，标记为Zn/BMP-2。
进一步的是，步骤S1中所述PBS缓冲液的浓度为0.02mM，pH＝7.2。
本发明的目的之二是提供了由上述方法制备获得的一种骨诱导和免疫双效涂层，该双效应涂层可以更好地改善骨内植物的生物相容性，促进巨噬细胞向抗炎M2表型的极化，协同改善骨-内植物界面的免疫微环境诱导骨-内植物界面的最佳成骨性能和骨整合效应，其中的金属离子和骨诱导性能的生长因子通过贻贝分子表面粘附化学、离子配位和生物正交反应共同修饰在骨内植物的表面，骨诱导生长因子在这种结合中表现出了潜在的免疫调节功能，激活和增强了金属离子的免疫活性，进而协同促进骨整合效应，并大大提高了体内的机械稳定性。
本发明的目的之三是提供上述涂层的应用，其是将该涂层用于促进骨-内植物的骨整合。
本发明的有益效果如下：
本发明借助贻贝分子介导金属-酚配位化学和生物正交反应策略，设计了一种具有免疫调节活性和骨诱导的双效涂层的骨内植物。通过贻贝分子表面粘附化学、离子配位和生物正交反应将具有免疫活性的Zn2+和骨诱导性能的BMP-2肽共同修饰在骨内植物的表面，发现该Zn/BMP-2双效应涂层可以更好地改善骨内植物的生物相容性，促进巨噬细胞向抗炎M2表型的极化，协同改善骨-内植物界面的免疫微环境诱导骨-内植物界面的最佳成骨性能和骨整合效应，从而提高体内的机械稳定性。本发明为设计具有免疫调节和骨诱导双重生物学效应的骨内植物的仿生表面提供一种有效地解决方案，提供了一种简单且生物相容性好的表面工程化策略以有效地结合多种生物学功能，对于适应骨组织再生复杂的生理过程提供了良好的功能。本发明还阐明了直接诱导成骨和免疫调节功能对成骨整合效应的协同作用，对构建骨诱导和免疫调节双效涂层的骨内植物的工程化策略提供了参考。
附图说明
图1：(A，B)(DOPA)6-PEG5-DBCO和(2-Azido)-PEG5-BMP-2的分子结构图；(C， D)两种生物活性多肽的ESI-MS图；(E，F)不同仿生涂层表面的AFM图及表面粗造度的定量结果；(G，H)不同仿生涂层表面的接触角及定量结果；(I)Zn2+和BMP-2肽共修饰表面的SEM-EDS的元素图谱；(J，K，L)不同表面的XPS 结果；(M)Zn/BMP-2涂层表面的元素定量结果；(N)PBS溶液浸泡2周后 Zn/BMP-2表面的N1s的变化；(O)Zn/BMP-2仿生表面的锌离子释放图谱。
图2：(A)(DOPA)6-PEG5-DBCO的分子结构图；(B)(2-Azido)-PEG5-BMP-2的分子结构图。
图3：高效液相色谱纯化(DOPA)6-PEG5-DBCO和(2-Azido)-PEG5-BMP-2两种肽的结果。
图4：叠氮修饰后成骨活性肽(2-Azido)-PEG5-BMP-2的成骨活性。
图5：扫描电子显微镜(SEM)对不同涂层钛表面的形貌观察结果。
图6：(A)BM-MSCs和RAW264.7在不同仿生涂层表面的活/死染色结果；(B) BM-MSCs在不同表面的细胞形态(SEM)；(C)BM-MSCs在不同仿生涂层表面的细胞骨架；(D)BM-MSCs和RAW264.7在不同仿生涂层表面的细胞增殖活性； (E)BM-MSCs和RAW264.7在不同仿生涂层表面的细胞毒性(LDH)；(*p<0.05， **p<0.01与TiO2组比较；#p<0.05,##p<0.01与DBCO-TiO2组比较；&p<0.05， &&p<0.01与组比较)。
图7：(A)实验设计示意图；(B)RAW246.7在LPS刺激下的形态；(C)RAW264.7 在不同仿生涂层表面的细胞形态；(D)“薄饼状”细胞(M1)占总细胞比例的定量结果；(E，F)TNF-α和IL-10细胞因子的分泌；(G，J)不同仿生涂层表面的RAW264.7免疫荧光染色结果：红色(M1标记物：CD86或iNOS，M2标记物：CD206或Arg-1)，绿色(F4/80，一种专门针对小鼠巨噬细胞的单克隆抗体)，蓝色(细胞核)；双阳性巨噬细胞M1(H，I)和M2(K，L)相应百分比；(M-R) RT-PCR定量结果(TNF-α、IL-10、CCR7、CD206、BMP-2、VEGF)。(*p<0.05； **p<0.01)。
图8：(A)实验设计示意图；(B，E)巨噬细胞条件培养基诱导间充质干细胞的碱性磷酸酶染色和(C，G)茜素红染色；(F)不同仿生涂层表面ALP活性测定； (D)免疫荧光染色：(绿色：OPN，红色：细胞骨架，蓝色：细胞核)和(H) 定量结果；(I-L)RT-PCR检测成骨相关基因(ALP、Col-1、Runx2和OPN)的表达。(*p<0.05，**p<0.01)。
图9：(A)ALP、Nuclear、Actin、Merged免疫荧光染色结果；(B)ALP荧光染色的定量分析结果。
图10：(A)动物实验设计示意图；(B)螺钉凹凸螺纹之间直径的钻头示意图。
图11：(A)钛螺钉周围H&E染色，并用(D)纤维层和(E)浸润炎性细胞进行定量比较；(B)钛螺钉周围组织免疫染色图像：绿色(M1：CCR7和M2： CD206)，红色(CD68：大鼠巨噬细胞特异性抗原标记)，蓝色(细胞核)，白色箭头表示双阳性细胞和(F,G)定量双阳性巨噬细胞；(C)钛螺钉周围组织中IL-10 免疫组化和(H)IL-10阳性细胞占总细胞比例的定量。(*p<0.05，**p<0.01与TiO2 组比较；#p<0.05，#p<0.01与DBCO-TiO2组比较；&p<0.05，&&<0.01，与Zn 组比较)。
图12：不同涂层螺钉植入后对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的体内毒性反应结果。
图13：(A)Micro-CT三维重建图像；(B)钛螺钉周围骨生成情况(BMD、BV/TV、Tb.Sp、Th.Tb和Tb.N)；(C-E)钙黄素/茜素红标记新生骨组织及VG染色和(D) 定量结果和骨植入接触(BIC)；(F)钛螺钉的拉拔试验；(G)M2巨噬细胞表型转换和骨诱导作用的骨再生机制示意图(*p<0.05，**p<0.01)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例
1.1贻贝衍生肽的合成及表面改性
(一)贻贝衍生肽(DOPA)6-PEG5-DBCO的合成
模拟Mfps(贻贝足蛋白)的多肽合成方法，采用固相多肽合成策略制备了具有可点击DBCO基团的贻贝衍生肽(参考X.Chen,Y.Gao,Y.Wang,G.Pa n,Smart Materials inMedicine 2021,2,26.和Z.Yang,X.Zhao,R.Hao,Q. Tu,X.Tian,Y.Xiao,K.Xiong,M.Wang,Y.Feng,N.Huang,G.Pan,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.2020,117,16127.)。为了将儿茶酚氨基酸DOPA引入多肽序列中，在固相多肽合成过程中使用了丙酮保护的Fmoc-DOPA(丙酮)-O H。为了保证锌与邻苯二酚基团能够充分反应，合成了含一个氨基酸间隔的六重DOPA单元与聚乙二醇(PEG)长链间隔的DBCO基团的贻贝衍生肽：Ac-(DOP A)-G-(DOPA)-G-(DOPA)-K[(PEG5)-(Mpa)-(Mal-DBCO)]-(DOPA)-G-(DOPA)-G-(D OPA)(记为(DOPA)6-PEG5-DBCO)(图1A和图2A)。
(二)叠氮修饰的BMP-2衍生肽(2-Azido)-PEG5-BMP-2的合成
从BMP-2蛋白核心序列73-92个氨基酸片段中提取的BMP-2衍生肽(KIPKASSVPTELSAISTLYL)分别与2-叠氮乙酸和PEG5羧基耦联，获得叠氮修饰的 BMP-2衍生肽(Azido-KIPKASSVPTELSAISTLYL，(2-Azido)-PEG5-BMP-2)(图 1B和图2B)，其可以很容易地与(DOPA)6-PEG5-DBCO结合，提供灵活的表面改性策略。
首先，用高效液相色谱(HPLC，纯度>95％)纯化这两种合成的肽(结果见图3)。采用电喷雾电离质谱(ESI-MS)对其分子结构进行了验证，(DOPA)6-PE G5-DBCO单一同位素的质量[M+2H]2+和(2-Azido)-PEG5-BMP-2的同位素质量[M +2H]2+分别在1036.69Da和1247.63Da处发现，分别对应着2070.18Da和2492.8 6Da的理论相对分子量(图1C和1D)。这些结果表明，本发明成功合成了可点击的贻贝衍生肽和互补的叠氮修饰的BMP-2衍生肽。进一步研究结果表明，叠氮修饰后成骨活性肽(2-Azido)-PEG5-BMP-2仍表现出良好的成骨活性(图4)。将骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)与(2-Azido)-PEG5-BMP-2肽共同孵育，在14 天后可诱导碱性磷酸盐(ALP)的表达和细胞外基质矿化，表明叠氮修饰的BM P-2衍生肽仍然具有高效的成骨诱导能力。这些结果均表明，成功地制备出了生物可点击的贻贝衍生肽和叠氮修饰成骨活性分子。
(三)贻贝分子/离子共修饰的骨诱导/免疫双效涂层的制备
利用上述两种多肽，借助金属-酚配位化学和生物正交反应在钛基材料表面上制备Zn2+和BMP-2肽共修饰的表面涂层。选用TiO2镀膜的石英片(TiO2)来模拟医用钛材料的表面，用于所有的体外研究。首先，将(DOPA)6-PEG5-DBCO 贻贝衍生肽溶于磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS，0.02mM，pH＝7.2)中，得到 (DOPA)6-PEG5-DBCO多肽溶液，将TiO2的石英片浸没在上述多肽溶液中，制备了(DOPA)6-PEG5-DBCO修饰TiO2(标记为DBCO-TiO2)。然后，将DBCO-TiO2浸泡在醋酸锌(ZnAC2)溶液中，利用DBCO-TiO2表面的邻苯二酚残基与Zn2+之间的配位螯合作用，制备含Zn的TiO2(标记为Zn)。最后，(2-Azido)-PEG5-BMP-2可通过生物正交点击化学与金属-酚配位化学的方式制备Zn2+和BMP-2肽共修饰TiO2表面(标记为Zn/BMP-2)。以BMP-2修饰的表面不负载Zn2+(标记为BMP-2)作为对照。
首先，利用原子力显微镜(AFM)评价仿生多肽修饰后TiO2表面粗糙度的变化(图1E)，发现(DOPA)6-PEG5-DBCO贻贝衍生肽修饰后的表面粗糙度有明显的改变。尽管Zn2+的负载引起的表面粗糙度的改变可忽略，但是 (2-Azido)-PEG5-BMP-2多肽的进一步修饰引起表面粗糙度明显增加。Zn2+或 BMP-2肽修饰后表面亲水性也明显改善(图1G和1H)，可能是由于表面结合了亲水性的Zn2+及BMP-2肽的氨基酸序列。能量色散X射线能谱(EDS)评价Zn2+元素在表面的分布，这一结果进一步证实了成功引入Zn2+(图1I)。虽然，扫描电子显微镜(SEM)对不同涂层钛表面的形貌并无显著的差别(图5)，但是EDS 元素图谱显示，在Zn/BMP-2组表面的Zn元素均匀分布；进一步利用X射线光电子能谱(XPS)测定了Zn/BMP-2表面元素组成，证实了Zn2+和BMP-2肽共修饰(图1J-1L)。
在Zn和Zn/BMP-2的仿生涂层表面可发现Zn2p3/2和Zn2p1/2的信号峰，分别为1021.75Da和1044.85Da(图1L)；而在TiO2组只能发现C、Ti和O元素的信号峰。此外，在DBCO-TiO2、BMP-2和Zn/BMP-2组可以在400.13eV处发现N1s信号。与DBCO-TiO2相比，用(2-Azido)-PEG5-BMP-2对表面进行了进一步的改性(即BMP-2和Zn/BMP-2组)，进一步观察到N1s信号的逐渐增加(图 1K)。例如，N/Ti原子由0.052(TiO2组)增加到0.686(BMP-2组)；Zn/Ti原子比由0.000(TiO2组)到0.003(BMP-2组)(表1)，其定量分析结果显示Zn/BMP-2 表面Zn和N元素的原子百分比分别为2.57％和4.89％，这些均表明Zn2+离子和 BMP-2肽能够成功共修饰在钛基材料表面(图1M)。
表1不同仿生涂层表面的化学组成
Figure RE-RE-GDA0003181728200000101
Figure RE-RE-GDA0003181728200000111
进一步研究，表面BMP-2肽的稳定性和Zn2+的缓释作用，将Zn/BMP-2涂层的钛基材料分别置于完全培养基中(DMEM，37℃)和PBS溶液中孵育2周，其结果如图1N所示，XPS中N1s信号的强度略有下降，小于15％，表明表面修饰的BMP-2肽具有长期的稳定性。另外，Zn2+释放量也与前报道的利用磺化和磁控溅射技术改性聚醚醚酮表面锌的释放曲线相似(图1O)，虽然Zn2+在第一天释放量可高达0.14ppm，在接下来的几天释放减慢，可达一个稳定的释放，持续3-4周。这些结果共同表明Zn/BMP-2涂层成功修饰在TiO2的表面，且能够保持长期的生物活性。
1.2表面细胞相容性
利用小鼠巨噬细胞系(RAW264.7细胞)和骨髓基质干细胞(BM-MSCs) 评价Zn/BMP-2双效涂层的生物相容性。首先，Live/Dead染色结果表明，与纯 TiO2组相比，Zn、BMP-2或Zn/BMP-2共修饰的表面死细胞略有减少(图6A)。此外，还研究了BM-MSCs在不同涂层表面的粘附及细胞形态，进一步评价 Zn/BMP-2表面的细胞相容性。扫描电镜图像显示，与Zn、BMP-2和Zn/BMP-2 表面的细胞相比，BM-MSCs在纯TiO2表面表现出较少的铺展和伪足出现(图6B)。细胞骨架染色(FITC-phalloidin/DAPI)的进一步研究表明，BM-MSCs在 TiO2上培养1天后，大多表现呈圆形；相反，Zn、BMP-2和Zn/BMP-2的表面具有较好的细胞粘铺展，大多呈多角形，细胞微丝蛋白F-actin表达较高(图6C)。培养4天后，各组间细胞粘附和扩散状态并无明显差异。然而，细胞计数(CCK-8) 方法被用来评估BM-MSCs和RAW264.7细胞的增殖，其结果表明，Zn、BMP-2 和Zn/BMP-2的表面RAW264.7和BM-MSCs表现出更好的细胞活力；有趣地是，含Zn2+的仿生表面(即Zn和Zn/BMP-2组)在诱导RAW264.7细胞增殖最快，而含BMP-2肽的仿生表面(即BMP-2和Zn/BMP-2组)更倾向于促进BM-MSCs 增殖(图6D)。这意味着Zn2+和BMP-2肽具有潜在的免疫活性和骨诱导性。上述结果与乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测试结果(图6E)都表明Zn2+和BMP-2肽共修饰的表面对巨噬细胞和BM-MSCs的生长均有积极的影响。Zn2+和BMP-2 肽共修饰的双效涂层能够减少细胞毒性，改善免疫细胞和多潜能干细胞的粘附和增殖，这将是为组织再生创造有利微环境的先决条件。
1.3体外巨噬细胞极化
用于组织修复的生物材料的典型免疫调节是促炎M1巨噬细胞向抗炎M2巨噬细胞的表型转换。研究表明，对于骨科内植入物来说周围过量的M1型巨噬细胞将导致周围骨质的破坏或骨的吸收，这是引起假体植入松动失败的重要因素。有研究已证实，在体内外负载细胞因子或活性离子的功能活性涂层可以促进巨噬细胞M2表型极化，同时改善植入物-骨界面的骨整合。
本发明中，利用借助贻贝衍生肽介导的离子配位和生物正交化学点击策略在骨内植入物表面成功地结合了Zn2+和BMP-2肽。进一步研究了巨噬细胞在 Zn/BMP-2双效涂层表面上的极化状态，明确该仿生策略对免疫微环境调节的影响。首先，利用脂多糖(LPS)的刺激M0巨噬细胞(RAW264.7)。然后，在不同仿生涂层表面培养巨噬细胞，评价各仿生涂层表面巨噬细胞的表型转换(图 7A)。众所周知，M0巨噬细胞的细胞形态大多呈圆形，在LPS刺激后的这些细胞将发育成具有“薄饼状”形态的促炎M1巨噬细胞(图7B)。由于钛基材料表面不同的仿生修饰，则各仿生涂层表面的巨噬细胞表现出不同的形态(图7C)。在没有Zn2+修饰的钛基表面(即TiO2，DBCO-TiO2和BMP-2组)的RAW264.7 细胞大多表现出“薄饼状”；相反，巨噬细胞在Zn2+改性的钛基表面(即Zn和 Zn/BMP-2组)上的细胞形态大多转变为细长型。在Zn和Zn/BMP-2组的仿生涂层表面细长细胞的数量显著增加，这些结果初步表明巨噬细胞从促炎M1表型向抗炎M2表型的转换(图7D)。
M1型和M2型巨噬细胞具有不同的细胞表面标记物以及分泌不同的细胞因子。因此，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时聚合酶链反应(RT-PCR) 分别测定炎症细胞因子分泌水平和基因表达水平，结果如图7E所示。促炎细胞因子TNF-α在TiO2、DBCO-TiO2和BMP-2组中的分泌明显高于Zn2+修饰的仿生涂层(即Zn和Zn/BMP-2组)，这表明巨噬细胞在这些表面大多呈现M1巨噬细胞的表型。相反，Zn和Zn/BMP-2组抗炎细胞因子IL-10的分泌明显增加，显示出Zn2+能够有效抑制炎症作用，促进巨噬细胞向M2表型转换(图7F)。免疫荧光染色进一步标记M1巨噬细胞表面标记物(CD86和iNOS)和M2巨噬细胞表面标记物(CD206和Arg-1)。其结果如图7G-7L所示，在TiO2、DBCO-TiO2和 BMP-2组表面在LPS刺激可上调M1巨噬细胞的比例(F4/80+/CD86+和 F4/80+/iNOS，红色)；相反，在Zn和Zn/BMP-2组的表面抗炎M2型巨噬细胞占主导地位(CD206+和Arg-1+，红色)。我们发现，在Zn/BMP-2组CD206和Arg-1 阳性细胞的百分比最高，iNOS和CD86阳性细胞的百分比最低；同时我们还发现，与TiO2和DBCO-TiO2对照组相比，在BMP-2组也显示出M1巨噬细胞的表面标记物(iNOS和CD86)略有下调，M2巨噬细胞的表面标记物略有上调，可能的原因在于BMP-2蛋白在调节局部骨免疫微环境中发挥了一定的作用。
实时定量PCR分析也显示出和上述类似的结果。在Zn2+存在的情况下，促炎TNF-α基因表达下降和抗炎IL-10的基因表达升高，进一步证实了Zn2+具有调控巨噬细胞向M2表型转变的潜力(图7M和7N)。进一步检测M1型巨噬细胞表面标记物(如，CCR7)和M1型巨噬细胞表面标记物(如，CD206)的表达水平。在Zn和Zn/BMP-2组中，CD206的表达显著增加，相反CCR7的表达进一步减少，这些结果均表明Zn2+具有调节巨噬细胞向M2表型极化的功能(图 7O和7P)。有趣地是从上述结果可以发现Zn2+和BMP-2肽共修饰表面诱导巨噬细胞向M2表型极化效果最好，这可能是由于BMP-2肽具有潜在的免疫调节功能，激活和增强了Zn2+的免疫活性。此外，我们还发现，在含Zn2+修饰组M2巨噬细胞可以上调成骨相关基因表达，如BMP-2和VEGF。其中Zn/BMP-2表面基因表达最高(图7Q和7R)。这些结果预示着Zn2+和BMP-2肽在免疫调节和骨诱导中起到的作用既有不同又能相互融合。因此，Zn/BMP-2的共修饰表面可能为成骨作用提供更有利的微环境，且在骨-种植体界面创造更好的骨整合效应。
1.4免疫调节-体外增强成骨分化
利用巨噬细胞条件培养基(Macrophage Conditioned Medium,MCM)进一步研究Zn/BMP-2表面诱导巨噬细胞向M2表型极化对成骨分化影响(图8A)。将巨噬细胞接种在不同仿生涂层表面，24h后收集巨噬细胞培养液制备条件配眼镜，然后用收集的MCMs诱导骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的成骨分化。培养14天后，测定碱性磷酸盐(ALP)，钙结节和骨桥蛋白(OPN)三种成骨相关蛋白的表达以评价成骨分化。ALP染色可以清楚地发现，与对照组(TiO2和 DBCO-TiO2)相比，MCMs来源于Zn2+或BMP-2肽修饰表面(即Zn、BMP-2 和Zn/BMP-2组)可诱导更高的ALP活性(图8B)。ALP免疫荧光染色进一步证实了这一结果，其中Zn/BMP-2来源的MCM能诱导ALP活性水平最高(图9)；进一步ALP荧光染色的定量分析结果表明，Zn/BMP-2来源的MCM中的ALP 活性比TiO2、DBCO-TiO2、Zn和BMP-2组分别高5.06、4.22、2.00和1.80倍(图8E和8F)。除了ALP蛋白水平外，在钙结合蛋白和OPN的表达中也发现了相似的趋势。茜素红S(ARS)染色显示，在第14天Zn/BMP-2组矿化基质中矿物结节的大小和数量分别是Zn和BMP-2组的1.50倍和1.33倍，这表明Zn/BMP-2 来源的MCM培养的BM-MSCs中最有效的钙沉积(图8C和8G)。OPN免疫荧光染色也证实了Zn/BMP-2来源的MCM成骨分化能力的最强，其中相对Zn和BMP-2组OPN表达分别增加46.10％和34.11％。除上述成骨相关蛋白外，还进一步研究了ALP、成骨相关转录因子(runt-related transcription factor 2，Runx2)、 I型胶原(typeI collagen，Col-1)和OPN(图8I-8L)等成骨相关基因的表达水平。这些成骨相关基因在Zn/BMP-2来源的MCM培养的BM-MSCs中的mRNA 表达均明显高于其他组，证实了Zn/BMP-2来源的MCM能够增强BM-MSCs的成骨分化能力。总之，这些结果表明，Zn2+的免疫活性和BMP-2肽的骨诱导更有利于调控巨噬细胞从M1表型转向M2表型，分泌抗炎及成骨的细胞因子提供最佳的骨免疫微环境，最终促进BM-MSCs的成骨分化。
1.5体内巨噬细胞表型转换
体外研究结果表明，Zn/BMP-2共修饰表面具有优良的性能，包括改善细胞相容性、有效地调节巨噬细胞从M1表型转向M2表型，从而增强骨诱导性能，促进成骨分化。基于体外结果，我们进一步研究在体内的免疫调节活性和成骨特性。选用临床常用的皮质骨自攻钛基螺钉作为骨内植入物的模型。螺钉处理与 TiO2表面处理相同，以获得螺钉表面不同的表面改性，分别命名为DBCO-TiO2、 Zn、BMP-2和Zn/BMP-2；未做任何处理的钛螺钉命名为TiO2。根据标准手术方案对大鼠股骨外髁进行螺钉植入手术。为了最大限度地减少植入过程中表面涂层的破坏，在动物实验中使用了螺钉凹凸螺纹之间直径的钻头(在黄色线图10内)。在植入4天后，取含有钛螺钉的大鼠股骨髁进行组织学分析。苏木精-伊红(H&E) 染色结果显示，与TiO2和DBCO-TiO2组相比，Zn、BMP-2和Zn/BMP-2组的螺钉表现出更温和的炎症反应、更薄的纤维组织层和更完整的骨结构(图11A)。在Zn-BMP-2组中，可以观察到更薄的纤维组织层，而Zn和Zn/BMP-2仿生涂层的钛螺钉显示较温和的炎症反应(图11D和11E)。有趣地是在BMP-2组中的螺钉周围组织纤维化和炎症反应都有所改善，表明BMP-2肽修饰的钛螺钉具有一定潜在的免疫活性。相反，未做处理组的钛螺钉周围有较厚的纤维组织层和炎症细胞的大量浸润，这可能是骨内植物发生失败的重要原因之一。此外，进一步利用免疫荧光染色评估螺钉周围巨噬细胞的表型。CD68标记螺钉周围浸润的炎症细胞，CCR7和CD206分别标记螺钉周围M1巨噬细胞和M2巨噬细胞(图 11B)。免疫荧光结果显示，Zn、BMP-2和Zn/BMP-2组的螺钉周围的CD206标记的细胞(M2型巨噬细胞)明显多于TiO2和DBCO-TiO2对照组中的钛螺钉周围。进一步定量结果表明，M2巨噬细胞在Zn、BMP-2和Zn/BMP-2组中的比例分别为TiO2对照组的1.92倍、1.50倍和2.25倍(图11F)。相比之下，TiO2和 DBCO-TiO2对照组中钛螺丝周围CCR7标记的细胞(M1型巨噬细胞)的数量高于其他组，而Zn/BMP-2组中钛螺钉周围的M1巨噬细胞数量最低(图11G)。免疫组织化学染色的结果进一步表明，与TiO2对照组(5.76％)相比，Zn(10.63％)、 BMP-2(8.16％)和Zn/BMP-2(15.61％)组中的抗炎细胞因子IL-10的分泌显著增加。这一结果进一步证实了Zn/BMP-2在体内拥有最好的免疫活性，并逆转因损伤引起的过度炎症和增强骨-种植体界面的骨整合效应。
1.6体内骨整合效应
以上已证实Zn/BMP-2共修饰表面在体外和体内具有最佳的免疫活性，可以调节巨噬细胞M1/M2的极化，且在体外能够显著增强成骨分化能力。因此，钛螺钉植入8周后对螺钉与骨界面的新骨形成和骨整合进行了评价。首先评估螺钉植入后对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的体内毒性反应，其结果并未观察到明显的组织毒性，表明我们的共修饰策略具有较好生物相容性(图12)。然后，用对获取的带有螺钉的骨组织进行Micro-CT三维重建和组织学分析。Micro-CT扫描结果显示，Zn/BMP-2组的钛螺钉周围产生的新骨组织形成的数量最高，而TiO2对照组仅有少量且不连续的骨组织覆盖(图13A)。Zn/BMP-2组的钛螺钉周围的骨密度(BMD)和骨体积/组织体积(BV/TV)的百分比最高，在兴趣区域(Volume ofInterest，VOI)表现出最佳小梁结构特征(图13B)。其中，Zn/BMP-2组中钛螺钉周围的BV/TV值(82.06±1.46％)分别是Zn(59.77±3.89％)和BMP-2组 (65.35％±3.63％)的1.37和1.26倍。此外，骨小梁分离值、骨小梁厚度TB和骨小梁数，Zn/BMP-2组分别为70.92％、128％和162％，BMP-2组分别为84.28％、 137％和143％。这一结果是可能是由于免疫活性的Zn2+和骨诱导性的BMP-2肽的协同作用所导致，而Zn或BMP-2单独修饰的表面可能不能为骨-内植物界面骨整合提供最有利的免疫微环境。我们利用Calcein(绿色)和茜素红(红色)对钛螺钉周围的新生骨组织进行序贯荧光标记，并得到相似的结果(图13C和 13D)。结果发现，在Zn/BMP-2组中的钛螺钉周围有大面积的新骨矿化(18.80％)，而BMP-2组(11.10％)、Zn组(8.22％)、DBCO-TiO2组(4.20％)和TiO2(3.74％) 组的新骨矿化逐渐减少，定量分析表明，Zn/BMP-2的骨-种植体接触率(Bone implant contact，BIC)明显高于其他组(图13E)。
由于种植体与周围骨组织之间的稳定连接与种植体的临床结果密切相关，因此我们应用生物力学拔出实验来测试钛螺钉在骨组织中的锚固力，结果如图13F 所示。与TiO2对照组相比，Zn、BMP-2和Zn/BMP-2组的最大推出力均有显著提高，表明钛螺钉在骨组织中的稳定性良好。例如，Zn/BMP-2组的最大拔出力 (203.3±14.3N)几乎是TiO2对照组(98.6±16.0N)的2.1倍。这些结果证实 Zn/BMP-2共修饰表面能显著促进骨-内植物界面成骨能力，增强体内骨整合效应。总之，根据组织再生中相互重叠又相互不同的阶段(即免疫反应和愈合过程)，我们证实了免疫调节功能和直接成骨作用促进骨-内植入物之间的骨整合效应至关重要。在这项工作中，骨诱导和免疫调节双效应涂层的种植体表面可以通过贻贝衍生肽介导的离子配位和生物分子点击策略将具有免疫活性的Zn2+和骨诱导性的BMP-2肽联合修饰获得。这种双效涂层不仅能实现巨噬细胞的M2表型的转换，而且还能直接诱导成骨，从而在体内为骨整合创造有利的免疫微环境(图 13G)。因此，这项工作能为改善骨植入物的临床结果提供新的思路和解决方案。

Claims (10)

1.一种骨诱导和免疫双效涂层的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用固相多肽合成法得到贻贝衍生肽，记为(DOPA)6-PEG5-DBCO，该贻贝衍生肽含多重儿茶酚氨基酸结构单元，并具有可生物点击的二苯基环辛炔基团；
(2)将金属离子Zn2+与步骤(1)的贻贝衍生肽的儿茶酚表面残基配位螯合，获得具有免疫活性的生物活性表面；
(3)将BMP-2衍生肽进行叠氮耦联，获得叠氮修饰的BMP-2衍生肽，记为(2-Azido)-PEG5-BMP-2；
(4)将步骤(2)和步骤(3)所得物通过叠氮与二苯基环辛炔基团之间的环加成生物正交点击化学反应实现BMP-2肽的特异性携载，得到具有骨诱导和免疫功能的双效涂层。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中(DOPA)6-PEG5-DBCO的合成方法为：使用丙酮保护的Fmoc-DOPA-OH，采用固相多肽合成法，合成含一个氨基酸间隔的六重儿茶酚氨基酸单元与聚乙二醇长链间隔的二苯基环辛炔基团的贻贝衍生肽，其结构简式为：Ac-(DOPA)-G-(DOPA)-G-(DOPA)-K[(PEG5)-(Mpa)-(Mal-DBCO)]-(DOPA)-G-(DOPA)-G-(DOPA)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中BMP-2衍生肽是从BMP-2蛋白核心序列73-92个氨基酸片段中提取得到，其氨基酸序列为KIPKASSVPTELSAISTLYL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中(2-Azido)-PEG5-BMP-2是将BMP-2衍生肽分别与2-叠氮乙酸和PEG5羧基耦联得到。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中是在骨内植物材料表面制备Zn2+和BMP-2肽共修饰的双效表面涂层。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的骨内植物材料包括医用金属基质、聚合物或陶瓷生物材料，所述的医用金属基质包括钛或钛合金、316L不锈钢。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述双效涂层的具体制备步骤如下：
S1：将贻贝衍生肽(DOPA)6-PEG5-DBCO溶于PBS缓冲液中，得到(DOPA)6-PEG5-DBCO多肽溶液，将TiO2的石英片浸没在上述多肽溶液中，得到(DOPA)6-PEG5-DBCO修饰TiO2，标记为DBCO-TiO2；
S2：将DBCO-TiO2浸泡在醋酸锌溶液中，利用DBCO-TiO2表面的邻苯二酚残基与Zn2+之间的配位螯合作用，制备得到含Zn的TiO2，标记为Zn；
S3：将叠氮修饰的BMP-2衍生肽(2-Azido)-PEG5-BMP-2通过生物正交点击化学与金属-酚配位化学的方式制备Zn2+和BMP-2肽共修饰TiO2表面的双效涂层，标记为Zn/BMP-2。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述PBS缓冲液的浓度为0.02mM，pH＝7.2。
9.一种具有骨诱导和免疫作用的双效涂层，其特征在于，是由权利要求1-8任一项所述方法制备得到。
10.一种如权利要求9所述的双效涂层的应用，其特征在于，是将该双效涂层用于促进骨-内植物的骨整合。
CN202110558714.4A 2021-05-21 2021-05-21 一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用 Active CN113368305B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110558714.4A CN113368305B (zh) 2021-05-21 2021-05-21 一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110558714.4A CN113368305B (zh) 2021-05-21 2021-05-21 一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113368305A true CN113368305A (zh) 2021-09-10
CN113368305B CN113368305B (zh) 2022-04-26

Family

ID=77571648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110558714.4A Active CN113368305B (zh) 2021-05-21 2021-05-21 一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113368305B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113769166A (zh) * 2021-09-26 2021-12-10 四川大学华西医院 包含金属-多酚网络的骨修复材料及其制备方法和用途
CN114146218A (zh) * 2021-12-03 2022-03-08 中国人民解放军空军军医大学 一种多孔peek材料的人工骨及其制备方法
CN114366853A (zh) * 2022-01-20 2022-04-19 华东理工大学 一种高诱骨活性牙种植体涂层及其制备方法
CN114588315A (zh) * 2022-03-14 2022-06-07 东莞市人民医院 抗炎蛋白涂层的制备方法、生物工程功能材料及其应用
CN115429933A (zh) * 2022-09-05 2022-12-06 苏州大学附属第一医院 基于生物正交点击化学反应捕获BMSCs在骨领域中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1492579A1 (en) * 2002-04-09 2005-01-05 Astra Tech AB Medical prosthetic devices having improved biocompatibility
US20140335197A1 (en) * 2013-05-10 2014-11-13 Reed A. Ayers Combustion synthesis of calcium phosphate constructs and powders doped with atoms, molecules, ions, or compounds
CN111116964A (zh) * 2019-12-17 2020-05-08 上海交通大学医学院附属仁济医院 生物功能化表面改性的聚醚醚酮材料及其制备方法与应用
CN111643732A (zh) * 2020-06-03 2020-09-11 西南交通大学 一种具有二氧化钛金属卟啉涂层的医用植入材料制备方法
CN111888522A (zh) * 2020-09-22 2020-11-06 中山大学附属口腔医院 一种具有免疫调控功能的牙周再生材料及其制备方法
CN113144290A (zh) * 2020-09-09 2021-07-23 苏州大学附属第一医院 一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1492579A1 (en) * 2002-04-09 2005-01-05 Astra Tech AB Medical prosthetic devices having improved biocompatibility
US20140335197A1 (en) * 2013-05-10 2014-11-13 Reed A. Ayers Combustion synthesis of calcium phosphate constructs and powders doped with atoms, molecules, ions, or compounds
CN111116964A (zh) * 2019-12-17 2020-05-08 上海交通大学医学院附属仁济医院 生物功能化表面改性的聚醚醚酮材料及其制备方法与应用
CN111643732A (zh) * 2020-06-03 2020-09-11 西南交通大学 一种具有二氧化钛金属卟啉涂层的医用植入材料制备方法
CN113144290A (zh) * 2020-09-09 2021-07-23 苏州大学附属第一医院 一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法
CN111888522A (zh) * 2020-09-22 2020-11-06 中山大学附属口腔医院 一种具有免疫调控功能的牙周再生材料及其制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU W等: "Zinc-modified sulfonated polyetheretherketone surface with immunomodulatory function for guiding cell fate and bone regeneration", 《ADVANCED SCIENCE》 *
PAN G等: "Biomimetic Design of Mussel-Derived Bioactive Peptides for Dual-Functionalization of Titanium-Based Biomaterials", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 *
WANG X等: "Surface bioengineering of diverse orthopaedic implants with optional functions via bioinspired molecular adhesion and bioorthogonal conjugationsj", 《BIOMEDICAL MATERIALS》 *
WANG, TAO等: "Engineering immunomodulatory and osteoinductive implant surfaces via mussel adhesion-mediated ion coordination and molecular clicking", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *
陈岚: "医用钛表面纳米结构及功能元素的免疫应答研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113769166A (zh) * 2021-09-26 2021-12-10 四川大学华西医院 包含金属-多酚网络的骨修复材料及其制备方法和用途
CN114146218A (zh) * 2021-12-03 2022-03-08 中国人民解放军空军军医大学 一种多孔peek材料的人工骨及其制备方法
CN114366853A (zh) * 2022-01-20 2022-04-19 华东理工大学 一种高诱骨活性牙种植体涂层及其制备方法
CN114366853B (zh) * 2022-01-20 2023-04-14 华东理工大学 一种高诱骨活性牙种植体涂层及其制备方法
CN114588315A (zh) * 2022-03-14 2022-06-07 东莞市人民医院 抗炎蛋白涂层的制备方法、生物工程功能材料及其应用
CN115429933A (zh) * 2022-09-05 2022-12-06 苏州大学附属第一医院 基于生物正交点击化学反应捕获BMSCs在骨领域中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113368305B (zh) 2022-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113368305B (zh) 一种骨诱导及免疫双效涂层及制备方法和在骨整合的应用
Wang et al. Engineering immunomodulatory and osteoinductive implant surfaces via mussel adhesion-mediated ion coordination and molecular clicking
US20230037048A1 (en) Extracellular Matrix-Derived Gels and Related Methods
Bai et al. Biomimetic osteogenic peptide with mussel adhesion and osteoimmunomodulatory functions to ameliorate interfacial osseointegration under chronic inflammation
Li et al. The biocompatibility of nanostructured calcium phosphate coated on micro-arc oxidized titanium
Lin et al. Enhanced osteoporotic bone regeneration by strontium-substituted calcium silicate bioactive ceramics
Afzal Implantable zirconia bioceramics for bone repair and replacement: A chronological review
Zhou et al. Improving osteogenesis of three-dimensional porous scaffold based on mineralized recombinant human-like collagen via mussel-inspired polydopamine and effective immobilization of BMP-2-derived peptide
Meng et al. KR-12 coating of polyetheretherketone (PEEK) surface via polydopamine improves osteointegration and antibacterial activity in vivo
Zhou et al. The performance of bone marrow mesenchymal stem cell–implant complexes prepared by cell sheet engineering techniques
Ma et al. Biologically modified polyether ether ketone as dental implant material
WO2008150119A1 (en) Injectable bone regeneration gel containing bone formation enhancing peptide
JPH02218372A (ja) 移植体固定の改良方法
CN113750290A (zh) 聚醚醚酮复合植入物及其制备方法和应用
Xing et al. Osseointegration of layer-by-layer polyelectrolyte multilayers loaded with IGF1 and coated on titanium implant under osteoporotic condition
CN102145194A (zh) 具有多孔磷酸钙-胶原复合涂层的生物医用材料及其制备方法
Wang et al. Fabrication of
CN113354786A (zh) 一种利用贻贝衍生肽联合生物正交反应制备双功能聚醚醚酮的方法及其应用
Hu et al. Comparison of surface properties, cell behaviors, bone regeneration and osseointegration between nano tantalum/PEEK composite and nano silicon nitride/PEEK composite
Li et al. Fabricating biodegradable calcium phosphate/calcium sulfate cement reinforced with cellulose: in vitro and in vivo studies
Zhou et al. 3D printing monetite-coated Ti-6Al-4V surface with osteoimmunomodulatory function to enhance osteogenesis
Ichinohe et al. Bone regeneration using titanium nonwoven fabrics combined with fgf-2 release from gelatin hydrogel microspheres in rabbit skull defects
Wan et al. Polydopamine-modified decellularized intestinal scaffolds loaded with adipose-derived stem cells promote intestinal regeneration
Yao et al. Preparation and characterization of icariin/PHBV drug delivery coatings on anodic oxidized titanium
Oltean-Dan et al. BIOCOMPATIBILITY OF TITANIUM IMPLANTS COATED WITH BIOCOMPOSITE IN A RAT MODEL OF FEMORAL FRACTURE.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant