JPH0591872A

JPH0591872A - 動物細胞の逐次培養方法

Info

Publication number: JPH0591872A
Application number: JP4038123A
Authority: JP
Inventors: Hirohisa Kubota; 裕久久保田
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1991-02-27
Filing date: 1992-02-25
Publication date: 1993-04-16

Abstract

(57)【要約】【目的】動物細胞を大量に連続増殖する。【構成】親水性合成高分子からなる細胞培養担体を用
いて動物細胞を増殖するにあたり、細胞の付着した培養
担体と新しい培養担体とを混合することにより、細胞の
一部を新しい培養担体に移し替えて、動物細胞を連続的
に増殖させる。【効果】トリプシン処理工程不要、細胞活性の維持可
能、微生物による汚染防止、等の効果が奏され、動物細
胞を容易かつ効率的に、連続的に大量増殖させることが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動物細胞の逐次培養方法
に係り、詳しくは、親水性合成高分子からなる細胞培養
担体を用いて動物細胞を大量に増殖させる方法であっ
て、細胞活性を損なうことなく、動物細胞を連続的に増
殖させる方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、動物細胞を培養するための担体と
して、粒子状担体、多孔性担体、繊維状担体、薄膜状担
体（特開昭６４−４７３７２号公報）等、種々の培養担
体が開発されている。とりわけ、微小球体表面に細胞を
付着又は固定化することで動物細胞を擬似浮遊状態で培
養するマイクロキャリア（以下「ＭＣ」と略称す
る。）、及び、担体の内部に細胞を付着又は物理的に細
胞を固定化し増殖する多孔性担体（“ＴＩＢＴＥＣＨ”
Ｍａｙ１９９０，Ｖｏｌ．８，１３１−１３６）がよ
く知られている。前者のＭＣの例として、サイトデック
ス（Ｃｙｔｏｄｅｘ（商品名），Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）、メタクリル酸エステル系担体（特開昭６３−７１
１７３号、特開昭６３−２２６２８２号、特開昭６４−
１０９７９号各公報）等が知られている。一方、担体の
内部も付着体として利用している多孔性担体としては、
ベラックス社の担体（特開昭６２−５０２９３６号公
報）、ニルソン社の担体（特開昭６２−１６９８３７号
公報）、三菱化成株式会社の担体（特開平２−２９１２
６０号、特開平３−４３０７６号各公報）等の報告があ
る。

【０００３】従来、細胞を播種する場合、約０．２５％のトリプシン、その他、ディスパーゼ、
コラゲナーゼ溶液、約０．０２％のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
又はエチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエ
ーテル）−Ｎ，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート
剤、上記，の混合溶液、の何れかを添加し、担体から一度細胞を剥離、回収した
後、再度細胞を播種し直す方法が一般的である。

【０００４】の例として、P, Vretblad、 D, Billing
(World Biotech Rep., １巻，９７−１０５（１９８
５））らは、培養担体としてデキストランの架橋重合体
からなるサイトデックスを用いた、Ｖｅｒｏ細胞（アフ
リカミドリザル腎細胞）及びＭＲＣ−５細胞（ヒト胎児
正常二倍体細胞）の例を報告している。それによると、
０．１０％トリプシンの０．０２％ＥＤＴＡ溶液中（ｐ
Ｈ８．０〜８．２）で細胞を回収した後、再度播種し、
逐次培養を行っているが、連続培養する上で、指数増殖
期にある細胞をＥＤＴＡ溶液中で溶液中の２価イオンを
除去し、ｐＨ８．０〜８．２に調節したリン酸緩衝溶液
で細胞を剥離することが重要であることを報告してい
る。更に、ＦＳ−４細胞（ヒト包皮細胞）又はＢＫ細胞
（ウシ腎細胞）を用いて、トリプシン処理により一度細
胞を剥離した後、再度細胞を播種し断続的な培養も行っ
ている。

【０００５】の例として、例えば、CL. Crespi, WG.
Thilly(Biotechnol. Bioeng., ２３巻，９８３（１９８
１））らは、培養担体としてサイトデックスを用いた例
を報告している。彼らは、通常のＣａ²⁺の濃度範囲では
逐次培養が不可能なＣＨＯ−Ｋｌ細胞（チャイニーズハ
ムスター子宮卵巣細胞）、ＬＬＣ−ＭＫ₂ 細胞（アカゲ
ザル腎細胞）を用い、Ｃａ²⁺濃度を下げることにより、
逐次培養が可能であることを報告している。T-Y, Tao,
W.S. Hu(Biotech. Bioeng., ３２巻，１０３７（１９８
８））らは、ＴＣＬ−５９８（ヒト腎細胞）、ＦＳ−４
細胞、ＢＫ細胞を用いてサイトデックス−３でトリプシ
ン処理によって連続培養ができることを報告している。
また、ＴＣＬ−５９８細胞を０．５ｍＭのＥＤＴＡ又は
ＥＧＴＡ処理で、それぞれ９１％及び９３％の収率で細
胞が回収できることを報告している。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】以上述べたように、従
来の天然系の培養担体を用いる方法では、何らかの方法
で細胞を担体から剥離し回収した後、改めて播種する方
法が採用されていた。即ち、トリプシン溶液、キレート
剤溶液又は両者の混合溶液を添加し、一度細胞を担体上
から剥離した後、再度、新しい培養担体に回収した細胞
を播種していた。この方法の特徴は、細胞を培養担体に
均一に付着させることができる点にある。しかしなが
ら、トリプシン或いはキレート剤等で細胞を回収する逐
次培養方法は、以下に述べるような欠点が挙げられる。細胞の剥離工程が煩雑で、細胞によっては、剥離する
のに長時間を要する。細胞を剥離及び回収するための付帯装置が必要であ
る。トリプシン処理の場合は、特に、細胞に大きなダメー
ジを与えるため、播種直後の細胞の伸展、増殖性が低下
する。又は、死細胞の割合が増加する。酵素の活性が強い場合には回収した細胞溶液がゲル状
となり、細胞が均一に分散し難い。この結果、担体に細
胞が一様に付着しない。微生物による汚染の危険性が増加する。特に、大量培
養の場合、及びの問題点が顕在化する。

【０００７】本発明は上記従来の問題点を解決し、動物
細胞の大量培養の際、上述の細胞の剥離操作及び回収工
程を経ることなく、細胞活性を高く維持して、連続的
に、かつ効率的に細胞培養を行うことができる動物細胞
の逐次培養方法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段及び作用】請求項１の動物
細胞の逐次培養方法は、動物細胞を細胞培養担体を用い
て培養液中にて培養する方法において、親水性合成高分
子からなる細胞培養担体を用い、動物細胞が付着した古
い細胞培養担体を新しい細胞培養担体と混合することに
より、古い培養担体から新しい培養担体へ移し替え、動
物細胞を連続的に増殖させることを特徴とする。請求項
２の動物細胞の逐次培養方法は、請求項１の方法におい
て、下記式で求められる細胞培養担体の移し替え比が、
１．１〜１５倍であることを特徴とする。

【０００９】

【数２】

【００１０】請求項３の動物細胞の逐次培養方法は、請
求項１又は２の方法において、培養液を懸濁状態又は擬
似浮遊状態で、古い培養担体から新しい培養担体へ移し
替えることを特徴とする。請求項４の動物細胞の逐次培
養方法は、請求項１〜３の方法において、動物細胞が付
着依存性細胞であることを特徴とする。請求項５の動物
細胞の逐次培養方法は、請求項１〜４の方法において、
移し替え時の培養液中の血清濃度が５〜１０％であるこ
とを特徴とする。請求項６の動物細胞の逐次培養方法
は、請求項１〜５の方法において、親水性合成高分子
が、（メタ）アクリル酸エステル又はメタクリル酸エス
テルを構成単位とすることを特徴とする。請求項７の動
物細胞の逐次培養方法は、請求項６の方法において、細
胞培養担体が、正に荷電し得る化学残基を、乾燥細胞培
養担体１グラム当り０．５〜２．０ミリ当量含有し、該
正に荷電し得る構成モノマー単位のＣＬＯＧＰ値の範囲
が、−１．５〜＋２．０であることを特徴とする。請求
項８の動物細胞の逐次培養方法は、請求項６又は７の方
法において、親水性合成高分子が疎水性残基を有する重
合性モノマー単位を１〜４０重量％含有し、該疎水性モ
ノマー単位のＣＬＯＧＰ値が＋１．５〜＋４．０である
ことを特徴とする。請求項９の動物細胞の逐次培養方法
は、請求項１〜８の方法において、細胞培養担体の形状
が粒子状であり、その平均粒径が５０〜１０００μｍで
あることを特徴とする。請求項１０の動物細胞の逐次培
養方法は、請求項１〜９の方法において、培養担体の膨
潤度が、ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液中で１０〜３０ｍ
ｌ／ｇであることを特徴とする。

【００１１】即ち、本発明者は、前記の問題を解決すべ
く鋭意検討を行った結果、細胞を連続的に良好に移し替
えするためには、特定の細胞培養担体を用いること、そ
してそれにより、細胞を培養担体から剥離する操作が不
用となることを見出し、本発明を完成させた。従来、サ
イトデックス等の天然系の培養担体では、何らかの方法
で細胞を担体から剥離し回収した後、改めて播種する方
法が用いられていた。しかし、本発明は、親水性合成高
分子からなる細胞培養担体を用いるものであって、動物
細胞の培養、特に大量培養を行う際に有用な培養方法で
ある。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明で
は、細胞培養担体として、蛋白質等に対して非特異的吸
着の少ない素材、即ち親水性合成高分子材料からなるも
のを用いる。ただし、当該高分子材料は、正に荷電しう
る化学的残基を付与するため、素材自身は電荷的に中性
状態であることが好ましい。使用される親水性合成高分
子としては、従来よく知られているもの、例えば、アク
リル酸エステル又はメタクリル酸エステル（以下、「ア
クリル又はメタクリル」を「（メタ）アクリル」と記載
する。）、（メタ）アクリルアミド、ポリビニルアルコ
ール、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポ
リアミノ酸、ポリウレタン等が挙げられる。とりわけ好
ましい親水性合成高分子材料としては、（メタ）アクリ
ル酸エステルが挙げられる。

【００１３】本発明においては、このような高分子材料
の親水性−疎水性の指標として、ＣＬＯＧＰ値を用い
る。このＣＬＯＧＰ値（ポモナ大学が作成；詳細につい
ては、特開昭６４−１０９７９号の中で記載されてあ
る。）は、溶質の１−オクタノール−水系における分配
係数の対数値を示したものである。この値は、溶液に溶
解した溶質に適用されるものである。しかし、本発明で
は高分子にも応用するため、ポリマーの相当するモノマ
ー単位のＣＬＯＧＰ値を指標とした。この手法により、
高分子の疎水性を半定量的に表現することができる。

【００１４】材料を親水性にするためには、ＣＬＯＧＰ
値が低いモノマー単位が好適であり、そのモノマーのＣ
ＬＯＧＰ値は、−１．５〜＋２．０の範囲であることが
好ましい。このようなＣＬＯＧＰ値を有する代表的な
（メタ）アクリル酸エステルの例としては、２−ヒドロ
キシエチル（メタ）アクリレート、ジエチレングリコー
ル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メ
タ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレー
ト、グリシジル（メタ）アクリレート、及び、下記表１
〜表３に記載したモノマー単位等が挙げられる。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

【００１７】

【表３】

【００１８】このような親水性合成高分子からなる本発
明に係る細胞培養担体は、正に荷電しうる化学的残基に
相当するモノマー単位を乾燥培養担体１グラム当り０．
５〜２．０ミリ当量含有することが好ましい。この含有
量が０．５ミリ当量未満の場合は、付着率及び増殖性が
低下し、一方、２．０ミリ当量を超える場合には電荷阻
害により増殖性が低下する。なお、細胞の付着性や増殖
性に影響を与える因子として、本発明に係る水不溶性培
養担体中の正に荷電しうる化学的残基に相当するモノマ
ー単位のＣＬＯＧＰ値も重要である。水不溶性の培養担
体表面に細胞が付着し増殖するためには、含有される正
に荷電しうる化学的残基に相当するモノマー単位のＣＬ
ＯＧＰ値の範囲は、−１．５〜＋２．０であることが好
ましい。

【００１９】また、細胞が良好な伸展増殖を示すために
は、培養担体の親水性合成高分子中に、疎水性残基を有
する重合性モノマー単位を１〜４０重量％含有し、該モ
ノマー単位のＣＬＯＧＰ値が、＋１．５〜＋４．０の範
囲にあることが好ましい。疎水性残基を有する重合性モ
ノマーの具体的な例としては、スチレン（２．８７）、
フェニル（メタ）アクリレート（２．０６、２．３
７）、ベンジル（メタ）アクリレート（２．５２、２．
８３）、フェネチル（メタ）アクリレート（２．８４、
３．１５）、フェノキシエチル（メタ）アクリレート
（２．５０、２．８１）、フェノキシジエチレングリコ
ール（メタ）アクリレート（２．５６、２．８７）、フ
ェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレー
ト、ヘキシル（メタ）アクリレート（３．３９、３．７
０）、シクロヘキシル（メタ）アクリレート等が挙げら
れる。ただし、ここに記載されていない重合性モノマー
であっても、本発明の要旨を超えない限り好適に使用さ
れる。なお、上記カッコ内の数値はＣＬＯＧＰ値であ
り、２つの値が記載されている場合、前者はアクリレー
トの値、後者はメタクリレートの値である。

【００２０】上記のモノマー単位を構成成分とする細胞
培養担体は、水不溶性高分子からの可溶性成分の溶出を
できる限り抑えるため、架橋剤成分を添加することが好
ましい。架橋剤成分としては、前述のモノマー成分と共
重合性を有する多官能性のビニルモノマーが好適であ
り、具体的には、エチレングリコールジ（メタ）アクリ
レート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレー
ト、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、
ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリ
セロールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。

【００２１】本発明に係る水不溶性の細胞培養担体の製
造は、従来提案されている培養担体の製造方法に従って
行えば良い。

【００２２】本発明に係る細胞培養担体の膨潤度は、ｐ
Ｈ７．４のリン酸緩衝溶液（以下、「ＰＢＳ」と略
す。）中で乾燥培養担体１グラム当たり１０〜３０ｍｌ
／ｇであることが好ましい。担体の膨潤度は、通常の担
体表面のみを付着面とする培養担体では、担体の架橋
度、重合の際に添加する希釈剤により制御することが可
能である。膨潤度が大き過ぎる場合には、培養担体の沈
降速度が遅すぎる。逆に膨潤度が小さ過ぎる場合には、
沈降速度が大きすぎるため細胞に与える剪断力が大きく
なる。更に、一般的な傾向として、膨潤度が大きい方が
細胞の移し替えが容易であることが観察された。

【００２３】本発明に係る細胞培養担体の形状は、粒子
状、平膜状、繊維状のいずれであっても良い。培養担体
が粒子状である場合には、その大きさは、平均粒径で５
０〜１０００μｍであることが好ましい。また、その担
体は、その担体内部に１０μｍ〜５００μｍの平均細孔
径を有する多孔性担体であっても良い。

【００２４】本発明の方法においては、動物細胞を培養
液中にて培養するにあたり、培養液を懸濁状態又は擬似
浮遊状態にて培養担体の移し替えを行なうのが好まし
い。この場合、培養液を懸濁状態又は擬似浮遊状態とす
るために、培養液を撹拌する際動物細胞は撹拌等による
剪断力に弱いため、穏やかに撹拌しなければならない。
しかし、懸濁状態を維持するためのある程度の剪断力は
必要である。懸濁状態を維持するための剪断力をできる
限り小さくするためには、培養担体の比重を小さくする
ことが好ましい。従って、良好な懸濁状態又は擬似浮遊
状態で培養するためには、細胞培養担体の比重は１．０
０〜１．１５ｇ／ｍｌであることが好ましい。

【００２５】本発明において、培養液中における細胞培
養担体の占める容積は、培養目的、培養担体、培養方法
により異なり、これらにより担体の投入量は大きく異な
る。一般に、細胞培養担体は培養液に対して２〜４０容
量％、より好ましくは５〜２０容量％の範囲で加える。
細胞培養担体の投入量が少ない場合には、細胞密度が低
く、培養効率が悪い。一方、多すぎる場合には、培地、
酸素、老廃物の除去が律速となり、細胞密度が低くとど
まる他、細胞培養担体間の衝突頻度が高くなり、細胞が
担体から剥離、脱落しやすくなる。

【００２６】本発明に係る逐次培養は、例えば、以下に
述べる方法で実施される。まず、スケールアップ培養に
用いられる。通常の培養を行い飽和状態に達した培養担
体を、新たに準備した培養液中に加えることで逐次培養
を行うことができる。その他、継代培養に用いられる。
この場合には、飽和状態に達した培養担体の一部を抜き
出し、新たに準備した培養液中に加えることで逐次培養
を行うことができる。

【００２７】飽和状態に達した培養担体中に、更に新し
い培養担体を追加し、逐次培養する方法も挙げられる。
例えば、培養担体に対する播種密度が低い場合、特に平
板効率が低いため、細胞が成長しないことがよくある。
この場合、初期培養は、できる限り、確実に培養できる
播種細胞密度で培養を行い、その後、新しい培養担体を
追加して逐次培養を行うことにより目的とする細胞数を
得ることができる。更に、この培養方法を用いるなら
ば、極端な例として、断続的に数回逐次培養を繰り返す
ことで、一つの培養器内で細胞数、或いは、細胞培養を
大きくすることが可能である。本発明において、以下に
定義される移し替え比、即ち、

【００２８】

【数３】

【００２９】は、細胞によって大きく異なる。移し替え
比が比較的大きい細胞種としては、ＨｅＬａ（ヒト子宮
卵巣）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、Ｃ６
（ラットグリオーマ）細胞等が挙げられる。これに対
し、移し替え比が小さい細胞種としては、ＷＩ３８（ヒ
ト胎児正常二倍体）、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル
腎）、ＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎）、Ｌ−９２
９（マウス皮下脂肪組織）、ＢＨＫ−２１（シリアンハ
ムスター腎）、ＭＤＣＫ（イヌ腎）等の細胞が挙げられ
る。

【００３０】本発明は動物細胞を大量培養する際に有用
であるが、通常、大量培養に移行する場合、スケールア
ップの倍率は、移し替え比で１．１〜１５倍、特に２〜
１５倍が良い。この移し替え比が小さ過ぎる場合、スケ
ールアップの効率が悪く実用的ではない。一方、移し替
え比が大き過ぎる場合、新しく加えた培養担体に均一に
細胞が付着し難い。この場合、特に大きな悪影響はない
が、加えた培養担体が有効に使用されないため、効率が
悪い。本発明において、以下に定義される増殖比、即
ち、

【００３１】

【数４】

【００３２】は、細胞種、培養条件（血清濃度、培養容
積）、培養担体等によって異なる。ただし、細胞の平板
効率を考慮しなければならないため、この値は大きくは
できない。

【００３３】細胞を移し替える際には、新たに加えた培
養担体に細胞を均一に付着させるため、培養担体が滞留
しないよう、流動させることが好ましい。流動状態は、
担体間の衝突や、担体から細胞が剥離しない状態を維持
しなければならない。なお、前述した懸濁状態又は擬似
浮遊状態で培養可能な細胞培養担体としては、従来技術
で記述した具体例が挙げられる。例えば、粒子状担体、
多孔性担体、繊維状担体、薄膜状担体等、種々の培養担
体が開発されている。これらの培養担体は、撹拌羽根に
よる懸濁培養又は培養液の上方向流による擬似浮遊培養
等のいずれの培養方法に対しても、本発明を適用するこ
とができる。培養担体を移し替えした後は、細胞は指数
増殖期にあるため、血清を添加することが好ましい。培
養液中の血清濃度は５〜１０％であることが好ましい。

【００３４】このような本発明により、細胞培養担体を
用いて動物細胞を大量に増殖させる際、担体に付着した
細胞を新たに担体と混合することにより、細胞を連続的
に増殖させることが可能になった。なお、本発明の方法
は、動物細胞を対象としている。動物細胞は付着依存性
細胞と浮遊性細胞に大別され、本発明は、両者とも適用
は可能である。しかし、一般的には、浮遊性細胞は培養
担体を用いた培養には使用されない傾向にあるため、本
発明は付着依存性細胞に多く適用されるものと考えられ
る。

【００３５】

【実施例】以下に製造例、実施例及び比較例を挙げて本
発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超
えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
なお、移し替え実験に使用した細胞は、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎）細胞ＣＨＯ−Ｋｌ（チャイニーズハムスター）子宮卵巣細胞ＨｅＬａ（ヒト子宮卵巣）細胞Ｃ６（ラットグリオーマ）細胞であり、いずれの細胞も大日本製薬株式会社から購入し
たものである。

【００３６】製造例１細胞培養担体を、以下に述べる方法により製造した。３
００ｍｌの四ツ口フラスコに温度計、冷却管、窒素導入
管、撹拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシウム・２
水塩２５ｇ、３％ポリビニルアルコール水溶液３０ｍ
ｌ、イオン交換水８５ｍｌを入れ撹拌した。別に、１−
ヘキサノール２７ｇ、シクロヘキサノール３５ｇ、ポリ
エチレングリコールメタクリレート（商品名「ブレンマ
ーＰＥ−３５０」日本油脂製）１１．２ｇ、グリシジル
メタクリレート６．５ｇ、フェノキシジエチレングリコ
ールアクリレート（商品名「ＡＭＰ−２０Ｇ」新中村化
学製）４．４ｇ、ポリエチレングリコールジメタクリレ
ート（商品名「４Ｇ」新中村化学製）１．３ｇ、及び重
合開始剤として２，２’−アゾビス−（２，４−ジメチ
ルバレロニトリル）３０ｍｇを溶解したモノマー溶液を
調製し、この溶液を前記四ツ口フラスコに滴下した後、
窒素雰囲気下で重合反応を行うため、窒素を通気し溶存
酸素を除去した。室温から徐々に昇温し、６０℃で５時
間重合反応を行った。重合終了後、該ポリマーをブッフ
ナー漏斗上にあけ、水洗後、５０％メタノール水溶液で
ポリマーを洗浄した。ポリマーを再度フラスコ内へ戻し
た。この操作を繰り返し、１−ヘキサノール及びシクロ
ヘキサノール臭がしなくなるまでポリマーを洗浄した。
得られたポリマーは、少々撥水性を示し、無色透明球状
体であった。重合収率は７７％であった。

【００３７】該ポリマーを用いてアミノ化反応を行っ
た。水中で３０ｍｌのポリマーを８０％１，４−ジオキ
サン水溶液で充分に洗浄し置換した。これを３００ｍｌ
のフラスコ内に入れ、更にジオキサンを３０ｍｌ追加し
た。この中へエタノールアミン１０ｇのジオキサン溶液
３０ｍｌを滴下し、７５℃で４時間アミノ化反応を行っ
た。反応終了後、アミン臭がしなくなるまで充分にポリ
マーを水洗した。得られたポリマーを標準篩を用いて、
２１０μｍ〜２５０μｍの範囲で分級した。

【００３８】元素分析より、アミンの官能基量は１．２
８ミリ当量／ｇ、であった。ＰＢＳ溶液（日水製薬製）
（以下、同種の溶液を使用。）中における該ポリマーの
膨潤度は１４．８ｍｌ／ｇ、平均粒径は１７５μｍ、比
重は１．０３ｇ／ｍｌであった。本製造例の場合、正に
荷電するモノマー単位は、メタクリル酸ヒドロキシエチ
ルアミノ−２−ヒドロキシエチルでありそのＣＬＯＧＰ
値は−０．６７である。また、相当する疎水性残基を有
するモノマー単位はフェノキシエチルアクリレートであ
り、そのＣＬＯＧＰ値は２．８１である。

【００３９】製造例２細胞培養担体を、以下に述べる方法により製造した。３
００ｍｌの四ツ口フラスコに温度計、冷却管、窒素導入
管、撹拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシウム・２
水塩２５ｇ、３％ポリビニルアルコール水溶液３０ｍ
ｌ、イオン交換水８５ｍｌを入れ撹拌した。別に、１−
ヘキサノール３５ｇ、１−オクタノール３５ｇ、ポリエ
チレングリコールメタクリレート（ブレンマーＰＥ−３
５０）１２．７ｇ、ジエチルアミノエチルメタクリレー
ト（商品名「アクリルエステルＤＥ」三菱レーヨン製）
４．４ｇ、β−アクリロイルオキシエチルハイドロジェ
ンサクシネート（商品名「ＮＫエステルＡ−ＳＡ」新中
村化学製）０．７ｇ、２−ヒドロキシ−３−フェニルオ
キシプロピルアクリレート３．５ｇ、ポリエチレングリ
コールジメタクリレート（商品名「ＮＫエステル９Ｇ」
新中村化学製）０．８ｇ、及び、重合開始剤として２，
２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）８
０ｍｇを溶解したモノマー溶液を調製した。この溶液を
前記四ツ口フラスコ内へ滴下した。窒素雰囲気下で重合
反応を行うため、窒素を通気し溶存酸素を除去した。室
温から徐々に昇温し、５５℃で７時間、重合反応を行っ
た。重合終了後の後処理は、製造例１と同様に行った。
得られたポリマーは、無色透明球状体で撥水性を示し、
重合収率は７５％であった。このポリマーを標準篩を用
いて、１８０μｍ〜２１０μｍの範囲で分級した。次い
で、分級ポリマーを用いてアミノ化反応を行った。エタ
ノールアミンの代わりにＮ，Ｎ−ジエチルエチレンジア
ミンを使用したこと以外は、製造例１と同様に行った。

【００４０】元素分析より、アミンの官能基量は１．４
４ミリ当量／ｇであった。ＰＢＳ溶液中におけるポリマ
ーの膨潤度は１６．３ｍｌ／ｇ、平均粒径は２４０μ
ｍ、比重は１．０３ｇ／ｍｌであった。

【００４１】製造例３細胞培養担体を、以下に述べる方法により製造した。ポ
リエチレングリコールメタクリレート（ブレンマーＰＥ
−３５０）５．１０ｇ、グリシジルメタクリレート２．
５０ｇ、フェノキシジエチレングリコールアクリレート
（ＡＭＰ−２０Ｇ）４．４ｇ、ポリエチレングリコール
ジメタクリレート（４Ｇ）２．４ｇ、ジオキサン２０．
０ｇ、及び、塩化メチレンに溶解したアゾ系重合開始剤
（２，２’−アゾビス−（４−メトキシ−２，４−バレ
ロニトリル）２０ｍｇを溶解したモノマー溶液を調製
し、室温で窒素ガスを通じ、モノマー溶液中の溶存酸素
を除去した。発泡ポリウレタン（平均細孔径；約２００
μｍ、半連続発泡体、三菱化成ダウ社製）（５ｃｍ×５
ｃｍ×５ｃｍ）に、上記で調製したモノマー溶液を含浸
し、過剰のモノマー溶液を圧縮し、絞り出した。該ポリ
ウレタン片をガラス溶液内に入れ、窒素雰囲気下５０℃
に加温し、２時間重合反応を行った。重合反応終了後、
残留モノマー及びジオキサンを除去するため、５０℃に
加温したアセトン水溶液で洗浄し、最後に蒸留水で洗浄
した。更に、このポリウレタン片をジオキサンで置換し
た後、この中へ３−プロパノール・１−アミン２．０ｇ
のジオキサン溶液１０ｍｌを滴下し、７５℃で４時間ア
ミノ化を行った。反応終了後、ポリウレタン片を５０％
アセトン水溶液で充分洗浄した後、アミン臭がしなくな
るまで充分にポリマーを水洗した。被覆されたポリマー
の量は１２．５％であった。

【００４２】ＰＢＳ溶液中における該ポリマーの膨潤度
は３２．２ｍｌ／ｇ、平均細孔径はおおよそ２００μ
ｍ、比重は１．０２ｇ／ｍｌであった。細胞培養を行う
ため、含水ポリウレタン片を液体窒素で固化し、ポリウ
レタン片を裁断し、約５００〜８００μｍのポリウレタ
ン片を培養に用いた。

【００４３】実施例１ｅ−ＲＤＦ培地で置換した培養担体（製造例１で得られ
たもの）１２．５ｍｌ（ＰＢＳ中）を１０００ｍｌのス
ピンナーフラスコ（ベルコ社製）に入れ、１２１℃で２
０分間オートクレーブ滅菌した。フラスコに牛胎児血清
（以下「ＦＣＳ」と略す。）（三菱化成株式会社製）を
２０ｍｌ、及び、ｅ−ＲＤＦ培地を加え２９５ｍｌとし
た。この中へＣＨＯ−Ｋｌ細胞３．３×１０⁷ ｃｅｌｌ
ｓを入れ、２５ｒｐｍで連続撹拌状態で培養を開始し
た。培養環境は、５％炭酸インキュベーター内で温度３
６．５℃とした。４日目より急激にｐＨ、グルコース濃
度が低下、乳酸が増加し始めたため、必要に応じ該培地
を増殖培地で交換した。また、細胞数の増加とともに徐
々に血清濃度を下げ、培養を継続した。ＣＨＯ−Ｋｌ細
胞は、７日間で新しい培養担体に移り、その細胞は担体
の表面を覆い尽くした。細胞密度は２．１×１０⁶ ｃｅ
ｌｌｓ／ｍｌ（６．３×１０⁸ ｃｅｌｌｓ）に達した。
増殖比（＝飽和細胞数／播種細胞数）は１９倍であっ
た。次に飽和状態に達した担体を用いて、本発明の移し
替えの実験を行った。

【００４４】移し替えをするため、最初の培養と同様
に、ｅ−ＲＤＦ培地で洗浄、置換した担体（製造例１で
得られたもの）１１０ｍｌ（ＰＢＳ中）を５０００ｍｌ
の通気装置を備えたスピンナーフラスコに入れ、１２１
℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。フラスコにＦＣ
Ｓを２００ｍｌ及びｅ−ＲＤＦ培地を加え２７００ｍｌ
とした。この中へ、先の担体を含む培養液を全量（培養
担体１２．５ｍｌ含有）移し、１０ｒｐｍで連続撹拌を
した。３日目より急激にｐＨ及びグルコース濃度が低下
し始めたため、必要に応じ該培地と増殖培地で交換し
た。播種後７日間で新しい培養担体に移った細胞は培養
担体の表面を覆い尽くした。細胞密度は３．７×１０⁶
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１．１×１０¹⁰ｃｅｌｌｓ）に達し
た。移し替え比は９．８倍、増殖比（＝飽和細胞数／播
種細胞数）は１７倍であった。

【００４５】更に、２回目の移し替えをするため、最初
の培養と同様に、ｅ−ＲＤＦ培地で洗浄、置換した担体
（製造例２で得られたもの）１２．５ｍｌ（ＰＢＳ中）
を１０００ｍｌのスピンナーフラスコに入れ、１２１℃
で２０分間オートクレーブ滅菌した。フラスコにＦＣＳ
を２０ｍｌ及びｅ−ＲＤＦ培地を加え２９５ｍｌとし
た。ここで飽和状態の培養液を均一になるように撹拌
し、担体を含む培養液３０ｍｌ（培養担体１．２２ｍｌ
含有）（細胞数は１．１×１０⁸ ｃｅｌｌｓ）を１００
０ｍｌのスピンナーフラスコ内に加え、２５ｒｐｍで連
続撹拌状態で培養を開始した。３日目より急激にｐＨ、
グルコース濃度が低下、乳酸が増加し始めたため、必要
に応じ該培地と増殖培地で交換した。また、細胞数の増
加とともに徐々に血清濃度を下げ、培養を継続した。Ｃ
ＨＯ−Ｋｌ細胞は、６日間で全ての培養担体の表面を覆
い尽くした。細胞密度は２．４×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌ（７．２×１０⁶ ｃｅｌｌｓ）に達した。移し替え比
は１１．２倍、増殖比（＝飽和細胞数／播種細胞数）は
６．５倍であった。

【００４６】実施例２ｅ−ＲＤＦ培地で交換した培養担体（製造例２で得られ
たもの）１５．０ｍｌ（ＰＢＳ中）を１０００ｍｌのス
ピンナーフラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートク
レーブ滅菌した。フラスコにＦＣＳを２０ｍｌ及びｅ−
ＲＤＦ培地を加え２９５ｍｌとした。この中へＶｅｒｏ
細胞３．３×１０⁷ ｃｅｌｌｓを加え、２５ｒｐｍで連
続撹拌で培養を開始した。４日目よりｐＨが低下し、ま
たグルコース濃度も低下、乳酸が増加し始めたため、必
要に応じて培地交換した。また、細胞全ての増殖ともに
徐々に血清濃度を下げ、培養を継続した。Ｖｅｒｏ細胞
は、８日間で全ての培養担体の表面上を覆い尽くした。
細胞密度は１．６×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（４．８×
１０⁸ ｃｅｌｌｓ）に達した。増殖比は１４．５倍であ
った。次に、飽和状態に達した担体を用いて、本発明の
移し替えの実験を行った。

【００４７】移し替えをするため、最初の培養と同様
に、ｅ−ＲＤＦ培地で洗浄、置換した担体（製造例２で
得られたもの）１２．５ｍｌ（ＰＢＳ中）を１０００ｍ
ｌのスピンナーフラスコに入れ、１２１℃で１５分間オ
ートクレーブ滅菌した。フラスコにＦＣＳを２０ｍｌ及
びｅ−ＲＤＦ培地を加え２６０ｍｌとした。この中へ、
細胞培養担体を含む培養液のうち、５０ｍｌ（培養担体
２．５ｍｌ含有）（８．０×１０⁷ ｃｅｌｌｓ）を移
し、２５ｒｐｍで連続撹拌で培養を継続した。４日目よ
り急激にｐＨ及びグルコース濃度が低下し始めたため、
必要に応じ培地交換した。Ｖｅｒｏ細胞は、培養担体添
加後７日間で全ての培養担体の表面上を覆い尽くした。
細胞密度は１．４×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（４．２×
１０⁸ ｃｅｌｌｓ）に達した。移し替え比は６倍、増殖
比は５．３倍であった。

【００４８】実施例３ｅ−ＲＤＦ培地で置換した培養担体（製造例１で得られ
たもの）１５．０ｍｌ（ＰＢＳ中）を１０００ｍｌのス
ピンナーフラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートク
レーブ滅菌した。フラスコにＦＣＳを２０ｍｌ及びｅ−
ＲＤＦ培地を加え２９５ｍｌとした。この中へＨｅＬａ
細胞４．５×１０⁷ ｃｅｌｌｓを加え、２５ｒｐｍの連
続撹拌で培養を開始した。３日目よりｐＨが低下し、ま
たグルコース濃度も低下し始めたため、必要に応じて培
地交換した。また、細胞数の増殖ともに徐々に血清濃度
を下げ、培養を継続した。ＨｅＬａ細胞は、６日間で全
ての培養担体の表面を覆い尽くした。細胞密度は２．８
×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（８．４×１０⁸ ｃｅｌｌ
ｓ）に達した。増殖比（＝飽和細胞数／播種細胞数）は
１９倍であった。次に、飽和状態に達した担体を用い
て、本発明の移し替えの実験を行った。

【００４９】移し替えを行うため、最初の培養と同様
に、ｅ−ＲＤＦ培地で洗浄、置換した新たな担体（製造
例２で得られたもの）１２．５ｍｌ（ＰＢＳ中）を１０
００ｍｌのスピンナーフラスコに入れ、１２１℃で１５
分間オートクレーブ滅菌した。フラスコにＦＣＳを２０
ｍｌ及びｅ−ＲＤＦ培地を加え２８０ｍｌとした。この
中へ、担体を含む培養液２０ｍｌ（培養担体１．０ｍｌ
含有）（５．６×１０⁷ｃｅｌｌｓ）を移し、２５ｒｐ
ｍで連続撹拌状態で培養を継続した。３日目より急激に
ｐＨ及びグルコース濃度が低下し始めたため、必要に応
じ培地交換した。ＨｅＬａ細胞は、播種後５日間で全て
の培養担体の表面を覆い尽くした。細胞密度は２．９×
１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（８．７×１０⁸ ｃｅｌｌｓ）
に達した。移し替え比は１３．５倍、増殖比（＝飽和細
胞数／播種細胞数）は１５．５倍であった。

【００５０】実施例４ｅ−ＲＤＦ培地で置換した培養担体（製造例３で得られ
たもの）８．０ｍｌ（ＰＢＳ中）を１０００ｍｌのスピ
ンナーフラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレ
ーブ滅菌した。フラスコにＦＣＳを２０ｍｌ及びｅ−Ｒ
ＤＦ培地を加え２９５ｍｌとした。この中へＣ６細胞
２．７×１０⁷ ｃｅｌｌｓを入れ、１５ｒｐｍの連続撹
拌で培養を開始した。３日目よりｐＨが低下し、またグ
ルコース濃度も低下し始めたため、必要に応じて培地交
換した。また、細胞数の増殖ともに徐々に血清濃度を下
げ、培養を継続した。Ｃ６細胞は、６日間で全ての培養
担体の表面を覆い尽くした。細胞密度は７．６×１０⁶
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（２．３×１０⁹ ｃｅｌｌｓ）に達し
た。増殖比（＝飽和細胞数／播種細胞数）は８５倍であ
った。次に、飽和状態に達した担体を用いて、本発明の
移し替えの実験を行った。

【００５１】移し替えを行うため、最初の培養と同様
に、ｅ−ＲＤＦ培地で洗浄、置換した新たな培養担体
（製造例３で得られたもの）８．０ｍｌ（ＰＢＳ中）を
１０００ｍｌのスピンナーフラスコに入れ、１２１℃で
１５分間オートクレーブ滅菌した。スピンナーフラスコ
にＦＣＳを２０ｍｌ及びｅ−ＲＤＦ培地を加え２８０ｍ
ｌとした。この中へ、担体を含む培養液２５ｍｌ（培養
担体０．６６ｍｌ含有）（５．０×１０⁷ ｃｅｌｌｓ）
を移し、１５ｒｐｍで連続撹拌状態で培養を継続した。
３日目より急激にｐＨ及びグルコース濃度が低下し始め
たため、必要に応じ培地交換した。Ｃ６細胞は、播種後
７日間で全ての培養担体の表面を覆い尽くした。細胞密
度は８．５×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（２．６×１０⁹
ｃｅｌｌｓ）に達した。移し替え比は１３．１倍、増殖
比（＝飽和細胞数／播種細胞数）は１４倍であった。

【００５２】比較例１細胞培養担体としてサイトデックス−３（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社製）を用いて、比較実験を行った。ｅ−ＲＤＦ
培地で置換したサイトデックス−３を１５．０ｍｌ（Ｐ
ＢＳ中）、１０００ｍｌのスピンナーフラスコに入れ、
１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。フラスコ
に牛胎児血清を２０ｍｌ及びｅ−ＲＤＦ培地を加え２９
５ｍｌとした。この中へＶｅｒｏ細胞３．５×１０⁷ ｃ
ｅｌｌｓを加え、２５ｒｐｍで連続撹拌で培養を開始し
た。４日目よりｐＨが低下し、またグルコース濃度も低
下、乳酸が増加し始めたため、必要に応じて培地交換し
た。また、細胞全ての増殖ともに徐々に血清濃度を下
げ、培養を継続した。Ｖｅｒｏ細胞は、８日間で全ての
培養担体の表面上を覆い尽くした。細胞密度は１．７×
１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（５．１×１０⁸ ｃｅｌｌｓ）
に達した。増殖比は１４．６倍であった。次に、飽和状
態に達した担体を用いて、移し替えの実験を行った。

【００５３】移し替えをするため、最初の培養と同様
に、ｅ−ＲＤＦ培地で洗浄、置換した１２．５ｍｌ（Ｐ
ＢＳ中）のサイトデックス−３を１０００ｍｌのスピン
ナーフラスコに入れ、１２１℃で１５分間オートクレー
ブ滅菌した。フラスコにＦＣＳを２０ｍｌ及びｅ−ＲＤ
Ｆ培地を加え２６０ｍｌとした。この中へ、細胞培養担
体を含む培養液のうち、５０ｍｌ（８．０×１０⁷ ｃｅ
ｌｌｓ）を抜き出し、２５ｒｐｍで連続撹拌で培養を継
続した。移し替え比は５倍であった。しかし、５日間経
過後も細胞の移動は観察されなかった。

【００５４】実施例５実施例１における最初の培養と同様にして、ＣＨＯ−Ｋ
１細胞の密度が飽和状態である２．１×１０⁶ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌ（６．３×１０⁸ｃｅｌｌｓ）に達した培養担
体を得た。この培養担体（１２．５ｍｌ）を用いて、次
の逐次培養の実験を行った。上記の飽和状態に達した担
体懸濁溶液の上澄み液を抜き出した。血清を３０ｍｌ、
培地を２００ｍｌ加えた。この中へ、滅菌し、ｅ−ＲＤ
Ｆ培地で置換した新しい培養担体（製造例１で得られた
もの）１０．０ｍｌを加えた。２０ｒｐｍで培養を継続
した。５日後には、新たに加えた培養担体に表面を覆
い、細胞密度は飽和状態に達した。到達細胞密度は、
３．３×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１．１×１０¹⁰ｃｅ
ｌｌｓ）であった。移し替え比は１．８倍、増殖比（＝
飽和細胞数／播種細胞数）は１．６倍であった。

【００５５】

【発明の効果】以上詳述した通り、本発明の動物細胞の
逐次培養方法は細胞培養担体を用いて動物細胞を大量に
増殖させる際、トリプシン等の酵素又はキレート剤を添
加して細胞を剥離する方法を使用しないで、細胞が付着
した培養担体に新たに培養担体を投入することにより、
細胞の一部を新しい培養担体に移し替えて、容易かつ効
率的に、連続的に細胞を増殖する方法であって、本発明
の方法によれば、トリプシン処理工程が不要になる。細胞の活性が維持できる。微生物による汚染の危険性が低下する。等の優れた効果が奏される。本発明の方法は、動物細胞
の大量培養法として、細胞を継代する際に工業的に極め
て有用な方法である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年４月３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３０】本発明は動物細胞を大量培養する際に有用
であるが、通常、大量培養に移行する場合、スケールア
ップの倍率は、移し替え比で１．１〜１５倍、特に２〜
１５倍が良い。この移し替え比が小さ過ぎる場合、スケ
ールアップの効率が悪く実用的ではない。一方、移し替
え比が大き過ぎる場合、新しく加えた培養担体に均一に
細胞が付着し難い。この場合、特に大きな悪影響はない
が、加えた培養担体が有効に使用されないため、効率が
悪い。なお、培養担体の付着表面積は以下の方法により
測定する。本発明においては、細胞が培養担体に付着す
る場合は、担体全体に付着する（部分的に付着すること
はない）と考え、培養担体の付着表面積は培養担体の表
面積に等しいとみなす。使用する担体をＰＢＳ溶液（ｐ
Ｈ７．４）中で膨潤させて、その粒径をＰｒｏｆｉｌｅ
ｐｒｏｊｅｃｔｏｒＶ−１２型（ニコン社製、２００
倍）により測定する。この方法により約５００個の担体
の平均粒径（ｒ）を求める。また、担体１個の体積
（ｖ）及び表面積（Ｓ）は以下のように示される。

【数４】担体１ｇあたりの膨潤度（前述：Ｐ）を加味し、担体が
剛体球であると仮定すると担体１ｇあたりの表面積Ｖは

【数５】で示される。本発明において、以下に定義される増殖
比、即ち、

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３１】

【数６】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】動物細胞を細胞培養担体を用いて培養液
中にて培養する方法において、親水性合成高分子からな
る細胞培養担体を用い、動物細胞が付着した古い細胞培
養担体を新しい細胞培養担体と混合することにより、古
い培養担体から新しい培養担体へ移し替え、動物細胞を
連続的に増殖させることを特徴とする動物細胞の逐次培
養方法。
【請求項２】下記式で求められる細胞培養担体の移し
替え比が、１．１〜１５倍であることを特徴とする請求
項１に記載の動物細胞の逐次培養方法。【数１】
【請求項３】培養液を懸濁状態又は擬似浮遊状態で、
古い培養担体から新しい培養担体へ移し替えることを特
徴とする請求項１又は２に記載の動物細胞の逐次培養方
法。
【請求項４】動物細胞が付着依存性細胞であることを
特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の動
物細胞の逐次培養方法。
【請求項５】移し替え時の培養液中の血清濃度が５〜
１０％であることを特徴とする請求項１ないし４のいず
れか１項に記載の動物細胞の逐次培養方法。
【請求項６】親水性合成高分子が、アクリル酸エステ
ル又はメタクリル酸エステルを構成単位とすることを特
徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の動物
細胞の逐次培養方法。
【請求項７】細胞培養担体が、正に荷電し得る化学残
基を、乾燥細胞培養担体１グラム当り０．５〜２．０ミ
リ当量含有し、該正に荷電し得る構成モノマー単位のＣ
ＬＯＧＰ値の範囲が、−１．５〜＋２．０であることを
特徴とする請求項６に記載の動物細胞の逐次培養方法。
【請求項８】親水性合成高分子が疎水性残基を有する
重合性モノマー単位を１〜４０重量％含有し、該モノマ
ー単位のＣＬＯＧＰ値が＋１．５〜＋４．０であること
を特徴とする請求項６又は７記載の動物細胞の逐次培養
方法。
【請求項９】細胞培養担体の形状が粒子状であり、そ
の平均粒径が５０〜１０００μｍであることを特徴とす
る請求項１ないし８のいずれか１項に記載の動物細胞の
逐次培養方法。
【請求項１０】培養担体の膨潤度が、ｐＨ７．４のリ
ン酸緩衝溶液中で１０〜３０ｍｌ／ｇであることを特徴
とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の動物細
胞の逐次培養方法。