JP5641669B2 - 細胞表層蛋白修復方法 - Google Patents
細胞表層蛋白修復方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5641669B2 JP5641669B2 JP2007105311A JP2007105311A JP5641669B2 JP 5641669 B2 JP5641669 B2 JP 5641669B2 JP 2007105311 A JP2007105311 A JP 2007105311A JP 2007105311 A JP2007105311 A JP 2007105311A JP 5641669 B2 JP5641669 B2 JP 5641669B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- temperature
- cell surface
- substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 36
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 title claims description 32
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 title claims description 32
- 230000005451 protein repair Effects 0.000 title claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 126
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 40
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 32
- 229920000208 temperature-responsive polymer Polymers 0.000 claims description 12
- 230000036571 hydration Effects 0.000 claims description 11
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 claims description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 3
- 229920003213 poly(N-isopropyl acrylamide) Polymers 0.000 claims description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 26
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 26
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 102100030485 Platelet-derived growth factor receptor alpha Human genes 0.000 description 19
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 18
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 18
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 18
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 18
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 12
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 11
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 11
- 101710148465 Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 description 10
- 101001126417 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 9
- 102000018710 Heparin-binding EGF-like Growth Factor Human genes 0.000 description 8
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 8
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011557 critical solution Substances 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 3
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000871708 Homo sapiens Proheparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N Vinyl ether Chemical class C=COC=C QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- -1 acrylamide compound Chemical class 0.000 description 1
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000003851 corona treatment Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 102000045108 human EGFR Human genes 0.000 description 1
- 102000043417 human HBEGF Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005660 hydrophilic surface Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004898 kneading Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000009832 plasma treatment Methods 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
また、本発明は、細胞表層蛋白修復方法の利用方法についても提供する。
1.細胞培養
市販の3.5cmφ培養皿(ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア(Becton Dickinson Labware)社製ファルコン(FALCON)3001)上に、N−イソプロピルアクリルアミドモノマーを52%になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを0.07ml塗布した。0.25MGyの強度の電子線を照射し、培養皿表面にN−イソプロピルアクリルアミドポリマー(PIPAAm)を固定化した。照射後、イオン交換水により培養皿を洗浄し、残存モノマーおよび培養皿に結合していないPIPAAmを取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、エチレンオキサイドガスで滅菌することで細胞培養培養基材材料を得た。基材表面における温度応答性高分子量を測定したところ、それぞれ1.7μg/cm2被覆されていることが分かった(実施例1)。比較として、通常の細胞培養用ディッシュ(コーニング社、Cat.No.430165)を使用した(比較例1)。この基材表面に、37℃に保温した細胞培養液を8ml入れ、37℃の炭酸ガス培養装置内で15分間以上静置した。その後、上記、骨髄間葉系細胞、脂肪前駆細胞、軟骨細胞、羊膜由来間葉系細胞それぞれを別の基材表面に6×103〜1×105個/cm2の細胞同士が接触しない範囲の細胞密度で播種し、37℃、5%炭酸ガス雰囲気下で24時間炭酸ガス培養装置内で培養した。
2.細胞回収
(実施例1)基材を炭酸ガス培養装置から取り出し、25℃で、20分静置し、基材側面を液がこぼれない程度にタッピングことで培養細胞を基材表面から剥離させ、その後、50mlの遠心管に入れ、300G、5分間遠心して細胞を沈殿させた。
(比較例1)ディッシュを炭酸ガス培養装置から取り出し、細胞培養液を除去し、6mlのリン酸緩衝液で洗浄した。0.25%トリプシンを含むリン酸緩衝液をディッシュに加えて37℃で2〜3分間静置し、細胞をディッシュから剥離させ、6mlの細胞培養液を加えてトリプシンによる消化反応を止めた。その後、50mlの遠心管に入れ、300G、5分間遠心して細胞を沈殿させた。
3.回収した細胞の表面抗原の検出
PDGFR−alpha(platelet−derived growth factor receptor−alpha)/CD140a:
回収した細胞を0.2mlのリン酸緩衝液に懸濁し、2mgのPhycoerythrin(PE)標識したCD140a抗体(human CD140a specific monoclonal mouse IgG2a,phycoerythrin conjugated,BD Biosciences Pharmingen,556002,clone aR1)と4℃で1時間反応させた。ネガティブコントロールとしてPE標識したmouse IgG2a アイソタイプコントロール抗体(mouse IgG2a,phycoerythrin conjugated,BD Biosciences Pharmingen,553457,clone G155−178)を使用し、4℃で1時間反応させた。4倍容量のリン酸緩衝液で2回洗浄後、0.5mlのリン酸緩衝液に細胞を再懸濁し、FC500フローサイトメーター(ベックマン・コールター社)でPEの蛍光強度を検出した。結果を図1に示す。白のピークがネガティブコントロールの蛍光強度を示し、黒のピークがPE標識したCD140a抗体の蛍光強度を示す。
その結果、実施例1の場合、ピーク位置が蛍光強度が強い側にシフトし、比較例1ではネガティブコントロールとピークのシフトは見られなかった。このことより、従来、骨髄間葉系細胞、脂肪前駆細胞、軟骨細胞を代表とする接着細胞は細胞増殖因子の受容体の一つであるPDGFR−alphaはフローサイトメトリー解析では検出できない、或いは発現量が低いとされていたが、細胞表面を損なわずに回収した細胞では検出できた。このことはPDGFR−alphaがトリプシンにより消化され、本発明で示す基材によって初めて接着細胞系におけるPDGFR−alphaの発現量を規定することが可能となったことを示している。
回収した細胞を0.2mlのリン酸緩衝液に懸濁し、2mgのEGFR抗体(human EGFR specific monoclonal mouse IgG2b,R&D Systems,MAB1095,clone 102618)と4℃で1時間反応させた。4倍容量のリン酸緩衝液で2回洗浄後、0.2mlのリン酸緩衝液に細胞を再懸濁し、PE標識した抗マウスIgGヤギ抗体(anti−mouse IgG polyclonal goat Ig,phycoerythrin conjugated,BD Biosciences Pharmingen,550589,lot 17891)と4℃で1時間反応させた。4倍容量のリン酸緩衝液で2回洗浄後、0.5mlのリン酸緩衝液に細胞を再懸濁した。ネガティブコントロールとしてPE標識した抗マウスIgGヤギ抗体(anti−mouse IgG polyclonal goat Ig,phycoerythrin conjugated,BD Biosciences Pharmingen,550589,lot 17891)を使用し、4℃で1時間反応させた。4倍容量のリン酸緩衝液で2回洗浄後、0.5mlのリン酸緩衝液に細胞を再懸濁し、FC500フローサイトメーター(ベックマン・コールター社)でPEの蛍光強度を検出した。白のピークがネガティブコントロールの蛍光強度を示し、黒のピークがPE標識したEGFR抗体の蛍光強度を示す。得られた結果を図1に示す。
その結果、実施例1の場合、ピーク位置が蛍光強度が強い側にシフトし、比較例1ではネガティブコントロールとピークのシフトは見られなかった。従来、羊膜由来間葉系細胞を代表とする接着細胞は細胞増殖因子の受容体の一つであるEGFRはフローサイトメトリー解析では検出できない、または発現量が低いとされていたが、細胞表面を損なわずに回収した細胞では検出できた。このことはEGFRがトリプシンにより消化され、本発明で示す基材によって初めて接着細胞系におけるEGFRの発現量を規定することが可能となったことを示している。
回収した細胞を0.2mlのリン酸緩衝液に懸濁し、2mgのHB−EGF抗体(human heparin−binding EGF−like growth factor(HB−EGF)specific polyclonal goat IgG,R&D Systems,AF−259−NA,lot PX04)と4℃で1時間反応させた。4倍容量のリン酸緩衝液で2回洗浄後、0.2mlのリン酸緩衝液に細胞を再懸濁し、PE標識した抗ヤギIgGウサギ抗体(anti−goat IgG polyclonal rabbit Ig,phycoerythrin conjugated,Sigma,P9787,lot 065K4889)と4℃で1時間反応させた。4倍容量のリン酸緩衝液で2回洗浄後、0.5mlのリン酸緩衝液に細胞を再懸濁した。ネガティブコントロールとしてPE標識した抗マウスIgGヤギ抗体(anti−goat IgG polyclonal rabbit Ig,phycoerythrin conjugated,Sigma,P9787,lot 065K4889)を使用し、4℃で1時間反応させた。4倍容量のリン酸緩衝液で2回洗浄後、0.5mlのリン酸緩衝液に細胞を再懸濁し、FC500フローサイトメーター(ベックマン・コールター社)でPEの蛍光強度を検出した。得られた結果を図1に示す。
その結果、白のピークがネガティブコントロールの蛍光強度を示し、黒のピークがPE標識したHB−EGF抗体の蛍光強度を示す。実施例1の場合、ピーク位置が蛍光強度が強い側にシフトし、比較例1ではネガティブコントロールとピークのシフトは見られなかった。従来、脂肪前駆細胞を代表とする接着細胞は細胞増殖因子の受容体の一つであるHB−EGFはフローサイトメトリー解析では検出できない、または発現量が低いとされていたが、細胞表面を損なわずに回収した細胞では検出できた。このことはHB−EGFがトリプシンにより消化され、本発明で示す基材によって初めて接着細胞系におけるHB−EGFの発現量を規定することが可能となった。
1.細胞培養
市販の3.5cmφ培養皿(ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア(Becton Dickinson Labware)社製ファルコン(FALCON)3001)上に、N−イソプロピルアクリルアミドモノマーを54%になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを0.07ml塗布した。0.25MGyの強度の電子線を照射し、培養皿表面にN−イソプロピルアクリルアミドポリマー(PIPAAm)を固定化した。照射後、イオン交換水により培養皿を洗浄し、残存モノマーおよび培養皿に結合していないPIPAAmを取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、エチレンオキサイドガスで滅菌することで細胞培養培養基材材料を得た。基材表面における温度応答性高分子量を測定したところ、それぞれ1.9μg/cm2被覆されていることが分かった(実施例2)。比較として、通常の細胞培養用ディッシュ(コーニング社、Cat.No.430165)を使用した(比較例2、3)。
この基材表面に、37℃に保温した細胞培養液を8ml入れ、37℃の炭酸ガス培養装置内で15分間以上静置した。その後、上記、骨髄細胞を基材表面に6×103〜1×105個/cm2の細胞同士が接触しない範囲の細胞密度で播種し、37℃、5%炭酸ガス雰囲気下で24時間炭酸ガス培養装置内で培養した。
2.細胞回収
(実施例2)基材を炭酸ガス培養装置から取り出し、25℃で、20分静置し、基材側面を液がこぼれない程度にタッピングことで培養細胞を基材表面から剥離させ、その後、50mlの遠心管に入れ、300G、5分間遠心して細胞を沈殿させた。
(比較例2)トリプシン処理。ディッシュを炭酸ガス培養装置から取り出し、細胞培養液を除去し、6mlのリン酸緩衝液で洗浄した。0.25%トリプシンを含むリン酸緩衝液をディッシュに加えて37℃で2〜3分間静置し、細胞をディッシュから剥離させ、6mlの細胞培養液を加えてトリプシンによる消化反応を止めた。その後、50mlの遠心管に入れ、300G、5分間遠心して細胞を沈殿させた。
(比較例3)トリプシン・コラゲナーゼ・EDTA処理。ディッシュを炭酸ガス培養装置から取り出し、細胞培養液を除去し、6mlのリン酸緩衝液で洗浄した。0.25%トリプシン・コラゲナーゼ・EDTAを含むリン酸緩衝液をディッシュに加えて37℃で2〜3分間静置し、細胞をディッシュから剥離させ、6mlの細胞培養液を加えてトリプシンによる消化反応を止めた。その後、50mlの遠心管に入れ、300G、5分間遠心して細胞を沈殿させた。
3.回収した細胞の表面抗原の検出
PDGFR−alpha(platelet−derived growth factor receptor−alpha)/CD140a:
回収した細胞を0.2mlのリン酸緩衝液に懸濁し、2mgのPhycoerythrin(PE)標識したCD140a抗体(human CD140a specific monoclonal mouse IgG2a,phycoerythrin conjugated,BD Biosciences Pharmingen,556002,clone aR1)と4℃で1時間反応させた。ネガティブコントロールとしてPE標識したmouse IgG2a アイソタイプコントロール抗体(mouse IgG2a,phycoerythrin conjugated,BD Biosciences Pharmingen,553457,clone G155−178)を使用し、4℃で1時間反応させた。4倍容量のリン酸緩衝液で2回洗浄後、0.5mlのリン酸緩衝液に細胞を再懸濁し、FC500フローサイトメーター(ベックマン・コールター社)でPEの蛍光強度を検出した。結果を図2に示す。白のピークがネガティブコントロールの蛍光強度を示し、黒のピークがPE標識したCD140a抗体の蛍光強度を示す。
その結果、実施例2の場合、ピーク位置が蛍光強度が強い側にシフトし、比較例2、3ではネガティブコントロールとピークのシフトは見られなかった。このことより、従来、骨髄細胞を代表とする接着細胞は細胞増殖因子の受容体の一つであるPDGFR−alphaはフローサイトメトリー解析では検出できない、或いは発現量が低いとされていたが、細胞表面を損なわずに回収した細胞では検出できた。このことはPDGFR−alphaがトリプシンにより消化され、本発明で示す基材によって初めて接着細胞系におけるPDGFR−alphaの発現量を規定することが可能となったことを示している。近年、従来の細胞回収方法であるトリプシン処理に比べ、細胞表面タンパク質に対する障害の少ない方法とされるトリプシン・コラゲナーゼ・EDTA処理が広まりつつある。しかしながら、トリプシン・コラゲナーゼ・EDTA処理した細胞でも、トリプシン処理と同様にCD140aの検出はできず、本発明で示す基材による細胞回収法の優位性が示された。
Claims (4)
- 0〜80℃の温度範囲で水和力が変化する温度応答性ポリマーを被覆した基材表面を利用する細胞表層蛋白修復方法であって、
温度応答性ポリマーの被覆量が、0.8〜3.0μg/cm2の範囲であり、かつ、
細胞表層蛋白が酵素処理により損傷した細胞を、当該基材表面上に播種後、その細胞の倍化時間の80%以内に蛋白質加水分解酵素を使わずに、温度処理だけで細胞を当該基材表面から剥離することにより、細胞表層蛋白を修復する工程を含む
ことを特徴とする方法。 - 細胞表層蛋白が抗原である、請求項1に記載の細胞表層蛋白修復方法。
- 0〜80℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーがポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)である、請求項1又は2に記載の細胞表層蛋白修復方法。
- 0〜80℃の温度範囲で水和力が変化する温度応答性ポリマーを被覆した基材表面を利用する、細胞表層蛋白が修復された細胞の製造方法であって、
温度応答性ポリマーの被覆量が、0.8〜3.0μg/cm2の範囲であり、かつ、
細胞表層蛋白が酵素処理により損傷した細胞を、当該基材表面上に播種後、その細胞の倍化時間の80%以内に蛋白質加水分解酵素を使わずに、温度処理だけで細胞を当該基材表面から剥離することにより、細胞表層蛋白を修復する工程を含む
ことを特徴とする方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007105311A JP5641669B2 (ja) | 2007-03-14 | 2007-03-14 | 細胞表層蛋白修復方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007105311A JP5641669B2 (ja) | 2007-03-14 | 2007-03-14 | 細胞表層蛋白修復方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008220354A JP2008220354A (ja) | 2008-09-25 |
JP5641669B2 true JP5641669B2 (ja) | 2014-12-17 |
Family
ID=39839685
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007105311A Active JP5641669B2 (ja) | 2007-03-14 | 2007-03-14 | 細胞表層蛋白修復方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5641669B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010044417A1 (ja) * | 2008-10-14 | 2010-04-22 | 株式会社セルシード | 温度応答性細胞培養器材、及びその製造方法 |
JP5444721B2 (ja) * | 2009-01-13 | 2014-03-19 | 日本精工株式会社 | マニピュレーションシステム |
WO2011024963A1 (ja) | 2009-08-27 | 2011-03-03 | 学校法人 東京女子医科大学 | 直鎖型温度応答性高分子が固定化された温度応答性細胞培養基材、及びその製造方法 |
US9279102B2 (en) | 2010-08-31 | 2016-03-08 | Tokyo Women's Medical University | Temperature-responsive substrate for cell culture and production method thereof |
JP5935477B2 (ja) * | 2011-04-20 | 2016-06-15 | Dic株式会社 | 骨髄由来細胞の培養方法 |
US20140335610A1 (en) | 2011-11-20 | 2014-11-13 | Tokyo Women's Medical University | Cell culture substrate, and method for manufacturing same |
CA2882802C (en) | 2012-08-24 | 2021-07-06 | Riken | Method for producing retinal pigment epithelial cell sheet |
US20160115441A1 (en) | 2013-02-28 | 2016-04-28 | Hideaki Sakai | Novel graft polymer, temperature-responsive substrate for cell culture using the same and production method therefor, as well as liquid chromatographic carrier having the novel graft polymer immobilized thereon and liquid chromatographic method using the same |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05192138A (ja) * | 1992-01-22 | 1993-08-03 | Kao Corp | 皮膚細胞培養法及び培養皮膚 |
JP4874514B2 (ja) * | 2003-10-28 | 2012-02-15 | 幸二 西田 | 上皮系細胞の重層化培養方法、それから得られる重層化上皮系細胞シート及びその利用方法 |
EP1731030B1 (en) * | 2004-03-04 | 2017-06-21 | CellSeed Inc. | Method of constructing animal having cancer cells transplanted thereinto |
US20080131476A1 (en) * | 2005-02-28 | 2008-06-05 | Masato Kanzaki | Cultured Cell Sheet, Production Method and Tissue Repair Method Using Thereof |
JP2006320304A (ja) * | 2005-05-18 | 2006-11-30 | Cellseed Inc | 密閉系細胞培養容器及びそれを利用した細胞培養方法 |
-
2007
- 2007-03-14 JP JP2007105311A patent/JP5641669B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2008220354A (ja) | 2008-09-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5641669B2 (ja) | 細胞表層蛋白修復方法 | |
JP6069384B2 (ja) | 温度応答性細胞培養器材、及びその製造方法 | |
JP6206930B2 (ja) | 直鎖型温度応答性高分子が固定化された温度応答性細胞培養基材、及びその製造方法 | |
Klotz et al. | Engineering of a complex bone tissue model with endothelialised channels and capillary-like networks | |
EP3219790B1 (en) | Myocardial cell sheet | |
CN103409361A (zh) | 温敏微载体及其制备工艺和使用方法 | |
JP2016039806A (ja) | サイトカイン産生細胞シートとその利用方法 | |
JP6202621B2 (ja) | 細胞培養用基材及びその製造方法 | |
JP5261920B2 (ja) | 細胞を用いた試験法および試験用キット | |
US11667906B2 (en) | Magnetic microcarriers | |
JP5907661B2 (ja) | 直鎖型温度応答性高分子が固定化された温度応答性細胞培養基材、及びその製造方法 | |
JP2013059312A (ja) | 温度応答性細胞培養用ビーズ及びその製造方法 | |
Kobayashi et al. | Thermoresponsive thin hydrogel-grafted surfaces for biomedical applications | |
KR102554582B1 (ko) | 세포 배양 기판, 이의 제조방법 및 용도 | |
JP5777299B2 (ja) | 組織幹細胞の増殖方法、およびそれより得られる組織幹細胞 | |
JP6111013B2 (ja) | 腱細胞シート及びその製造方法 | |
JP2013000121A (ja) | 上皮細胞培養用培地、それを用いた上皮細胞培養方法及びそれより得られた上皮細胞 | |
JP5674255B2 (ja) | 細胞培養基材の評価方法 | |
JP5911678B2 (ja) | 伸縮可能な温度応答性基材、製造方法及びその利用方法 | |
TW202016288A (zh) | 細胞培養用水凝膠、凝膠套組、細胞培養物之製造方法、及細胞培養用水凝膠之製造方法 | |
Yamaoka et al. | Cell rolling column in purification and differentiation analysis of stem cells | |
JPH05276923A (ja) | 細胞培養用基材およびその製造方法 | |
JPH0541976A (ja) | 細胞培養試験用基材およびその製造方法 | |
JPH0541983A (ja) | 細胞培養用基材およびその製造方法 | |
JPH04278075A (ja) | 細胞培養試験用基材およびその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100312 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20100312 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120904 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121105 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130730 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130930 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140422 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140722 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20140910 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20141007 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20141028 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5641669 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |