CN104395457B - 用于细胞培养的合成粘附培养基 - Google Patents

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Abstract

一种水性细胞培养基组合物，所述组合物包含用于支持哺乳动物细胞培养的水性细胞培养溶液。所述组合物还包含溶解于水性细胞培养溶液的与多肽偶联的合成聚合物。与多肽偶联的合成聚合物用于在细胞培养条件下粘附于细胞培养制品的表面。在细胞培养条件下在细胞培养表面上孵育水性细胞培养基组合物导致与多肽偶联的合成聚合物对所述表面的粘附。

Description

用于细胞培养的合成粘附培养基
本申请根据35U.S.C.§119要求2012年2月2日提交的美国临时申请系列第61/594016号的优先权，本文以该申请的内容为基础并通过参考将其完整地结合于此。
技术领域
本发明涉及细胞培养，并且更具体地涉及含有合成的、化学限定聚合物的用于细胞培养的培养基，以及用于细胞培养的方法和用于使用这类培养基的被覆基质的方法。
背景
治疗性细胞正处于开发中，这是一种可以被导入人中用于治疗疾病的细胞。治疗性细胞的示例包括干细胞，诸如人胚胎干细胞(hESC)和人间充质干细胞(hMSC)，其能够分化成人体中的各种细胞类型。干细胞的这种性质为开发针对多种严重细胞退化疾病(诸如糖尿病、脊髓损伤、心脏病等)的新治疗方法提供了潜力。然而，在基于这类细胞的治疗的开发中存在障碍。
在开发和控制治疗性细胞培养中，在细胞和组织培养中得到并维持足够数量的治疗性细胞并且确保这些细胞在细胞培养中不以不需要的方式变化是重要的。例如，干细胞培养通常用来自细胞库或细胞储物的少数细胞接种，然后以未分化或部分分化的状态扩增直至给定的治疗性应用所需要的分化。出于该目的，干细胞或其分化的细胞通常在含有动物来源组分的表面或培养基(诸如饲养层、血清或购自美国新泽西州富兰克林湖市的BD生物科学公司(BD Biosciences，Franklin Lakes NJ)的MatrigelTM)的存在下培养。加至培养环境的这些动物来源的添加物可能会使细胞暴露于潜在有害的病毒或其他感染剂，这些有害物可能被传递至患者或可能危害hESC的一般培养和维持。另外，这类生物产品容易产生批次差异、免疫应答和有限保存期。
最近，已显示不含动物来源组分的合成表面在化学限定的培养基中成功培养干细胞，解决了在动物来源组分存在下培养细胞中所产生的许多问题。然而，这类合成表面由高浓度的重组多肽制成，这对于制造而言可能是昂贵的。在一些情况下，由于水溶性被覆材料在细胞培养条件下通常不能充分保持与表面的结合，因此合成表面需要使用有机溶剂来达到被覆目的。
发明内容
其中，本发明描述了能够支持干细胞在化学限定的培养基中生长和粘附的肽-聚合物，其中可以向细胞培养基中加入作为补充剂的肽-聚合物以增强细胞对未被覆表面的粘附。已经发现当作为补充剂引入细胞培养基时，肽聚合物在细胞培养基质表面上形成稳定的被覆层。
在本文所述的各种实施方式中，水性细胞培养基组合物包含(i)用于支持哺乳动物细胞培养的水性细胞培养溶液；(ii)与溶于水性细胞培养溶液的多肽偶联的合成聚合物，其中与多肽偶联的合成聚合物用于在细胞培养的条件下粘附到细胞培养制品的表面，并且其中在细胞培养的条件下在细胞培养表面上孵育水性细胞培养基组合物导致对偶联有多肽的合成聚合物的表面的粘附。细胞培养基可以是化学限定的组合物或可以基本不含有机溶剂。在实施方式中，所述聚合物具有线性主链并且没有交联，其中在20℃或更低温度下，偶联有多肽的合成聚合物可溶于水。在实施方式中，所述细胞培养基包含葡萄糖和一种或多种氨基酸。
在实施方式中，本文所述的方法包括(i)向水性细胞培养基引入含有共价连接的多肽的合成聚合物以产生含有聚合物的细胞培养基，其中与多肽偶联的合成聚合物用于在细胞培养条件下粘附到细胞培养制品的表面；(ii)在细胞培养制品的表面上配置含有所述聚合物的细胞培养基，以获得经被覆的制品；以及(iii)在细胞培养条件(例如，37℃)下在所述培养基中孵育所述经被覆的制品以使所述偶联有多肽的合成聚合物粘附到所述细胞培养制品的表面。所述基质的表面可以具有0°和50°之间的水接触角。在实施方式中，所述基质的表面是等离子体处理的聚苯乙烯表面。该方法还可以包括在细胞培养条件下在培养基中于经被覆的制品上孵育细胞(诸如干细胞；例如，人间充质干 细胞或人胚胎干细胞)。该方法还可包括在使含有所述聚合物的细胞培养基与所述细胞培养制品的表面接触之前向含有所述聚合物的细胞培养基引入细胞。
本文所述的细胞培养制品、组合物或方法的一个或多个实施方式提供了优于现有的细胞培养制品、组合物或用于产生经被覆的细胞培养制品的方法的一个或多个优势。例如，因为被覆层是完全合成的，其没有如下问题：批次差异、免疫应答、有限的保存期和使细胞暴露于可能传递给患者的潜在有害的病毒或其他感染剂的风险。在各种实施方式中，在一般的细胞培养条件下，所述覆层由细胞培养基中存在的肽聚合物原位形成。结合以下附图，对以下详述部分进行阅读，可以很容易地理解这些优点以及其它的优点。
附图简要说明
图1是制备偶联有细胞粘附多肽的聚(MAA-PEG4-VN)均聚物的反应方案。
图2是制备偶联有细胞粘附多肽的聚(HEMA-共聚-MAA-PEG4-VN)共聚物的反应方案。
图3A-B是经被覆制品的侧视示意图。
图4A-C是有孔的细胞培养制品的截面示意图。未被覆(4A)；被覆的表面(4B)；以及被覆的表面和侧壁(4C)。
图5a-c是在含有或不含粘附补充剂的化学限定的培养基中不同表面上培养的人间充质干细胞(hMSC)的图像：(a)在用MesenCult-XF粘附基质(MC-ASB)预被覆的TCT表面上；(b)在用0.037mg/ml MC-ASB补充的培养基中的TCT表面上；在用0.0074mg/ml MC-ASB补充的培养基中的TCT表面上。
图6a-f是在含有或不含粘附补充剂的化学限定的培养基中不同表面上培养的hMSC的图像：(a)在聚HEMA-共聚-VN预被覆的表面上；(b)在不含粘附补充剂的表面上；(c)在用0.006mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上；(d)在用0.012mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上；(e)在用0.025mg/ml聚HEMA- 共-VN补充的培养基中的表面上；(f)在用0.050mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上。
图7a-i是在含有或不含粘附补充剂的化学限定的培养基中不同表面上培养的结晶紫染色的hMSC的图像：(a)在用MC-ASB预被覆的TCT表面上；(b)在用0.037mg/ml MC-ASB补充的培养基中的TCT表面上；(c)在用0.0074mg/ml MC-ASB补充的培养基中的TCT表面上；(d)在聚HEMA-共-VN预被覆的表面上；(e)在不含补充剂的表面上；(f)在用0.006mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上；(g)在用0.012mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上；(h)在用0.025mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上；(i)(c)在用0.050mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上。
图8是显示在化学限定的培养基中各种表面上培养的活hMSC的百分比的柱形图。
图9是显示在化学限定的培养基中各种基质上培养的hMSC的细胞密度(细胞/cm2)的柱形图。
图10a-c是在含有或不含粘附补充剂的化学限定的培养基中各种表面上培养2天的人胚胎干细胞(hESC)的图像：(a)在用0.025mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上；(b)在用0.006mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上；在被覆的对照表面上。
图11a-c是在含有或不含粘附补充剂的化学限定的培养基中各种表面上培养4天的hESC的图像：(a)在用0.025mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上；(b)在用0.006mg/ml聚HEMA-共-VN补充的培养基中的表面上；在被覆的对照表面上。
图12是显示在各种表面上培养的hESC的平均细胞数目的柱形图。
附图不一定是按比例绘制的。图中使用的相同附图标记表示相同的部分、步骤等。但应理解，在特定的附图中使用附图标记表示一个部分并不会对另一附图中用相同附图标记标出的部分构成限制。此外，用不同的附图标记表示各部分并不表明附图标记不同的部分不能相同或相似。
发明详述
在以下详述中，参照构成说明书的一部分的附图，以示意性方式描述本发明的装置、系统和方法的几种具体实施方式。应理解，可以在不偏离本发明的范围或精神的前提下，可构思和实现其它的实施方式。因此，以下发明详述不应理解为限制性的。
除非另外说明，本文使用的所有科学和技术术语的含义是本领域通用的含义。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。
在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括具有多个所指对象的实施方式，除非文中有明确的相反表示。如本说明书和所附权利要求书所用，“或”字通常在其包括“和/或”的含义上使用，除非文中有明确的相反表示。
在本文中，“具有”、“含有”、“包括”、“包含”、“含”、“拥有”等在其开放含义上使用，通常表示“包括但不限于”。应当理解，“主要由……组成”、“由……组成”等涵盖在术语“包括”等的范围之内。
当涉及单体或聚合物和多肽时，本文使用的“偶联的”表示多肽与聚合物或单体直接或间接(例如，通过间隔子)共价结合。
本文使用的“单体”表示能够与另一个单体聚合的化合物，(不论该“单体”与另一个单体是相同还是不同的化合物)。
在本文中，“(甲基)丙烯酸酯单体”表示甲基丙烯酸酯单体或者丙烯酸酯单体。在本文中，“(甲基)丙烯酰胺单体”表示甲基丙烯酰胺或者丙烯酰胺单体。(甲基)丙烯酸酯和(甲基)丙烯酰胺单体包含至少一个烯键式不饱和部分。在本文中，“聚(甲基)丙烯酸酯”表示由包括至少一种(甲基)丙烯酸酯单体的一种或多种单体形成的聚合物。在本文中，“聚(甲基)丙烯酰胺”表示由包括至少一种(甲基)丙烯酰胺单体的一种或多种单体形成的聚合物。
本文使用的与偶联有多肽的聚合物“基本相似”的不偶联多肽的聚合物是以与偶联有多肽的聚合物相同的方式形成的聚合物，除了不包含多肽以外。例如，多肽可以在聚合物形成之后通过移接与该聚合物偶联。在这类情况中，并不偶联多肽的基本相似的聚合物是未经移接的聚合物。通过其他实施例的方 式，单体可以由多肽衍生化并且该多肽可以在单体聚合或共聚合时被纳入该聚合物中。在这类情况中，不偶联多肽的基本相似的聚合物是在与偶联有多肽的聚合物相同的条件下形成的聚合物，除了该单体不由多肽衍生化以外。
在本文中用单字母氨基酸代码或三字母氨基酸代码表示多肽序列。这些代码可以互换使用。
在本文中，“肽”和“多肽”表示氨基酸序列，它们可以通过化学方式合成或者可以重组衍生，但是它们无法以完整蛋白质的形式从动物来源分离。出于本发明的目的，肽和多肽不是完整的蛋白质。肽和多肽可以包括作为蛋白质片段的氨基酸序列。例如，肽和多肽可以包括被称为细胞粘附序列(如RGD)的序列。多肽可以具有任何合适的长度，例如长度为3-30个氨基酸。多肽可以进行乙酰化(如Ac-LysGlyGly)或者酰胺化(如SerLysSer-NH2)以保护其自身免于被例如外肽酶破坏。可以理解，在描述某种序列的时候，也考虑了这些修饰形式。
在本文中，“化学限定的培养基”表示不含具有未知组成的组分的细胞培养基。在各实施方式中，化学限定的培养基可以不含蛋白质或水解物。
在实施方式中，本文所述的聚合物和多肽是“合成的”。即它们不含来源于动物或动物提取物的成分。聚合物或单体可以与多肽偶联(“聚合物-多肽”或“单体-多肽”)。可以通过重组技术来合成或得到多肽，从而它们是合成的、非动物来源的材料。
本发明描述了用于培养细胞或用于被覆细胞培养制品的组合物和方法。该组合物和方法包括偶联有多肽的合成聚合物。合成的聚合物-肽是水溶性的，但是在一般哺乳动物细胞培养条件下(如约37℃下在培养基中孵育)粘附于细胞培养制品的表面。会理解细胞培养条件不包括暴露于高于背景或环境的水平的辐射，如UV辐射。
聚合物-肽可以作为粘附补充剂加入到细胞培养基中或作为其部分。可以向含有该聚合物-肽的细胞培养基中加入细胞，并且可将所述接种了细胞的培养基置于细胞培养制品上或与细胞培养制品接触。在细胞培养条件下，例如，在约37℃下在培养基中孵育，聚合物-肽粘附于所述细胞培养制品的表面，并 且细胞粘附于该聚合物肽的肽。因此，细胞通过聚合物-肽粘附于细胞培养制品的表面。
在本文所述的实施方式中，相对于使不含聚合物-肽的培养基中的细胞与已经用聚合物-肽预被覆的制品接触，通过向培养基加入聚合物-肽并且与未被覆的细胞培养制品接触增强了细胞对细胞培养制品表面的粘附。
合成的聚合物-肽
任何合适的偶联有多肽的水溶性聚合物均可以用作细胞培养基粘附补充剂，前提是当在一般细胞培养条件下于培养基中孵育时，聚合物粘附于细胞培养制品的表面。在实施方式中，本文所述的合成的聚合物和偶联的多肽可溶于低温(例如，低于20℃)或室温(25℃)下的水中但当暴露于一般的细胞培养条件(例如，约37℃)时变得牢固粘附至基质。在实施方式中，在室温左右的温度(例如，约25℃)下，合成的聚合物和偶联的多肽变得牢固粘附至基质。可以对合成的聚合物和偶联的多肽进行修饰以得到任何需要的温度下的基质粘附。在实施方式中，聚合物不含交联剂或交联，但是当与水性培养基(诸如细胞培养基)中的基质接触时，它们粘附于细胞培养基质。不需要经过高于一般背景辐射水平的辐射水平(例如UV辐射)就可产生聚合物-多肽与基质的粘附。
本文所述的偶联有多肽的聚合物可以在室温或更低的温度下溶于水。然而，在实施方式中，不偶联多肽的基本相似的聚合物在室温或更低的温度下不溶于水。在这类实施方式中，多肽使偶联有多肽的聚合物溶于水。在实施方式中，不偶联多肽的基本相似的聚合物在细胞培养温度(其通常是37℃，但可以更低，诸如室温(25℃))下不溶于水。也可希望聚合物在37℃或细胞培养需要的温度下可在水中溶胀，以得到合适的细胞培养模量。
可以通过使用任何合适的单体的任何合适的方法来形成偶联有多肽的聚合物。在实施方式中，选择用于形成聚合物的一种或多种单体和用于形成聚合物的反应机制(例如，逐步聚合或缩聚，或链式聚合或加成聚合)来形成具有线性聚合物主链的聚合物。在实施方式中，选择用于形成聚合物的一种或多种单体和用于形成聚合物的反应机制来形成具有支化聚合物主链的聚合物。支化聚合物可以不含交联。在实施方式中，选择用于形成聚合物的一种或多种单体 和用于形成聚合物的反应机制来形成星状(star)。为了形成支化或星状聚合物，多官能单体可以与单官能单体联合使用。形成支化或树突或星状聚合物的合适的反应方案见述于，例如Konkolewicz等，Dendritic and hyperbranched polymers frommacromolecular units：Elegant Approaches to the Synthesis of FunctionalPolymers，Macromolecules(从大分子单元形成树突和高分支聚合物：功能性聚合物合成的极佳方法)，2011，44：7067-7087。当然可以使用任何其他合适的技术。
在许多实施方式中，用于形成聚合物的单体含有烯键式不饱和基团，诸如(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、马来酰亚胺、富马酸酯、乙烯砜等。所述聚合物可以是均聚物或共聚物。可以选择单体，从而聚合物与多肽偶联时在37℃、25℃等温度下不溶或微溶于水，但是在4℃-25℃、4℃-15℃或20℃等的范围内可溶于水。
在各种实施方式中，使用的单体是式(I)的(甲基)丙烯酸酯单体：
其中，A是H或甲基，并且其中B是H、C1-C6直链或支链的醇或醚、或由羧基基团(-COOH)取代的C1-C6直链或支链烷基。在一些实施方式中，B是C1-C4直链或支链的醇。在一些实施方式中，B是由羧基基团取代的直链或者支链的C1-C3。例如，可以使用甲基丙烯酸2-羧基乙酯、丙烯酸2-羧基乙酯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸甘油酯、丙烯酸羟丙酯、丙烯酸4-羟丁酯等。
在各种实施方式中，使用的单体是式(II)的(甲基)丙烯酰胺单体：
其中，A是氢或甲基，并且其中B是H、C1-C6直链或支链的醇或醚、或由羧基基团(-COOH)取代的C1-C6直链或支链烷基。在一些实施方式中，B是由羧基基团取代的直链或者支链的C1-C3。在一些实施方式中，B是C1-C4直链或支链的醇。例如，可以使用2-羧基乙基丙烯酰胺、丙烯酰氨基乙醇酸、N-(羟甲基)丙烯酰胺、N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺、3-丙烯酰氨基-1-丙醇、N-丙烯酰氨基-乙氧基乙醇、N-羟乙基丙烯酰胺等。
可以选择用于形成聚合物的一种或多种单体来获得具有所需特性(例如，模量、可溶胀性、水溶性)的聚合物。例如，由超过一种单体形成的共聚物可以具有比由任何一种单独的单体形成的均聚物更高程度的可溶胀性。通常，具有较长链烷基基团的单体倾向于赋予聚合物过高的水不溶性，供于偶联的多肽使聚合物-多肽在合适的温度下溶于水。另外，具有有利于形成氢键或在选择的pH水平下带电的部分的单体可能倾向于使聚合物更易溶于水。本领域技术人员能够容易地选择合适的单体和单体的比率来制备具有需要特征的聚合物。
一旦选择了合适量的合适单体，可以通过聚合反应形成聚合物。除了形成聚合物的单体以外，组合物可以包括一种或多种其他化合物，例如表面活性剂、湿润剂、光引发剂、热引发剂、催化剂和活化剂。
可以使用任何合适的聚合引发剂。本领域技术人员能够很容易地选择适合与单体一起使用的合适的引发剂，例如自由基引发剂或者阳离子型引发剂。在各种实施方式中，用UV光产生自由基单体以引发链聚合。聚合引发剂的例子包括有机过氧化物、偶氮化合物、醌、亚硝基化合物、酰基卤、腙、巯基化合物、吡喃鎓化合物、咪唑、氯三嗪、苯偶姻、苯偶姻烷基醚、二酮、苯基酮或它们的混合物。能够被紫外光活化或者被可见光活化的光引发剂的可以在市场上购得的合适的例子的商品名为例如：购自美国纽约的塔利镇的希巴特别化学品公司(Ciba Specialty Chemicals，Tarrytown，N.Y.)的IRGACURE 651，IRGACURE 184，IRGACURE 369，IRGACURE 819，DAROCUR 4265和DAROCUR 1173，以及购自巴斯夫公司(美国北卡罗来纳州，夏洛特市)的LUCIRIN TPO和LUCIRIN TPO-L。
还可以在合适的引发剂体系中包含光敏剂。代表性的光敏剂包含羰基或叔胺基，或者这些基团的组合。包含羰基的光敏剂包括二苯甲酮、苯乙酮、苯偶酰、苯甲醛、邻氯代苯甲醛、呫吨酮、噻吨酮、9，10-蒽醌和其它的芳族酮。包含叔胺的光敏剂包括甲基二乙醇胺、乙基二乙醇胺、三乙醇胺、苯基甲基乙醇胺和二甲基胺基乙基苯甲酸酯。可以在市场上购得的光敏剂包括购自彼得索耶尔公司(Biddle Sawyer Corp)的QUANTICURE ITX、QUANTICUREQTX、QUANTICURE PTX、QUANTICURE EPD。
一般来说，光敏剂或光引发剂体系的量可以约为0.01-10重量％。
可以采用的阳离子引发剂的例子包括鎓阳离子的盐，例如芳族锍鎓盐，以及例如离子芳烃体系之类的有机金属盐。
可以使用的自由基引发剂的例子包括偶氮类引发剂，例如2-2′-偶氮二(二甲基-戊腈)、偶氮二(异丁腈)、偶氮二(环己烷亚硝酸盐/酯)、偶氮二(甲基-丁腈)等，过氧化物引发剂，例如过氧化苯甲酰、过氧化月桂酰、甲基乙基酮过氧化物、过碳酸异丙酯、2，5-二乙基(dienethyl)-2，5-二(2-乙基己酰基-过氧基)己烷、二叔丁基过氧化物、氢过氧化枯烯、过氧化二氯苄基苯甲酰、过硫酸钾、过硫酸铵、硫酸氢钠、过硫酸钾、硫酸氢钠等的组合，以及它们的混合物。当然可以使用任何其他合适的自由基引发剂。引发剂的有效用量通常约为反应混合物的0.1-15重量％，例如约为反应混合物的0.1-10重量％或者约0.1-8重量％。
在各种实施方式中，在发生聚合反应之前，稀释一种或多种单体。
从聚合反应中得到的聚合物可以具有任何合适的分子量。在各种实施方式中，聚合物具有10,000-1000,000道尔顿的平均分子量(Mw)，诸如10,000-250,000道尔顿。本领域技术人员会理解可以改变引发剂的量、反应时间、反应温度等来调节所得聚合物的分子量。
(甲基)丙烯酸酯单体、(甲基)丙烯酰胺单体或者其他合适的单体可以通过本领域已知的方式合成，或者购自供应商，例如购自聚合科学有限公司 (Polysciences，Inc.)、希格玛-艾尔德里奇有限公司(Sigma Aldrich，Inc.)和萨托默有限公司(Sartomer，Inc.)。
多肽可以任何合适的方式与聚合物偶联。在一些实施方式中，单体经衍生化以包含多肽，并且因此多肽在聚合物形成时纳入聚合物中。在一些实施方式中，多肽在聚合物形成之后移接到聚合物上。
参考图1-2，显示了在聚合物形成时将多肽纳入聚合物的反应方案的示例。在图1中，玻连蛋白多肽(VN)通过重复的聚乙二醇(PEG4)间隔子与甲基丙烯酸酯(MAA)偶联。通过在合适的条件下聚合与多肽(VN)偶联的单体(MMA)来产生均聚物。在所示的实施方式中，乙醇是溶剂，2，2′-偶氮二(2-甲基丁腈)(AMBN)是热引发剂，反应温度是68℃，并且在氩气下进行该反应。
单体可以使用任何合适的方法衍生化以包含多肽，如本文中的实施例1所述。熟知的用于制备多肽-单体的方法见述于2007年8月16日公开的US2007/0190036，Kizilel，S.等为发明人。当然，可以使用其他用多肽衍生化单体的方法。
在图2所示的实施方式中，在与上述图1的描述中相似的反应条件下由甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)和MMA-PEG4-VN形成共聚物。使用多种单体来产生聚合物允许更容易地根据需要调节所得的聚合物的性质，无论多肽是否在聚合物形成时纳入聚合物中。
在实施方式中，由式1描述了肽单体肽：
式1：Rm-Sp-Cap，
其中，R是聚合部分，“m”是大于或等于1的整数，Sp是任选的间隔子，并且Cap是细胞粘附多肽(例如，如下所述)。R可以是α，β-不饱和基团或烯键式不饱和基团，其包括丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、马来酰亚胺或富马酸酯，其能够在外部能源存在下聚合。在实施方式中，官能化的肽具有聚合部分R，其可以是可光聚合部分或可热聚合部分。
在实施方式中，Sp可以是聚环氧烷，包括例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)，其表示为式(O-CH2CHR’)m2，其中R’是H或CH3并且m2是0-200的整数，诸如0-100或0-20。间隔子可以是亲水性间隔区，例如聚环氧乙烷 (PEO)。在实施方式中，间隔子是PEO4。在实施方式中，希望聚环氧烷的链相对较短。例如，在实施方式中，Sp可以是PEG2、PEG4、PEG6、PEG8、PEG10、PEG12或PPG2、PPG4、PPG6、PPG8、PPG10、PPG12或PPG20。在实施方式中，间隔子是具有20个或更少重复单元的聚环氧乙烷(即，PEG4、PEG6、PEG8、PEG10、PEG12、PEG14、PEG16、PEG18或PEG20)。在实施方式中，Sp是具有官能团的PPG或PEG。例如，PEG或PPG间隔子可以具有马来酰亚胺、硫醇、胺、硅烷、醛、环氧化物、异氰酸酯、丙烯酸酯或羧基基团。在实施方式中，PEG间隔子是Jeffamine，一种具有胺官能团的PEG。在其他实施方式中，PEG或PPG可以是支化的。例如，支化PEG或PPO可以是Y-支化的或星状-PEG或PPG。在实施方式中，这些支化的PEG或PPO间隔子可以允许多种肽通过单官能肽与基材偶联。
一旦细胞培养表面形成(下文详述)，间隔子可以作用使肽(Cap)从细胞培养表面延伸出去，使肽更易于接触培养中的细胞，并且改善用于细胞培养的表面的效率。另外，亲水性间隔子可以作用以排斥蛋白质，防止细胞或蛋白质对官能化的肽的非特异性吸收。在实施方式中，在细胞培养制品的制备中使用具有诸如PEO(聚环氧乙烷)的间隔子的细胞粘附肽允许制备具有较低的粘附肽总浓度的这类制品。
在实施方式中，Sp可以是氨基酸Xaan，其中Xaa是独立的任何氨基酸并且n是0-30、0-10、0-6或0-3的整数。例如，在实施方式中，Sp可以是氨基酸Xaan，其中Xaa是G并且其中n＝1-20，或者Sp可以是氨基酸Xaan，其中Xaa是K并且其中n＝1-20，或者Sp可以是氨基酸Xaan，其中Xaa是D并且其中n＝1-20，或者Sp可以是氨基酸Xaan，其中Xaa是E并且其中n＝1-20。在实施方式中，间隔子Sp可以是三个氨基酸的序列，诸如LysGlyGly或LysTyrGly。在实施方式中，Xaan是一系列的相同氨基酸。在实施方式中，间隔子Sp可以是Xaan和聚环氧乙烷或聚环氧丙烷的组合。Xaan可以包含亲水性氨基酸，诸如赖氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸氨基酸。在实施方式中，Xaan可以具有末端赖氨酸或精氨酸。或者，在实施方式中，间隔子Sp可以包含任何组合的聚环氧乙烷间隔子或氨基酸间隔子。在实施方式中，Sp 可以是疏水性间隔子，诸如棕榈酸、硬脂酸、月桂酸或六亚乙基二胺。在实施方式中，Sp可以是甲基丙烯酸羧基乙酯。
聚合部分可以任何合适的方式与间隔子Sp相连，如通过聚环氧乙烷、通过诸如赖氨酸的氨基酸侧链、在氨基酸的N-末端等。氨基酸Xaan可以经乙酰化和/或酰胺化以防止其降解。然而，如果Xaan经乙酰化，聚合部分不能通过氨基酸的N-末端与Xaan结合。例如，甲基丙烯酸可以通过赖氨酸氨基酸的侧链与赖氨酸氨基酸结合，其中Sp是Xaan，Xaa是赖氨酸，n＝1并且Rm是甲基丙烯酸。
在实施方式中，间隔子Sp是Xaan并且Xaan具有末端赖氨酸。在实施方式中，Xaan可以与聚合部分Rm结合。例如，Xaan可以是(MAA)LysGlyGly或(MAA)LysTyrGly，其中MAA是通过末端赖氨酸的侧链与Xaan结合的聚合部分甲基丙烯酸(MAA)。在另外的实施方式中，聚合部分可以与Xaan氨基酸的N-末端或氨基酸链(如果N-末端未乙酰化)结合。各官能化的肽具有至少一个聚合部分，并且可以具有超过一个的聚合部分。
在各实施方式中，将多肽移接到已经形成的聚合物中。优选地，多肽包括能够与聚合物的侧基反应基团偶联的氨基酸。可以使聚合物与多肽反应的反应基团的示例包括马来酰亚胺、缩水甘油基、异氰酸酯、异硫氰酸酯、活化的酯、活化的碳酸酯、酸酐等。例如，在多肽中可以包含任何能够进行亲核加成(例如通过形成酰胺键)的天然或者仿生氨基酸，用来与具有合适反应基团的多肽进行偶联。具有供于与聚合物的反应基团偶联的合适性质的氨基酸的例子是赖氨酸、高赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丙酸以及二氨基丁酸。另外，如果多肽的N-末端胺没有封端，其可以用来与羧基偶联。在各个实施方式中，与聚合物偶联的多肽氨基酸位于多肽的羧基末端位置或者氨基末端位置。
可以通过任何合适的技术将多肽偶联到聚合物。可以通过氨基末端氨基酸、羧基末端氨基酸或者内部氨基酸，将多肽与聚合物偶联。本领域公知，一种合适的技术包括盐酸1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学方法。EDC和NHS或N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)可以与聚合物的游离羧基基团反应，以得到胺反应性NHS酯。EDC与聚合物的羧基反应，以得到易于水解的胺反应性O-酰基异脲中间体。通过加入NHS 或者磺基-NHS，将胺反应性O-酰基异脲中间体转化为胺活性NHS或磺基-NHS酯，使得可以进行两步过程，由此使得胺反应性O-酰基异脲中间体稳定化。在聚合物活化之后，可以随后加入多肽，所述多肽的末端胺可以与胺反应性酯反应，形成稳定的酰胺键，从而使得多肽与聚合物层偶联。当使用EDC/NHS化学试剂将多肽与聚合物偶联的时候，N-末端氨基酸优选是含胺的氨基酸，例如赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸或者二氨基丙酸。当然也可以使用任何可以接受的亲核试剂，例如羟基胺、肼、羟基等。
EDC/NHS化学试剂导致多肽与聚合物的零长度交联。可以向多肽的N-末端氨基酸中加入具有末端胺的接头或间隔区，例如聚(乙二醇)接头(例如商业购自款沓生物设计公司(Quanta BioDesign，Ltd.))。当将接头加入N-末端氨基酸的时候，所述接头优选是N-PG-酰氨-PEGx-酸，其中PG是保护基团，例如Fmoc基团、BOC基团、CBZ基团或者可用于肽合成的任何其它基团，X为2、4、6、8、12、24，或者可得的任何其它离散的PEG。当然，可以使用任何其他合适的向聚合物移接多肽的机制。
无论多肽与聚合物如何偶联；例如，通过纳入与多肽偶联的衍生化的单体或通过移接，多肽粘附或待粘附的单体(肽-单体)与无多肽粘附或待粘附的单体(无肽-单体)的比率可以变化以获得所需性质，诸如可溶胀性、水溶性、模量等。在实施方式中，肽单体与无肽单体的摩尔比为约1∶1-约1∶50，诸如约1∶5和1∶20、约1∶10、约1∶9等。
在实施方式中，多肽通过接头或间隔子与聚合物偶联。可以使用接头或间隔子，例如重复的聚(乙二醇)接头或者任何其它合适的接头来增加从多肽到聚合物表面的距离。所述连接物可以具有任何合适的长度。例如，如果所述连接物是重复的聚(乙二醇)接头，所述接头可以包含2-10个重复的乙二醇单元。在一些实施方式中，所述接头是包含大约4个重复乙二醇单元的聚(乙二醇)接头。全部、一部分、或者没有多肽通过接头与聚合物偶联。其它可能使用的潜在接头包括多肽接头，例如聚(甘氨酸)或者聚(β-丙氨酸)。
当用于细胞培养时，接头可以提供细胞对多肽的更佳可及性。另外，在多肽与单体偶联的实施方式中使用接头，可以增加单体聚合成均聚体或共聚体的效率。
所述多肽可以是环状的，或者包括环状部分。可以使用任何合适的用来形成环状多肽的方法。例如，可以通过使得合适的氨基酸侧链上的游离氨基官能团与合适的氨基酸侧链上的游离羧基成环，形成酰氨连接键。另外，可以在肽序列中合适的氨基酸侧链的游离巯基之间形成二硫键。可以采用任何合适的技术形成环状多肽(或其部分)。例如，可以使用WO1989005150所述的方法形成环状多肽。可以使用首尾相接的环状多肽，其中多肽的羧基末端和氨基末端之间形成酰胺键。二硫键的一种替代是使用两个硒半胱氨酸的二硒键，或者混合的硒/硫键，如以下文献所述：Koide等，1993，Chem.Pharm.Bull.41(3)：502-6；Koide等，1993，Chem.Pharm.Bull.41(9)：1596-1600；或者Besse和Moroder，1997，Journal ofPeptide Science，第3卷，442-453。
多肽可以通过本领域已知的方式合成(或者通过分子生物技术制备)或者由供应商处获得，例如购自美国肽公司(American Peptide Company)、CEM公司或者GS公司(GenScript Corporation)。连接物可以通过本领域已知的方式合成，或者购自供应商，例如购自款沓生物设计公司(Quanta BioDesign，Ltd.)的离散的聚乙二醇(dPEG)连接物。
在多种实施方式中，所述多肽或者其部分具有细胞粘附活性；即，当多肽与聚合物偶联时，所述多肽允许细胞粘附于含肽的聚合物的表面。例如，所述多肽可以包含由整联蛋白族的蛋白质识别或者导致与细胞分子的相互作用从而维持细胞粘附的氨基序列，或者其细胞粘附部分。例如，所述多肽可以包含源自以下的氨基酸序列：胶原、角蛋白、明胶、纤连蛋白、玻璃体结合蛋白、层粘连蛋白、骨唾液蛋白(BSP)等，或者它们的部分。在各种实施方式中，多肽包含氨基酸序列ArgGlyAsp(RGD)。
可用于本文的实施方式中的肽的示例列于表1。
表1：多肽的非限制性示例
对于本文讨论的任何多肽，应当理解可以用保守氨基酸代替具体限定的或者已知的氨基酸。在本文中，所谓“保守氨基酸”表示功能与第二种氨基酸类似的氨基酸。在多肽中，这些氨基酸可以根据公知技术彼此替代而对多肽的结构或功能造成非常小的影响。以下五组各自含有可互相保守取代的氨基酸：脂族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性的：天门冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷酰胺(Q)。一种或多种多肽可以任何合适的量偶联至聚合物，无论是移接还是在聚合物形成期间纳入。优选地，多肽的重量百分比足够高以使偶联至聚合物的聚合物具有水溶性。在各种实施方式中，多肽相对于偶联有多肽的聚合物的重量百分比为10％或更高、20％或更高、40％或更高、60％或更高等。已经确定这类重量百分比获得了良好的水溶性、固定效率和对于分子量为1500道尔顿或更高的多肽可接受的细胞粘附。
本文所述的聚合物提供了合成表面，任何合适的粘附多肽或多肽的组合可以偶联于所述合成表面上，提供了对于包含未知组分的生物底物或者血清的替代方式。在目前的细胞培养实践中，已知一些细胞类型需要在培养表面上存在生物多肽或者多肽的组合，以便细胞粘附于所述表面并进行可持续的培养。例如，HepG2/C3A肝细胞可以在存在血清的情况下粘附于塑料培养皿。还已知血清可以提供能够附着于塑料培养皿的多肽，以提供供某些细胞附着的表面。但是，生物来源的底物和血清包含未知的组分。对于一些细胞，导致细胞粘附的血清或者生物来源的底物中的特定组分或者组分(肽)的组合是已知的，这些已知的多肽可以合成并应用于本文所述的聚合物，由此可以在不含或者包含很少未知来源或组成的组分的合成表面上培养细胞。
细胞培养基组合物
与多肽偶联的聚合物可以溶于水性溶液用于被覆细胞培养制品或培养细胞。在实施方式中，水性溶液不含或基本不含有机溶剂。应理解，在水性溶液中可以存在少量的有机溶剂，例如，由聚合后聚合物中残留的一些有机溶剂所造成。当述及水性溶液中的有机溶剂时，本文使用的“基本不含”表示水性溶液含有低于2重量％的有机溶剂。在许多实施方式中，水性溶液含有低于1％、低于0.5％、低于0.2％或低于0.1％的有机溶剂。水性溶液不含的有机溶剂的示例包括甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、辛醇、己烷、庚烷、丙酮、乙酰乙酸酯、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)等。
与多肽偶联的聚合物可以任何合适的浓度溶于水性溶液中用于被覆或培养的目的。例如，水性溶液可能含有0.001mg/ml-1mg/ml的与多肽偶联的聚合物，诸如0.003mg/ml-0.05mg/ml的与多肽偶联的聚合物。
在实施方式中，水性溶液是细胞培养基溶液，表示该溶液用于支持细胞(诸如哺乳动物细胞)的培养。在实施方式中，所述细胞是干细胞，诸如人胚胎干细胞或人间充质干细胞。细胞培养基溶液可以具有约7-约8的pH，诸如约7.2-7.5，其由pH缓冲剂缓冲，诸如磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂等。细胞培养基溶液可以包括任何适于细胞培养的组分，诸如葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐等。细胞培养组分和浓度是本领域已知的。参见例如BurgenerA，Butler，“Medium Development(培养基发展)”刊于Cell Culture Technology ForPharmaceutical and Cell-Based Therapies(《用于药物和基于细胞的治疗的细胞培养技术》)中，由Ozturk SS和Hu WS主编，2006。在实施方式中，细胞培养基包括d-葡萄糖。
下文提供可以在细胞培养基中包含的各种组分的示例和培养基中组分的浓度。例如，细胞培养基可以包含约1mM d-葡萄糖-约50mM d-葡萄糖，诸如约2mM-约30mM d-葡萄糖。在细胞培养基中可以包括的氨基酸的示例包括1-精氨酸、1-胱氨酸、1-组氨酸、1-异亮氨酸、1-亮氨酸、1-赖氨酸、1-甲硫氨酸、1-苯丙氨酸、1-苏氨酸、1-色氨酸、1-酪氨酸、1-缬氨酸等。氨基酸可以任何合适的浓度存在，诸如约1x10-3mm-约20mM。会理解氨基酸的浓度可以根据氨基酸变化。在细胞培养基中可以包括合适浓度的无机盐。合适的无机盐的示例包括氯化钙、硝酸钙、硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸钠等。
在实施方式中，聚合物-多肽溶于市售可得的细胞培养基中，诸如DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基)，如购自GIBCO；专门为人胚胎干细胞(hESC)的生长和扩增配制的完全限制的无血清和无进料培养基(SFM)，购自英杰公司(Invitrogen.)；用于人胚胎干细胞的mTeSRTM1维持培养基，购自干细胞技术有限公司(StemCell Technologies，Inc.)；培养基，其是标准化的、无异种物、无血清的用于人间充质干细胞培养的培养基，可购自干细胞技术有限公司，等等。
在实施方式中，细胞培养基是化学限定的培养基。因为所有的化学限定的培养基具有已知的化学结构或者由已知结构的组分形成(例如，由已知结构的单体的合成聚合物形成)，可以减少培养环境的差异并由此减少细胞应答的差异，提高再现性。另外，降低了污染的可能性。另外，至少部分由于以上讨论的因素，可以更容易地进行按比例规模放大。化学限定的细胞培养基可以是商业购自英杰公司(Invitrogen)(英杰公司，Faraday大街1600号，PO Box 6482，卡尔斯巴德(Carlsbad)，美国加利福尼亚州92008)的专门为人胚胎干细胞(hESC)生长和扩增配制的完全限定不含血清和进料(feeder)的培养基(SFM)，以及干细胞技术有限公司(Stem Cell Technologies，Inc.)，例如用于人胚胎干细胞的mTeSRTM1维持培养基。是购自干细胞技术有限公司的化学限定培养基的另一个示例。
在实施方式中，细胞培养基是条件培养基，其中加入了聚合物-多肽。
在实施方式中，水溶性液，诸如细胞培养基溶液，不含或基本不含交联剂。本文使用的“交联剂”是指能够诱导交联，或能够交联聚合物-多肽的聚合物部分的试剂。当涉及交联剂时，本文使用的“基本不含”表示在聚合物中没有因存在痕量的交联剂而出现的交联。聚合物部分基本不含的交联剂的示例包括熟知的交联剂，包括Greg T.Hermanson的Bioconiugate Techniques(《生物偶联技术》)，第二版中所述的那些同-多官能或异-多官能交联剂。在实施方式中，组合物也“基本不含”能够导致互穿网络或半互穿网络形成的多官能低聚物和聚合物。
含有偶联有多肽的聚合物的细胞培养基可以任何合适的方式进行灭菌。在实施方式中，通过γ辐射对聚合物-多肽进行灭菌；例如，以干粉形式，并且使用无菌技术加入灭菌的细胞培养基。γ或电子束辐射，而不是采用天然存在或动物来源的胞外基质蛋白的过滤除菌，可以有益地用于本文所述的合成聚合物-多肽。当然，如果需要，可以采用过滤除菌。
含有偶联有的多肽的聚合物的细胞培养基可以在室温(25℃)或更低的温度下储存以保持聚合物-多肽溶解。例如，培养基可以冷藏(约5℃)。冷藏也可以用于延长培养基的寿命。
被覆工艺
与多肽偶联的聚合物可以任何合适的方式被覆于细胞培养制品上。通常，将上述含有与多肽偶联的聚合物的水性溶液(诸如细胞培养基)置于细胞培养制品的表面上。然后使与多肽偶联的聚合物在细胞培养条件下(诸如37℃，约25℃下等)在水性溶液中与细胞培养制品孵育，直至与多肽偶联的聚合物粘附于细胞培养制品的表面。在实施方式中，粘附过程立即，或在几秒钟或几分钟内开始。
虽然聚合物可能共价粘附于制品的表面，聚合物通常通过非共价相互作用粘附于制品上。可将聚合物粘附于基质的非共价相互作用的示例包括吸收、氢键、表面互穿、离子键、范德华力、疏水相互作用、偶极相互作用、机械互锁作用及其组合。
优选地，聚合物在细胞培养条件期间粘附于或被覆制品的表面，诸如在37℃下在细胞培养基存在下。因为聚合物-多肽在细胞培养基中稳定并相容，可接受聚合物-多肽中的一些留在培养基中或存在用于在未粘附和粘附的聚合物-多肽之间平衡。优选在补充培养基之后；例如，去除用过的培养基并且替换为新培养基(例如，不含聚合物-多肽)，粘附的聚合物-多肽仍然粘附于基质。在实施方式中，在培养基置换期间，有90％或更多(诸如95％或更多或者99％或更多)的之前粘附的聚合物-多肽仍保持粘附。在实施方式中，置换培养基可以包含合适浓度的聚合物-多肽以维持基质上聚合物-肽覆层所需的平衡。
不希望受到任何特定理论的限制，相对于聚合物的高百分比多肽被认为有助于聚合物令人惊讶地从水性溶液吸附到合适的基质上及其在吸收后不溶于水。高多肽含量可能导致多肽之间的高密度氢键，诱导物理交联或聚集，其是与天然存在的蛋白质相似的表现。一些特定的多肽已知在其转变温度以下溶于水性溶液中，但是当温度上升到转变温度以上时它们疏水折拢并聚集。这种疏水折拢可能在细胞培养条件(诸如37℃)下的偶联有多肽的聚合物的吸收中起作用。
与多肽偶联的聚合物被覆的细胞培养制品的表面可以由任何合适的材料形成。例如，细胞培养制品的表面可以由陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物、其任何组合或在一种材料上被覆另一种材料而形成。这类基材包括玻璃材料，如钠钙玻璃、派莱克斯(pyrex)玻璃、维克(vycor)玻璃、石英玻璃；硅；塑料或聚合物，包括树枝状聚合物，如聚氯乙烯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚(乙酸乙烯酯-共-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、环烯烃聚合物、碳氟聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺；共聚物如聚(乙酸乙烯酯-共-马来酸酐)、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)、聚(乙烯-共-丙烯酸)或者它们的衍生物等。
在实施方式中，聚合物-多肽粘附的细胞培养制品的表面具有约0-约100的水接触角(液滴测量)，诸如约0-约50、约0-约30、约12°-约85°、约25°-约70°、约30°-约60°等。会理解可以对基质进行处理使它们展现出合适的接触角。例如，基质可以经电晕处理或等离子体处理。真空或大气压等离子体的示例包括在分子或混合气体(包括空气、氧气、氮气、氩气、二氧化碳、一氧化二氮或水蒸气)中产生的一级和二级的RF和微波等离子体、介电阻挡放电，和电晕放电。例如，等离子体处理的聚苯乙烯(诸如TCT聚苯乙烯或处理的聚苯乙烯)提供了供聚合物-多肽粘附的良好基质。天然存在的动物来源的生物粘附性蛋白质也显示与这类表面良好结合。因此，天然蛋白质容易粘附的表面也提供了供聚合物-多肽粘附的良好基质。
细胞培养制品
本文所述的与多肽偶联的聚合物可以与任何合适的细胞培养制品的表面粘附，诸如单孔或多孔板，诸如6、12、96、384和1536孔板、瓶、皮氏培养 皿、烧瓶、烧杯、平板、微载体诸如玻璃或聚合物珠、滚瓶、载玻片(如分室和多室培养载玻片)、试管、盖玻片、袋子、膜、空心纤维、珠粒和微载体、杯子、转瓶、灌流室、生物反应器、以及发酵器。
参照图3A，显示了用于培养细胞的制品100的侧视图。制品100包括具有表面15的基质10。将与多肽70偶联的聚合物20置于基材10的表面15上。如图所示，多肽70可以直接或间接通过上述的接头80偶联或共价结合到聚合物20。虽然未显示，会理解与多肽70偶联的聚合物20可设置在基材10的一部分上。基材10可以是适于培养细胞的任何材料，诸如上述的那些。
如图3B所示，可将中间层30设置在基材10的表面15和与多肽70偶联的被覆的聚合物20之间。中间层30可以用于改善与多肽70偶联的被覆的聚合物20与基质10的结合，促进含有与多肽偶联的聚合物的水性溶液的铺展，赋予表面10的未被覆部分斥细胞性以促进细胞在被覆的区域生长，必要时例如通过图案印刷等方式提供形貌特征。例如，如果基材10是玻璃基材，可能需要用环氧覆层或硅烷覆层来处理玻璃基材的表面。对于各种基于聚合物基材10，可能需要提供聚酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯、聚乙烯或聚丙烯酸酯的中间层30。虽然未显示，应理解可将与多肽70偶联的被覆的聚合物20设置在中间层30的一部分上。还应理解可将中间层30设置在基材10的一部分上。
在多个实施方式中，制品100是含孔的细胞培养制件，诸如皮氏培养皿、多孔平板、烧瓶、烧杯或其他含孔容器。现在参考图4，由基材10形成的制品100可以包括一个或多个孔50。孔50包括侧壁55和表面15。
参考图4B-C，可将与多肽70偶联的聚合物20设置在表面15或侧壁55(或者，如以上图1所示，可将一个或多个中间层30设置在表面15或侧壁55和与多肽70偶联的被覆的聚合物20制件)或其部分上。如图4C所示，可以用与多肽70偶联的聚合物20被覆侧壁55。
在多个实施方式中，对基材10的表面15进行物理或化学处理，以使表面15具有所需性质。例如，并且如上述，表面15可以经电晕处理或等离子体处理。
在实施方式中，无论设置在中间层30还是基材10上，使与多肽70偶联的被覆的聚合物20均匀被覆下面的基质。“均匀被覆”表示在给定的区域， 例如培养平板的孔的表面中层20以约5nm或更大的厚度完全被覆该区域。虽然均匀被覆的表面的厚度可能在表面上变化，但没有均匀被覆的表面中没有下面的层(中间层30或基材10)是暴露的。在非均匀表面上的细胞反应差异会大于均匀表面上的细胞反应差异。
在多个实施方式中，制品100包括具有超过5mm2的面积的表面25的均匀覆层20。表面15的面积太小时，可能并不容易观察到可靠的细胞反应，因为一些细胞(如人胚胎干细胞)以群落或细胞簇(例如，具有约0.5mm的直径)接种并且需要充足的表面来确保足够数量的群落的粘附以产生定量的细胞反应。在多个实施方式中，制品100具有有均匀被覆的表面15的孔50，其中表面15具有超过约0.1cm2、超过约0.3cm2、超过约0.9cm2，或超过约1cm2的面积。
在含有偶联的多肽的合成聚合物上孵育细胞
可以对上文所述的具有含有偶联多肽的聚合物的细胞培养制品接种细胞。在实施方式中，细胞被引入包含上述聚合物-多肽的细胞培养基中。在细胞培养过程中，使与多肽偶联的聚合物被覆细胞培养制品的表面。
不受理论的限制，认为可以通过在细胞接种培养基中包含聚合物-多肽来增强细胞-细胞相互作用。即，在聚合物-多肽粘附于细胞培养制品的表面之前，细胞-细胞相互作用可以发生在培养基中，并且可以通过培养基中的聚合物-多肽来促进。
可以按照本文所述的教导使用任何类型的细胞。例如，所述细胞可以是结缔组织细胞，如上皮细胞和内皮细胞、肝细胞、骨骼肌或平滑肌细胞、心肌细胞、肠细胞、肾细胞、或者源自其他器官的细胞、干细胞、岛细胞、血管细胞、淋巴细胞、癌细胞等。所述细胞可以是哺乳动物细胞，优选是人细胞，但还可以是非哺乳动物细胞，例如细菌、酵母菌或者植物的细胞。
在很多实施方式中，所述细胞是干细胞，本领域公知，干细胞表示能够连续分裂(自我更新)并且能够分化成各种专门化细胞的细胞。在一些实施方式中，干细胞是从对象的器官或组织中分离的多能、全能或多向性干细胞。这些细胞能够得到完全分化的或者成熟的细胞种类。干细胞可以是源自骨髓的干细胞，类似的或者其它的，为神经干细胞或者胚胎干细胞。干细胞可以是Nestin 阳性的。干细胞可以是造血干细胞。干细胞可以是选自上皮和脂肪组织、脐带血、肝、脑或其他器官的多谱系细胞。在多个实施方式中，干细胞是未分化的干细胞，如未分化的胚胎干细胞。
在接种细胞之前，可以将细胞采集并悬浮在合适的培养基例如生长培养基中，细胞一旦被接种到表面上便可在所述基质中培养。如上所述，培养基可以包含当在细胞培养条件下在培养基中的细胞培养表面上孵育时会形成覆层的聚合物-多肽。例如，可以将细胞悬浮在以下培养基中并在其中进行培养：含血清的培养基、条件培养基，或者化学限定的培养基。在本文中，“化学限定的培养基”表示不含组成未知的组分的细胞培养基。在各种实施方式中，化学限定的培养基可以不含组成未知的蛋白质、水解物(hydrosylate)或肽。在一些实施方式中，条件培养基包含组成已知的多肽或者蛋白质，例如重组生长激素。因为化学限定的培养基中所有的组分都具有已知的化学结构，可以减少培养条件的差异并由此减少细胞反应的差异，由此提高了再现性。另外，降低了污染的可能性。
可以向细胞孵育的培养基中加入一种或多种生长因子或其他因子。这些因子可能促进细胞增殖、粘着、自我更新、分化等。可以添加的或者包括在培养基中的因子的例子包括肌肉形态发生因子(MMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素、神经生长因子(NGF)、促红细胞生成素、源自血小板的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、活化素A(ACT)、造血生长因子、视黄酸(RA)、干扰素、成纤蛋白质生长因子(如基础成纤蛋白质生长因子(bFGF))、骨形态形成蛋白质(BMP)、肽生长因子、肝素结合生长因子(HBGF)、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子、胰岛素样生长因子(IGF)I和II、转化生长因子(如转化生长因子-β1(TGFβ1))，和集落刺激因子。
细胞可以以任何合适的浓度接种。一般来说，细胞的接种浓度约为10,000个细胞/cm2基质至约500,000个细胞/cm2。例如，细胞可以以大约50000-150000个细胞/平方厘米基质的浓度接种。但是，也可以容易地采用更高和更低的浓度。培育时间和条件，例如温度、CO2和O2含量、培养基等，将取决于培养的细 胞的性质，并且可以很容易地进行改良。细胞在表面上孵育的时间长度可以根据所需的细胞反应变化。
培养的细胞可以用于任何合适的目的，包括(i)在化学限定的培养基中的合成表面上获得足够量的培养的未分化的干细胞，用于研究或开发治疗应用，(ii)用于对培养中的细胞进行研究，(iii)用来开发治疗应用，和(iv)用于治疗目的。
方面
本文中已经描述了组合物、方法和制品的多个方面。下面提供了这类组合物、方法和制品的一些选择示例的总结。
在第1方面，水性细胞培养基组合物包含(i)用于支持哺乳动物细胞培养的水性细胞培养溶液；和(ii)溶于水性细胞培养溶液的与多肽偶联的合成聚合物，其中与多肽偶联的合成聚合物用于在细胞培养条件下粘附到细胞培养制品的表面，并且其中在细胞培养条件下在细胞培养表面上对水性细胞培养基组合物的孵育导致对与多肽偶联的合成聚合物的表面的粘附。
第2方面是第1方面的组合物，其中细胞培养基组合物是化学限定的组合物。
第3方面是第1或第2方面的组合物，其中细胞培养基不含动物来源的组分。
第4方面是一种水性细胞培养基组合物，该组合物包含(i)用于支持哺乳动物细胞培养的水性细胞培养基溶液；和(ii)溶于水性细胞培养溶液中的与多肽偶联的合成聚合物，其中所述聚合物选自下组：具有线性主链且不含交联的聚合物、具有支化主链且不含交联的聚合物和不含交联的星状聚合物，并且其中所述与多肽偶联的合成聚合物在20℃或更低温度下可溶于水，其中所述组合物基本不含有机溶剂，并且其中在细胞培养条件下在细胞培养表面上孵育所述水性细胞培养基组合物导致对与多肽偶联的合成聚合物的表面的粘附。
第5方面是第4方面的组合物，其中不与多肽偶联的基本相似的聚合物在37℃下不溶于水。
第6方面是第4或第5方面的组合物，其中所述聚合物具有线性主链并且不含交联。
第7方面是第4-6方面中任一个的组合物，其中细胞培养基不含动物来源的组分。
第8方面是第4-7方面中任一个的组合物，其中细胞培养基组合物是化学限定的组合物。
第9方面是第4-8方面中任一个的组合物，其中聚合物不由具有2-或更高-官能度的单体形成。
第10方面是第4-9方面中任一个的组合物，其中聚合物由包含偶联的多肽的至少一种单体形成。
第11方面是第10方面的组合物，其中包含偶联的多肽的至少一种单体是甲基丙烯酸。
第12方面是第4-11方面中任一个的组合物，其中所述聚合物由(i)与多肽偶联的甲基丙烯酸和(ii)甲基丙烯酸羟乙酯的聚合形成。
第13方面是第11方面的组合物，其中与多肽偶联的甲基丙烯酸和甲基丙烯酸羟乙酯的摩尔比为1∶15至1∶5。
第14方面是第11方面的组合物，其中与多肽偶联的甲基丙烯酸和甲基丙烯酸羟乙酯的摩尔比为约1∶9。
第15方面是第4-13方面中任一个的组合物，其中所述聚合物由甲基丙烯酸羟乙酯和MAA-PEO4-多肽的聚合形成，其中MMA是甲基丙烯酸，并且PEO是聚环氧乙烷。
第16方面是第4-15方面中任一个的组合物，其中多肽相对于与多肽偶联的聚合物的重量百分比超过10％。
第17方面是第4-15方面中任一个的组合物，其中多肽相对于与多肽偶联的聚合物的重量百分比超过40％。
第18方面是第4-17方面中任一个的组合物，其中多肽是细胞粘附多肽。
第19方面是第4-18方面中任一个的组合物，其中多肽包含RGD序列。
第20方面是第4-19方面中任一个的组合物，其中多肽选自下组：玻连蛋白多肽、胶原多肽、层连蛋白多肽、骨唾液蛋白多肽和纤连蛋白多肽。
第21方面是第4-20方面中任一个的组合物，其中多肽是玻连蛋白多肽。
第22方面是第4-21方面中任一个的组合物，其中多肽包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
第23方面是第4-22方面中任一个的组合物，其中与多肽偶联的聚合物具有10千道尔顿-1000千道尔顿的分子量。
第24方面是第4-23方面中任一个的组合物，其中组合物具有7-8的pH，并且还包含：葡萄糖和一种或多种氨基酸。
第25方面是第4-24方面中任一个的组合物，其还包含细胞。
第26方面是第25方面的组合物，其中所述细胞是干细胞。
第27方面是第25方面的组合物，其中所述细胞是人胚胎干细胞或人间充质干细胞。
第28方面是第4-27方面中任一个的组合物，其中所述组合物不含微载体。
第29方面是第4-27方面任一个的组合物，其中所述细胞培养表面是微载体的表面。
第30方面是一种被覆细胞培养制品表面的方法，所述方法包括：(i)向水性细胞培养基中导入与多肽共价连接的合成聚合物以产生含有聚合物的细胞培养基，其中与多肽偶联的合成聚合物用于在细胞培养条件下粘附于细胞培养制品的表面；(ii)在细胞培养制品的表面上设置含有所述聚合物的细胞培养基以产生经被覆的制品；和(iii)在细胞培养条件下在培养基中孵育经被覆的制品以使与多肽偶联的合成聚合物粘附于所述细胞培养制品的表面。
第31方面是第30方面的方法，其中细胞培养基组合物是化学限定的组合物。
第32方面是第30或第31方面的方法，其中细胞培养基不含动物来源的组分。
第33方面是被覆细胞培养制品表面的方法，所述方法包括：(i)向水性细胞培养基中引入具有共价连接的多肽的聚合物以产生含有聚合物的细胞培养基，其中该聚合物选自下组：具有线性主链并且不含交联的聚合物、具有支化主链并且不含交联的聚合物和不含交联的星状聚合物，其中所述具有共价连接的多肽的聚合物在20℃或更低温度下可溶，其中所述水性溶液基本不含有机溶剂；(ii)在细胞培养制品的表面上设置含有所述聚合物的细胞培养基以 产生经被覆的制品；和(iii)在细胞培养条件下在培养基中孵育经被覆的制品以使与多肽偶联的聚合物粘附于细胞培养制品的表面。
第34方面是第33方面的方法，其中聚合物具有线性主链。
第35方面是第31或第32方面的方法，其中细胞培养基不含动物来源的组分。
第36方面是第33-35方面中任一个的方法，其中细胞培养基组合物是化学限定的组合物。第37方面是第33-36方面中任一个的方法，其中在细胞培养条件下在培养基中孵育经被覆的制品包括在约37℃下在培养基中孵育被覆的制品。
第38方面是第33-34方面中任一个的方法，其中不与多肽偶联的基本相似的聚合物在25℃下不溶于水。
第39方面是第33-38方面中任一个的方法，其中多肽相对于与多肽偶联的聚合物的重量百分比超过10％。
第40方面是第33-38方面中任一个的方法，其中多肽相对于与多肽偶联的聚合物的重量百分比超过40％。
第41方面是第33-40方面中任一个的方法，其中多肽是细胞粘附多肽。
第42方面是第33-41方面中任一个的方法，其中多肽包含RGD序列。
第43方面是第33-42方面中任一个的方法，其中多肽选自下组：玻连蛋白多肽、胶原多肽、层连蛋白多肽、骨唾液蛋白多肽和纤连蛋白多肽。
第44方面是第33-43方面中任一个的方法，其中多肽是玻连蛋白多肽。
第45方面是第33-44方面中任一个的方法，其中多肽包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
第46方面是第33-45方面中任一个的方法，其中聚合物由包含偶联的多肽的至少一种单体形成。
第47方面是第46方面的方法，其中包含偶联的多肽的至少一种单体是甲基丙烯酸。
第48方面是第46方面中任一个的方法，其中聚合物由(i)与多肽偶联的甲基丙烯酸和(ii)甲基丙烯酸羟乙酯的聚合形成。
第49方面是第33-45方面中任一个的方法，其中聚合物由(i)包含甲基丙烯酸官能团的单体和(ii)甲基丙烯酸羟乙酯的聚合形成。
第50方面是第33-49方面中任一个的方法，其中与多肽偶联的聚合物具有10千道尔顿-1000千道尔顿的分子量。
第51方面是第33-50方面中任一个的方法，其中基质的表面具有0°-50°的水接触角。
第52方面是第33-50方面中任一个的方法，其中基质的表面具有0°-30°的水接触角。
第53方面是第33-52方面中任一个的方法，其中基质的表面是等离子体处理的聚苯乙烯表面。
第54方面是培养细胞的方法，所述方法包括：(i)向含有聚合物的细胞培养基中引入细胞，其中所述含有聚合物的细胞培养基包含具有共价连接的多肽的合成聚合物，其中与多肽共价偶联的聚合物用于在细胞培养条件下粘附于细胞培养制品的表面；(ii)将含有聚合物的细胞培养基和细胞与细胞培养制品的表面接触以产生经被覆的制品；和(iii)在细胞培养条件下在培养基中在经被覆的制品上孵育细胞，其中在细胞培养条件下在培养基中孵育经被覆的制品导致与多肽偶联的合成聚合物粘附于细胞培养制品的表面。
第55方面是第54方面的方法，其中细胞培养基不含动物来源的组分。
第56方面是第54或第55方面的方法，其中细胞培养基组合物是化学限定的组合物。
第57方面是培养细胞的方法，所述方法包括：(i)向含有聚合物的细胞培养基中引入细胞，其中含有聚合物的细胞培养基包含含有共价连接的多肽的聚合物，其中所述聚合物选自下组：具有线性主链并且不含交联的聚合物，具有支化主链并且不含交联的聚合物和不含交联的星状聚合物，其中所述含有共价连接的多肽的聚合物在20℃或更低温度下可溶于水，其中所述水性溶液基本不含有机溶剂；(ii)将含有聚合物的细胞培养基和细胞与细胞培养制品的表面接触以产生经被覆的制品；和(iii)在细胞培养条件下在培养基中在经被覆的制品上孵育细胞，其中在细胞培养条件下在培养基中孵育经被覆的制品导致与多肽偶联的聚合物粘附于细胞培养制品的表面。
第58方面是第57方面的方法，其中聚合物具有线性主链。
第59方面是第57或第58方面的方法，其中细胞培养基不含动物来源的组分。
第60方面是第57-59方面中任一个的方法，其中细胞培养基组合物是化学限定的组合物。
第61方面是第57-60方面中任一个的方法，其中在细胞培养条件下在培养基中孵育经被覆的制品包括在约37℃下在培养基中孵育经被覆的制品。
第62方面是第57-61方面中任一个的方法，其中不与多肽偶联的基本相似的聚合物在25℃下不溶于水。
第63方面是第57-62方面中任一个的方法，其中多肽相对于与多肽偶联的聚合物的重量百分比超过40％。
第64方面是第57-63方面中任一个的方法，其中多肽相对于与多肽偶联的聚合物的重量百分比超过60％。
第65方面是第57-64方面中任一个的方法，其中多肽是细胞粘附多肽。
第66方面是第57-65方面中任一个的方法，其中多肽包含RGD序列。
第67方面是第57-66方面中任一个的方法，其中多肽选自下组：玻连蛋白多肽、胶原多肽、层连蛋白多肽、骨唾液蛋白多肽和纤连蛋白多肽。
第68方面是第57-67方面中任一个的方法，其中多肽是玻连蛋白多肽。
第69方面是第57-69方面中任一个的方法，其中多肽包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。
第70方面是第57-69方面中任一个的方法，其中聚合物由包含偶联的多肽的至少一种单体形成。
第71方面是第70方面的方法，其中包含偶联的多肽的至少一种单体是甲基丙烯酸。
第72方面是第70方面中任一个的方法，其中聚合物由(i)与多肽偶联的甲基丙烯酸和(ii)甲基丙烯酸羟乙酯的聚合形成。
第73方面是第57-69方面中任一个的方法，其中聚合物由(i)包含甲基丙烯酸官能团的单体和(ii)甲基丙烯酸羟乙酯的聚合形成。
第74方面是第59-73方面中任一个的方法，其中与多肽偶联的聚合物具有10千道尔顿-1000千道尔顿的分子量。
第75方面是第57-74方面中任一个的方法，其中基质的表面具有0°-50°的水接触角。
第76方面是第57-75方面中任一个的方法，其中基质的表面具有0°-30°的水接触角。
第77方面是第57-76方面中任一个的方法，其中基质的表面是等离子体处理的聚苯乙烯表面。
第78方面是第57-77方面中任一个的方法，其中所述细胞是干细胞。
第79方面是第78方面的方法，其中所述细胞是人胚胎干细胞或人间充质干细胞。
本文所述的组合物、方法和制品的非限制性示例如下所示用于示例的目的。
实施例
实施例1：在预被覆的基质与培养基中的聚合物上培养
在预被覆MesenCult-XF粘附基质(“MC-ASB”)(干细胞技术有限公司，目录号05424)、聚(HEMA-共-MAA-PEO4-VN)(“聚HEMA-共-VN”)的6-孔平板，或未被覆的康宁平板(康宁目录号3335)或TC-处理的平板(康宁目录号3516)中培养细胞。如下所述制备聚HEMA-共-VN。简而言之，肽单体MAA-PEG4-VN(甲基丙烯酸-[聚乙二醇]4-玻连蛋白，其中玻连蛋白具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列)购自美国肽有限公司(American Peptide Company Inc.)，其使用固体肽合成物合成分子。该单体与甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)以1∶9的摩尔比在乙醇中使用热自由基聚合共聚合，并且得到最终的聚HEMA-共-VN肽共聚物。
对于未被覆的平板，与细胞一起向细胞培养基中加入MC-ASB或聚HEMA-共-VN。细胞培养基是MesenCult-XF完全培养基(“MC-XF”)基础培养基(干细胞技术有限公司，目录号054020)，其包括MesenCult-XF基础培养基(干细胞技术有限公司，目录号05421)，MesenCult-XF补充剂(5X) (干细胞技术有限公司，目录号05422)和2mM L-谷氨酰胺(干细胞技术有限公司，目录号07100)。
A.预被覆容器的制备
i.MesenCult粘附基质
按照生产商的说明预被覆MC-ASB。简而言之，MC-ASB以1mg/ml的浓度溶于水作为母液。为了被覆，进一步在不含Ca++或Mg++的无菌PBS(生命技术公司(Life Technologies)目录号14190)中以1∶28稀释MC-ASB母液并且向TCT平板中每孔加入0.8ml。在4℃下在有盖的Nalgene容器中过夜储存平板以供蛋白质吸收。在培养细胞之前，平板允许升温至室温20-30分钟并且用无菌细胞培养水沿着孔的边缘向下洗涤。水呈漩涡状以清洗全部表面然后吸出。
ii.聚HEMA-共-VN
在无菌组织培养水中无菌重建γ灭菌的聚HEMA-共-VN粉末至2mg/ml的浓度以产生母液。温和地来回摇晃母液并且允许其在室温下溶解5分钟。在 孔平板中，在每孔中使25μl的聚合物母液在1ml的无菌水中稀释并且在37℃下孵育1小时。用无菌细胞培养水沿着平板中每孔的边缘向下洗涤平板。水呈漩涡状以清洗全部表面然后吸出。
iii.Matrigel
以1∶30稀释并且被覆在TCT 6-孔平板上作为hESC接种和后续培养的对照表面。
B.细胞培养
i.hMSC
在MC-XF中MC-ASB预被覆的表面上增殖骨髓衍生的干细胞供体#2637，p4细胞。当时细胞达到80％融合度时对细胞进行传代。用dPBS(生命技术公司，目录号14190)简单地清洗细胞然后用MesenCult-ACF酶促解离溶液(干细胞有限公司，目录号05427)孵育约2分钟。从该表面上温和吹下细胞，上下抽吸几次随后转移至15ml离心管中。然后，培养瓶用MesenCult-ACF酶抑制溶液(干细胞技术有限公司，目录号05428)漂洗，然后加至含有细胞的管。细胞在1200-1500RPM下离心6分钟。从Vi-Cell(自动化的细胞活力分析仪 (贝克曼库尔特公司(Beckman-Coulter)))中得到细胞计数和活力。用MC-XF中的hMSC细胞以3500个细胞/cm2的细胞密度接种预被覆的MC-ASB平板、CellBIND和预被覆的聚HEMA-共-VN平板。对于未被覆的平板，用使用相应母液的0.05mg/ml、0.025mg/ml、0.012mg/ml和0.006mg/ml的聚HEMA-共-VN或0.037mg/ml和0.0074mg/ml的MC-ASB进一步补充细胞悬液。向每孔中加入4ml含有或不含粘附补充剂的细胞混合悬浮液。在培养过程中每2-3天更换培养基。
a.细胞计数和染色
从6-孔平板的4-5个孔中收获在各条件下培养的细胞并且汇集在一起，随后转移至含有1ml胎牛血清(生命技术公司，目录号16000)的15ml离心管中。然后用dPBS洗涤全部的孔并且添加至15ml管中的细胞悬浮液中。细胞在1200-1500RPM下离心5-6分钟，然后在3-5ml的MC-XF中重悬。从Vi-Cell中得到细胞计数和活力。为了显示细胞覆盖率的均匀性，各平板中有一个孔是结晶紫染色溶液。
ii.hESC
人ESC-BGO1v购自生命技术公司并且用于在对照或实验条件下测试。化学限定的培养基mTeSRl购自干细胞技术有限公司并且用作本文报道的全部hESC培养实验的标准培养基。购自BD科学公司。CellBind和TCT 6-孔平板购自康宁生命科学公司(Corning Life Sciences)。
聚HEMA-共-VN以0.006mg/ml-0.025mg/ml的浓度添加至mTeSR1并且与BGO1v细胞混合供于在CellBind 6-孔细胞平板中接种。
细胞以每孔0.8x106接种并且在2天之后每天进料。在再进料期间不在培养基中补充聚合物。每天使用光学显微镜观察细胞形态。在4天后从Vi-Cell观察细胞计数和活力。
C.结果和讨论
i.hMSC
图5表示在6-孔TCT平板的孔上培养的细胞的图像，其中的孔是：(a)用MC-ASB预被覆，(b)未被覆，但是接种细胞培养基含有0.037mg/ml MC-ASB，和(c)未被覆，但是接种细胞培养基含有0.0074mg/ml MC-ASB。 如图所示，预被覆的MC-ASB支持hMSC的正常粘附和增殖(图5a)。相反，向细胞培养基中加入MC-ASB并且在未被覆的表面上移接在0.037mg/ml(图5b)或0.0074mg/ml(图5c)的测试浓度下并不向hMSC提供相似的粘附支持。
我们测试了0.037mg/ml和0.0074mg/ml MC-ASB浓度，因为0.037mg/ml是用于预被覆MC-ASB的MC-ASB溶液的浓度，其提供了成功的细胞性能，而0.0074mg/ml在预被覆的孔中提供了每孔中相同量的物质。由于相比在预被覆过程中使用的0.8ml，在细胞培养中使用培养基体积高出4ml，采用5X稀释。
与MC-ASB相反，在培养基中补充的聚HEMA-共-VN有效地支持了hMSC的生长。这种生长与用聚HEMA-共-VN预被覆的表面相当。没有聚HEMA-共-VN时，单独培养基无法达到这样的效果。参考图6，显示了在含有或不含聚HEMA-共-VN的表面上培养的hMSC的图像。显示了在预被覆聚HEMA-共-VN(图6a)、接种细胞培养基中不加入聚HEMA-共-VN的未被覆的(图6b)、接种细胞培养基中加入0.006mg/ml聚HEMA-共-VN的未被覆的(图6c)、接种细胞培养基中加入0.012mg/ml聚HEMA-共-VN的未被覆的(图6d)、接种细胞培养基中加入0.025mg/ml聚HEMA-共-VN的未被覆的(图6e)，和接种细胞培养基中加入0.050mg/ml聚HEMA-共-VN的未被覆的(图6f)上培养的细胞。
现在参考图7，显示了在不同表面上培养的结晶紫染色的hMSC的图像。图像是在(a)用MC-ASB预被覆的TCT表面；(b)未预被覆的TCT表面，采用0.037mg/ml的MC-ASB补充的接种培养基；(c)未预被覆的TCT表面，采用0.0074mg/ml的MC-ASB补充的接种培养基；(d)聚HEMA-共-VN预被覆的表面；(e)未预被覆的表面；(f)未预被覆的表面，采用0.006mg/ml聚HEMA-共-VN补充的接种培养基；(g)未预被覆的表面，采用0.012mg/ml聚HEMA-共-VN补充的接种培养基；(h)未被覆的表面，采用0.025mg/ml聚HEMA-共-VN补充的接种培养基；(i)未被覆的表面，采用 0.050mg/ml聚HEMA-共-VN补充的接种培养基上培养的hMSC细胞。
如图7所示，预被覆MC-ASB的平板(a)支持hMSC粘附，但是采用MC-ASB补充接种培养基和未预被覆的平板不支持粘附(b-c)。相反，预被覆聚HEMA-共-VN的平板(d)以及用聚HEMA-共-VN补充接种培养基和非预被覆聚HEMA-共-VN的平板(f-g)支持hMSC粘附。其中未向接种培养基加入聚HEMA-共-VN的未被覆平板没有显示良好的hMSC粘附(e)。
现在参考图8，显示了各聚HEMA-共-VN和MC-ASB表面观察到的活细胞的百分比。虽然对各表面粘附的细胞的数量不同，对于所有测试的表面，这些粘附的细胞的活力接近100％。
现在参考图9，显示了对各聚HEMA-共-VN和MC-ASB表面粘附的细胞的数量。这些结果证实了上述显示的结果和关于图7的讨论。即，预被覆的MC-ASB支持粘附和生长，而其中向接种培养基中加入MC-ASB的未预被覆的孔不支持粘附。相反，其中向接种培养基中加入聚HEMA-共-VN的未预被覆的孔和预被覆聚HEMA-共-VN的表面都支持hMSC的粘附。
这些结果表明，聚HEMA-共-VN能够(而MC-ASB不能)从培养基中被有效吸附到基质表面上并且快速供于hMSC粘附和生长。随着聚HEMA-共-VN的聚合物浓度增加，细胞数量降低而不影响细胞形态和表面覆盖率。在吸收后溶液中剩余的额外的聚合物可能降低细胞粘附，但是影响是很小的。这表明该聚合物在培养基中对hMSC几乎没有副作用并且对于细胞培养是安全的。
因此，能够使用聚HEMA-共-VN作为培养基补充剂来使hMSC粘附并且直接在传统细胞培养基质上生长。这种聚合物可以提供制备用于治疗性应用的合成化学限定的培养基的新方式。
ii.hESC
与hMSC相似，向接种细胞培养基中加入聚HEMA-共-VN支持了hESC粘附和在未预被覆的表面上的生长。
现在参考图10，显示了第2天时在被覆的TCT平板上(c)和其中用0.006mg/ml聚HEMA-共-VN(b)或0.25mg/ml聚HEMA-共-VN(a) 补充细胞接种培养基的未预被覆的平板上的hESC的图像。如图所示，hESC粘附并且在0.006mg/ml浓度的聚HEMA-共-VN下铺展得非常好，这与Matrigel表面相当，如图10b和10c所示。如图10a所示，当用0.025mg/ml补充接种培养基时，观察到更多的细胞簇，这表明细胞之间有更多相互作用。
现在参考图11，显示了第4天时在被覆的TCT平板上(c)和其中用0.006mg/ml聚HEMA-共-VN(b)或0.25mg/ml聚HEMA-共-VN(a)补充细胞接种培养基的未预被覆的平板上的hESC的图像。如图11b和11c所示，当使用较低浓度的聚HEMA-共-VN来补充接种培养基时，细胞持续保持与被覆的表面相当的良好形态。也在较高浓度聚HEMA-共-VN下观察到连续的粘附和生长(图11a)。
现在参考图12，显示了在未预被覆的表面(其中用0.025mg/ml聚HEMA-共-VN补充接种培养基)和未预被覆的表面(其中用0.0.006mg/ml聚HEMA-共-VN补充接种培养基)上培养4天后的细胞数量。如图12所示，Matrigel对照和补充了聚HEMA-共-VN的最终细胞数量相当。
总之，越高浓度的聚HEMA-共-VN导致越多的细胞成簇和越囊性的形态。然而，细胞数量不受影响。这些结果表明，培养基中聚合物的浓度可能影响加入的多肽如何与细胞和细胞簇发生相互作用。
因此，本发明揭示了用于细胞培养的合成粘附培养基的实施方式。本领域的技术人员可以理解，本文所述的组合物、覆层、制品、方法等可以采用除上述公开之外的其它实施方式实施。本文所述的实施方式是出于说明的目的，而不构成限制。

Claims (14)

1.一种水性细胞培养基组合物，所述组合物包含：
用于支持哺乳动物细胞培养的水性细胞培养溶液；和
溶解于所述水性细胞培养溶液的与多肽偶联的合成聚合物，所述合成聚合物由(i)与所述多肽偶联的甲基丙烯酸和(ii)甲基丙烯酸羟乙酯的聚合形成；
其中所述合成聚合物没有交联，
其中所述与多肽偶联的合成聚合物用于在细胞培养条件下粘附于细胞培养制品的表面，并且
其中在细胞培养条件下在细胞培养表面上孵育所述水性细胞培养基组合物导致所述与多肽偶联的合成聚合物对所述表面的粘附。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述细胞培养基组合物是化学限定的组合物。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述合成聚合物具有线性主链，其中所述与多肽偶联的合成聚合物在20℃或更低温度下溶于水，并且
其中所述组合物基本不含有机溶剂。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述合成聚合物由包含偶联的多肽的至少一种单体形成。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述包含偶联的多肽的至少一种单体是甲基丙烯酸。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，与所述多肽偶联的甲基丙烯酸和所述甲基丙烯酸羟乙酯的摩尔比为1:50至1:1。
7.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述合成聚合物由甲基丙烯酸羟乙酯和MAA-PEO4-多肽的聚合形成，其中MAA是甲基丙烯酸，并且PEO是聚环氧乙烷。
8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述多肽相对于所述与多肽偶联的合成聚合物的重量百分比超过10％。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述多肽是细胞粘附性多肽。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述多肽包含RGD序列。
11.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述多肽是玻连蛋白多肽。
12.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述多肽由SEQ ID NO:27的氨基酸序列组成。
13.如权利要求9-11中任一项所述的组合物，其特征在于，所述与多肽偶联的合成聚合物的分子量为10千道尔顿-1000千道尔顿。
14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH为7-8，并且所述组合物还包含：
葡萄糖；和
一种或多种氨基酸。
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