TW202317751A - 無血清培養液中之細胞培養用基底材料 - Google Patents
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Abstract
本發明之目的為提供一種在細胞凝集塊之量產製造中，即使不使用來自生體之血清，也能夠製造均質且高品質之細胞凝集塊之細胞培養之基底膜、用於形成其之基底膜形成劑及細胞凝集塊製造用基板。
本發明者們提供一種細胞培養之基底膜形成劑，其係包含:
包含下述式(I)表示之單體所衍生之重複單位之聚合物、
細胞接著性物質，及
溶媒，
[式中，U
a1、U
a2、R
a1及R
a2如本說明書及專利範圍之記載所述]。
Description
本發明為關於一種在無血清培養液中之細胞培養之基底膜形成劑、具備前述基底膜之細胞凝集塊製造用基板，及細胞凝集塊之製造方法。
作為用於有效率地進行細胞培養之基底膜形成劑，有提案各種材料。
專利文獻1中有揭示一種作為細胞培養之基底膜使用之聚合物之製造方法及細胞培養容器。專利文獻2中有揭示一種細胞構造物之製造方法。
此等之細胞培養之基底膜在均質之細胞凝集塊之製造(培養)步驟中，為了使細胞均勻地接著於基底膜，必須要使用來自生體之血清，因此會有以個體差所造成的增殖能力為首的品質不均之問題，或使用來自人以外之動物血清時過敏的產生或病毒混入等，安全性風險之產生等問題。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1] 國際公開第2020/040247號
[專利文獻2] 日本特開2017-143755號公報
[本發明欲解決之課題]
本案發明提供一種，在細胞凝集塊之量產製造中，即使不使用來自生體之血清，也能夠製造均質且高品質之細胞凝集塊之細胞培養之基底膜、用於形成其之基底膜形成劑，及細胞凝集塊製造用基板。
[解決課題之手段]
本發明包含以下內容。
[1] 一種細胞培養之基底膜形成劑，其係包含：
包含下述式(I)表示之單體所衍生之重複單位之聚合物、
細胞接著性物質，及
溶媒，
[式中，
U
a1及U
a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
[2] 如[1]之細胞培養之基底膜形成劑，其中，上述聚合物進而包含式(II)表示之單體所衍生之重複單位，
[式中，
R
b表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基]。
[3] 如[1]或[2]之細胞培養之基底膜形成劑，其中，前述聚合物與細胞接著性物質之重量比為100:0.1~ 100:100。
[4] 如[1]~[3]中任一項之細胞培養之基底膜形成劑，其中，前述細胞接著性物質包含糖蛋白質。
[5] 一種細胞凝集塊製造用基板，在具有細胞之附著抑制能之基板上，具備如[1]~[4]中任一項之細胞培養之基底膜形成劑所形成之細胞培養之基底膜之部位。
[6] 一種細胞凝集塊之製造方法，其係包含：
在具有細胞之附著抑制能之基板上，形成包含聚合物及細胞接著性物質之細胞培養之基底膜之步驟，接著種入細胞之步驟，
該聚合物包含下述式(I)表示之單體所衍生之重複單位，
[式中，
U
a1及U
a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
[7] 一種細胞培養之基底膜形成劑，其係包含：
包含下述式(Ia)表示之重複單位與交聯構造之聚合物、
細胞接著性物質，及
溶媒，
[式中，
U
a1及U
a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
[8] 如[7]之細胞培養之基底膜形成劑，其中，前述交聯構造包含來自多官能丙烯酸酯化合物、多官能丙烯酸醯胺化合物、多官能聚酯或異戊二稀化合物之構造。
[9] 如[7]之細胞培養之基底膜形成劑，其中，前述交聯構造包含下述式(IIIa)、(IVa)及/或(Va)表示之構造，
[式中，R
c及R
d各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
e表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基，n表示1~50之數]。
[10] 一種細胞凝集塊之製造方法，其係包含：
在具有細胞之附著抑制能之基板上，形成包含聚合物及細胞接著性物質之細胞培養之基底膜之步驟，接著種入細胞之步驟，
該聚合物包含下述式(Ia)表示之重複單位與交聯構造，
[式中，
U
a1及U
a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
[11] 一種細胞凝集塊之製造方法，其係包含：
在具有細胞之附著抑制能之基板上，具備包含聚合物及細胞接著性物質之細胞培養之基底膜之細胞凝集塊製造用基板中，種入細胞之步驟，
該聚合物包含下述式(Ia)表示之重複單位與交聯構造，
[式中，
U
a1及U
a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
[12] 一種細胞凝集塊製造用基板，其係具備聚合物及細胞接著性物質之細胞培養之基底膜之部位，
該聚合物包含下述式(Ia)表示之重複單位與交聯構造，
[式中，
U
a1及U
a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
[13] 一種細胞培養之基底膜形成劑，其係包含：
包含下述式(Ia)表示之重複單位與式(IIa)表示之重複單位與交聯構造之聚合物、
細胞接著性物質，及
溶媒，
[式中，
U
a1及U
a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]
[式中，
R
b表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基]。
[發明效果]
使用本發明之細胞培養之基底膜形成劑所形成之細胞培養之基底膜，即使在不包含來自動物血清之培養條件中，也能夠實現細胞對前述基底膜之均勻接著，故能夠製造良質之細胞凝集塊。藉此，藉由使用上述細胞培養之基底膜形成劑，能夠達成再生醫療領域中使用之均質且高品質之細胞凝集塊之量產化。
＜細胞培養之基底膜形成劑＞
本發明之細胞培養之基底膜形成劑包含：
包含下述式(I)表示之單體所衍生之重複單位之聚合物、
細胞接著性物質，及
溶媒，
[式中，
U
a1及U
a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
(聚合物)
本案細胞培養之基底膜形成劑所包含之聚合物為包含上述式(I)表示之單體所衍生之重複單位之聚合物。
上述聚合物為與上述式(I)表示之陽離子性單體同時聚合下述式(II)表示之陰離子性單體所得之聚合物較佳，
[式中，
R
b表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基]。
包含上述式(I)表示之單體所衍生之重複單位之聚合物亦能夠表示成包含下述式(Ia)表示之重複單位之聚合物，
[式中，U
a1、U
a2、R
a1以及R
a2與式(I)同義]。同樣地，與上述式(I)表示之陽離子性單體同時聚合上述式(II)表示之陰離子性單體所得之聚合物也能夠表示成與上述式(Ia)表示之重複單位同時包含下述式(IIa)表示之重複單位之聚合物，
[式中，R
b與式(II)同義]。
因此，本發明之基底膜形成劑係包含：與包含上述式(Ia)表示之重複單位之聚合物，或與上述式(Ia)表示之重複單位同時包含上述式(IIa)表示之重複單位之聚合物、細胞接著性物質及溶媒之基底膜形成劑。
本說明書中，只要沒有其他定義，作為「碳原子數1~5之直鏈或分支烷基」，有舉例如甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、s-丁基、t-丁基、n-戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基或1-乙基丙基。
R
a1及R
b各自獨立選自氫原子及甲基較佳。
U
a1及U
a2各自獨立為選自氫原子、甲基、乙基、n-丙基、異丙基及n-丁基較佳，但為甲基或乙基較佳，為甲基亦最佳。
本說明書中，只要沒有其他定義，作為「碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基」，有舉例如亞甲基、伸乙基、伸丙基、三亞甲基、四亞甲基、1-甲基伸丙基、2-甲基伸丙基、二甲基伸乙基、乙基伸乙基、五亞甲基、1-甲基-四亞甲基、2-甲基-四亞甲基、1,1-二甲基-三亞甲基、1,2-二甲基-三亞甲基、2,2-二甲基-三亞甲基、1-乙基-三亞甲基等。此等中，作為R
a2，為選自伸乙基及伸丙基較佳。
因此，作為上述式(I)表示之陽離子性單體，有舉出2-N,N-二甲基胺基酸乙基甲基丙烯酸酯、N,N-二甲基胺基酸甲基甲基丙烯酸酯等，2-N,N-二甲基胺基酸乙基甲基丙烯酸酯較佳。作為上述式(II)表示之陰離子性單體，有舉出丙烯酸、甲基丙烯酸等，為甲基丙烯酸較佳。
前述聚合物中，來自式(I)表示之單體之單位/來自式(II)表示之單體之單位之莫耳比為100/0~50/50。較佳為98/2~50/50。再較佳為98/2~60/40，特別佳為98/2~ 70/30。
式(II)之莫耳比若為50以下，則能夠抑制聚合物之陰離子性所造成之細胞之接著力降低。
(交聯構造)
上述聚合物只要是包含來自式(I)表示之單體之單位與因狀況之來自式(II)表示之單體之單位即可，並無特別限定，在不損害本發明目的之範圍中，亦可包含來自式(I)/式(II)表示之單體之單位以外之其他重複單位。上述聚合物中，作為重複單位，來自式(I)/式(II)表示之單體之單位亦可為50莫耳%以上，較佳為75莫耳%以上，再較佳為80莫耳%以上，更較佳為90莫耳%以上。例如，亦可為包含來自式(I)/式(II)表示之單體之單位與交聯構造之聚合物。作為如此之聚合物之例，有舉出與式(I)/式(II)表示之單體同時進而聚合具有2個以上碳-碳不飽和鍵結之單體所得之聚合物。具有2個以上碳-碳不飽和鍵結之單體具體來說意指具有2個以上碳-碳二重鍵結之單體，有舉例如多官能丙烯酸酯化合物、多官能丙烯酸醯胺化合物、多官能聚酯，或異戊二稀化合物等。
作為較佳具體例，有舉出下述式(III)~(V)表示之單體。
式中，R
c及R
d各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
e表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基，n表示1~50之數。此等之中，為式(III)表示之單體較佳。
前述交聯構造亦可為來自具有2個以上碳-碳二重鍵結之單體之構造，例如來自多官能丙烯酸酯化合物、多官能丙烯酸醯胺化合物、多官能聚酯，或異戊二稀化合物之構造，較佳為來自上述式(III)~(V)表示之單體之構造。來自上述式(III)、(IV)或(V)表示之單體之構造亦能夠表示成下述式(IIIa)、(IVa)或(Va)，
[式中，R
c、R
d、R
e及n與式(III)~(V)同義]。
相對於前述聚合物全體，式(III)~(V)表示之單體之莫耳比較佳為0~50%，更較佳為2~25%。
式(III)~(V)之莫耳比若為50%以下，則能夠抑制過度交聯所造成之高分子量化在製造中之固形分之凝膠化，且能夠容易製造。
R
c及R
d各自獨立選自氫原子及甲基較佳。
R
e為選自亞甲基、伸乙基及伸丙基較佳，為伸乙基最佳。
n為1~50之數，但n為1~30之數較佳，n為1~10之數較佳。
相對於前述聚合物全體，式(II)表示之單體所占之莫耳%之值與相對於前述調製步驟時之單體添加量全體，式(II)表示之單量體所占之莫耳%之值之差為0~10莫耳%。本案聚合物藉由後述製造方法，單體添加比與製造之聚合物之實測值之差較少，為0~10莫耳%，更較佳為0~8莫耳%。
前述聚合物之數平均分子量(Mn)為20,000~ 1,000,000，為50,000~800,000更較佳。
前述聚合物之重量平均分子量(Mw)與前述數平均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)為1.01~10.00，為1.2~8.0較佳，為1.4~6.0較佳，為1.5~5.0較佳，為1.6~4.5較佳。
前述數平均分子量(Mn)與數平均分子量(Mn)能夠藉由例如實施例所記載之膠體層析法求出。
藉由利用本案聚合物作為細胞培養之基底膜，能夠使細胞接著後，使其剝離形成細胞凝集塊。且，細胞凝集塊意指細胞凝集後之結果形成之構造物，並沒有限定於如球狀或環狀等之形狀。且，並無限定構成細胞凝集塊之細胞之種類數，亦可由複數細胞種所構成。細胞凝集塊包含球體、器官原基、類器官等各種構造物。相較於在以往之細胞低接著盤上以非接著培養所製作之細胞凝集塊，於接著面積之規定所帶來之細胞凝集塊之大小調整(能夠製造任意大小之細胞凝集塊)等點上具有優點。
本案參照國際公開第2020/040247號公報、日本特願2020-028120號說明書記載之全揭示並沿用其內容。
(細胞接著性物質)
本發明之細胞培養之基底膜形成劑包含細胞接著性物質。藉由包含細胞接著性物質，能夠促進細胞之接著、伸展、增殖及分化。
作為細胞接著性物質，能夠使用細胞外基質(ECM)蛋白質質、糖蛋白質質、胜肽等來自生物之物質，或合成化合物(低分子、高分子)等之公知物質，但為非來自生物之物質之化合物，例如合成化合物(低分子、高分子)較佳。低分子意指例如重量平均分子量為2,000以下之化合物，高分子意指例如重量平均分子量為2,000以上，上限為例如1,000,000。
作為細胞外基質(ECM)蛋白質質之例，膠原蛋白(例如Merck公司之I型膠原蛋白(產品編號C9791、C7661、C1809、C2249、C2124)、II型膠原蛋白(產品編號C9301)、IV型膠原蛋白(產品編號C0543、C5533)、彈力蛋白(例如Merck公司產品編號：E1625、E6527)、纖網蛋白(例如Merck公司產品編號F1141、F0635、F2518、F0895、F4759、F2006)、層黏蛋白(例如Merck公司產品編號：L6724、L2020、L4544)、層黏蛋白片斷(例如Matrixome公司製：892011)、玻璃體結合蛋白(例如VTN-N(Gibco公司)、玻璃體結合蛋白，人類，重組，無動物(PeproTech公司)、Merck公司產品編號：V0132、V9881、V8379、08-126、SRP3186)。
細胞接著性物質為糖蛋白質質較佳。具體來為選自玻璃體結合蛋白、整合蛋白、鈣黏蛋白、纖網蛋白、層黏蛋白、生腱蛋白、骨橋蛋白及骨涎蛋白質較佳。且，作為胺基酸酸配列，為具有RGD配列之蛋白質質較佳。
作為胜肽之例，有舉出ECM胜肽(Kollodis Bio Sciences公司之MAPTrix(註冊商標)、RGD胜肽(FUJIFILM Wako Pure Chemical公司製：180-01531)。
作為合成化合物(高分子)之例，有舉出聚離胺酸(例如Merck公司製，品：P4707、P4832、P7280、P9155、P6407、P6282、P7405、P5899)、聚鳥胺酸(例如Merck公司產品編號P4975)。作為合成化合物(低分子)之例，有舉出黏結胺(例如長瀨產業公司製：AD-00000-0201)、合成環狀RGD胜肽(例如IRIS BIOTECH公司製：LS-3920.0010)。
本發明之細胞培養之基底膜形成劑中，前述聚合物與細胞接著性物質之比(質量基準)只要是能夠形成能夠細胞培養之基底形成劑即可，並無限制，但為100:0.1~100:100較佳。細胞接著性物質若為0.1以上，細胞接著性會充分地發揮，細胞接著性物質若為100以下，能夠容易地形成細胞接著後之細胞之凝集(細胞凝集塊之形成)。
本發明之細胞培養之基底膜形成劑中包含溶媒。作為前述溶媒，只要是能夠溶解前述聚合物者即可，並無限定，但為包含水之含水溶液較佳。
含水溶液意指水、生理食鹽水或磷酸緩衝溶液等之含鹼之水溶液，禍水或含鹼之水溶液與醇組合之混合溶媒。作為醇，可舉出碳原子數2~6之醇，有舉例如乙醇、丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、t-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-庚醇、2-庚醇、2,2-二甲基-1-丙醇(=新戊基醇)、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇(=t-戊基醇)、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-3-戊醇、環戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、2,3-二甲基-2-丁醇、3,3-二甲基-1-丁醇、3,3-二甲基-2-丁醇、2-乙基-1-丁醇、2-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、3-甲基-1-戊醇、3-甲基-2-戊醇、3-甲基-3-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、4-甲基-3-戊醇及環己醇，亦可單獨或使用此等組合之混合溶媒。
含水溶液中水之含量為例如50質量%~100質量%、80質量%~100質量%、90質量%~100質量%。
進而，基底膜形成劑中，除了上述聚合物、細胞接著性物質及溶媒之外，因應必要，在不損害所得之基底膜之性能之範圍內，能夠添加其他物質。作為其他物質，有舉出pH調整劑、交聯劑、防腐劑、界面活性劑、提高與容器或基板之密著性之促進劑、防霉劑及糖類等。
(細胞)
本發明中之細胞意指構成動物或植物之最基本的單位，作為其要素，為細胞膜內部具有細胞質與各種細胞小器官。此時，將DNA內包之核亦可包含或不包含於細胞內部。例如，本發明中來自動物之細胞中包含精子或卵子等之生殖細胞、構成生體之體細胞、幹細胞(多能性幹細胞等)、前驅細胞、自生體分離之癌細胞、自生體分離且獲得永生化能並能夠在體外安定維持之細胞(細胞株)、自生體分離且經人為基因改變所成之細胞、自生體分離且經人為性核交換之細胞等。作為構成生體之體細胞之例，並非限定於以下，但纖維芽細胞、骨髓細胞、B淋巴球、T淋巴球、嗜中性球、紅血球、血小板、巨噬細胞、單球、骨細胞、骨髓細胞、周皮細胞、樹狀細胞、角質細胞、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、內皮細胞、血管內皮細胞、肝實質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神經系細胞、膠質細胞、神經元、神經間膠細胞、小神經膠細胞、星狀膠細胞、心臟細胞、食道細胞、肌肉細胞(例如平滑肌細胞或骨格肌細胞)、胰臟β細胞、黑色素細胞、造血前驅細胞(例如來自臍帶血之CD34陽性細胞)及單核細胞等。該體細胞包含例如皮膚、腎臟、脾臟、腎上腺、肝臟、肺、卵巢、胰臟、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、結締組織、骨頭、軟骨、血管組織、血液(包含臍帶血)、骨髓、心臟、心肌、眼睛、腦或神經組織等自任意組織所採取之細胞。進而，該體細胞包含自幹細胞或前驅細胞分化衍生之細胞。
幹細胞意指兼具複製自身之能力與分化成其他複數系統之細胞之能力之細胞，作為其例，並非限定於以下，但包含胚性幹細胞(ES細胞)、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、肌幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞等。作為多能性幹細胞，前述幹細胞中，有舉出ES細胞、胚性生殖幹細胞、iPS細胞。前驅細胞意指自前述幹細胞分化成特定體細胞或生殖細胞之過程階段之細胞。癌細胞意指自體細胞新生且獲得無限增殖能之細胞。細胞株意指生體外經人為操作所獲得之無限增殖能之細胞。此等之中，在纖維芽細胞、幹細胞、幹細胞中，為多能性幹細胞更較佳。
＜細胞凝集塊製造用基板＞
本發明之細胞凝集塊製造用基板在具有細胞之附著抑制能之基板上，具備以前述細胞培養之基底膜形成劑所形成之細胞培養之基底膜之部位。
本發明之細胞凝集塊製造用基板係使用具有細胞之附著抑制能之基板來製造。上述部位(基底膜)之形成前，基板亦可施予細胞之附著抑制處理。具有細胞之附著抑制能之基板亦可使用市售之細胞低接著處理過後之細胞培養皿、具有細胞之附著抑制能之細胞培養器等，能夠使用例如日本特開2008-61609號公報中記載之細胞培養容器，但不限定於此等。且，亦可為例如經過塗布具有公知之具有細胞之附著抑制能之塗布膜形成用組成物之步驟所製造之基板。上述塗布膜形成用組成物能夠使用例如國際公開第2014/196650號公報中記載之塗布膜形成用組成物。作為上述塗布膜形成組成物，包含將包含共聚物(P)與溶媒之塗布膜形成用組成物塗布於容器或基板之表面並乾燥之步驟較佳，該共聚物(P)包含：包含下述式(a)表示之有機基之重複單位，與包含下述式(b)表示之有機基之重複單位。
[式中，
U
a11、U
a12、U
b11、U
b12及U
b13各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，An
-表示選自鹵化物離子、無機酸離子、氫氧化物離子及異硫氰酸酯離子所構成群之陰離子]。
上述塗布膜亦可包含在基板表面中至少一部分，但遍布製造細胞凝集塊之表面(亦即本案部位存在之表面)全體，或遍布基板表面全體來塗布較佳。
參照國際公開第2014/196650號公報及國際公開第2016/093293號公報之全揭示並沿用其內容。
前述具有細胞之附著抑制能意指相較於無以例如國際公開第2016/093293號公報之實施例中記載之方法來進行之螢光顯微鏡所得之塗布膜，或無細胞低吸著處理時，相對吸光度(WST O.D.450nm)(%)((實施例之吸光度(WST O.D.450nm))/(比較例之吸光度(WST O.D.450nm)))為50%以下，較佳為30%以下，更較佳為20%以下。
且，作為具有細胞之附著抑制能之塗布膜，亦可使用乙烯性不飽和單體或多糖類或者其衍生物共聚合所得者。作為乙烯性不飽和單體之例，能夠舉出(甲基)丙烯酸及其酯；乙酸乙烯酯；乙烯基吡咯烷酮；伸乙基；乙烯基醇；以及此等之親水性之官能性衍生物所成群中1種或2種以上之乙烯性不飽和單體。作為多糖類或其衍生物之例，能夠舉出羥基烷基纖維素(例如羥基乙基纖維素或羥基丙基纖維素)等之纖維素系高分子、澱粉、葡萄聚醣、卡德蘭膠。
親水性之官能性衍生物意指具有親水性之官能基或構造之乙烯性不飽和單體。作為親水性之官能性基或構造之例，有舉出甜菜鹼構造；醯胺構造；烷二醇殘基；胺基酸基；以及亞磺醯基等。
甜菜鹼構造意指具有四級銨型之陽離子構造與酸性陰離子構造之兩性中心之化合物之一價或二價之基，能夠舉例如磷酸化膽鹼基：
作為具有如此之構造之乙烯性不飽和單體之例，能夠舉出2-甲基丙烯醯基氧基乙基磷酸化膽鹼(MPC)等。
醯胺構造為下述式表示之基。
[於此，R
16、R
17及R
18各自獨立為氫原子或有機基(例如甲基、羥基甲基或羥基乙基等)]。作為具有如此之構造之乙烯性不飽和單體之例，能夠舉出(甲基)丙烯酸醯胺、N-(羥基甲基)(甲基)丙烯酸醯胺、N-異丙基(甲基)丙烯酸醯胺等。進而，具有如此之構造之單體或聚合物揭示於例如日本特開2010-169604號公報等。
烷二醇殘基意指烷二醇(HO-Alk-OH；於此Alk為碳原子數1~10之伸烷基)之單側端末或兩端末之羥基與其他化合物縮合反應後所殘留之伸烷基氧基(-Alk-O-)，亦包含伸烷基氧基單位重複之聚(伸烷基氧基)基。作為具有如此之構造之乙烯性不飽和單體之例，能夠舉出2-羥基乙基(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯等。進而，具有如此之構造之單體或聚合物揭示於例如日本特開2008-533489號公報等。
胺基酸基意指式：-NH
2、-NHR
19或-NR
20R
21[於此，R
19、R
20及R
21各自獨立為有機基(例如碳原子數1~5之直鏈或分支烷基等)]表示之基。本發明中之胺基酸基中包含四級化或氯化之胺基酸基。作為具有如此之構造之乙烯性不飽和單體之例，能夠舉出二甲基胺基酸乙基(甲基)丙烯酸酯、2-(t-丁基胺基酸)乙基(甲基)丙烯酸酯、甲基丙烯醯基氯化膽鹼等。
亞磺醯基意指下述式表示之基。
[於此，R
22為有機基(例如碳原子數1~10之有機基，較佳為具有1個以上羥基之碳原子數1~10之烷基等)]。
作為具有如此之構造之聚合物，能夠舉出日本特開2014-48278號公報等揭示之共聚物。
作為進而具有細胞之附著抑制能之塗布膜，能夠使用難以溶解於磷酸緩衝生理食鹽水且非水溶性之共聚物。
本說明書中，「水溶性」意指對25℃之水100g中能夠溶解1.0g以上。「非水溶性」不相當於「水溶性」，亦即，意指對25℃之水100g的溶解性未滿1.0g。因此，「非水溶性共聚物」意指對25℃之水100g的溶解性未滿1.0g之共聚物，尤其是意指對25℃之磷酸緩衝生理食鹽水100g的溶解性未滿1.0g之共聚物。
作為非水溶性共聚物，有舉出包含下述式(A)表示之重複單位(A)及下述式(B)表示之重複單位(B)之共聚物。
式中，R
1~R
3各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，X
1及X
2各自獨立表示經單鍵結、酯鍵結、醚鍵結、醯胺鍵結或氧原子中斷之碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基。
前述非水溶性共聚物亦可包含2種以上之重複單位(A)，或亦可包含2種以上之重複單位(B)，但包含1種類之重複單位(A)及1種類之重複單位(B)較佳。
前述非水溶性共聚物中，R
1~R
3各自獨立為氫原子、甲基或乙基較佳。
本說明書中，只要沒有其他定義，「酯鍵結」意指-C(=O)-O-或-O-C(=O)-，「醚鍵結」意指-O-，「醯胺鍵結」意指-NHC(=O)-或-C(=O)NH-。
本說明書中，只要沒有其他定義，「亦可經氧原子中斷之碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基」意指碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基，或碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基中1個或2個以上之碳-碳鍵結間介隔著醚鍵結所鍵結之基。
前述非水溶性共聚物中，X
1及X
2各自獨立為亞甲基、伸乙基或伸丙基較佳。
前述非水溶性共聚物中，R
1及R
2為氫原子，R
3為甲基，X
1及X
2為單鍵結較佳。
前述非水溶性共聚物中之重複單位(A)與重複單位(B)之莫耳比率(A:B)為89:11~50:50。
前述非水溶性共聚物中，將重複單位(A)與重複單位(B)之合計莫耳數設為100時，重複單位(A)與重複單位(B)之莫耳比率(A:B)能夠以(100-m):m表示。此時，m之範圍為11~50。且，m之下限亦可為12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。m之上限亦可為49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、38、37、36或35。作為m之範圍，為例如12~49、12~48、15~48、20~49、20~45、22~49或22~45。
前述非水溶性共聚物中，作為全重複單位中之重複單位(A)與重複單位(B)之合計莫耳%，並無特別限制，但為90莫耳%以上較佳，為95莫耳%以上再較佳，為99.5莫耳%以上再更較佳，為100%特別佳。
前述非水溶性共聚物中，藉由將重複單位(A)與重複單位(B)之莫耳比率限定在特定範圍，不須使共聚物交聯，能夠得到難溶解於磷酸緩衝生理食鹽水之塗布膜。因此，前述非水溶性共聚物中，不需要具有用來使共聚物交聯之感光基。亦即，前述非水溶性共聚物不具有感光基較佳。作為感光基，有舉例如疊氮基。
如此，前述非水溶性共聚物中，不需要用來使共聚物交聯之感光基，因此形成塗布膜時，不須進行用來使共聚物交聯之光照射。因此，前述非水溶性共聚物之使用能夠簡易化成形成具有細胞之附著抑制能之塗布膜時之步驟。
前述非水溶性共聚物之黏度平均聚合度(以下有時亦單純稱為「聚合度」)並無特別限制，但以適當地得到細胞之附著抑制能之觀點來看，為200~3,000較佳，為200~2,500再較佳，為200~2,000特別佳。
黏度平均聚合度係以將前述非水溶性共聚物完全皂化之狀態來測定。
完全皂化所得之聚乙烯基醇之「黏度平均聚合度」係自藉由將離子交換水作為溶媒之Ostwald黏度計並於30℃下測定時之極限黏度[η](g/dL)，且以下述式算出之值。
作為製造前述非水溶性共聚物之方法，並無特別限制，但有舉例如將下述式(C)表示之化合物聚合，製造同質聚合物，將所得之同質聚合物藉由公知皂化反應進行部分水解，得到共聚物之方法。
式中，R
1、R
3及X
1與上述同義。
且，作為製造前述非水溶性共聚物之方法，有舉例如將下述式(C)表示之化合物與下述式(D)表示之化合物共聚合，得到共聚物之方法。
式中，R
1~R
3、X
1及X
2與上述同義。
前述非水溶性共聚物亦可為無規聚合物，亦可為嵌段聚合物。
作為前述非水溶性共聚物，亦可使用市售品。作為共聚物之市售品，具體來說有舉出聚乙酸乙烯酯(日本VAM & POVAL (股)製，商品名JMR-150L(註冊商標))。
作為本發明相關之具有細胞之附著抑制能之基板之製造中使用之塗布膜形成用組成物中之膜形成成分中之共聚物之含量，並無特別限制，但為80質量%以上較佳，為90質量%以上再較佳，為95質量%以上特別佳。且，膜形成成分意指自組成物之全成分去除溶媒成分之成分。
作為本發明相關之具有細胞之附著抑制能之基板之製造中使用之塗布膜形成用組成物中之共聚物之含量，並無特別限制，但以容易形成所期望之厚度之塗布膜之觀點來看，為0.1~10質量%較佳，為0.3~8質量%再較佳，為0.5~5質量%特別佳。且，塗布膜形成用組成物中之共聚物之含量亦可為0.02~2質量%，亦可為0.05~1質量%。
(部位)
本發明之細胞凝集塊製造用基板所具備之部位，較佳為複數部位(基底膜)之總面積之比例、各部位之直徑或部位中心間之間隔能夠因應使用之細胞或基板之種類、細胞凝集塊之所期望之大小等，適當地自特定範圍來選擇，但對基板之表面積之部位之總面積之比例為30%以上，40%以上，為50%以上較佳，且為99%以下較佳，各部位之直徑為50~5000μm，為100~3000μm較佳，部位中心間之間隔為100~6000μm，為150~4000μm，為150~300μm較佳。
本發明在具有細胞之附著抑制能之基板上，較佳為以高密度將細胞能夠接著之獨立微小尺寸之區域(部位)配置成規則狀，將複數個均勻之大小之球體一次形成在一個基板(容器)上。
上述部位能夠藉由塗布上述基底膜形成劑來形成。做為基底膜形成劑之塗布方式，能夠使用例如噴墨法、網印法、狹縫式法、卷對卷法等，但較佳為以噴墨法或網印等之印刷技術來進行。
作為另一塗布方法，例如根據不同狀況，將保護部位之非形成之處之基板浸漬於上述基底膜形成劑，並根據不同狀況，將基底膜形成劑添加於保護部位之非形成之處之基板(容器)中，靜置特定時間等之方法，但作為基板、一型態之細胞培養容器時，根據不同狀況，將基底膜形成劑添加於保護部位之非形成之處之容器，靜置特定時間之方法來進行。添加能夠藉由使用例如注射器等添加容器之全容積之0.5~1倍量的基底膜形成劑來進行。靜置為因應容器或基板之材質或細胞培養之基底膜形成劑的種類，並適當地選擇時間或溫度來實施，但例如以1分鐘至24小時，較佳為5分鐘至3小時，並於10~80℃下來實施。藉此，能夠製造細胞凝集塊製造用基板。
且，由相關之方法所得之基板表面之部位能夠不經過乾燥步驟直接，或使用水或附著於細胞培養之試料之媒介(例如水、緩衝液、培養液等)來洗淨後，作為細胞凝集塊製造用基板來使用。
亦即，能夠在上述基板表面之部位形成後，在48小時以內，較佳為24小時以內，更較佳為12小時以內，更較佳為6小時以內，更較佳為3小時以內，更較佳為1小時以內，不經過乾燥步驟直接，或使用水或附著於細胞培養之試料之媒介(例如水、緩衝液、培養液等，特別佳為培養液(例如DMEM培養液(Dulbecco modified Eagle培養液))來洗淨後，作為細胞凝集塊製造用基板來使用。
細胞凝集塊製造用基板亦可添附在乾燥步驟中。乾燥步驟為在大氣壓下或真空下，較佳為在溫度-200℃~200℃之範圍內進行。藉由乾燥步驟，且去除上述基底膜形成劑中之溶媒，完全固著於基體上。
部位例如以室溫(10℃~35℃，較佳為20℃~30℃，例如25℃)之乾燥也能夠形成，但為了迅速地使部位形成，亦可例如以40℃~80℃來乾燥。乾燥溫度若未滿-200℃，則必須要使用並非一般的冷媒，缺乏廣用性，且為了使溶媒昇華，必須要乾燥長時間，效率較差。乾燥溫度若超過200℃，則會產生聚合物之熱分解。再較佳乾燥溫度為10℃~180℃，再較佳乾燥溫度為20℃~150℃。本案細胞凝集塊製造用基板係經由以上簡單之步驟來製造。
且，為了清除殘存在部位(基底膜)雜質、未固著之聚合物等，亦可實施以選自水及包含電解質之水溶液中至少1種溶媒來洗淨之步驟。洗淨較期望為流水洗淨或超音波洗淨等。上述水及包含電解質之水溶液亦可為在例如40℃~95℃之範圍內加溫者。包含電解質之水溶液為PBS、生理食鹽水(僅包含氯化鈉)、Dulbecco磷酸緩衝生理食鹽水、Tris緩衝生理食鹽水、HEPES緩衝生理食鹽水及veronal緩衝生理食鹽水較佳，為PBS特別佳。固著後即使以水、PBS及乙醇等來洗淨，塗布膜也不會溶出，會依然強固地固著在基體上。
本案部位(基底膜)之膜厚之最大膜厚與最小膜厚為1~1000nm之範圍，較佳為5~500nm之範圍。
(基板)
藉由將前述基底膜形成劑塗布於基板之表面並乾燥，能夠製造細胞凝集塊製造用基板。於此，「表面」意指與細胞或細胞培養液等內容物接觸之面。
基板表面之形狀亦可為平面或凹凸，但為平面形狀較佳。
且，基板之材質能夠舉例如玻璃、金屬、含金屬之化合物或含半金屬之化合物、活性碳或樹脂。金屬有舉出典型金屬：(鋁族元素：Al、Ga、In；鐵族元素：Fe、Co、Ni；鉻族元素：Cr、Mo、W、U；錳族元素：Mn、Re；貴金屬：Cu、Ag、Au等。含金屬之化合物或含半金屬之化合物有舉例如基本材成分為金屬氧化物且因高溫之熱處理而燒結之燒結體之陶磁、如矽之半導體、金屬氧化物或半金屬氧化物(矽氧化物、氧化鋁等)、金屬碳化物或半金屬碳化物、金屬氮化物或半金屬氮化物(矽氮化物等)、金屬硼化物或半金屬硼化物等之無機化合物之成形體等之無機固體料、鋁、鎳鈦、不銹鋼(SUS304、SUS316、SUS316L等)。
作為樹脂，亦可為天然樹脂或其衍生物，或合成樹脂之任一者，作為天然樹脂或其衍生物，較佳使用纖維素、三乙酸纖維素(CTA)、硝基纖維素(NC)、將葡聚糖硫酸固定化之纖維素等，作為合成樹脂，較佳使用聚丙烯腈(PAN)、聚醯亞胺(PI)、聚酯系聚合物合金(PEPA)、聚苯乙烯(PS)、聚碸(PSF)、聚對苯二甲酸乙酯(PET)、聚甲基甲基丙烯酸酯(PMMA)、聚乙烯乙醇(PVA)、聚胺基甲酸酯(PU)、伸乙基乙烯醇(EVAL)、聚乙烯(PE)、聚酯、聚丙烯(PP)、聚氟化亞乙烯(PVDF)、聚醚碸(PES)、聚碳酸酯(PC)、環烯烴聚合物(COP)、聚氯化乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、超高分子量聚乙烯(UHPE)、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯樹脂(ABS)或Teflon(註冊商標)。
本發明之細胞凝集塊製造用基板之製造中，形成基底膜時，不需要以高溫處理，也能夠適應耐熱性較低之樹脂等。
基板之材質亦可為1種類亦可為2種類以上組合，但本案之細胞凝集塊製造用基板，例如為了大量製造細胞培養凝集塊，該基板亦可為像皮帶輸送機這樣具有如能夠捲起(卷軸方式)之柔軟性之基板。作為上述卷軸方式所使用之基板材質，有舉出合成樹脂、天然高分子。
且，本案之基板，亦可為所謂細胞培養器中使用之基板。一般細胞之培養中所使用之培養皿、組織培養用培養盤、多用性培養盤等之細胞培養皿或培養盤、細胞培養燒瓶、攪拌式燒瓶、多段燒瓶等之燒瓶、塑膠包袋、Teflon(註冊商標)包袋、培養包袋等之包袋、微盤、微孔盤、多用性盤、多用性孔盤等之盤、細胞培養玻片、管子、托盤、轉瓶等之瓶罐等。
＜細胞凝集塊之製造方法＞
本發明之細胞凝集塊之製造方法包含：在具有細胞之附著抑制能之基板上，形成包含聚合物及細胞接著性物質之細胞培養之基底膜之步驟，接著將細胞種入來培養細胞之步驟，該聚合物包含下述式(I)：表示之單體所衍生之重複單位。
[式中，
U
a1及U
a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R
a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。細胞之種入･培養步驟並無特別限定，能夠因應細胞之種類並以適當公知之方法來進行。具有細胞之附著抑制能之基板、基底膜之形成步驟(製造方法)、細胞之詳細如前述。
本發明之細胞凝集塊之製造方法中，能夠於來自生體之血清之存在下或不存在下進行細胞之種入･培養步驟，尤其是培養液中來自生體之血清亦可為低濃度(例如未滿5質量%，尤其是未滿3質量%)，或亦可不存在，在能夠進行高品質之細胞凝集塊之製造這一點較優異。
[實施例]
以下，舉出實施例及比較例，來更具體地說明本發明，但本發明不限定於下述實施例。
＜重量平均分子量之測定方法＞
下述合成例所示之重量平均分子量為以膠體層析法(以下簡稱為GFC)所得之結果。
(測定條件)
･裝置：HLC-8320GPC(TOSOH(股)製)
･GFC管柱：TSKgel G 6000 + 3000 PWXL-CP
･流速：1.0mL/min
･溶離液：含鹽之水/有機混合溶媒
･管柱溫度：40℃
･檢測器：RI
･注入濃度：聚合物固形分0.05質量%
･注入量：100μL
･檢量線：三次近似曲線
･標準試料：聚氧化乙烯(Agilent公司製)×10種
＜合成例1＞
混合甲基丙烯酸2-(二甲基胺基酸)乙酯(東京化成工業(股)製)24.00g、甲基丙烯酸(東京化成工業(股)製)1.46g、乙二醇二甲基丙烯酸酯(東京化成工業(股)製)5.09g、二甲基1,1’-偶氮雙(1-環己烷羧酸酯)(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical(股)製)0.31g、2-丙醇111.09g，藉由對成為回流溫度之2-丙醇166.62g，滴入聚合，合成聚合物。將反應生成物以貧溶媒之己烷再沉澱，藉由過濾析出物來回收，並使其減壓乾燥。
GFC所得之此聚合物之重量平均分子量為228,000 (以下稱作「合成例聚合物1」)。
＜合成例2＞
混合甲基丙烯酸2-(二甲基胺基酸)乙酯(東京化成工業(股)製)8.00g、甲基丙烯酸(東京化成工業(股)製)1.88g、乙二醇二甲基丙烯酸酯(東京化成工業(股)製)1.98g、二甲基1,1’-偶氮雙(1-環己烷羧酸酯)(VE-073，FUJIFILM Wako Pure Chemical(股)製)0.12g、2-丙醇43.10g，藉由對成為回流溫度之2-丙醇64.65g，滴入聚合，合成聚合物。將反應生成物以貧溶媒之己烷再沉澱，藉由過濾析出物來回收，並使其減壓乾燥。
GFC所得之此聚合物之重量平均分子量為438,000 (以下稱作「合成例聚合物2」)。
＜調製例1＞
將聚乙酸乙烯酯(日本VAM & POVAL (股)製JMR-150L(註冊商標)(聚合度1480，皂化度22.7%))以乙醇/1-甲氧基-2-丙醇(7/3質量比)使其溶解，並使濃度成為10mg/g，調製具有細胞之附著抑制能之塗布膜形成用組成物1。所得之組成物為透明且均勻。
＜調製例2＞
將聚乙酸乙烯酯(日本VAM & POVAL (股)製JMR-150L(註冊商標)(聚合度1480，皂化度22.7%))以乙醇/1-甲氧基-2-丙醇(7/3質量比)使其溶解，並使濃度成為3mg/g，調製具有細胞之附著抑制能之塗布膜形成用組成物2。所得之組成物為透明且均勻。
＜調製例3＞
於上述合成例1所得之聚合物0.0466g中添加純水46.6g，充分攪拌後，調製稀釋用組成物。
＜製作例1＞
(具有細胞之附著抑制能之基板之製作)
將調製例1之塗布膜形成用組成物1添加於24孔細胞培養盤(Corning公司製，#351147，容積1mL，聚苯乙烯製)之各孔洞中，使其成為25μL/孔洞，於室溫靜置3小時後，使用烘箱，以70℃乾燥24小時，製作具有細胞之附著抑制能之基板1。
＜製作例2＞
(具有細胞之附著抑制能之基板之製作)
將調製例1之塗布膜形成用組成物1添加於24孔細胞培養盤(Corning公司製，#351147，容積1mL，聚苯乙烯製)之各孔洞中，使其成為100μL/孔洞，於室溫靜置3小時後，使用烘箱，以70℃乾燥24小時，製作具有細胞之附著抑制能之基板2。
＜製作例3＞
(具有細胞之附著抑制能之基板之製作)
將調製例1之塗布膜形成用組成物1添加於Φ40mm培養皿(AS ONE公司製，#1-8549-01，容積1mL，聚苯乙烯製)之各孔洞中，使其成為125μL/孔洞，於室溫靜置3小時後，使用烘箱，以70℃乾燥24小時，製造具有細胞之附著抑制能之基板3。
＜製作例4＞
(以噴墨之具有細胞之附著抑制能之基板之製作)
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，在具有79mm×121mm之大小之聚苯乙烯基板上，將調製例2所調製之塗布膜形成用組成物2以直徑18mm之真圓狀來適量地塗布。以70℃之烘箱乾燥24小時，製作具有細胞之附著抑制能之基板4。
＜製作例5＞
(以噴墨之具有細胞之附著抑制能之基板之製作)
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，在具有79mm×121mm之大小之聚苯乙烯基板上，將調製例2所調製之塗布膜形成用組成物2以直徑37mm之真圓狀來適量地塗布。以70℃之烘箱乾燥24小時，製作具有細胞之附著抑制能之基板5。
＜實施例1＞
於上述合成例1所得之聚合物0.0025g中添加純水99.5g、0.5mg/mL玻璃體結合蛋白VTN-N(Gibco公司) 0.5mL，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：500-S-C)，於具有細胞之附著抑制能之培養皿(直徑：35mm)(住友Bakelite股份公司，MS9035X)之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。
＜實施例2＞
於上述合成例1所得之聚合物0.0025g中添加純水99g、0.5mg/mL玻璃體結合蛋白VTN-N(Gibco公司)1mL，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。與實施例1同樣地，使用噴墨裝置來塗布基底膜形成劑，形成多數部位。使其乾燥，調製細胞凝集塊製造用基板。
＜實施例3＞
於上述合成例2所得之聚合物0.005g中添加純水99g、0.5mg/mL玻璃體結合蛋白VTN-N(Gibco公司)1.0mL，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。與實施例1同樣地，使用噴墨裝置來塗布基底膜形成劑，形成多數部位。使其乾燥，調製細胞凝集塊製造用基板。
＜實施例4＞
於上述合成例1所得之聚合物0.005g中添加純水99g、0.5mg/mL玻璃體結合蛋白VTN-N(Gibco公司)1.0mL，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。與實施例1同樣地，使用噴墨裝置來塗布基底膜形成劑，形成多數部位。使其乾燥，調製細胞凝集塊製造用基板。
＜實施例5＞
於上述合成例1所得之聚合物0.015g中添加純水94g、0.5mg/mL玻璃體結合蛋白VTN-N(Gibco公司)6.0mL，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股) MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：IJHBS-1000)，於具有細胞之附著抑制能之培養盤(住友Bakelite股份公司，PrimeSurface(註冊商標)盤24F，型號：MS-90240)之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數直徑250μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例6＞
於上述合成例1所得之聚合物0.005g中添加純水98g、0.5mg/mL玻璃體結合蛋白VTN-N(Gibco公司)2.0mL，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：IJHBS-1000)，於具有細胞之附著抑制能之培養盤(住友Bakelite股份公司，PrimeSurface(註冊商標)盤24F，型號：MS-90240)之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數直徑250μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例7＞
於上述合成例1所得之聚合物0.005g中添加純水31.3g、0.5mg/mL玻璃體結合蛋白VTN-N(Gibco公司) 2.0mL，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於具有細胞之附著抑制能之培養盤(住友Bakelite股份公司，PrimeSurface(註冊商標)盤24F，型號：MS-90240)之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例8＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物0.70g中添加滅菌水3.69g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之重組人類玻璃體結合蛋白(Peprotech公司製)0.28g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：IJHBS-1000)，於製作例4所製作之具有細胞之附著抑制能之基板4之培養表面上，塗布適量的基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之24孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例9＞
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，於製作例4所製作之具有細胞之附著抑制能之基板4之培養表面上塗布適量的實施例8所調製之基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之24孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例10＞
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，於製作例4所製作之具有細胞之附著抑制能之基板4之培養表面上塗布適量的實施例8所調製之基底膜形成劑。於室溫乾燥5分鐘後，再次塗布並進行重複塗布，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之24孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例11＞
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，於製作例5所製作之具有細胞之附著抑制能之基板5之培養表面上塗布適量的實施例8所調製之基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之6孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例12＞
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，於製作例5所製作之具有細胞之附著抑制能之基板5之培養表面上塗布適量的實施例8所調製之基底膜形成劑。於室溫乾燥5分鐘後，再次塗布並進行重複塗布，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之6孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例13＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物1.50g中添加滅菌水17.9g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之重組人類玻璃體結合蛋白(Peprotech公司製)0.60g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：IJHBS-1000)，於製作例4所製作之具有細胞之附著抑制能之基板4之培養表面上，塗布適量的基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之24孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例14＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物0.80g中添加滅菌水4.48g、iMatrix-511((股)Matrixome公司製)0.08g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股) MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：IJHBS-1000)，於製作例2所製作之具有細胞之附著抑制能之基板2之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例15＞
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，於製作例4所製作之具有細胞之附著抑制能之基板4之培養表面上塗布適量的實施例14所調製之基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之24孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例16＞
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，於製作例4所製作之具有細胞之附著抑制能之基板4之培養表面上塗布適量的實施例14所調製之基底膜形成劑。於室溫乾燥5分鐘後，再次塗布並進行重複塗布，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之24孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例17＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物1.00g中添加滅菌水5.59g、iMatrix-221((股)Matrixome製)0.10g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：IJHBS-1000)，於製作例2所製作之具有細胞之附著抑制能之基板2之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例18＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物0.50g中添加滅菌水7.54g、使用旋轉管柱(Zeba Spin Desalting Columns and Plates，7K MWCO，Thermo Fisher Scientific(股)製)所純化之0.5mg/mL纖網蛋白溶液、來自人類之血漿(FUJIFILM Wako Pure Chemical(股)製)0.30g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：IJHBS-1000)，於具有細胞之附著抑制能之培養盤(住友Bakelite股份公司，PrimeSurface(註冊商標)盤24F，型號：MS-90240)之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例19＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物2.81g中添加滅菌水33.35g、使用旋轉管柱(Zeba Spin Desalting Columns and Plates，7K MWCO，Thermo Fisher Scientific(股)製)所純化之0.5mg/mL玻璃體結合蛋白VTN-N(Gibco公司)1.28g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股) MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：IJHBS-1000)，於具有細胞之附著抑制能之培養盤(住友Bakelite股份公司，PrimeSurface(註冊商標)盤24F，型號：MS-90240)之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例20＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物2.50g中添加滅菌水13.92g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之胜肽RGDS(胜肽研究所，型號：4171-v)0.26g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於製作例3所製作之具有細胞之附著抑制能之基板3之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例21＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物2.50g中添加滅菌水13.92g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之胜肽GRGDS(胜肽研究所，型號：4189)0.25g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於製作例3所製作之具有細胞之附著抑制能之基板3之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例22＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物2.50g中添加滅菌水13.92g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之胜肽GRGDNP(胜肽研究所，型號：PCI-3909-PI)0.25g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於製作例3所製作之具有細胞之附著抑制能之基板3之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例23＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物2.50g中添加滅菌水13.92g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之胜肽YIGSR-NH2 (胜肽研究所，型號：4194-v)0.25g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於製作例3所製作之具有細胞之附著抑制能之基板3之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例24＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物2.50g中添加滅菌水13.92g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之胜肽c[RGDfK(C)] (胜肽研究所，型號：RGD-3794-PI)0.25g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於製作例3所製作之具有細胞之附著抑制能之基板3之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例25＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物2.50g中添加滅菌水14.12g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之胜肽c[RGDfK(C)] (胜肽研究所，型號：RGD-3794-PI)0.05g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於製作例3所製作之具有細胞之附著抑制能之基板3之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例26＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物2.50g中添加滅菌水30.33g、以滅菌水稀釋成1.0mg/mL之PASAP1 (Nanomed3D公司製)0.50g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：IJHBS-1000)，於製作例1所製作之具有細胞之附著抑制能之基板1之培養表面上徒步適量的基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例27＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物2.50g中添加滅菌水30.33g、以滅菌水稀釋成1.0mg/mL之PASAP2 (Nanomed3D公司製)0.51g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：IJHBS-1000)，於製作例1所製作之具有細胞之附著抑制能之基板1之培養表面上徒步適量的基底膜形成劑，形成多數直徑400μm之部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例28＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物0.70g中添加滅菌水3.45g、乙醇0.23g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之重組人類玻璃體結合蛋白(Peprotech公司製)0.28g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於具有細胞之附著抑制能之培養皿(直徑：35mm)(住友Bakelite股份公司，MS9035X)之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例29＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物0.70g中添加滅菌水3.22g、乙醇0.47g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之重組人類玻璃體結合蛋白(Peprotech公司製)0.28g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於具有細胞之附著抑制能之培養皿(直徑：35mm)(住友Bakelite股份公司，MS9035X)之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例30＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物0.70g中添加滅菌水3.70g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之重組人類玻璃體結合蛋白(Peprotech公司製)0.28g、以滅菌水稀釋成10mg/mL之單寧酸(FUJIFILM Wako Pure Chemical(股)製)溶液0.0056g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於具有細胞之附著抑制能之培養皿(直徑：35mm)(住友Bakelite股份公司，MS9035X)之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例31＞
於上述調製例3所得之稀釋用組成物0.80g中添加滅菌水4.21g、以滅菌水稀釋成0.5mg/mL之重組人類玻璃體結合蛋白(Peprotech公司製)0.32g、以滅菌水稀釋成10mg/mL之五倍子酸水和物(東京化成工業(股)製)溶液0.0063g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股) MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於具有細胞之附著抑制能之培養皿(直徑：35mm)(住友Bakelite股份公司，MS9035X)之培養表面上塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例32＞
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，於製作例4所製作之具有細胞之附著抑制能之基板4之培養表面上塗布適量的實施例8所調製之基底膜形成劑，使其成為部位直徑170μm且部位中心間間隔250μm。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之24孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例33＞
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，於製作例4所製作之具有細胞之附著抑制能之基板4之培養表面上塗布適量的實施例8所調製之基底膜形成劑，使其成為部位直徑400μm且部位中心間間隔500μm。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之24孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜實施例34＞
使用噴墨裝置(SEIKO EPSON(股)製，R&D用噴墨裝置)及噴墨噴頭(SEIKO EPSON(股)製，Precision Core噴頭S800-A1)，於製作例4所製作之具有細胞之附著抑制能之基板4之培養表面上塗布適量的實施例8所調製之基底膜形成劑，使其成為部位直徑900μm且部位中心間間隔1000μm。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天。貼附在無底之24孔盤(CSTEC公司製)，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜比較例1＞
於上述合成例1所得之聚合物0.0025g中添加純水100.0g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。與實施例1同樣地使用噴墨裝置，塗布基底膜形成劑，形成多數部位。使其乾燥，調製細胞凝集塊製造用基板。
＜比較例2＞
於上述合成例2所得之聚合物0.005g中添加純水100.0g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。與實施例1同樣地使用噴墨裝置，塗布基底膜形成劑，形成多數部位。使其乾燥，調製細胞凝集塊製造用基板。
＜比較例3＞
於上述合成例1所得之聚合物0.005g中添加純水33.3g，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。使用噴墨裝置((股)MICROJET製，型號：LaboJet-600)及噴墨噴頭(型號：200-S-C)，於具有細胞之附著抑制能之培養皿(直徑：35mm)(住友Bakelite股份公司，MS9035X)之培養表面上，塗布適量的基底膜形成劑，形成多數部位。以70℃之恆溫乾燥機使其乾燥1天，調製細胞凝集塊製造用基板。藉由照射γ線25kGy，進行滅菌。
＜比較例4＞
添加純水4.8g、0.5mg/mL玻璃體結合蛋白VTN-N(Gibco公司)0.2mL，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。與實施例1同樣地使用噴墨裝置，塗布基底膜形成劑，形成多數部位。使其乾燥，調製細胞凝集塊製造用基板。
＜比較例5＞
添加純水2.1g、0.5mg/mL玻璃體結合蛋白VTN-N (Gibco公司)1.2mL，充分攪拌後，調製基底膜形成劑。與實施例1同樣地使用噴墨裝置，塗布基底膜形成劑，形成多數部位。使其乾燥，調製細胞凝集塊製造用基板。
＜試驗例1：實施例1~3、比較例1~2之FBS不含培養液中之小鼠纖維芽細胞之細胞接著確認試驗＞
(細胞之調製)
細胞使用小鼠胎兒纖維芽細胞(C3H10T1/T2細胞：DS Pharma Biomedical(股)製)。細胞之培養，對基礎培養液之BME培養液(Gibco公司製)添加成FBS(Sigma-Aldrich公司製)為10%，麩胺酸/青黴素/鍊黴素(Gibco公司製)為1%，使用此培養液。細胞係在37℃/CO
2培養箱內保持5%二氧化碳濃度之狀態下，使用直徑10cm的培養皿(培養基10mL)，靜置培養2天以上。接著，以PBS溶液(FUJIFILM Wako Pure Chemical(股)製)3mL洗淨本細胞後，添加胰蛋白酶-EDTA溶液(PromoCell公司製)3mL，於室溫下靜置3分鐘，剝離細胞。添加FBS(牛血清)及不含麩胺酸/青黴素/鍊黴素之BME培養液7mL，回收細胞。離心(股份有限公司TOMY精工製，型號LC-230，200×g/3分鐘，室溫)本懸浮液後，去除上清液，添加上述的培養液，調製細胞懸浮液。
(細胞接著確認試驗)
對實施例1~3、比較例1、2所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加細胞懸濁液2.0mL。細胞密度在實施例1、實施例2、比較例1中為種入1.5×10
5cells/cm
2，在實施例3、比較例2中為種入3.0×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，在37℃/CO
2培養箱內靜置2小時。靜置後，去除非接著細胞與培養液，藉由以PBS洗淨，僅將接著細胞殘留於孔洞上。洗淨後，添加新的培養液2.0mL，使用實體顯微鏡SZX16(Olympus(股)製)，觀察並攝影接著細胞之狀況。其結果，如圖1所示，能夠確認對實施例1~3及比較例1、2所製作之基板上之基底膜部分之選擇性之細胞接著。關於實施例1~3，細胞接著並無間隙，並引起均勻之接著。另一方面，可得知關於比較例1~2，細胞接著有間隙，且不均勻地細胞接著。
由上述可得知，藉由基底膜形成劑中含有促進細胞接著或伸展之添加物，不含血清(FBS)之培養液中，能夠在基底膜上達成均勻之細胞接著。
＜試驗例2：實施例4、6之FBS不含培養液之小鼠纖維芽細胞之細胞接著、細胞凝集塊形成確認試驗＞
(細胞之調製)
以與試驗例1相同之方法，實施細胞之調製。
(細胞接著確認試驗)
對實施例4、6所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加細胞懸濁液2.0mL，使其成為3.0×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，在37℃/CO
2培養箱內靜置2小時。靜置後，去除非接著細胞與培養液，藉由以PBS洗淨，僅將接著細胞殘留於孔洞上。洗淨後，添加新的培養液2.0mL，使用實體顯微鏡SZX16(Olympus(股)製)，觀察並攝影接著細胞之狀況。隔天觀察並攝影細胞凝集塊形成之有無。其結果，如圖2所示能夠確認對製作之基板上之基底膜部分上選擇性的細胞接著。且，細胞接著並無間隙，並引起均勻之接著。進而確認到，在2天後之時間點，接著之細胞會從培養皿剝離並凝集，且形成細胞凝集塊(球體)。由上述可得知，在含有促進細胞接著或伸展之添加物之基底膜中，均勻的細胞接著後，細胞會剝離，並能夠形成細胞凝集塊。
＜試驗例3：實施例5、比較例3之使用來自人類脂肪組織之間葉系幹細胞之無血清培養液之細胞接著確認試驗＞
(細胞之調製)
細胞為使用來自人類脂肪組織之間葉系幹細胞(ADSC：CellSource(股)製)。細胞之培養為使用低血清培養液Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2(Takara Bio (股)製：血清濃度2%)。細胞係在37℃/CO
2培養箱內保持5%二氧化碳濃度之狀態下，使用直徑10cm的培養皿(培養基10mL)，靜置培養2天以上。接著，以PBS溶液(FUJIFILM Wako Pure Chemical(股)製)3mL洗淨本細胞後，添加胰蛋白酶-EDTA溶液(PromoCell公司製)3mL，於室溫下靜置3分鐘，剝離細胞。添加無血清培養液之Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF培養液7mL，將細胞回收。離心(股份有限公司TOMY精工製，型號LC-230，200×g/3分鐘，室溫)本懸浮液後，去除上清液，添加上述的培養液，調製細胞懸浮液。
(細胞接著確認試驗)
對實施例5、比較例3所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加細胞懸濁液2.0mL，使其3.0×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，在37℃/CO
2培養箱內靜置2小時。靜置後，去除非接著細胞與培養液，藉由以PBS洗淨，僅將接著細胞殘留於孔洞上。洗淨後，添加新的培養液2.0mL，使用實體顯微鏡SZX16(Olympus(股)製)，觀察並攝影接著細胞之狀況。其結果，如圖3所示能夠確認實施例5時，對製作之基板上之基底膜部分上選擇性的細胞接著。且，細胞接著並無間隙，並引起均勻之接著。另一方面，關於比較例3能夠得之，細胞接著有間隙，且不均勻地細胞接著。
由上述可得知，藉由基底膜形成劑中含有促進細胞接著或伸展之添加物，即使使用ADSC，在無血清培養液中，在基底膜上能夠達成均勻的細胞接著。
＜試驗例4：實施例7之使用來自人類脂肪組織之間葉系幹細胞之低血清培養液之細胞接著確認試驗＞
(細胞之調製)
試驗例3中，除了將細胞剝離後之培養液改變成低血清培養液之Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2培養液以外，其餘以相同之方法來實施細胞之調製。
(細胞接著確認試驗)
對實施例7所製作之細胞凝集塊製造用基板，以與試驗例3相同之方法，實施細胞接著確認試驗。其結果，如圖4所示能夠確認對製作之基板上之基底膜部分上選擇性的細胞接著。且，細胞接著並無間隙，並引起均勻之接著。
由上述可得知，藉由基底膜形成劑中含有促進細胞接著或伸展之添加物，在使用ADSC時，即使在低血清培養液中，在基底膜上也能夠達成均勻的細胞接著。
＜試驗例5：實施例8~10、13~14、17~19、26~27之使用來自人類脂肪組織之間葉系幹細胞之無血清培養液之細胞接著、細胞凝集塊形成確認試驗＞
(細胞之調製)
試驗例3以相同之方法來實施細胞之調製。
(細胞接著、細胞凝集塊形成確認試驗)
對實施例8~10、13~14、17~19、26~27所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加細胞懸濁液0.5~2.0mL使其成為2.0×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，在37℃/CO
2培養箱內靜置2小時。靜置後，使用實體顯微鏡SZX16(Olympus(股)製)，觀察並攝影接著細胞之狀況。其結果，如圖5所示能夠確認對製作之基板上之基底膜部分上選擇性的細胞接著。且，細胞接著並無間隙，並引起均勻之接著。進而確認到，在2天後之時間點，接著之細胞會從培養皿剝離並凝集，且形成細胞凝集塊(球體)。由上述可得知，在含有促進細胞接著或伸展之添加物之基底膜中，均勻的細胞接著後，細胞會剝離，並能夠形成細胞凝集塊。
＜試驗例6：實施例20~25、28~31之使用來自人類脂肪組織之間葉系幹細胞之無血清培養液之細胞接著、細胞凝集塊形成確認試驗＞
(細胞之調製)
以與試驗例3相同之方法來實施細胞之調製。
(細胞接著確認、細胞凝集塊形成試驗)
對實施例20~25、28~31所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加細胞懸濁液2.0mL使其成為2.0×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，在37℃/CO
2培養箱內靜置2小時。靜置後，去除非接著細胞與培養液，藉由以PBS洗淨，僅將接著細胞殘留於孔洞上。洗淨後，添加新的培養液2.0mL，使用實體顯微鏡SZX16(Olympus(股)製)，觀察並攝影接著細胞之狀況。其結果，如圖6所示能夠確認對製作之基板上之基底膜部分上選擇性的細胞接著。且，細胞接著並無間隙，並引起均勻之接著。進而確認到，在1天後之時間點，接著之細胞會從培養皿剝離並凝集，且形成細胞凝集塊(球體)。由上述可得知，在含有促進細胞接著或伸展之添加物之基底膜中，均勻的細胞接著後，細胞會剝離，並能夠形成細胞凝集塊。
＜試驗例7：實施例32~34之使用來自人類脂肪組織之間葉系幹細胞之無血清培養液之細胞接著、細胞凝集塊形成確認試驗＞
(細胞之調製)
試驗例3以相同之方法來實施細胞之調製。
(細胞接著確認試驗)
對實施例32~34所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加細胞懸濁液1.0mL使其成為0.75×10
5~3.0×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，在37℃/CO
2培養箱內靜置6小時。靜置後，使用實體顯微鏡SZX16 (Olympus(股)製)，觀察並攝影接著細胞之狀況。進而在2天後，觀察並攝影細胞凝集塊形成之有無。其結果，如圖7所示能夠確認對製作之基板上之基底膜部分上選擇性的細胞接著。且，細胞接著並無間隙，並引起均勻之接著。且，細胞接著直徑為與塗布直徑相同大小。進而確認到，在2天後之時間點，接著之細胞會從培養皿剝離並凝集，且形成細胞凝集塊(球體)。且，可得知細胞凝集塊之直徑會隨著接著直徑而變化。由上述可得知，在含有促進細胞接著或伸展之添加物之基底膜中，均勻的細胞接著後，細胞會剝離，並能夠形成細胞凝集塊。且得知，藉由塗布直徑，能夠控制細胞接著直徑或細胞凝集塊之直徑。
＜試驗例8：實施例9、10之使用人類人工多能性幹細胞之細胞接著確認試驗＞
(細胞之調製)
細胞為使用人類人工多能性幹細胞(hiPSC)1383D2株(由京都大學iPS細胞研究所取得)。細胞之培養為使用mTeSR1培養液((股)VERITAS製)。細胞係在37℃/CO
2培養箱內保持5%二氧化碳濃度之狀態下，使用以0.5μg/cm
2之濃度塗布玻璃體結合蛋白(VTN-N)重組人類蛋白，截斷(Thermo Fisher Scientific(股)製)之6孔盤，靜置培養3天間以上。接著，將本細胞以PBS溶液(FUJIFILM Wako Pure Chemical(股)製)2mL/孔洞來洗淨後，添加TrypLE(商標)Select Enzyme(1X)，無酚紅(Thermo Fisher Scientific (股)製)0.5mL，於室溫靜置10分鐘，將細胞剝離成單一細胞。使用mTeSR1培養液，將細胞回收，將本懸濁液離心((股)TOMY精工製，型號EIX-136，200×g/3分鐘，室溫)。清除上清液，懸浮於10μM之包含Y-27632(FUJIFILM Wako Pure Chemical(股)製)之mTeSR1培養液後，通過40μm細胞濾器(CORNING製)，調製細胞懸濁液。
(細胞接著確認試驗)
對實施例9、10所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加細胞懸濁液0.5mL使其成為1.5×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，於37℃/CO
2培養箱內靜置3小時或24小時間。靜置後，去除非接著細胞與培養液，藉由以mTeSR1培養液洗淨，僅將接著細胞殘留於孔洞上。洗淨後添加新的培養液0.5mL，使用倒立顯微鏡IX73(Olympus(股)製)，觀察並攝影接著細胞之狀況。其結果，如圖8所示能夠確認hiPSC之接著。
由上述可確認，藉由基底膜形成劑中含有促進細胞接著或伸展之添加物，即使使用hiPSC，也能夠在基底膜上達成均勻的細胞接著。
＜試驗例9：實施例9、10之使用人類人工多能性幹細胞之球體形成確認試驗＞
對實施例9、10所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加試驗例8所調製之細胞懸濁液0.5mL使其成為1.5×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，於37℃/CO
2培養箱內靜置。種入的隔天，將非接著細胞與培養液去除，並藉由添加0.5mL之不含Y-27632之mTeSR1培養液，交換成不含Y-27632之培養液。進而保持在5%二氧化碳濃度之狀態，於37℃/CO
2培養箱內靜置，種入2天後，使用倒立顯微鏡IX73(Olympus(股)製)，觀察並攝影細胞之狀況。其結果，如圖9所示能夠確認接著之細胞會從培養皿剝離並凝集，且形成細胞凝集塊(球體)。並確認能夠形成孔洞全體為均勻大小之球體。
＜試驗例10：實施例11、12之使用人類人工多能性幹細胞之細胞接著、球體形成後之生存率、未分化性確認試驗＞
與上述試驗例8同樣地，細胞使用人類人工多能性幹細胞(hiPSC)1383D2株。
對實施例11、12所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加細胞懸濁液2mL使其成為1.5×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，於37℃/CO
2培養箱內靜置。種入的隔天，將非接著細胞與培養液去除，並藉由添加2mL之不含Y-27632之mTeSR1培養液，交換成不含Y-27632之培養液。進而保持在5%二氧化碳濃度之狀態，於37℃/CO
2培養箱內靜置後，與上述同樣地，在種入2天後確認到形成細胞凝集塊(球體)。將所得之球體回收至15mL離心分離管，以200×g離心3分鐘，去除上清液，懸浮於TrypLE(商標)Select Enzyme(1X)、無酚紅(Thermo Fisher Scientific製)0.25mL。藉由在37℃之水浴中，一邊滴量一邊進行5~10分鐘之培養，分散成單一細胞。添加含有10%FBS之DMEM750μL中和後，以NucleoCounter NC-200 (ChemoMetec製)進行細胞計數。如表1所示，形成所得之球體之iPSC能夠維持較高之生存率。
接著，將分散成單一細胞之細胞以SM溶液(2%FBS/PBS)洗淨後，添加PE標識小鼠抗人類SSEA-4抗體及AlexaFluor647標識小鼠抗人類TRA-1-60抗體(BD Biosciences製)，以室溫培養30分鐘。以SM溶液洗淨2次後，以FACSLSRFortessaX-20(BD Biosciences公司製)進行解析。將SSEA-4及TRA-1-60之共表現細胞之比例，如於表2所示，皆表示較高之表現，並表示以本法所製作出的球體維持在未分化性。
＜試驗例11：實施例15、16之使用人類人工多能性幹細胞之細胞接著確認試驗＞
對實施例15、16所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加細胞懸濁液0.5mL使其成為1.5×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，於37℃/CO
2培養箱內靜置6小時後，使用倒立顯微鏡IX73(Olympus(股)製)，觀察並攝影接著細胞之狀況結果，如圖10所示能夠確認hiPSC之接著。接著，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，於37℃/CO
2培養箱內靜置至種入後26小時為止。靜置後，去除非接著細胞與培養液，藉由以mTeSR1培養液洗淨，僅將接著細胞殘留於孔洞上。洗淨後添加新的培養液0.5mL，使用倒立顯微鏡IX73(Olympus(股)製)，觀察並攝影接著細胞之狀況。其結果，如圖10所示能夠確認hiPSC之接著。
由上述可確認，藉由基底膜形成劑中含有促進細胞接著或伸展之添加物，即使使用hiPSC，也能夠在基底膜上達成均勻的細胞接著。
＜試驗例12：實施例15、16之使用人類人工多能性幹細胞之球體形成確認試驗＞
對實施例15、16所製作之細胞凝集塊製造用基板，添加細胞懸濁液0.5mL使其成為1.5×10
5cells/cm
2。之後，以保持在5%二氧化碳濃度之狀態，於37℃/CO
2培養箱內靜置。種入的隔天，將非接著細胞與培養液去除，並藉由添加0.5mL之不含Y-27632之mTeSR1培養液，交換成不含Y-27632之培養液。進而保持在5%二氧化碳濃度之狀態，於37℃/CO
2培養箱內靜置，種入2天後，使用倒立顯微鏡IX73(Olympus(股)製)，觀察並攝影細胞之狀況。其結果，如圖11所示能夠確認接著之細胞會從培養皿剝離並凝集，且形成細胞凝集塊(球體)。並確認能夠形成孔洞全體為均勻大小之球體。
＜試驗例13：比較例4(不含聚合物且僅有添加物)之不含FBS之培養液之小鼠纖維芽細胞之細胞接著、細胞凝集塊形成確認試驗＞
(細胞之調製)
以與試驗例1相同之方法，實施細胞之調製。
(細胞接著確認試驗)
對比較例4所製作之細胞凝集塊製造用基板，以與試驗例2相同之方法，實施細胞接著、細胞凝集塊形成確認試驗。其結果，如圖12所示無法確認製作之基板上之細胞對基底膜部分之接著。由上述可得知，不含聚合物且僅含有促進細胞之接著或伸展之添加物之基底膜中，無法達成細胞接著。藉此，可得知藉由組合聚合物與添加物，才能夠表現細胞接著效果。
＜試驗例14：比較例5(不含聚合物且僅有添加物)之含有FBS之培養液隻小鼠纖維芽細胞之細胞接著、細胞凝集塊形成確認試驗＞
(細胞之調製)
除了將細胞剝離後之培養液改變成含有FBS(牛血清) 10%及麩胺酸/青黴素/鍊黴素1%之BME培養液以外，其餘以與試驗例1相同之方法，實施細胞之調製。
(細胞接著確認試驗)
對比較例5所製作之細胞凝集塊製造用基板，以與試驗例2相同之方法，實施細胞接著、細胞凝集塊形成確認試驗。其結果，如圖13所示能夠確認對製作之基板上之基底膜部分上選擇性的細胞接著。且，細胞接著並無間隙，並引起均勻之接著。進而，在2天後之時間點，能夠確認到接著之細胞直接接著在培養皿上。由上述得知，不含聚合物且僅含有促進細胞之接著或伸展之添加物之基底膜中，血清培養液中，雖然會達成均勻的細胞接著，但之後不會剝離，因此無法形成細胞凝集塊。
[產業可利用性]
本發明之細胞培養之基底膜形成劑係在含有或不含有來自動物之血清之任一種培養條件，都能夠實現細胞之均勻接著，接著製造出細胞凝集塊。因此，藉由使用上述細胞培養之基底膜形成劑，能夠達成再生醫療領域所使用之均質且高品質之細胞凝集塊之量產化。
[圖1]攝影附著在使用試驗例1之小鼠纖維芽細胞之細胞接著確認試驗，且由實施例1~3、比較例1及2中所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之實體顯微鏡照片。
[圖2]分別在2小時後及2天後攝影附著在使用試驗例2之小鼠纖維芽細胞之細胞接著･細胞凝集塊形成確認試驗，且由實施例4及6所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之實體顯微鏡照片。
[圖3]攝影附著在使用試驗例3之ADSC之細胞接著確認試驗，且由實施例5及比較例3所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之實體顯微鏡照片。
[圖4]攝影附著在使用試驗例4之ADSC之細胞接著確認試驗，且由實施例7所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之實體顯微鏡照片。
[圖5]在2小時後及2天後攝影附著在使用試驗例5之ADSC之細胞接著･細胞凝集塊形成確認試驗，且由實施例8~10、13~14、17~19、26~27所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之實體顯微鏡照片。
[圖6]2小時後及1天後攝影附著在使用試驗例6之ADSC之細胞接著･細胞凝集塊形成確認試驗，且由實施例20~25、28~31所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之實體顯微鏡照片。
[圖7]6小時後及2天後攝影附著在使用試驗例7之ADSC之細胞接著･細胞凝集塊形成確認試驗，且由實施例32~34所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之實體顯微鏡照片。
[圖8]3小時後及1天後攝影附著在使用試驗例8之hiPSC之細胞接著確認試驗，且由實施例9、10所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之倒立顯微鏡照片。
[圖9]種入2天後攝影附著在使用試驗例9之hiPSC之球體形成確認試驗，且由實施例9、10所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之倒立顯微鏡照片。
[圖10]種入6小時後及1天後攝影附著在使用試驗例11之hiPSC之細胞接著確認試驗，且由實施例15、16所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之倒立顯微鏡照片。
[圖11]種入2天後攝影附著在使用試驗例12之hiPSC之球體形成確認試驗，且由實施例15、16所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之倒立顯微鏡照片。
[圖12]2小時後及2天後攝影附著在使用試驗例13之小鼠纖維芽細胞之細胞接著･細胞凝集塊形成確認試驗，且由比較例4所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之實體顯微鏡照片。
[圖13]2小時後及2天後攝影附著在使用試驗例14之小鼠纖維芽細胞之細胞接著･細胞凝集塊形成確認試驗，且由比較例5所製作之細胞凝集塊製造用基板之狀況之實體顯微鏡照片。
Claims (13)
- 一種細胞培養之基底膜形成劑，其係包含： 包含下述式(I)表示之單體所衍生之重複單位之聚合物、 細胞接著性物質，及 溶媒，[式中， U a1及U a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
- 如請求項1之細胞培養之基底膜形成劑，其中，上述聚合物進而包含式(II)表示之單體所衍生之重複單位，[式中， R b表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基]。
- 如請求項1或2之細胞培養之基底膜形成劑，其中，前述聚合物與細胞接著性物質之重量比為100:0.1~100:100。
- 如請求項1~3中任1項之細胞培養之基底膜形成劑，其中，前述細胞接著性物質包含糖蛋白質。
- 一種細胞凝集塊製造用基板，其係在具有細胞之附著抑制能之基板上，具備以如請求項1~4中任1項之細胞培養之基底膜形成劑所形成之細胞培養之基底膜之部位。
- 一種細胞凝集塊之製造方法，其係包含： 在具有細胞之附著抑制能之基板上，形成包含聚合物及細胞接著性物質之細胞培養之基底膜之步驟，接著種入細胞之步驟， 該聚合物包含下述式(I)表示之單體所衍生之重複單位，[式中， U a1及U a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
- 一種細胞培養之基底膜形成劑，其係包含： 包含下述式(Ia)表示之重複單位與交聯構造之聚合物、 細胞接著性物質，及 溶媒，[式中， U a1及U a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
- 如請求項7之細胞培養之基底膜形成劑，其中，前述交聯構造包含來自多官能丙烯酸酯化合物、多官能丙烯酸醯胺化合物、多官能聚酯或異戊二稀化合物之構造。
- 如請求項7之細胞培養之基底膜形成劑，其中，前述交聯構造包含下述式(IIIa)、(IVa)及/或(Va)表示之構造，[式中，R c及R d各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R e表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基，n表示1~50之數]。
- 一種細胞凝集塊之製造方法，其係包含： 在具有細胞之附著抑制能之基板上，形成包含聚合物及細胞接著性物質之細胞培養之基底膜之步驟，接著種入細胞之步驟， 該聚合物包含下述式(Ia)表示之重複單位與交聯構造，[式中， U a1及U a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
- 一種細胞凝集塊之製造方法，其係包含： 在具有細胞之附著抑制能之基板上，且具備包含聚合物及細胞接著性物質之細胞培養之基底膜之細胞凝集塊製造用基板上，種入細胞之步驟， 該聚合物包含下述式(Ia)表示之重複單位與交聯構造，[式中， U a1及U a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
- 一種細胞凝集塊製造用基板，其係具備包含聚合物及細胞接著性物質之細胞培養之基底膜之部位，該聚合物包含下述式(Ia)表示之重複單位與交聯構造，[式中， U a1及U a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]。
- 一種細胞培養之基底膜形成劑，其係包含聚合物、細胞接著性物質及溶媒，該聚合物包含下述式(Ia)表示之重複單位與式(IIa)表示之重複單位與交聯構造，[式中， U a1及U a2各自獨立表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a1表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基，R a2表示碳原子數1~5之直鏈或分支伸烷基]，
[式中， R b表示氫原子或碳原子數1~5之直鏈或分支烷基]。
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