TW202216987A - 軟骨組織之製造方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種軟骨組織之製造方法，其特徵為包含：提供細胞凝集體製造用基板之步驟，該細胞凝集體製造用基板係於具有抑制細胞附著能力之基板上，具備包含衍生自下述式(I)及(II)所示之單體的重複單元之共聚物所構成的多個塗點；對該基板播種源自多潛能幹細胞之PRRX1蛋白質陽性的人類軟骨前驅細胞之步驟；培養該細胞而作成細胞凝集體之步驟；培養該凝集體而作成軟骨組織之步驟；
Figure 110124496-A0101-11-0001-1
[式中，U a1、U a、R a1、R a2及R b係如說明書及申請專利範圍所記載]。

Description

軟骨組織之製造方法
本案發明係有關於一種軟骨組織之製造方法。
移植自行培養軟骨組織的方法係屬關節軟骨損傷治療的一種，由於需要採取軟骨及移植培養之軟骨此二次手術，而對患者的負擔極大。基於減輕此患者的負擔等觀點，有人提出各種的再生醫療技術，其係由各種幹細胞的誘導分化暨培養製作供移植用的軟骨組織而非由自行培養來製作。例如有人報導藉由在中胚層誘導人工多潛能幹細胞(iPS細胞)，並於抗壞血酸、BMP2、TGFβ、GDF5的存在下進行培養，而使培養盤上的部分細胞形成軟骨細胞凝集物，將其剝離並進行浮游培養而作出透明軟骨組織之技術(例如參照非專利文獻1)。 [先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]A. Yamashita, M. Morioka, Y. Yahara, M. Okada, T. Kobayashi, S. Kuriyama, S. Matsuda, N. Tsumaki, Generation of scaffoldless hyaline cartilaginous tissue from human iPSCs, Stem cell reports 4(2015)404-418.
[發明所欲解決之課題]
如採上述技術，雖可由人類多潛能幹細胞作出作為最終產物的透明軟骨組織，但卻未規範中間階段之細胞(=人類軟骨前驅細胞)。因此，有不易以高效率大量生產組織形狀/性質狀態均一之軟骨再生材料的課題。 [解決課題之手段]
本案發明人等針對迄此由幹細胞製作軟骨組織時之中間階段的細胞及其製造方法，與由該細胞製造軟骨組織之方法致力進行研究，並針對其部分進行專利申請(例如參照PCT/JP2020/035517)。就此方法，可擴大培養中間階段之具分化指向性的細胞(即軟骨前驅細胞)並進行原種化，且可藉由將經品質管理之同批次的細胞進行軟骨誘導分化處理而作成軟骨組織，而且製作之軟骨組織中不含軟骨細胞以外的細胞，因此在將軟骨組織使用於再生醫療上係屬有利。本發明係發現藉由在既定的培養條件下進行此種從軟骨前驅細胞至軟骨組織的製作，可有效地使細胞生長，同時由少數的細胞作成大型軟骨組織片而完成者。
本發明係包含以下者： [1]　一種軟骨組織之製造方法，其特徵為包含：提供細胞凝集體製造用基板之步驟，該細胞凝集體製造用基板係於具有抑制細胞附著能力之基板上，具備包含衍生自下述式(I)所示之單體的重複單元及衍生自下述式(II)所示之單體的重複單元之共聚物所構成的多個塗點；對該基板播種源自多潛能幹細胞之PRRX1蛋白質陽性的人類軟骨前驅細胞之步驟；培養該細胞而作成細胞凝集體之步驟；培養該凝集體而作成軟骨組織之步驟；
Figure 02_image001
[式中， U a1及U a2分別獨立表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，R a1表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，R a2表示碳原子數1至5之直鏈或者分支伸烷基]；
Figure 02_image003
[式中， R b表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基]。
[2]　如上述[1]之製造方法，其中衍生自式(I)所示之單體的重複單元相對於衍生自上述式(I)所示之單體的重複單元及衍生自上述式(II)所示之單體的重複單元之合計的莫耳比率為99莫耳%～51莫耳%。
[3]　如上述[1]或[2]之製造方法，其中上述共聚物進一步包含衍生自下述式(III)所示之單體的結構單元；
Figure 02_image005
[式中， R c及R d分別獨立表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，R e表示碳原子數1至5之直鏈或者分支伸烷基，n表示1～50的數]。
[4]　如上述[1]～[3]中任一項之製造方法，其中上述具有抑制細胞附著能力之基板係於其表面的至少一部分包含塗覆膜，該塗覆膜係包含共聚物(P)，該共聚物(P)係包含含有下述式(a)所示之基的重複單元與含有下述式(b)所示之基的重複單元；
Figure 02_image007
[式中， U a11、U a12、U b11、U b12及U b13分別獨立表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，An -表示選自鹵化物離子、無機酸離子、氫氧化物離子及異硫氰酸酯離子所成群組的陰離子]。
[5]　如上述[1]～[4]中任一項之製造方法，其中作成軟骨組織之步驟中的培養係以含有瓊脂的培養基來實施。
[6]　如上述[5]之製造方法，其中瓊脂的重量平均分子量為10,000～60,000，瓊脂的含量相對於培養基的總量為0.005(w/v)%以上且未達2(w/v)%。 [發明之效果]
本發明之製造方法能以經品質管理之軟骨前驅細胞為原料，並進行軟骨誘導分化處理而作成軟骨組織，而且製作之軟骨組織中不含軟骨細胞以外的細胞，因此在將軟骨組織安全地使用於再生醫療上係屬有利。再者，藉由在既定的培養條件下進行從軟骨前驅細胞至軟骨組織的製作，可有效地使細胞生長，同時由少數的細胞作成大型軟骨組織片，於成本面亦屬有利。
[實施發明之形態] ＜軟骨組織之製造方法＞
本發明之軟骨組織之製造方法，其特徵為包含： (1)提供細胞凝集體製造用基板之步驟，該細胞凝集體製造用基板係於具有抑制細胞附著能力之基板上，具備包含衍生自式(I)及(II)所示之單體的重複單元之共聚物所構成的多個塗點； (2)對該基板播種源自多潛能幹細胞之PRRX1蛋白質陽性的人類軟骨前驅細胞之步驟； (3)培養該細胞而作成細胞凝集體之步驟；及 (4)培養該凝集體而作成軟骨組織之步驟。
步驟(1) 於步驟(1)中，係提供細胞凝集體製造用基板。本發明之細胞凝集體製造用基板係於具有抑制細胞附著能力之基板上，具備包含衍生自式(I)及(II)所示之單體的重複單元之共聚物所構成的多個塗點。
(共聚物) 前述共聚物係包含衍生自下述式(I)所示之單體的重複單元及衍生自下述式(II)所示之單體的重複單元；
Figure 02_image009
[式中， U a1及U a2分別獨立表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，R a1表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，R a2表示碳原子數1至5之直鏈或者分支伸烷基]；
Figure 02_image011
[式中， R b表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基]。
於本說明書中，除非另有定義，否則「碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基」可舉出例如甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、s-丁基、t-丁基、n-戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基或1-乙基丙基。
R a1及R b分別獨立為選自氫原子及甲基較佳。
U a1及U a2分別獨立為選自氫原子、甲基、乙基、n-丙基、異丙基及n-丁基較佳，但為甲基或乙基較佳，為甲基最佳。
於本說明書中，除非另有定義，否則「碳原子數1至5之直鏈或者分支伸烷基」可舉出例如伸甲基、伸乙基、伸丙基、三伸甲基、四伸甲基、1-甲基伸丙基、2-甲基伸丙基、二甲基伸乙基、乙基伸乙基、五伸甲基、1-甲基-四伸甲基、2-甲基-四伸甲基、1,1-二甲基-三伸甲基、1,2-二甲基-三伸甲基、2,2-二甲基-三伸甲基、1-乙基-三伸甲基等。此等當中，作為R a2，為選自伸乙基及伸丙基較佳。
從而，作為上述式(I)所示之單體，可舉出2-N,N-二甲基胺基乙基甲基丙烯酸酯、N,N-二甲基胺基甲基甲基丙烯酸酯等，為2-N,N-二甲基胺基乙基甲基丙烯酸酯較佳。作為上述式(II)所示之單體，可舉出丙烯酸、甲基丙烯酸等，為甲基丙烯酸較佳。
前述共聚物中衍生自式(I)所示之單體的重複單元相對於衍生自式(I)所示之單體的重複單元及衍生自式(II)所示之單體的重複單元之合計的莫耳比率較佳為99莫耳%～51莫耳%，更佳為98莫耳%～60莫耳%，再更佳為95莫耳%～70莫耳%，再佳為93莫耳%～70莫耳%。衍生自式(II)所示之單體的重複單元的莫耳比率若為50莫耳%以上，共聚物會呈現過度的陰離子性，而有細胞之接著力降低的傾向。此外，於本說明書中，除非另行合先敘明，否則衍生自各單體的重複單元的莫耳比率可替換為由單體之饋入量(莫耳量)所算出的比率。
前述共聚物亦可與衍生自式(I)/式(II)所示之單體的重複單元共同進一步包含衍生自具有2個以上之碳-碳不飽和鍵之單體的結構單元。具有2個以上之碳-碳不飽和鍵之單體具體而言意指具有2個以上碳-碳雙鍵之單體，可舉出例如多官能丙烯酸酯化合物、多官能丙烯醯胺化合物、多官能聚酯或異戊二烯化合物等。
較佳具體例可舉出下述式(III)～(V)所示之單體。
Figure 02_image013
Figure 02_image015
Figure 02_image017
式中，R c及R d分別獨立表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，R e表示碳原子數1至5之直鏈或者分支伸烷基，n表示1～50的數。此等當中，較佳為式(III)所示之單體。
R c及R d較佳分別獨立選自氫原子及甲基。 R e較佳選自伸甲基、伸乙基及伸丙基，更佳為伸乙基。
n為1～50的數，n較佳為1～30的數，n更佳為1～10的數。
前述共聚物中衍生自具有2個以上之碳-碳不飽和鍵之單體(典型上為式(III)～(V)所示之單體)的重複單元的莫耳比率較佳為0莫耳%～5莫耳%，更佳為0莫耳%～3莫耳%。衍生自具有2個以上之碳-碳不飽和鍵之單體的重複單元的莫耳比率若超過5莫耳%，有因過度交聯引起高分子量化，而於製造中凝膠化而不易製造之虞。
前述共聚物亦可進一步包含衍生自乙烯性不飽和單體，或多糖類或者其衍生物的重複單元作為任意的追加單體成分。作為乙烯性不飽和單體的實例，可舉出選自(甲基)丙烯酸酯；乙酸乙烯酯；乙烯基吡咯烷酮；乙烯；乙烯醇；以及該等的親水性的官能性衍生物所成群組中的1種或2種以上之乙烯性不飽和單體。作為多糖類或其衍生物的實例，可舉出羥烷基纖維素(例如羥乙基纖維素或羥丙基纖維素)等的纖維素系高分子、澱粉、葡聚糖、卡特蘭多醣。
所稱親水性的官能性衍生物，係指具有親水性的官能基或結構之乙烯性不飽和單體。作為親水性的官能性基或結構的實例，可舉出甜菜鹼結構；醯胺結構；烷二醇殘基；胺基；以及亞磺醯基等。
甜菜鹼結構係指具有四級銨型之陽離子結構與酸性之陰離子結構之兩性中心的化合物之一價或二價基團，可舉出例如磷醯膽鹼基：
Figure 02_image019
。作為具有如此結構之乙烯性不飽和單體的實例，可舉出2-甲基丙烯醯氧基乙基磷醯膽鹼(MPC)等。
醯胺結構係指下述式所示之基：
Figure 02_image021
[於此，R 16、R 17及R 18互相獨立為氫原子或有機基(例如可經取代之碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基等，具體而言為甲基、異丙基、羥甲基或羥乙基等)]。作為具有如此結構之乙烯性不飽和單體的實例，可舉出(甲基)丙烯醯胺、N-異丙基丙烯醯胺、N-(羥甲基)(甲基)丙烯醯胺等。再者，具有如此結構之單體例如已揭示於日本特開2010-169604號公報等。
烷二醇殘基係指烷二醇(HO-Alk-OH；於此，Alk為碳原子數1至10之伸烷基)之單側末端或兩末端之羥基與其他化合物進行縮合反應後所殘存的亞烷基氧基(-Alk-O-)，亦包含亞烷基氧基單元重複而成之聚(亞烷基氧基)基。作為具有如此結構之乙烯性不飽和單體的實例，可舉出2-羥乙基(甲基)丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯等。再者，具有如此結構之單體例如已揭示於日本特開2008-533489號公報等。
胺基係指式：-NH 2、-NHR 19或-NR 20R 21[於此，R 19、R 20及R 21互相獨立為有機基(例如碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基等)]所示之基。本發明中之胺基包含經四級化或氯化之胺基。作為具有如此結構之乙烯性不飽和單體的實例，可舉出二甲基胺基乙基(甲基)丙烯酸酯、2-(t-丁基胺基)乙基(甲基)丙烯酸酯、甲基丙烯醯基膽鹼氯化物等。
亞磺醯基係指下述式所示之基：
Figure 02_image023
[於此，R 22為有機基(例如碳原子數1至10之有機基，較佳為具有1個以上之羥基之碳原子數1至10之烷基等)]。作為亞磺醯基之導入方法，可舉出日本特開2014-48278號公報等所揭示之方法。
本案之共聚物能以其本身所熟知之方法(例如日本特開2014-162865號公報、國際公開第2020/040247號所記載之方法)來製造。
前述共聚物的數量平均分子量(Mn)為20,000～1,000,000，更佳為50,000～800,000。 前述共聚物的重量平均分子量(Mw)與前述數量平均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)為1.01～10.00，較佳為1.2～8.0，較佳為1.4～6.0，較佳為1.5～5.0，較佳為1.6～4.5。 前述數量平均分子量(Mn)與數量平均分子量(Mn)可藉由例如Gel Filtration Chromatography來求得。
透過利用前述共聚物，可使細胞接著後予以剝離而形成細胞凝集體(球狀體)。此外，細胞凝集體係表示細胞凝集之結果而形成的結構體，不限球狀或環狀等形狀。
(基板) 本發明中使用之細胞凝集體製造用基板可藉由將前述共聚物塗佈於基板的表面成點狀並加以乾燥而製造。此處所稱「表面」，係指與細胞或細胞培養液等內容物相接的面，尤其當基板為細胞培養容器的一部分時，係指與內容物相接的面當中的底面。
基板表面的形狀可為平面或凹凸，較佳為平面形狀。且基板可為所謂的細胞培養容器或其一部分。作為細胞培養容器，可舉出一般使用於細胞培養之培養皿、組織培養用培養盤、多用性培養盤等細胞培養皿或培養盤、細胞培養燒瓶、攪拌式燒瓶等燒瓶、塑膠包袋、Teflon(註冊商標)包袋、培養包袋等包袋、微盤、微孔盤、多用性盤、多用性孔盤等盤、細胞培養玻片、管子、托盤、轉瓶等瓶罐等。
基板的材質可舉出例如玻璃、金屬、含金屬化合物或含半金屬化合物、活性碳或樹脂。金屬可舉出典型金屬：(鋁族元素：Al、Ga、In；鐵族元素：Fe、Co、Ni；鉻族元素：Cr、Mo、W、U；錳族元素：Mn、Re；貴金屬：Cu、Ag、Au等。含金屬化合物或者含半金屬化合物可舉出例如基本成分為金屬氧化物且因高溫之熱處理而燒結之燒結體之陶瓷、如矽之半導體、金屬氧化物或半金屬氧化物(矽氧化物、氧化鋁等)、金屬碳化物或半金屬碳化物、金屬氮化物或半金屬氮化物(矽氮化物等)、金屬硼化物或半金屬硼化物等無機化合物之成形體等之無機固體材料、鋁、鎳鈦、不鏽鋼(SUS304、SUS316、SUS316L等)。
作為樹脂，可為天然樹脂或者其衍生物，或合成樹脂之任一者，作為天然樹脂或者其衍生物，較佳使用纖維素、三乙酸纖維素(CTA)、硝基纖維素(NC)、將葡聚糖硫酸固定化之纖維素等，作為合成樹脂，較佳使用聚丙烯腈(PAN)、聚醯亞胺(PI)、聚酯系聚合物合金(PEPA)、聚苯乙烯(PS)、聚碸(PSF)、聚對苯二甲酸乙酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯(PU)、伸乙基乙烯醇(EVAL)、聚乙烯(PE)、聚酯、聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚碸(PES)、聚碳酸酯(PC)、環烯烴聚合物(COP)、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、超高分子量聚乙烯(UHPE)、聚二甲基矽氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯樹脂(ABS)或Teflon(註冊商標)。
於製造本發明中使用之細胞凝集體製造用基板時，在將前述共聚物塗佈於基板的表面成點狀並加以乾燥之際，由於不需要高溫下的處理，亦可應用低耐熱性的樹脂等。基板的材質可為1種或2種以上之組合。
(塗點) 本發明中使用之細胞凝集體製造用基板係具備由前述共聚物所構成的多個塗點。塗點的總面積相對於基板的表面積之比例不特別限定，係例如30%以上，且各塗點的直徑係例如50～5000μm，塗點間的間隔係例如30～1000μm。塗點的形狀不特別限定，係例如類圓形、四角形形狀，較佳為類圓形之塗點。 塗點的總面積相對於基板的表面積之比例、各塗點的直徑或塗點間的間隔可依據所用細胞或基板的種類、細胞凝集體的期望大小等，由既定的範圍適宜選擇；塗點的總面積相對於基板的表面積之比例較佳為30%以上、40%以上、50%以上，且較佳為99%以下，各塗點的直徑為50～5000μm，較佳為300～3000μm；塗點間的間隔為30～1000μm，較佳為100～500μm。
藉由在具有抑制細胞附著能力之基板上，如此以高密度，較佳為規則性地配置細胞可接著的獨立微型區域(塗點)，可於一個基板(容器)一次形成多個大小均一的球狀體。與以往藉由在細胞低接著板上之非接著培養所製作的細胞凝集體相比，有規範接著面積而調整細胞凝集體的大小(可製造任意大小的細胞凝集體)等優點。
由前述共聚物所構成的塗點可藉由塗佈共聚物，較佳為包含前述共聚物之底劑而形成。底劑能以其本身週知之方法使含水溶液混於前述共聚物中來調製。此種底劑係有用於作為細胞凝集體形成促進用。
含水溶液可舉出水、生理食鹽水或磷酸緩衝溶液等含鹽水溶液，或者水或含鹽水溶液與醇類組合而成的混合溶劑。作為醇類，可舉出碳原子數2至6之醇，例如乙醇、丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇、t-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-庚醇、2-庚醇、2,2-二甲基-1-丙醇(=新戊醇)、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇(=t-戊醇)、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-3-戊醇、環戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、2,3-二甲基-2-丁醇、3,3-二甲基-1-丁醇、3,3-二甲基-2-丁醇、2-乙基-1-丁醇、2-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、3-甲基-1-戊醇、3-甲基-2-戊醇、3-甲基-3-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、4-甲基-3-戊醇及環己醇，可單獨使用或使用此等組合之混合溶劑。
再者，底劑中除前述共聚物與溶劑外，亦可視需求於不損及所得基底膜之性能的範圍內添加其他物質。其他物質可舉出pH調整劑、交聯劑、防腐劑、界面活性劑、提高與容器或基板之密著性的底塗劑、防黴劑及糖類等。
作為底劑之塗佈方式，能夠使用例如噴墨法、網版印刷法、縫塗佈法、捲對捲轉印法等，較佳為以噴墨法或網版印刷等印刷技術來進行。
作為別的塗佈方法，可採用例如視情況將未形成塗點處經保護之基板浸漬於上述底劑，及視情況將底劑添加於未形成塗點處經保護之基板(容器)，並靜置既定時間等方法；若為基板，作為一樣態為細胞培養容器時，係藉由視情況將底劑添加於未形成塗點處經保護之容器，並靜置既定時間的方法來進行。添加可例如透過使用注射器等添加容器之總容積之0.5至1倍量的底劑來進行。靜置係依據容器或基板的材質或細胞培養之底劑的種類，適宜選擇時間或溫度來實施，例如以1分鐘至24小時，較佳為5分鐘至3小時、10至80℃來實施。藉此，可製造細胞凝集體製造用基板。
又，藉由所述方法而得之基板表面的塗點可未經由乾燥步驟而直接作為細胞凝集體製造用基板使用，或者使用水或供施予細胞培養之試料的介質(例如水、緩衝液、培養基等)洗淨後，作為細胞凝集體製造用基板使用。
亦即，形成基板表面的塗點後，可於48小時以內，較佳為24小時以內，更佳為12小時以內，更佳為6小時以內，更佳為3小時以內，更佳為1小時以內未經由乾燥步驟而直接作為細胞凝集體製造用基板使用，或者使用水或供施予細胞培養之試料的介質(例如水、緩衝液、培養基等，特佳為培養基(例如DMEM培養基(達爾伯克式必需基本培養基))洗淨後，作為細胞凝集體製造用基板使用。
細胞凝集體製造用基板亦可施予乾燥步驟。乾燥步驟係於大氣下或真空下，較佳為溫度-200℃至200℃的範圍內進行。藉由乾燥步驟去除上述底劑中的溶劑，由此完全地固接於基體上。
塗點在例如室溫(10℃至35℃，較佳為20℃至30℃，例如25℃)下乾燥亦可形成，而為了更迅速地形成塗點，亦能以例如40℃至50℃加以乾燥。乾燥溫度若未達-200℃，必須使用特殊冷媒而缺乏泛用性，且為了使溶劑昇華，乾燥需要長時間而使得效率惡化。乾燥溫度若超過200℃，則會發生共聚物的熱分解。更佳之乾燥溫度為10℃至180℃，更佳之乾燥溫度為20℃至150℃。
本發明中使用之細胞凝集體製造用基板係經由以上的簡便步驟而製造。 且，為了清除殘存於塗點(塗佈膜)的雜質、未反應單體等，亦可實施以選自水及包含電解質之水溶液中至少1種溶劑來洗淨之步驟。洗淨宜為流水洗淨或超音波洗淨等。上述水及包含電解質之水溶液亦可為在例如40℃至95℃之範圍內加溫者。包含電解質之水溶液較佳為PBS、生理食鹽水(僅含氯化鈉)、Dulbecco磷酸緩衝生理食鹽水、Tris緩衝生理食鹽水、HEPES緩衝生理食鹽水及veronal緩衝生理食鹽水，特佳為PBS。固接後即使以水、PBS及醇等來洗淨，塗覆膜也不會溶出，依然強固地固接在基體上。
塗點(塗佈膜)的膜厚，最大膜厚與最小膜厚為1～1000nm的範圍，較佳為5～500nm的範圍。
本發明中使用之細胞凝集體製造用基板係使用抑制細胞附著能力之基板來製造。作為此種基板，可使用市售之經細胞低接著處理的細胞培養皿、具有抑制細胞附著能力之細胞培養器等，例如日本特開2008-61609號公報所記載之細胞培養容器，但不限定於此。或者可於前述塗點(塗佈膜)的形成前，對基板實施細胞之附著抑制處理。具有抑制細胞附著能力之基板可經由例如塗佈週知具有抑制細胞附著能力之塗覆膜形成用組成物的步驟來製造。具有抑制細胞附著能力之塗覆膜形成組成物，較佳包含將塗覆膜形成用組成物塗佈於容器或基板的表面並乾燥之步驟；該塗覆膜形成用組成物係包含含有下述式(a)所示之有機基的重複單元與含有下述式(b)所示之有機基的重複單元之共聚物(P)：
Figure 02_image025
[式中， U a11、U a12、U b11、U b12及U b13分別獨立表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，An -表示選自鹵化物離子、無機酸離子、氫氧化物離子及異硫氰酸酯離子所成群組的陰離子] 與溶劑。前述塗覆膜只要包含於基板表面的至少一部分即可，較佳塗佈整個製造細胞凝集體的表面(即存在本案之塗點的表面)，或者整個基板表面。 碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基係與上述者相同。
前述塗覆膜形成用組成物可使用例如記載於國際公開第2014/196650之塗覆膜形成用組成物。
前述塗覆膜形成用組成物之塗佈方法無特別限制，可使用一般的旋轉塗佈、浸塗佈、溶液澆鑄法等塗佈法。
前述塗覆膜之乾燥步驟係於大氣下或真空下，在溫度-200℃至180℃的範圍內進行。藉由乾燥步驟，去除上述塗覆膜形成用組成物中的溶劑，同時上述共聚物之式(a)及式(b)彼此形成離子鍵而完全地固接於基體。
前述塗覆膜在例如室溫(10℃至35℃，例如25℃)下乾燥亦可形成，而為了更迅速地形成塗覆膜，亦能以例如40℃至50℃加以乾燥。又，亦可使用採冷凍乾燥法之極低溫～低溫(-200℃至-30℃左右)下的乾燥步驟。冷凍乾燥係稱真空凍結乾燥，係通常將欲乾燥者以冷媒冷卻，於真空狀態下藉由昇華去除溶劑的方法。冷凍乾燥所使用的一般冷媒可舉出乾冰與甲醇之混合介質(-78℃)、液態氮(-196℃)等。 乾燥溫度若為-200℃以下，必須使用特殊冷媒而缺乏泛用性，且為了使溶劑昇華，乾燥需要長時間而使得效率惡化。乾燥溫度若為200℃以上，則塗覆膜表面的離子結合反應進行過度而導致該表面喪失親水性，而無法發揮抑制生物物質附著能力。更佳之乾燥溫度為10℃至180℃，更佳之乾燥溫度為25℃至150℃。
乾燥後，為了消除殘存於前述塗覆膜上之雜質、未反應單體等，甚而為了調節膜中共聚物的離子平衡，較佳以選自水及包含電解質之水溶液中的1種以上之溶劑，藉由流水洗淨或超音波洗淨等來洗淨。上述水及包含電解質之水溶液亦可為在例如40℃至95℃之範圍內加溫者。包含電解質之水溶液較佳為PBS、生理食鹽水(僅含氯化鈉)、Dulbecco磷酸緩衝生理食鹽水、Tris緩衝生理食鹽水、HEPES緩衝生理食鹽水及veronal緩衝生理食鹽水，特佳為PBS。固接後即使以水、PBS及醇等來洗淨，塗覆膜也不會溶出，會依然強固地固接在基體上。形成之塗覆膜即使附著有生物物質，其後仍能以水洗等容易地去除，形成有前述塗覆膜的基體表面係具有抑制生物物質附著能力。
前述塗覆膜的膜厚較佳為5～1000nm，更佳為5～500nm。
所稱具有抑制細胞附著能力，係指與例如未有採用以WO2016/093293之實施例所記載之方法進行之螢光顯微鏡的塗覆膜，或未經細胞低吸附處理比較時之相對吸光度(WST O.D.450nm)(%)((實施例的吸光度(WST O.D.450nm))/(比較例的吸光度(WST O.D.450nm)))為50%以下，較佳為30%以下，更佳為20%以下之意。
步驟(2) 於步驟(2)中，係對前述細胞凝集體製造用基板播種源自多潛能幹細胞之PRRX1蛋白質陽性的人類軟骨前驅細胞。
「多潛能幹細胞」係指兼具自行複製力與分化成其他多個系統之細胞的能力(多分化能力)之細胞；且「前驅細胞」係指位處由幹細胞向最終分化標的之機能細胞分化的中途之細胞。從而，源自多潛能幹細胞之人類軟骨前驅細胞係指以多潛能幹細胞作為原料細胞經誘導分化，且位處向最終分化標的之軟骨細胞分化的中途之細胞。此處作為多潛能幹細胞，可舉出例如胚性幹細胞(ES細胞)、人工多潛能幹細胞(iPS細胞)等萬能細胞(具有分化成各種體細胞及生殖系列之細胞的能力之細胞)。
再者，本發明中「人類軟骨前驅細胞」為PRRX1蛋白質陽性。PRRX1(Paired related homeobox 1)蛋白質係指具有同源域之轉錄因子的一種，於產生過程中已知會在源自側板中胚層之肢芽、或源自沿軸中胚層之頭部中胚層專一性地表現。
人類(Homo sapiens)的PRRX1基因之cDNA的鹼基序列及PRRX1蛋白質的胺基酸序列係以下述之登錄號登錄於美國國家生物技術資訊中心(NCBI; National Center for Biotechnology Information)所提供的GenBank。此外，登錄有多個修訂(revision)時，係理解為意指最新之修訂。 -　人類PRRX1基因：NM_006902(NM_006902.5)、NM_022716(NM_022716.4) -　人類PRRX1蛋白質：NP_008833(NP_008833.1)、NP_073207(NP_073207.1)
細胞為PRRX1蛋白質陽性，可藉由週知之手法來檢測。可舉出例如採藉由PRRX1基因之轉錄啟動子序列來控制其表現之報導基因的檢測、採使用對PRRX1蛋白質之專一性抗體之免疫染色的檢測等。
PRRX1蛋白質陽性之軟骨前驅細胞可例如藉由包含以下步驟之手法來製造： -　由多潛能幹細胞誘導分化側板中胚層細胞之步驟； -　在活化Wnt訊號的環境下培養藉由前述步驟所誘導分化之細胞，而調製肢芽間葉系細胞之步驟； -　在活化Wnt訊號的環境下培養藉由前述步驟所調製之肢芽間葉系細胞，而調製軟骨前驅細胞之步驟。
於前述手法中，作為原料細胞使用之多潛能幹細胞，可使用例如胚性幹細胞(ES細胞)、人工多潛能幹細胞(iPS細胞)等。ES細胞及iPS細胞可使用新製作者或既已確立者。
於前述手法中，係首先由多潛能幹細胞誘導分化側板中胚層細胞。由多潛能幹細胞誘導分化側板中胚層細胞之手段，可採用週知之手段。可採用例如依循文獻：Loh et al, 2016, Cell, 451-467所記載之方法的方法。具體而言，係首先由多潛能幹細胞向原始線條(Mid-primitive streak)進行誘導分化，接著進行由原始線條向側板中胚層細胞的誘導分化。
側板中胚層細胞經誘導分化，可藉由檢測例如側板中胚層細胞之專一性標記之HAND1蛋白質的表現來確認。
其次，在活化Wnt訊號的環境下培養經誘導分化之側板中胚層細胞，而向屬PRRX1蛋白質陽性之源自側板中胚層的PRRX1陽性細胞誘導分化。此外，為了降低先前培養環境的影響，較佳以PBS緩衝液等適宜進行洗淨後在活化Wnt訊號的環境下進行培養。
由側板中胚層細胞向肢芽間葉系細胞的誘導分化又較佳在FGF2等FGF訊號活化劑的未存在下進行，更佳在活化Wnt訊號的環境下進行，且於選自TGFβ訊號抑制劑、BMP訊號抑制劑及刺蝟訊號抑制劑所成群組的1種、2種或3種的存在下進行，再更佳在TGFβ訊號抑制劑、BMP訊號抑制劑、TGFβ訊號抑制劑及刺蝟訊號抑制劑的存在下進行。
在活化Wnt訊號的環境下的培養可藉由在例如有效量之Wnt訊號活化劑的存在下進行培養來進行。Wnt訊號活化劑係供增強由Wnt所媒介之訊號傳遞(尤為正準Wnt路徑)者。Wnt訊號活化劑可舉出GSK3β抑制劑、Wnt家族蛋白質等。例如作為GSK3β抑制劑，可舉出CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)、XAV939(3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one)、LiC1等。Wnt訊號活化劑使用CHIR99021時，其添加量可採例如0.1～20μM左右，較佳為1～10μM。
BMP訊號抑制劑係供抑制(阻礙)由BMP所媒介之訊號傳遞者。BMP訊號抑制劑可舉出LDN193189(4-[6-[4-(1-Piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline)或其鹽(例如鹽酸鹽)、DMH-1等，其添加量可採例如0.1～10μM左右，較佳為0.2～5μM。 TGFβ訊號抑制劑係供抑制(阻礙)由TGFβ所媒介之訊號傳遞者。TGFβ訊號活化劑可舉出A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-碳硫醯胺)、SB431542等，其添加量可採例如0.1～10μM左右，較佳為0.2～5μM。 刺蝟訊號抑制劑係供抑制(阻礙)由刺蝟所媒介之訊號傳遞者。刺蝟訊號活化劑可舉出維莫德吉(Vismordegib)、環巴胺、索尼得吉等，其添加量可採例如10nM～1μM左右，較佳為50nM～500nM左右。
培養可例示在約37℃左右及二氧化碳濃度約5%左右的條件下進行培養之手法，但不限定於此。上述條件下的培養可使用例如週知之CO 2恆溫箱控制溫度及CO 2濃度而同時進行。
培養能以二維細胞培養(平面培養)來進行。二維細胞培養可對培養器具視需求實施促進細胞之接著的塗覆處理來進行。
進行活化Wnt訊號的環境下之培養的時間不特別限定，可採例如6小時～4天左右，較佳為1天～3天左右，更佳為2天左右(48小時左右)。可視需求進行培養基的更換。培養條件較佳依循常用方法。
於培養時，可視需求進行繼代。進行繼代時，係於達到全滿狀態前或達到全滿狀態後隨即回收細胞，並將細胞播種於新的培養基。又，亦可適宜更換培養基。
培養基較佳使用IMDM培養基、F12培養基或其混合培養基等無血清培養基。可於不含動物來源成分的狀態下誘導分化以及維持培養。又，可對前述無血清培養基添加鏈黴素、青黴素等抗菌藥、非必需胺基酸(NEAA)、ROCK抑制劑(例如Y-27632((R)-(+)-trans-N-(4-Pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide・2HCl))、胰島素等激素、運鐵蛋白、白蛋白等蛋白質、脂質、聚乙烯醇、單硫代甘油等的各種培養基添加物。
其次，在活化Wnt訊號的環境下培養調製之肢芽間葉系幹細胞，而向屬PRRX1蛋白質陽性的軟骨前驅細胞誘導分化。此外，活化Wnt訊號的環境下係與上述同義。又，由肢芽間葉系細胞向軟骨前驅細胞的誘導分化較佳進一步在FGF2等FGF訊號活化劑的存在下進行。
如此，即製成PRRX1蛋白質陽性之軟骨前驅細胞。具體的實施樣態係如後述實施例所記載。且亦可參照國際公開第2021/054449號之記載。又，如此所得之軟骨前驅細胞可於同一批次中經擴大培養，且可於一定的品質管理條件下儲存。
人類軟骨前驅細胞向前述細胞凝集體製造用基板的播種能以將細胞作成懸浮於培養基，例如後續步驟(3)中之培養所使用之培養基的細胞懸浮液，並將其添加於前述細胞凝集體製造用基板等其本身週知之方法來實施。
步驟(3) 於步驟(3)中，係培養源自多潛能幹細胞之PRRX1蛋白質陽性的人類軟骨前驅細胞而作成細胞凝集體。 培養只要是可由前述人類軟骨前驅細胞作成細胞凝集體之手法則不特別限定，可依據人類軟骨前驅細胞的性質等適宜選擇。
例如源自多潛能幹細胞之PRRX1蛋白質陽性之人類軟骨前驅細胞的培養較佳於活化Wnt訊號的環境下，及/或抑制TGFβ訊號的環境下進行。
活化Wnt訊號的環境下的培養可藉由在例如有效量之Wnt訊號活化劑的存在下進行培養來進行。Wnt訊號活化劑係供增強由Wnt所媒介之訊號傳遞(尤為正準Wnt路徑)者。Wnt訊號活化劑可舉出GSK3β抑制劑、Wnt家族蛋白質等。例如GSK3β抑制劑可舉出CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)、 XAV939(3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one)、LiC1等。Wnt訊號活化劑使用CHIR99021時，其添加量可採例如0.1～20μM左右，較佳為1～10μM。
抑制TGFβ訊號的環境下的培養可藉由在例如有效量之TGFβ訊號抑制劑的存在下進行培養來進行。TGFβ訊號抑制劑係供抑制(阻礙)由TGFβ所媒介之訊號傳遞者。TGFβ訊號抑制劑可舉出A-83-01(3-(6-methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazol-1- carbothioamide)、SB431542(4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide)等。TGFβ訊號抑制劑使用A-83-01時，其添加量可採例如0.1～10μM左右，較佳為0.2～5μM。
培養可例示在約37℃左右及二氧化碳濃度約5%左右的條件下進行培養之手法，但不限定於此。上述條件下的培養可使用例如週知之CO 2恆溫箱控制溫度及CO 2濃度而同時進行。
進行培養的時間不特別限定，可採例如6小時～4天左右，較佳為1天～3天左右，更佳為2天左右(48小時左右)。可視需求進行培養基的更換。培養條件較佳依據常用方法。
培養基較佳使用IMDM培養基、F12培養基、或其混合培養基等無血清培養基。可於不含動物來源成分的狀態下誘導分化及維持培養。又可對前述無血清培養基添加鏈黴素、青黴素等抗菌藥、非必需胺基酸(NEAA)、ROCK抑制劑(例如Y-27632)、EGF、FGF等細胞生長因子、胰島素等激素、運鐵蛋白、白蛋白等蛋白質、脂質、聚乙烯醇、單硫代甘油等的各種培養基添加物。
如此，即由人類軟骨前驅細胞製成細胞凝集體。具體的實施樣態係如後述實施例所記載。
透過利用步驟(1)中所提供之具備由特定共聚物所構成的多個塗點之細胞凝集體製造用基板，可使細胞接著於塗點後予以剝離而形成細胞凝集體。此外，細胞凝集體係表示細胞凝集之結果而形成的結構體，不限球狀或環狀等形狀。與以往藉由在細胞低接著板上之非接著培養所製作的細胞凝集體相比，有規範接著面積而調整細胞凝集體的大小(可製造任意大小的細胞凝集體)等優點。
步驟(4) 於步驟(4)中，係培養前述步驟中所得之細胞凝集體而作成軟骨組織。 培養只要是可由前述細胞凝集體作成軟骨組織之手法則不特別限定，可依據由前述人類軟骨前驅細胞所得之細胞凝集體的性質等適宜選擇。
例如，由源自多潛能幹細胞之PRRX1蛋白質陽性之人類軟骨前驅細胞所得之細胞凝集體的培養較佳以包含在活化Wnt訊號的環境下進行培養之步驟的方法來進行。
活化Wnt訊號的環境下的培養可藉由在例如有效量之Wnt訊號活化劑的存在下進行培養來進行。Wnt訊號活化劑係供增強由Wnt所媒介之訊號傳遞(尤為正準Wnt路徑)者。Wnt訊號活化劑可舉出GSK3β抑制劑、Wnt家族蛋白質等。例如GSK3β抑制劑可舉出CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)、XAV939(3,5,7,8-Tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one)、LiC1等。Wnt訊號活化劑使用CHIR99021時，其添加量可採例如0.1～20μM左右，較佳為1～10μM。
且，培養較佳以多階段進行。具體而言，較佳以 (i)在Wnt訊號活性劑的存在下且FGF訊號活化劑的存在下進行培養之步驟，其次， (ii)在FGF訊號活化劑的存在下(且較佳為在Wnt訊號活化劑的未存在下)進行培養之步驟，其次， (iii)較佳為在Wnt訊號活化劑的未存在下且FGF訊號活化劑的未存在下進行培養之步驟 之3階段進行。
活化FGF訊號的環境下的培養可藉由在例如有效量之FGF訊號活化劑的存在下進行培養來進行。FGF訊號活化劑係供增強纖維芽細胞成長因子(FGF)訊號傳遞者。FGF訊號活化劑可舉出FGF1/aFGF、FGF2/bFGF等。FGF訊號活化劑使用FGF2時，其添加量可採例如0.1～100ng/mL左右，較佳為1～50ng/mL。
以前述3階段進行培養時，步驟(i)及步驟(ii)能以二維細胞培養(平面培養)或三維培養來進行。二維細胞培養可對培養器具視需求實施促進細胞之接著的塗覆處理來進行。步驟(iii)較佳以三維培養來進行。此外，於各階段的培養期間，為了減少先前培養環境的影響，係以用PBS緩衝液等適當進行洗淨後再進行培養為佳。
培養可於供儲存細胞及培養基的合宜容器中進行。作為進行合宜之培養的手法，可例示在約37℃左右及二氧化碳濃度約5%左右的條件下進行培養之手法，但不限定於此。上述條件下的培養可使用例如週知之CO 2恆溫箱控制溫度及CO 2濃度而同時進行。
進行活化Wnt訊號的環境下之培養的期間，於不損及本發明之效果的範圍，不特別限定。例如可採2小時～12天左右、4天～8天左右。又以多階段進行培養時，例如以前述3階段進行培養時，步驟(i)及步驟(ii)可分別採2小時～12天左右、4天～8天左右；步驟(iii)可採2小時～60天左右、8天～54天左右。可視需求於培養期間中進行培養基的更換。培養條件較佳依循常用方法。
於培養時，可視需求進行繼代。進行繼代時，係於達到全滿狀態前或達到全滿狀態後隨即回收細胞，並將細胞播種於新的培養基。
步驟(4)之培養中所使用的培養基不特別限定。培養基可使用IMDM培養基、F12培養基或其混合培養基等無血清培養基，甚而可使用其中添加有L-抗壞血酸、ITS(胰島素-運鐵蛋白-亞硒酸鈉培養基補充品)、GDF5及/或BMP4等的週知之軟骨誘導培養基。又，亦可視需求添加鏈黴素、青黴素等抗菌藥、非必需胺基酸(NEAA)、ROCK抑制劑(例如、Y-27632)、EGF、TGFβ等細胞生長因子、胰島素等激素、運鐵蛋白、白蛋白等蛋白質、脂質、聚乙烯醇、單硫代甘油等週知之各種培養基添加物。
再者，步驟(4)之培養中所使用的培養基較佳含有瓊脂或含瓊脂培養基組成物。
瓊脂係由瓊脂糖與瓊脂果膠所構成，瓊脂果膠係瓊脂糖部分經硫酸酯化或由甲氧基、丙酮酸基、羧基所取代者；就此等構成成分的比率不予限制，亦可僅由瓊脂糖構成。又，瓊脂糖經羥乙基化的低熔點瓊脂糖、透過選擇原料海藻或藉由實施羥乙基化等所調製而成的低熔點瓊脂，甚而對溫水亦顯示高溶解性的即溶性瓊脂等亦包含於本發明中的「瓊脂」。
於本發明中，工業上製造之粉末狀、片狀或固態之瓊脂因純度高且品質均一，而能夠合宜地使用。又，於醫藥品、食品等領域，可使用具有一般所使用之具有各種性質狀態、物性者，可使用重量平均分子量為10,000～60,000的低分子量瓊脂、重量平均分子量超過60,000且為100,000以下左右的低凝膠強度之低強度瓊脂、重量平均分子量為290,000左右的高分子量瓊脂等。作為所述瓊脂，可利用市售製品，可使用例如由伊那食品工業股份有限公司販售之「Ultra Kanten Ina」、「Ultra Kanten AX-30」、「Ultra Kanten AX-100」、「S-6」、「S-7」等。
於本發明中，較佳使用重量平均分子量為10,000～60,000，且分子量低於一般的瓊脂之瓊脂(以下於本說明書中有稱為「低分子瓊脂」)。低分子瓊脂的重量平均分子量係如上述為10,000～60,000，更佳為20,000～60,000，再更佳為30,000～60,000，再佳為40,000～60,000，再佳為43,000～60,000，特佳為43,000～50,000。使用重量平均分子量未達10,000之瓊脂時，不易獲得使細胞分散之效果。另一方面，使用重量平均分子量超過60,000之瓊脂時，則細胞或組織在培養基中的分散不均，而無法獲得充分的生長促進效果。
再者，本發明中所使用之低分子瓊脂較佳為分子量分布較小者；以瓊脂的重量平均分子量(Mw)除以數量平均分子量(Mn)而得之值所得到的分子量分布(Mw/Mn)較佳為1.1～8.0，更佳為1.5～7.0，再更佳為2.0～6.0，再佳為2.5～5.5，特佳為3.5～5.0。
此外，瓊脂的上述重量平均分子量及數量平均分子量可藉由採高效液相層析法(HPLC)的凝膠滲透層析法來測定。
前述低分子瓊脂可藉由採用一般的瓊脂之酸處理予以低分子化，或者對在由石花菜、龍鬚菜、擬雞毛菜等海藻之萃取步驟時，或經過前述萃取步驟或者過濾步驟之任一者的瓊脂進行酸處理等週知之方法來製造，惟低分子瓊脂亦可使用市售製品，例如上述之「Ultra Kanten Ina」(伊那食品工業股份有限公司製)等。
可直接將前述瓊脂作為培養基添加物添加至前述步驟(4)中所使用之培養基，或將包含前述瓊脂的培養基組成物，以前述步驟(4)中所使用之培養基稀釋來實施培養。此種含瓊脂培養基組成物可使用例如「SphereMAX(商標)」(日產化學股份有限公司製)等。且，瓊脂及含瓊脂培養基組成物之進一步之具體樣態係記載於國際公開第2016/167373號。
瓊脂的含量，相對於步驟(4)中所使用之培養基的總量較佳為0.005(w/v)%以上且未達2(w/v)%，更佳為0.03(w/v)%以上且未達2(w/v)%，再更佳為0.03(w/v)%～1(w/v)%，再佳為0.03(w/v)%～0.1(w/v)%。培養基中之瓊脂的含量若為0.005(w/v)%以上，不會形成過大的細胞凝集體地生長，可看出細胞的生長促進效果。又，培養基中之瓊脂的含量若為0.03(w/v)%以上，則可獲得細胞或組織的均勻分散而更佳。另一方面，培養基組成物中之瓊脂的含量若為2(w/v)%以上，由於在室溫下會凝膠化而不易操作處理。
如此，即製成軟骨組織。獲得軟骨組織，可藉由例如番紅O染色、愛爾新藍染色、番紅O染色或甲苯胺藍染色為陽性等來確認。
＜軟骨組織的使用＞ 本發明又有關於一種方法，其係人類之關節軟骨損傷之治療方法，其特徵為將藉由本發明之製造方法而得之軟骨組織移植至關節軟骨的損傷或缺損部位。於此，軟骨組織之製造方法的具體樣態或較佳樣態係如上述。又，移植可對關節軟骨的損傷或缺損部位植入1個或多個藉由本發明之製造方法而得之軟骨組織來實施。 [實施例]
[調製例1] (細胞凝集體製造用基板的調製) 於具有抑制細胞附著能力之培養盤(直徑：35mm) (Sumitomo Bakelite股份有限公司，MS9035X)的培養表面中央部之1.5cm見方的範圍，使用液滴突出裝置(MICROJET corporation，BioSpot BT600)逐次適量地以格子狀向上下左右隔開300μm之間隔地滴加2-(N,N-二甲胺基)乙基甲基丙烯酸酯與甲基丙烯酸之共聚物(2-(N,N-二甲胺基乙基)甲基丙烯酸酯相對於全單體的莫耳比率為90%)的水溶液後，將液滴於室溫下乾燥15分鐘使其固著化，而調製成具有350個細胞可接著之獨立的直徑100～1000μm之圓形塗點區的細胞凝集體製造用基板。
[調製例2] (PRRX1蛋白質陽性之人類軟骨前驅細胞的調製) 將人類iPS細胞(由3×10 4：京都大學iPS細胞研究所所提供之414C2細胞株)懸浮於含有10μM CultureSure(註冊商標)Y-27632(Fujifilm Wako Pure Chemical(股))及4μL之iMatrix-511(Nippi(股))的1mL之StemFit(註冊商標) (AJINOMOTO HEALTHY SUPPLY AJINOMOTO HEALTHY SUPPLY AJINOMOTO HEALTHY SUPPLY(股))，予以添加至35mm的培養皿中。隔天，將培養基更換為不含Y-27632之新的StemFit(註冊商標)。培養2天後，以細胞PBS洗淨，依各階段更換為具有以下組成的培養基，而依序向原始線條(mid-primitive streak)、側板中胚層細胞(LPM)、肢芽間葉系細胞(LBM)誘導分化。
・原始線條誘導分化培養基組成： 無血清培養基：50%IMDM培養基(Gibco)+50%F12培養基(Gibco)+1mg/mL聚乙烯醇(Sigma-Aldrich)+1%(v/v)脂質濃縮物(Gibco)+450μM單硫代甘油(Sigma-Aldrich) +0.7μg/mL胰島素(Sigma-Aldrich)+15μg/mL運鐵蛋白(Sigma-Aldrich)+1%(v/v)青黴素/鏈黴素(Gibco)(下稱「CDM2 basal medium」) 30ng/mL活化素A 40ng/mL BMP4 6μM CHIR99021 100nM PIK90(Funakoshi(股)) 10μM Y-27632
・側板中胚層(LPM)誘導分化培養基組成： CDM2 basal medium 1μM A-83-01 30ng/mL BMP4 1μM C59 10μM Y-27632
・肢芽間葉系細胞(LBM)誘導分化培養基組成： CDM2 basal medium 1μM A-83-01 0.5μM LDN-193189 3μM CHIR99021 150nM 維莫德吉 10μM Y-27632
其次，使用Accutase(Thermo Fisher Scientific)將所得LBM細胞剝離，並將2×10 5個細胞懸浮於含有16μL之iMatrix-511(Nippi(股))的下述人類軟骨前驅細胞誘導分化培養基，並添加至60mm的培養皿中。每隔2天將培養基更換為新的人類軟骨前驅細胞誘導分化培養基，誘導分化成人類軟骨前驅細胞。細胞係於達半滿前，同樣地進行繼代。
・人類軟骨前驅細胞誘導分化培養基組成： CDM2 basal medium 1μM A-83-01 3μM CHIR99021 20ng/mL FGF2 20ng/mL EGF 10μM Y-27632
[實施例1] (細胞凝集體的作成) 對調製例1中所得之培養盤播種以1mL之培養基(CDM2 basal medium+3μM CHIR99021+1μM A-83-01+20ng/ mL EGF+20ng/mL FGF)懸浮之調製例2中所得之1×10 6個人類軟骨前驅細胞(下稱「ExpLBM細胞」)，於37℃進行培養。4小時後進行培養基更換。培養基更換2天後確認形成細胞凝集體。將結果示於圖1。
(軟骨組織的作成) 剝離所得細胞凝集體，移至ultra low attachment plate(6 well)(Corning公司製＃3471)。移動之細胞凝集體係以培養基1進行處理6天(day0～day6：培養基組成係如下述記載)，於day6之時間點更換為培養基2並進行處理6天，(day6～day12：培養基組成係如下述記載)，其後更換為培養基3進行培養42天(day12～day54：培養基組成係如下述記載)，而得到軟骨組織。將結果示於圖2及圖3。圖2為實體顯微鏡照片，圖3為藉由倒立顯微鏡以亮視野進行拍攝而得的照片。
培養基組成 培養基1：CDM2 basal medium+3μM CHIR99021+ 10ng /mL FGF2+50μg/mL 抗壞血酸+1×ITS+4%含低分子瓊脂培養基組成物 培養基2：CDM2 basal medium+10ng/mL FGF2+50μg/ mL抗壞血酸+30ng/mL BMP4+10ng/mL TGFβ 1+10ng/mL GDF5+1×ITS+0.04%含低分子瓊脂培養基組成物 培養基3：CDM2 basal medium+50μg/mL 抗壞血酸+30ng/mL BMP4+10ng/mL TGFβ 1+10ng/mL GDF5+1×ITS+ 0.04%含低分子瓊脂培養基組成物 前述含低分子瓊脂培養基組成物係依循國際公開第2016/167373之試驗例10所調製的含低分子瓊脂培養基組成物。
(軟骨組織的觀察) 將形成之軟骨組織以4%PFA固定，作成組織切片並以蘇木精(HE)、愛爾新藍及番紅O進行染色的結果分別示於圖4。染色條件如下。 ・HE染色條件 於去石蠟後以Eosin進行1分鐘的染色，其次以蘇木精對標本進行處理20分鐘而進行核染色。 ・愛爾新藍染色條件 於去石蠟後對標本以1%愛爾新藍/3%乙酸進行處理20分鐘，以3%乙酸進行洗淨後，以蘇木精對標本進行處理20分鐘而進行核染色。 ・番紅O染色條件 於去石蠟後以魏格特氏鐵蘇木素(Weigert’s iron hematoxylin)溶液進行10分鐘染色。其次以堅牢綠溶液進行5分鐘染色後，以1%乙酸進行洗淨。其次以0.1%番紅O溶液進行5分鐘染色。
[評定例1] 以活檢圓鋸對SCID大鼠(supplied by the National BioResource Project - Rat, Tokyo University(Tokyo, Japan))的膝關節軟骨開孔(長徑1.5mm，深約1mm)，壓入移植實施例1中所製作之軟骨組織(3個)。移植4週後採取組織片，進行各種組織染色(HE染色、番紅O、甲苯胺藍染色)。將結果示於圖5。如圖5所示，可看出移植物植入於缺損部，且可知於同部位形成了透明軟骨。 [產業上可利用性]
本發明之製造方法能以經品質管理之軟骨前驅細胞為原料，並進行誘導分化處理而作成軟骨組織，而且製作之軟骨組織中不含軟骨細胞以外的細胞，因此在將軟骨組織安全地使用於再生醫療上係屬有利。再者，藉由在既定的培養條件下進行從軟骨前驅細胞至軟骨組織的製作，可有效地使細胞生長，同時由少數的細胞作成大型軟骨組織片，於成本面亦屬有利。
[圖1]為形成於實施例1中所得之細胞凝集體製造用基板之細胞凝集體的全體影像(左上)與放大影像(左下)，及藉由其紅色螢光蛋白質(tdTomato)表現而顯形之細胞凝集體的全體影像(右上)與放大影像(右下)。 [圖2]為實施例1中所得之軟骨組織的實際狀態顯微鏡照片。 [圖3]為實施例1中所得之軟骨組織的倒立顯微鏡照片(亮視野)。 [圖4]為經蘇木精(HE)染色(左)、愛爾新藍及染色(中央)或番紅O染色(右)之實施例1中所得之軟骨組織之組織切片的影像。 [圖5]為評定例1中，實施例1中所得之軟骨組織經移植4週後所採取之組織片經HE染色(左)、番紅O染色(中央)或甲苯胺藍染色(右)後的影像。

Claims (6)

  1. 一種軟骨組織之製造方法，其特徵為包含：提供細胞凝集體製造用基板之步驟，該細胞凝集體製造用基板係於具有抑制細胞附著能力之基板上，具備包含衍生自下述式(I)所示之單體的重複單元及衍生自下述式(II)所示之單體的重複單元之共聚物所構成的多個塗點；對該基板播種源自多潛能幹細胞之PRRX1蛋白質陽性的人類軟骨前驅細胞之步驟；培養該細胞而作成細胞凝集體之步驟；培養該凝集體而作成軟骨組織之步驟；
    Figure 03_image001
    [式中， U a1及U a2分別獨立表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，R a1表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，R a2表示碳原子數1至5之直鏈或者分支伸烷基]；
    Figure 03_image003
    [式中， R b表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基]。
  2. 如請求項1之製造方法，其中衍生自式(I)所示之單體的重複單元相對於衍生自上述式(I)所示之單體的重複單元及衍生自上述式(II)所示之單體的重複單元之合計的莫耳比率為99莫耳%～51莫耳%。
  3. 如請求項1或2之製造方法，其中上述共聚物進一步包含衍生自下述式(III)所示之單體的結構單元；
    Figure 03_image005
    [式中， R c及R d分別獨立表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，R e表示碳原子數1至5之直鏈或者分支伸烷基，n表示1～50的數]。
  4. 如請求項1～3中任一項之製造方法，其中上述具有抑制細胞附著能力之基板係於其表面的至少一部分包含塗覆膜，該塗覆膜係包含共聚物(P)，該共聚物(P)係包含含有下述式(a)所示之基的重複單元與含有下述式(b)所示之基的重複單元；
    Figure 03_image007
    [式中， U a11、U a12、U b11、U b12及U b13分別獨立表示氫原子或碳原子數1至5之直鏈或者分支烷基，An -表示選自鹵化物離子、無機酸離子、氫氧化物離子及異硫氰酸酯離子所成群組的陰離子]。
  5. 如請求項1～4中任一項之製造方法，其中作成軟骨組織之步驟中的培養係以含有瓊脂的培養基來實施。
  6. 如請求項5之製造方法，其中瓊脂的重量平均分子量為10,000～60,000，瓊脂的含量相對於培養基的總量為0.005(w/v)%以上且未達2(w/v)%。
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