WO2023127778A1 - 細胞培養用足場材料 - Google Patents

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WO2023127778A1
WO2023127778A1 PCT/JP2022/047836 JP2022047836W WO2023127778A1 WO 2023127778 A1 WO2023127778 A1 WO 2023127778A1 JP 2022047836 W JP2022047836 W JP 2022047836W WO 2023127778 A1 WO2023127778 A1 WO 2023127778A1
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acrylic copolymer
peptide
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PCT/JP2022/047836
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悠平 新井
大悟 小林
祥人 新井
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積水化学工業株式会社
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    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to scaffold materials for cell culture.
  • Animal cells such as human, mouse, rat, pig, cow, and monkey are used in research and development in the academic, drug discovery, and regenerative medicine fields.
  • Adhesive proteins such as laminin and vitronectin, and natural polymer materials such as matrigel derived from mouse sarcoma are used as scaffold materials for culturing animal cells.
  • Patent Document 1 discloses a cell culture article coated with a composition containing a polymer in which an acrylic polymer and a polypeptide are bound.
  • a hydrophilic acrylic polymer obtained by polymerizing a hydrophilic acrylic monomer is used as the acrylic polymer.
  • Patent Document 2 discloses a coating composition for adhesive cell culture in which a water-insoluble polymer compound is dissolved in a lower alcohol or a mixed solvent of a lower alcohol and water.
  • Patent Document 2 describes a copolymer of a (meth)acrylic acid derivative chemically modified with a peptide and a hydrophilic acrylate compound as the water-insoluble polymer compound. Further, as the above copolymer, a copolymer having a relatively high hydrophilic acrylate compound content is used.
  • cell culture scaffolding materials using peptide-bound acrylic copolymers are known. Cells can be cultured in a liquid medium using a scaffold material that has been processed or molded into a predetermined shape.
  • An object of the present invention is to provide a scaffold material for cell culture that can maintain the culture stability of cells for a long period of time.
  • a scaffold material for cell culture according to the first invention of the present application is a peptide-containing (meth)acrylic copolymer having a (meth)acrylic copolymer portion and a peptide portion bound to the (meth)acrylic copolymer portion.
  • a peptide-containing (meth)acrylic copolymer having a (meth)acrylic copolymer portion and a peptide portion bound to the (meth)acrylic copolymer portion.
  • the signal detected is The retention time of the peak top of the main peak having the largest area is 5 minutes or more and 30 minutes or less.
  • a scaffold material for cell culture according to the second invention of the present application is a peptide-containing (meth)acrylic copolymer having a (meth)acrylic copolymer portion and a peptide portion bound to the (meth)acrylic copolymer portion.
  • the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is measured by high performance liquid chromatography under the following condition 2, including coalescence, the retention time of the peak top of the main peak with the largest area among the signals detected , 5 minutes or more and 30 minutes or less.
  • the first and second inventions of the present application may be collectively referred to as the present invention.
  • the (meth)acrylic copolymer portion is a (meth)acrylate compound (A) represented by the following formula (A1) or the following formula (A2) It has a structural unit derived from
  • R represents a hydrocarbon group having 2 or more and 18 or less carbon atoms.
  • R represents a hydrocarbon group having 2 or more and 18 or less carbon atoms.
  • the (meth)acrylic copolymer portion is derived from a (meth)acrylate compound (B) having a functional group capable of reacting with an amino group or a carboxyl group.
  • the peptide portion is bound to a functional group capable of reacting with the amino group or the carboxyl group.
  • a structural unit derived from the (meth)acrylate compound (A) is contained in 100 mol% of the total structural units of the (meth)acrylic copolymer portion. ratio is 25 mol % or more and 98 mol % or less.
  • the peptide-containing (meth)acrylic copolymer has a number average molecular weight of 5000 or more.
  • the content of the peptide moiety in the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is 0.5 mol% or more and 25 mol% or less.
  • the peptide portion has an RGD sequence.
  • the present invention it is possible to provide a scaffold material for cell culture that can maintain the culture stability of cells over a long period of time.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view schematically showing a cell culture vessel according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view schematically showing a cell culture microcarrier according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows phase-contrast micrographs 24 hours, 48 hours, and 72 hours after cell seeding when cell culture was performed using the cell culture scaffold materials obtained in Examples 1 and 8 and Comparative Example 2. be.
  • scaffolding material for cell culture may be abbreviated as “scaffolding material”.
  • a scaffolding material according to a first invention of the present application includes a peptide-containing (meth)acrylic copolymer having a (meth)acrylic copolymer portion and a peptide portion bonded to the (meth)acrylic copolymer portion. .
  • the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is measured by high performance liquid chromatography under the following condition 1, the peak top of the main peak with the largest area among the signals is not detected within a retention time of 4 minutes.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • the scaffold material contains components other than the peptide-containing (meth)acrylic copolymer
  • an isolated peptide-containing (meth)acrylic copolymer is used as the measurement sample.
  • the scaffold material coated on a culture vessel or the like is immersed in ethanol, and the peptide-containing (meth)acrylic copolymer dissolved in the ethanol is measured. Used as a sample.
  • measuring instruments examples include HPLC apparatus (manufactured by Shimadzu Corporation, high-pressure gradient HPLC system Prominence), HPLC column (manufactured by Waters, XBridge (registered trademark) C18 [inner diameter 3.0 mm x length 150 mm, filler particle size 3 .5 ⁇ m]) and an evaporative light scattering detector (ELSD_LTII manufactured by Shimadzu Corporation) can be used. Analysis can be performed, for example, by the following procedure.
  • a 0.1% by weight formic acid aqueous solution is used as mobile phase A (liquid A), and isopropyl alcohol is used as mobile phase B (liquid B).
  • the inside of the HPLC apparatus was filled with a mixed solvent of mobile phase A/mobile phase B at a volume ratio of 7/3.
  • the measurement sample injection amount: 20 ⁇ L
  • the proportion of mobile phase B is increased at a constant rate over 15 minutes so that the proportion of mobile phase B in the mobile phase becomes 100% by volume.
  • the mobile phase B is allowed to flow for 15 minutes.
  • the column temperature is 40° C., and the total flow rate is 0.3 mL/min.
  • Nitrogen gas is used as the nebulizer gas for the evaporative light scattering detector.
  • the gas supply pressure is 350 kPa and the drift tube temperature is 40°C.
  • the baseline can be determined by analyzing a blank test solution prepared in the same manner as the analysis sample preparation except that the scaffold material is dissolved.
  • a scaffolding material according to a second invention of the present application includes a peptide-containing (meth)acrylic copolymer having a (meth)acrylic copolymer portion and a peptide portion bonded to the (meth)acrylic copolymer portion.
  • the main peak with the largest area among the signals detected when the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is measured by high performance liquid chromatography under the following condition 2
  • the retention time of the peak top of is 5 minutes or more and 30 minutes or less.
  • condition 2 the high-performance liquid chromatography measurement (HPLC measurement) of condition 2 can be performed in the same manner as condition 1 except for the following points.
  • the volume ratio of the mobile phase A is 100%, and the volume ratio of the mobile phase A is constant at 100% for 0 to 2 minutes. From 2 minutes to 5 minutes, the proportion of mobile phase B is increased at a constant rate so that the volume ratio of mobile phase A/mobile phase B is 90%/10% at 5 minutes. From 5 minutes to 17 minutes, the proportion of mobile phase B is increased at a constant rate so that the volume ratio of mobile phase B becomes 100% at 17 minutes. From 17 minutes to 30 minutes, mobile phase B is allowed to flow at a constant volume ratio of 100%. Other points are the same as the condition 1.
  • first and second inventions of the present application may be implemented individually as described above, or may be implemented in combination.
  • first invention and the second invention may be collectively referred to as the present invention.
  • the scaffolding material according to the present invention has the above configuration, it is possible to maintain cell culture stability over a long period of time.
  • the hydrophobicity is relatively high as measured by HPLC and the hydrophobicity is adjusted appropriately.
  • the material is difficult to separate from the container or the like. Therefore, with the scaffolding material according to the present invention, even if the cells are cultured for a long period of time, the growth speed of the cells is unlikely to decrease.
  • the scaffold material according to the present invention can have good solubility in alcohol solvents such as ethanol. Therefore, for example, a scaffolding material layer having a predetermined shape is formed on the surface of the container by applying a coating solution in which the scaffolding material is dissolved in ethanol to the surface of the container and then evaporating the ethanol. can be made Since the scaffolding material has good solubility in an alcohol solvent, the concentration of the scaffolding material in the coating solution can be increased, so that a thick scaffolding material layer can be formed.
  • the scaffold material according to the present invention does not require the use of natural polymer materials such as extracellular matrix (ECM), it is inexpensive, has small lot-to-lot variations, and is excellent in safety.
  • ECM extracellular matrix
  • the retention time of the peak top of the main peak with the largest area among the detected signals is preferably More than 4 minutes, more preferably 5 minutes or more, still more preferably 10 minutes or more, even more preferably 15 minutes or more, and particularly preferably 24 minutes or more.
  • the peak top retention time is at least the lower limit, the hydrophobicity of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer can be further increased, and the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the retention time of the peak top may be within 30 minutes, but may exceed 30 minutes. If the main peak is not detected even after 30 minutes, the retention time of the peak top exceeds 30 minutes. Further, in the first invention of the present application, the retention time of the peak top exceeds 4 minutes.
  • the retention time of the peak top of the main peak with the largest area among the detected signals is preferably 2 minutes or more, more preferably 5 minutes or more, still more preferably 8 minutes or more, still more preferably 10 minutes or more, even more preferably 15 minutes or more, particularly preferably 18 minutes or more, preferably 30 minutes or less, more preferably 28 minutes or less, more preferably 27 minutes or less, even more preferably 26 minutes or less, and most preferably 25 minutes or less.
  • the peak top retention time is at least the lower limit, the hydrophobicity of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer can be further increased, and the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the retention time of the peak top is equal to or less than the upper limit, the solubility in an alcohol solvent such as ethanol can be further improved, so that the coatability and workability can be further improved.
  • the retention time of the peak top is 5 minutes or more and 30 minutes or less.
  • the retention time of the peak top in the main peak with the largest area among the detected signals is, for example, peptide-containing (meth)acrylic It can be adjusted by the structure of the polymer, the molecular weight, and the like. Specifically, as described later, the ratio of hydrophobic (meth)acrylate compounds in the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is increased, or the molecular weight of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is moderately increased.
  • the retention time can be lengthened by, for example,
  • (meth)acrylic means one or both of “acrylic” and “methacrylic”
  • (meth)acrylate is a combination of “acrylate” and “methacrylate”. means one or both.
  • the scaffolding material includes a peptide-containing (meth)acrylic copolymer.
  • the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is a (meth)acrylic copolymer to which a peptide is bound.
  • the peptide-containing (meth)acrylic copolymer has a (meth)acrylic copolymer portion and a peptide portion bonded to the (meth)acrylic copolymer portion. Only one kind of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • the (meth)acrylic copolymer portion preferably has a structural unit derived from a (meth)acrylate compound (A) represented by the following formula (A1) or the following formula (A2). This can further increase the hydrophobicity of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer.
  • the (meth)acrylate compound (A) may contain a (meth)acrylate compound represented by the following formula (A1), and contains a (meth)acrylate compound represented by the following formula (A2).
  • the (meth)acrylate compound (A) contains both a (meth)acrylate compound represented by the following formula (A1) and a (meth)acrylate compound represented by the following formula (A2)
  • the following formula R in (A1) and R in the following formula (A2) may be the same or different. Only one type of the (meth)acrylate compound (A) may be used, or two or more types may be used in combination. Further, each of the (meth)acrylate compound represented by the following formula (A1) and the (meth)acrylate compound represented by the following formula (A2) may be used alone, or two or more may be used in combination. may
  • R represents a hydrocarbon group having 2 or more and 18 or less carbon atoms.
  • R represents a hydrocarbon group having 2 or more and 18 or less carbon atoms.
  • Each of R in the above formula (A1) and R in the above formula (A2) may be an aliphatic hydrocarbon group or an aromatic hydrocarbon group. From the viewpoint of further increasing the solubility of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer, each of R in formula (A1) and R in formula (A2) is preferably an aliphatic hydrocarbon group. .
  • the aliphatic hydrocarbon group may be linear, may have a branched structure, may have a double bond, or may not have a double bond.
  • Each of R in the above formula (A1) and R in the above formula (A2) may be an alkyl group or an alkylene group.
  • the number of carbon atoms of R in the above formula (A1) and the number of carbon atoms of R in the above formula (A2) are each preferably 4 or more, more preferably 6 or more, still more preferably 8 or more, particularly preferably 10 or more, and preferably is 16 or less, more preferably 14 or less, and most preferably 12.
  • the number of carbon atoms is at least the lower limit, the hydrophobicity of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer can be further increased.
  • the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is measured by HPLC under the above condition 1 or condition 2, the retention time of the peak top of the main peak with the largest area among the detected signals is increased. be able to.
  • the number of carbon atoms is equal to or less than the upper limit
  • the peptide-containing (meth) acrylic copolymer is measured by HPLC under the above conditions 1 or 2
  • the main peak with the largest area among the signals detected The peak top retention time can be made smaller.
  • the solubility of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer in alcoholic solvents such as ethanol can be further improved, so that the coatability and processability can be further improved.
  • the number of carbon atoms is 12, the effects of the present invention can be exhibited even more effectively, and coatability and workability can be further enhanced.
  • the content of structural units derived from the (meth)acrylate compound (A) in 100 mol% of all structural units in the (meth)acrylic copolymer portion is preferably 25 mol% or more, more preferably 30 mol%. More preferably 40 mol% or more, particularly preferably 50 mol% or more, preferably 98 mol% or less, more preferably 95 mol% or less, still more preferably 90 mol% or less, particularly preferably 80 mol% or less .
  • the content of structural units derived from the (meth)acrylate compound (A) in 100 mol% of all structural units in the (meth)acrylic copolymer portion is preferably 25 mol% or more and 98 mol% or less, and more It is preferably 30 mol % or more and 95 mol % or less, more preferably 40 mol % or more and 90 mol % or less, and particularly preferably 50 mol % or more and 80 mol % or less.
  • the hydrophobicity of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer can be further increased.
  • the retention time of the peak top of the main peak with the largest area among the detected signals is increased. be able to.
  • the content rate is equal to or less than the upper limit
  • the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is measured by HPLC under the above conditions 1 or 2
  • the main peak with the largest area among the signals detected The peak top retention time can be made smaller.
  • the solubility of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer in alcoholic solvents such as ethanol can be further improved, so that the coatability and processability can be further improved.
  • the (meth)acrylic copolymer portion preferably has a structural unit derived from a (meth)acrylate compound (B) having a functional group capable of reacting with an amino group or a carboxyl group.
  • the (meth)acrylate compound (B) may have a functional group capable of reacting with an amino group, may have a functional group capable of reacting with a carboxyl group, or may have a functional group capable of reacting with an amino group. and a functional group capable of reacting with a carboxyl group. Only one type of the (meth)acrylate compound (B) may be used, or two or more types may be used in combination.
  • Examples of the functional group capable of reacting with the amino group or carboxyl group include a carboxyl group, a thiol group, an amino group, a cyano group, and the like.
  • the peptide moiety is preferably bound to a functional group capable of reacting with the amino group or carboxyl group. More specifically, it is preferable that the carboxyl group or amino group of the amino acid that constitutes the peptide moiety is bonded to a functional group capable of reacting with the amino group or carboxyl group.
  • the functional group capable of reacting with the amino group or carboxyl group is preferably a carboxyl group or an amino group.
  • the (meth)acrylate compound (B) preferably has a carboxyl group or an amino group.
  • Examples of the (meth)acrylate compound (B) include (meth)acrylic acid, 3-butenoic acid, 4-pentenoic acid, 5-hexenoic acid, 6-heptenoic acid, 7-octenoic acid, benzeneacrylic acid, (meth) Acryloyloxyethyl succinate, (meth) acryloyloxyethyl phthalate, (meth) acryloyloxypropyl succinate, (meth) acryloyloxypropyl phthalate, (meth) acryloyloxyethyl hexahydrosuccinate, (meth) acryloyl roxyethylhexahydrophthalic acid, (meth)acryloyloxypropylhexahydrosuccinic acid, and (meth)acryloyloxypropylhexahydrophthalic acid.
  • the (meth)acrylate compound (B) includes (meth)acrylic acid, (meth)acryloyloxyethyl succinic acid, (meth)acryloyloxypropylsuccinic acid, (meth)acryloyloxyethylhexahydrosuccinic acid, (meth) Acryloyloxypropylhexahydrosuccinic acid or butenoic acid is preferred, and (meth)acrylic acid is more preferred. In this case, the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the content of structural units derived from the (meth)acrylate compound (B) in 100 mol% of all structural units in the (meth)acrylic copolymer portion is preferably 2 mol% or more, more preferably 5 mol%. Above, more preferably 10 mol % or more, preferably 75 mol % or less, more preferably 70 mol % or less, still more preferably 60 mol % or less.
  • the content is at least the lower limit, the solubility of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer in an alcohol solvent can be further enhanced.
  • the content is equal to or less than the upper limit, it becomes easier to maintain the culture stability of cells over a long period of time.
  • the content is preferably 50 mol% or more, more preferably 65 mol% or more, still more preferably 80 mol% or more, still more preferably 90 mol% or more, particularly preferably 95 mol% or more, most preferably 100 mol%. is.
  • the total content may be 100 mol % or less, or may be 90 mol % or less.
  • the (meth)acrylic copolymer part is a (meth)acrylate compound different from both the (meth)acrylate compound (A) and the (meth)acrylate compound (B) as long as it does not contradict the object of the present invention. It may contain a structural unit derived from. In addition, the (meth)acrylic copolymer portion may contain a structural unit derived from a vinyl compound copolymerizable with a (meth)acrylate compound, as long as it does not contradict the object of the present invention.
  • the content of structural units derived from the (meth)acrylate compound (A) in the (meth)acrylic copolymer portion and the content of structural units derived from the (meth)acrylate compound (B) are determined by NMR ( nuclear magnetic resonance).
  • the peptide portion is a structural portion derived from a peptide.
  • the peptide portion has an amino acid sequence.
  • the peptide constituting the peptide portion may be an oligopeptide or a polypeptide. Only one kind of the above peptides may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • the number of amino acid residues in the peptide portion is preferably 3 or more, more preferably 4 or more, still more preferably 5 or more, preferably 10 or less, more preferably 8 or less, still more preferably 6 or less. is.
  • the number of amino acid residues is equal to or more than the lower limit and equal to or less than the upper limit, the adhesion to cells after seeding can be further enhanced, and the cell proliferation rate can be further enhanced.
  • the number of amino acid residues in the peptide portion may exceed 10 or may exceed 15.
  • the peptide portion preferably has a cell-adhesive amino acid sequence.
  • the cell-adhesive amino acid sequence refers to an amino acid sequence whose cell-adhesive activity has been confirmed by the phage display method, sepharose beads method, or plate coating method.
  • the phage display method for example, the method described in "The Journal of Cell Biology, Volume 130, Number 5, September 1995 1189-1196" can be used.
  • Sepharose beads method for example, the method described in "Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Vol. 45, No. 15 (2000) 2477” can be used.
  • the plate coating method for example, the method described in "Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Vol. 45, No. 15 (2000) 2477” can be used.
  • cell-adhesive amino acid sequences include the RGD sequence (Arg-Gly-Asp), the YIGSR sequence (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), the PDSGR sequence (Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), HAV sequence (His-Ala-Val), ADT sequence (Ala-Asp-Thr), QAV sequence (Gln-Ala-Val), LDV sequence (Leu-Asp-Val), IDS sequence (Ile-Asp-Ser), REDV sequence (Arg-Glu-Asp-Val), IDAPS sequence (Ile-Asp-Ala-Pro-Ser), KQAGDV sequence (Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), and TDE sequence (Thr-Asp- Glu) and the like.
  • amino acid sequences for cell adhesion include ⁇ Pathophysiology, Vol. 66, 1992”, and the like.
  • the peptide portion may have only one type of the cell-adhesive amino acid sequence, or may have two or more types.
  • the cell-adhesive amino acid sequence preferably has at least one of the cell-adhesive amino acid sequences described above, more preferably has at least an RGD sequence, a YIGSR sequence, or a PDSGR sequence, and has an RGD sequence. is more preferred, and having at least the RGD sequence represented by the following formula (1) is particularly preferred. In this case, the adhesion to cells after seeding can be further enhanced, and the growth rate of cells can be further enhanced.
  • X represents Gly, Ala, Val, Ser, Thr, Phe, Met, Pro, or Asn.
  • the peptide portion may be linear or may have a cyclic peptide backbone.
  • the cyclic peptide skeleton is a cyclic skeleton composed of a plurality of amino acids. From the viewpoint of more effectively exerting the effect of the present invention, the cyclic peptide skeleton is preferably composed of 4 or more amino acids, preferably composed of 5 or more amino acids, and 10 or less. is preferably composed of the amino acids of
  • the content of the peptide portion is preferably 0.5 mol% or more, more preferably 1 mol% or more, still more preferably 5 mol% or more, preferably 25 mol%. Below, more preferably 20 mol % or less, still more preferably 15 mol % or less.
  • the content rate (mol %) of the peptide moiety is the amount of the peptide moiety with respect to the sum of the amounts of each structural unit constituting the peptide-containing (meth)acrylic copolymer.
  • the content of the peptide portion can be measured, for example, by NMR (nuclear magnetic resonance).
  • the number average molecular weight of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is preferably 5,000 or more, more preferably 10,000 or more, still more preferably 50,000 or more, preferably 5,000,000 or less, more preferably 2,500,000 or less, and still more preferably 1,000,000 or less. be.
  • the number average molecular weight is at least the lower limit, the solubility of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer in water can be further reduced, and the effects of the present invention can be exhibited more effectively. can.
  • the number average molecular weight is equal to or less than the upper limit, the solubility in alcohol solvents can be further enhanced.
  • the number average molecular weight of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer can be measured, for example, by the following method.
  • the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is dissolved in tetrahydrofuran (THF) to prepare a 0.2% by weight solution of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer.
  • THF tetrahydrofuran
  • APC system manufactured by Waters
  • the method for producing the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is not particularly limited.
  • the peptide-containing (meth)acrylic copolymer can be produced, for example, as follows.
  • a (meth)acrylate copolymer is obtained by polymerizing a monomer mixture containing the (meth)acrylate compound (A) and the (meth)acrylate compound (B). The resulting (meth)acrylate copolymer is reacted with a peptide to obtain a peptide-containing (meth)acrylic copolymer.
  • the scaffold material is used for culturing cells.
  • the scaffolding material is used as a scaffold for cells when the cells are cultured.
  • the above cells include animal cells such as humans, mice, rats, pigs, cows, and monkeys.
  • examples of the above-mentioned cells include somatic cells, such as stem cells, progenitor cells and mature cells.
  • the somatic cells may be cancer cells.
  • stem cells examples include somatic stem cells, embryonic stem cells, and the like. germline stem cells, mGS cells, and the like.
  • the above-mentioned mature cells include nerve cells, cardiomyocytes, retinal cells, hepatocytes, and the like.
  • the scaffold material is preferably used for two-dimensional culture (flat culture), three-dimensional culture or suspension culture of cells, more preferably used for two-dimensional culture (flat culture) or three-dimensional culture. is more preferably used for
  • the scaffold material is preferably used for serum-free medium culture. Since the scaffold material contains the peptide-containing (meth)acrylic copolymer, it is possible to increase cell adhesion even in serum-free medium culture that does not contain feeder cells or adhesion proteins. can increase the initial fixation rate of Moreover, since the scaffold material contains the peptide-containing (meth)acrylic copolymer, the effects of the present invention can be exhibited even in serum-free medium culture.
  • the content of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer in 100% by weight of the scaffold material is preferably 90% by weight or more, more preferably 95% by weight or more, still more preferably 97.5% by weight or more, and particularly preferably is 99% by weight or more, most preferably 100% by weight (total amount).
  • the content of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer is at least the lower limit, the effects of the present invention can be exhibited more effectively.
  • the content of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer in 100% by weight of the scaffold material may be 100% by weight or less, or may be 98% by weight or less.
  • the scaffold material may contain components other than the peptide-containing (meth)acrylic copolymer.
  • Components other than the peptide-containing (meth)acrylic copolymer include polyolefin resins, polyether resins, polyvinyl alcohol resins, polyesters, epoxy resins, polyamide resins, polyimide resins, polyurethane resins, polycarbonate resins, polysaccharides, cellulose, poly Examples include peptides, synthetic peptides, and the like.
  • the scaffold material preferably does not substantially contain animal-derived raw materials. By not containing animal-derived raw materials, it is possible to provide a scaffold material that is highly safe and has little variation in quality during production.
  • the expression "substantially free of animal-derived raw materials” means that the content of animal-derived raw materials in the scaffold material is 3% by weight or less.
  • the content of animal-derived raw materials in the scaffolding material is preferably 1% by weight or less, and most preferably 0% by weight. That is, it is most preferable that the scaffolding material does not contain animal-derived raw materials at all.
  • the shape of the scaffolding material is not particularly limited.
  • the shape of the scaffolding material may be particulate, fibrous, porous, or membranous.
  • the scaffolding material is preferably a resin film.
  • the resin film is preferably a resin film formed of the scaffolding material.
  • the resin film is a film-like scaffolding material.
  • the thickness of the resin film is not particularly limited.
  • the average thickness of the resin film may be 10 nm or more, 50 nm or more, 500 nm or more, 1000 ⁇ m or less, or 500 ⁇ m or less.
  • the cell culture vessel has the resin film described above on at least part of the cell culture region.
  • the cell culture vessel includes a vessel body and the resin film, and the resin membrane is disposed on the surface of the vessel body.
  • the resin film is preferably a membranous scaffolding material, and is preferably a scaffolding material layer.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view schematically showing a cell culture vessel according to one embodiment of the present invention.
  • the cell culture container 1 includes a container body 2 and a resin film 3.
  • a resin film 3 is arranged on the surface 2 a of the container body 2 .
  • a resin film 3 is arranged on the bottom surface of the container body 2 .
  • the container body may include a first container body and a second container body such as a cover glass on the bottom surface of the first container body.
  • the first container body and the second container body may be separable.
  • the resin film 3 may be arranged on the surface of the second container body.
  • a conventionally known container body can be used as the container body.
  • the shape and size of the container body are not particularly limited. Examples of the container body include 2- to 384-well plates, single-layer flasks, multi-layer flasks, multi-layer flasks, dishes, roller bottles, bags, insert cups, microchannel chips, and the like.
  • the material of the container body is not particularly limited, but examples include synthetic resin, metal, and glass.
  • examples of the synthetic resin include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyethersulfone, polycarbonate, polyester, polyisoprene, cycloolefin polymer, polyimide, polyamide, polyamideimide, (meth)acrylic resin, epoxy resin, and silicone.
  • a cell culture microcarrier (hereinafter sometimes abbreviated as "microcarrier") comprises a substrate particle and a coating layer that coats the outer surface of the substrate particle, and the coating layer is the scaffold It is preferably made of material.
  • the covering layer is preferably a scaffolding material layer.
  • substrate particles conventionally known substrate particles used in microcarriers can be used. Examples of the substrate particles include resin particles.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view schematically showing a cell culture microcarrier according to one embodiment of the present invention.
  • the coating layer 7 is arranged on the surface of the substrate particles 6 and is in contact with the surfaces of the substrate particles 6 .
  • the coating layer 7 covers the entire outer surface of the substrate particles 6 .
  • Cells can be cultured using the scaffold material, the resin film, and the microcarrier.
  • the cell culture method is a cell culture method using the scaffold material.
  • the cell culture method is preferably a cell culture method using the resin film, and preferably a cell culture method using the microcarrier. Examples of the cells include the cells described above.
  • the method for culturing cells preferably includes a step of seeding cells on the scaffold material.
  • the method for culturing cells preferably includes a step of seeding cells on the resin film.
  • the method for culturing cells preferably includes the step of seeding cells on the microcarriers.
  • the cells may be cell clusters.
  • the cell mass can be obtained by adding a cell detachment agent to a confluent culture vessel and homogenizing the cells by pipetting.
  • the cell detachment agent is not particularly limited, an ethylenediamine/phosphate buffer solution is preferable.
  • the size of the cell aggregates is preferably 50 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the structural unit content and the peptide portion content in the obtained peptide-containing (meth)acrylic copolymer were determined by dissolving the copolymer in DMSO-d6 (dimethyl sulfoxide), followed by 1H- Measured by NMR (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy).
  • Example 1 Preparation of peptide-containing (meth)acrylic copolymers: An acrylic monomer solution was obtained by dissolving 4.5 parts by weight of butyl acrylate and 7.0 parts by weight of acrylic acid in 27 parts by weight of tetrahydrofuran. 0.0575 parts by weight of Irgacure 184 (manufactured by BASF) was dissolved in the obtained acrylic monomer solution, and the resulting solution was applied onto a PET film. A (meth)acrylic copolymer solution is obtained by irradiating the coated material at 25° C.
  • a cyclic peptide having an amino acid sequence of Arg-Gly-Asp-Phe-Lys as a peptide (5 amino acid residues, Arg and Lys combine to form a cyclic skeleton, Phe is a D-form, c- described as RGDfK) was prepared.
  • 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride was prepared as a condensing agent.
  • a first solution was prepared by dissolving 50 parts by weight of the (meth)acrylic copolymer and 10 parts by weight of the peptide in 1000 parts by weight of DMF (N,N-dimethylformamide).
  • a condensing agent 1 part by weight was mixed with 1000 parts by weight of DMF to prepare a second solution.
  • the first solution and the second solution were mixed to prepare a solution containing a (meth)acrylic copolymer, a peptide and a condensing agent.
  • the resulting solution is reacted at 40° C. for 2 hours to dehydrate and condense the carboxyl group in the structural unit derived from acrylic acid of the (meth)acrylic copolymer with the amino group of Lys of the peptide to form a peptide-containing (meth)
  • a solution containing an acrylic copolymer was obtained.
  • Preparation of coating liquid The resulting solution containing the peptide-containing (meth)acrylic copolymer was diluted 100-fold with DMF and added dropwise at a rate of 0.3 mL/min to a column packed with an ion-exchange resin (manufactured by Organo) for washing. . The washed solution was vacuum-dried at 60° C. for 3 hours, and the dried product was dissolved in ethanol to obtain a coating liquid containing the peptide-containing (meth)acrylic copolymer and ethanol. The content of the peptide-containing (meth)acrylic copolymer in the coating liquid was 0.1% by weight.
  • Preparation of cell culture vessel After coating each well of a 6-well plate with 20 ⁇ L of the obtained coating liquid by cast coating, ethanol was removed by vacuum drying at 60° C. for 3 hours. Thus, a cell culture vessel was obtained in which a resin film (membrane-like scaffolding material) formed of the scaffolding material was placed on the bottom surface of each well.
  • Examples 2 to 10 and Comparative Examples 1 to 6 A peptide-containing (meth)acrylic copolymer having the structure shown in Tables 1 to 3 was obtained in the same manner as in Example 1, except that the type and amount of the (meth)acrylate compound were changed.
  • a cell culture vessel was obtained in the same manner as in Example 1, except that the obtained peptide-containing (meth)acrylic copolymer was used.
  • light acrylate MMG-A, manufactured by Kyoeisha Chemical Co., Ltd., methoxy-triethylene glycol acrylate
  • Comparative Example 7 the peptide-containing (meth)acrylic copolymer was used instead. Synthemax vitronectin substrate (manufactured by Corning Inc.) was used.
  • Peak top retention time (Condition 1) The HPLC measurement under condition 1 was performed as follows, and the retention time of the peak top of the main peak having the largest area among the detected signals was determined.
  • an HPLC apparatus manufactured by Shimadzu Corporation, high-pressure gradient HPLC system Prominence
  • an HPLC column manufactured by Waters, XBridge (registered trademark) C18 [inner diameter 3.0 mm ⁇ length 150 mm, filler particle diameter 3.5 ⁇ m ]
  • an evaporative light scattering detector ELSD_LTII manufactured by Shimadzu Corporation
  • a 0.1% by weight formic acid aqueous solution was used as mobile phase A (liquid A), and isopropyl alcohol was used as mobile phase B (liquid B).
  • the inside of the HPLC apparatus was filled with a mixed solvent of mobile phase A/mobile phase B at a volume ratio of 7/3.
  • the measurement sample injection volume: 20 ⁇ L
  • the proportion of mobile phase B was increased at a constant rate over 15 minutes so that the proportion of mobile phase B in the mobile phase reached 100% by volume.
  • mobile phase B was run for 15 minutes.
  • the column temperature was set to 40° C., and the total liquid flow rate was set to 0.3 mL/min.
  • Nitrogen gas was used as the nebulizer gas for the evaporative light scattering detector.
  • the gas supply pressure was 350 kPa and the drift tube temperature was 40°C.
  • the baseline was determined by analyzing a blank test solution prepared in the same manner as the analysis sample preparation except that the scaffold material was dissolved.
  • Peak top retention time (Condition 2) The HPLC measurement under condition 2 was performed in the same manner as under condition 1 except for the following points, and the retention time of the peak top of the main peak with the largest area among the detected signals was determined.
  • the analysis was performed according to the following procedure.
  • the volume ratio of the mobile phase A was 100%, and the volume ratio of the mobile phase A was constant at 100% for 0 to 2 minutes. From 2 minutes to 5 minutes, the proportion of mobile phase B was increased at a constant rate so that the volume ratio of mobile phase A/mobile phase B was 90%/10% at 5 minutes. From 5 minutes to 17 minutes, the proportion of mobile phase B was increased at a constant rate so that the volume ratio of mobile phase B reached 100% at 17 minutes. From 17 minutes to 30 minutes, the mobile phase B was flowed at a constant volume ratio of 100%.
  • phosphate-buffered saline 1 mL was added to the obtained cell culture vessel and allowed to stand in an incubator at 37°C for 1 hour, after which the phosphate-buffered saline was removed from the cell culture vessel.
  • a cell suspension containing 5 ⁇ 10 4 cells (manufactured by Lonza, human adipose-derived mesenchymal stem cells, model number: PT-5006) was prepared in 1.5 mL of liquid medium. This cell suspension was seeded into each well of a 6-well plate. Then, the 6-well plate was shaken left and right 5 times, placed in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 concentration, and cultured.
  • T1 and T2 are as follows. Calculated by the formula.
  • T1 24log2/(log(N(48)/N(24))
  • T2 24log2/(log(N(72)/N(48))
  • T1 Cell doubling time 24 hours to 48 hours after seeding
  • T2 Cell doubling time 48 hours to 72 hours after seeding
  • N(24) Number of cells (cells) 24 hours after seeding
  • N (48) number of cells (cells) 48 hours after seeding
  • N (72) number of cells (cells) 72 hours after seeding
  • T1/T2 The ratio of T1 to T2 (T1/T2) was calculated from the doubling time (T1) and the doubling time (T2). Cell culture stability was evaluated according to the following criteria. A larger ratio (T1/T2) means that the growth speed of cells is not decreased.
  • the ratio (T1/T2) is 0.9 or more ⁇ :
  • the ratio (T1/T2) is 0.7 or more and less than 0.9 ⁇ :
  • the ratio (T1/T2) is less than 0.7
  • FIG. 3 shows phase-contrast micrographs 24 hours, 48 hours, and 72 hours after cell seeding when cell culture was performed using the cell culture scaffold materials obtained in Examples 1 and 8 and Comparative Example 2.
  • the ratio (T1/T2) was 0.85
  • the ratio (T1/T2) was 0.99
  • the ratio (T1/T2) was was 0.5.
  • Solubility in Ethanol The solubility of the obtained scaffold material in ethanol was measured by the following method. The scaffold material was mixed with ethanol and stirred at 60° C. After 30 minutes, the presence or absence of undissolved scaffold material and the transparency of the solution were visually confirmed. The solubility was defined as the maximum solution concentration at which the scaffold material did not remain undissolved and the solution became transparent. The solubility in ethanol was evaluated according to the following criteria.
  • Solubility is 1% by weight or more
  • Solubility is 0.1% by weight or more and less than 1% by weight
  • Solubility is less than 0.1% by weight
  • SYMBOLS 1 Vessel for cell culture 2
  • Vessel body 2a Surface 3
  • Resin film 5 Microcarrier for cell culture 6
  • Substrate particle 7 Coating layer

Landscapes

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Abstract

細胞の培養安定性を長期間に亘って維持することができる細胞培養用足場材料を提供する。　本発明に係る細胞培養用足場材料は、（メタ）アクリル共重合体部と、前記（メタ）アクリル共重合体部に結合したペプチド部とを有するペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含み、下記の条件１で前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の高速液体クロマトグラフィー測定をしたときに、シグナルの中で最も面積の大きいメインピークのピークトップが保持時間４分以内に検出されない。　［条件１］　カラム：Ｃ１８（内径３．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、充填剤粒径３．５μｍ）　カラム温度：４０℃　流量：０．３ｍＬ／分　検出器：蒸発光散乱検出器　移動相Ａ（Ａ液）：０．１重量％ギ酸水溶液　移動相Ｂ（Ｂ液）：イソプロピルアルコール　保持時間０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝７０％／３０％　保持時間０分～１５分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝７０％／３０％から０％／１００％に変化　保持時間１５分～３０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝０％／１００％を維持

Description

細胞培養用足場材料
　本発明は、細胞培養用足場材料に関する。
　学術分野、創薬分野及び再生医療分野等の研究開発において、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ及びサル等の動物細胞が用いられている。動物細胞を培養するために用いられる足場材料として、ラミニン及びビトロネクチン等の接着タンパク質、並びにマウス肉腫由来のマトリゲル等の天然高分子材料が用いられている。
　また、合成樹脂を用いた足場材料、及びペプチドが結合した合成樹脂を用いた足場材料も知られている。
　下記の特許文献１には、アクリルポリマーとポリペプチドとが結合したポリマーを含む組成物が被覆された細胞培養用物品が開示されている。特許文献１では、上記アクリルポリマーとして、親水性アクリルモノマーが重合した親水性アクリルポリマーが用いられている。
　下記の特許文献２には、水不溶性高分子化合物を低級アルコール又は低級アルコールと水との混合溶媒に溶解させた接着性細胞培養用被覆組成物が開示されている。特許文献２には、上記水不溶性高分子化合物として、ペプチドで化学修飾された（メタ）アクリル酸誘導体と、親水性アクリレート化合物との共重合体が記載されている。また、上記共重合体として、親水性アクリレート化合物の含有率が比較的多い共重合体が用いられている。
ＷＯ２０１２／１５８２３５Ａ２ 特開平５－２９２９５７号公報
　特許文献１，２に記載のように、ペプチドが結合したアクリル共重合体を用いた細胞培養用足場材料が知られている。所定の形状に加工又は成形等された足場材料を用いて、液体培地中で細胞を培養することができる。
　しかしながら、特許文献１，２に記載のような従来の足場材料では、親水性の比較的大きいアクリル共重合体が用いられているので、細胞培養中に足場材料が液体培地中へ徐々に溶出したり、細胞培養中に足場材料が容器等から剥離したりしやすい。そのため、特許文献１，２に記載のような従来の足場材料では、細胞の培養日数が増えるにしたがって、細胞の増殖スピードが低下するなど、細胞の培養安定性が低下しやすい。
　本発明の目的は、細胞の培養安定性を長期間に亘って維持することができる細胞培養用足場材料を提供することである。
　本願の第１の発明に係る細胞培養用足場材料は、（メタ）アクリル共重合体部と、前記（メタ）アクリル共重合体部に結合したペプチド部とを有するペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含み、下記の条件１で前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の高速液体クロマトグラフィー測定をしたときに、シグナルの中で最も面積の大きいメインピークのピークトップが保持時間４分以内に検出されない。
　［条件１］
　カラム：Ｃ１８（内径３．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、充填剤粒径３．５μｍ）
　カラム温度：４０℃
　流量：０．３ｍＬ／分
　検出器：蒸発光散乱検出器
　移動相Ａ（Ａ液）：０．１重量％ギ酸水溶液
　移動相Ｂ（Ｂ液）：イソプロピルアルコール
　保持時間０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝７０％／３０％
　保持時間０分～１５分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝７０％／３０％から０％／１００％に変化
　保持時間１５分～３０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝０％／１００％を維持
　本願の第１の発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記条件１で前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の高速液体クロマトグラフィー測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間が、５分以上３０分以内である。
　本願の第２の発明に係る細胞培養用足場材料は、（メタ）アクリル共重合体部と、前記（メタ）アクリル共重合体部に結合したペプチド部とを有するペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含み、下記の条件２で前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の高速液体クロマトグラフィー測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間が、５分以上３０分以内である。
　［条件２］
　カラム：Ｃ１８（内径３．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、充填剤粒径３．５μｍ）
　カラム温度：４０℃
　流量：０．３ｍＬ／分
　検出器：蒸発光散乱検出器
　移動相Ａ（Ａ液）：０．１ｗｔ／ｖｏｌギ酸メタノール
　移動相Ｂ（Ｂ液）：ＴＨＦ／イソプロピルアルコール＝７／３（体積比）
　保持時間０分～２分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝１００％／０％を維持
　保持時間２分～５分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝１００％／０％から９０％／１０％に変化
　保持時間５分～１７分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝９０％／１０％から０％／１００％に変化
　保持時間１７分～３０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝０％／１００％を維持
　以下、本願の第１の発明及び第２の発明を総称して本発明と称する場合があるものとする。
　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記（メタ）アクリル共重合体部が、下記式（Ａ１）又は下記式（Ａ２）で表される（メタ）アクリレート化合物（Ａ）に由来する構造単位を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　前記式（Ａ１）中、Ｒは、炭素数が２以上１８以下の炭化水素基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　前記式（Ａ２）中、Ｒは、炭素数が２以上１８以下の炭化水素基を表す。
　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記（メタ）アクリル共重合体部が、アミノ基又はカルボキシル基と反応可能な官能基を有する（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）に由来する構造単位を有し、前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体において、前記ペプチド部が、前記アミノ基又はカルボキシル基と反応可能な官能基と結合している。
　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記（メタ）アクリル共重合体部の全構造単位１００モル％中、前記（メタ）アクリレート化合物（Ａ）に由来する構造単位の含有率が、２５モル％以上９８モル％以下である。
　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の数平均分子量が、５０００以上である。
　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体において、前記ペプチド部の含有率が、０．５モル％以上２５モル％以下である。
　本発明に係る細胞培養用足場材料のある特定の局面では、前記ペプチド部が、ＲＧＤ配列を有する。
　本発明によれば、細胞の培養安定性を長期間に亘って維持することができる、細胞培養用足場材料を提供することができる。
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞培養用容器を模式的に示す断面図である。 図２は、本発明の一実施形態に係る細胞培養用マイクロキャリアを模式的に示す断面図である。 図３は、実施例１，８及び比較例２で得られた細胞培養用足場材料を用いて細胞培養を行った際の細胞の播種後２４時間、４８時間及び７２時間の位相差顕微鏡写真である。
　以下、本発明の詳細を説明する。なお、本明細書において、「細胞培養用足場材料」を「足場材料」と略記することがある。
　本願の第１の発明に係る足場材料は、（メタ）アクリル共重合体部と、上記（メタ）アクリル共重合体部に結合したペプチド部とを有するペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含む。本願の第１の発明に係る足場材料では、下記の条件１でペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の高速液体クロマトグラフィー測定をしたときに、シグナルの中で最も面積の大きいメインピークのピークトップが保持時間４分以内に検出されない。
　［条件１］
　カラム：Ｃ１８（内径３．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、充填剤粒径３．５μｍ）
　カラム温度：４０℃
　流量：０．３ｍＬ／分
　検出器：蒸発光散乱検出器
　移動相Ａ（Ａ液）：０．１重量％ギ酸水溶液
　移動相Ｂ（Ｂ液）：イソプロピルアルコール
　保持時間０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝７０％／３０％
　保持時間０分～１５分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝７０％／３０％から０％／１００％に変化
　保持時間１５分～３０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝０％／１００％を維持
　具体的には、条件１の高速液体クロマトグラフィー測定（以下、「高速液体クロマトグラフィー」を「ＨＰＬＣ」と略記することがある）は、例えば、以下のようにして行うことができる。
　まず、測定サンプルは、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を、０．１重量％ギ酸水溶液及びイソプロピルアルコールの混合液（０．１重量％ギ酸水溶液／イソプロピルアルコール＝７／３［体積比］）を溶媒として濃度：２ｍｇ／ｍＬに調整することにより得ることができる。
　なお、足場材料中にペプチド含有（メタ）アクリル共重合体以外の成分が含まれる場合は、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を単離したものを測定サンプルとして用いる。また、足場材料が培養容器等にコーティングされた状態である場合は、培養容器等にコーティングされた足場材料をエタノール中に浸漬させ、該エタノールに溶解したペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を測定サンプルとして用いる。
　測定機器としては、例えば、ＨＰＬＣ装置（島津製作所社製、高圧グラジエントＨＰＬＣシステム　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）、ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ社製、ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）　Ｃ１８［内径３．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、充填剤粒径３．５μｍ］）、蒸発光散乱検出器（島津製作所社製、ＥＬＳＤ＿ＬＴＩＩ）を用いることができる。分析は、例えば、以下の手順で行うことができる。
　移動相Ａ（Ａ液）として０．１重量％ギ酸水溶液を使用し、移動相Ｂ（Ｂ液）としてイソプロピルアルコールを使用する。測定開始時はＨＰＬＣ装置内部を移動相Ａ／移動相Ｂが体積比で７／３の混合溶媒で満たした状態である。この状態で上記測定サンプル（注入量：２０μＬ）を注入する。そして、サンプル注入直後から１５分かけて移動相中の移動相Ｂの割合が体積比で１００％になるように一定速度で移動相Ｂの割合を増加させる。１５分後（この時点で移動相は完全に移動相Ｂに置換される）から１５分間は、移動相Ｂを流す。カラム温度は４０℃とし、送液流量は総流量０．３ｍＬ／分とする。
　蒸発光散乱検出器のネブライザーガスとしては、窒素ガスを使用する。ガス供給圧力は３５０ｋＰａとし、ドリフトチューブ温度は４０℃とする。なお、ベースラインの決定は、足場材料を溶解すること以外は、分析サンプルの調製と同様の方法で準備した空試験液を分析して行うことができる。
　本願の第２の発明に係る足場材料は、（メタ）アクリル共重合体部と、上記（メタ）アクリル共重合体部に結合したペプチド部とを有するペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含む。本願の第２の発明に係る足場材料では、下記の条件２でペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の高速液体クロマトグラフィー測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークのピークトップの保持時間が、５分以上３０分以内である。
　［条件２］
　カラム：Ｃ１８（内径３．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、充填剤粒径３．５μｍ）
　カラム温度：４０℃
　流量：０．３ｍＬ／分
　検出器：蒸発光散乱検出器
　移動相Ａ（Ａ液）：０．１ｗｔ／ｖｏｌギ酸メタノール
　移動相Ｂ（Ｂ液）：ＴＨＦ／イソプロピルアルコール＝７／３（体積比）
　保持時間０分～２分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝１００％／０％を維持
　保持時間２分～５分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝１００％／０％から９０％／１０％に変化
　保持時間５分～１７分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝９０％／１０％から０％／１００％に変化
　保持時間１７分～３０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝０％／１００％を維持
　具体的には、条件２の高速液体クロマトグラフィー測定（ＨＰＬＣ測定）は、以下の点以外は、条件１と同様にして行うことができる。
　測定サンプルは、足場材料を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びイソプロピルアルコールの混合液（ＴＨＦ：ＩＰＡ＝７：３［体積比］）を溶媒として濃度：２ｍｇ／ｍＬに調整することにより得ることができる。分析は、例えば、以下の手順で行うことができる。
　移動相Ａ（Ａ液）として０．１ｗｔ／ｖｏｌギ酸メタノールを使用し、移動相Ｂ（Ｂ液）としてＴＨＦ及びＩＰＡの混合液（ＴＨＦ：ＩＰＡ＝７：３［体積比］）を使用する。測定開始時は、移動相Ａが体積比で１００％とし、０分～２分は移動相Ａを体積比１００％一定で流す。２分～５分にかけて、５分時点で移動相Ａ／移動相Ｂが体積比で９０％／１０％になるように一定速度で移動相Ｂの割合を増加させる。５分～１７分にかけて、１７分時点で移動相Ｂが体積比で１００％になるように一定速度で移動相Ｂの割合を増加させる。１７分～３０分にかけて、移動相Ｂを体積比１００％一定で流す。なお、その他の点は、条件１と同様である。
　なお、本願の第１の発明及び第２の発明は、上記のようにそれぞれを単独で実施してもよく、組み合わせて実施してもよい。以下、第１の発明及び第２の発明を総称して本発明と称する場合があるものとする。
　本発明に係る足場材料では、上記の構成が備えられているので、細胞の培養安定性を長期間に亘って維持することができる。
　本発明に係る足場材料では、ＨＰＬＣ測定により疎水性が比較的大きく適度に疎水性が調整されているので、細胞培養中に足場材料が液体培地中へ溶出しにくく、また、細胞培養中に足場材料が容器等から剥離しにくい。そのため、本発明に係る足場材料では、細胞を長期間培養したとしても、細胞の増殖スピードが低下しにくい。
　また、本発明に係る足場材料では、エタノール等のアルコール溶媒への溶解性を良好にすることができる。そのため、例えば、該足場材料をエタノールに溶解させた塗工液を容器等の表面に塗布し、次いで、エタノールを揮発させることにより、容器等の表面上に所定の形状を有する足場材料層を形成させることができる。アルコール溶媒への溶解性が良好であることによって、塗工液中の足場材料の濃度を高くすることができるので、厚みの大きい足場材料層を形成することができる。
　また、本発明に係る足場材料では、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の天然高分子材料を材料として用いる必要がないため、安価であり、ロット間のばらつきが小さく、安全性に優れる。
　上記足場材料では、上記の条件１でペプチド含有（メタ）アクリル共重合体のＨＰＬＣ測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間が、好ましくは４分を超え、より好ましくは５分以上、より一層好ましくは１０分以上、更に好ましくは１５分以上、特に好ましくは２４分以上である。上記ピークトップの保持時間が上記下限以上であると、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の疎水性をより一層大きくすることができ、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。上記ピークトップの保持時間は、３０分以内であってもよいが、３０分を超えてもよい。なお、上記メインピークが３０分を超えても検出されない場合は、上記ピークトップの保持時間が３０分を超えている。また、本願の第１の発明では、上記ピークトップの保持時間は４分を超える。
　上記足場材料では、上記の条件２でペプチド含有（メタ）アクリル共重合体のＨＰＬＣ測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間が、好ましくは２分以上、より好ましくは５分以上、より一層好ましくは８分以上、更に好ましくは１０分以上、更に一層好ましくは１５分以上、特に好ましくは１８分以上、好ましくは３０分以下、より好ましくは２８分以下、より一層好ましくは２７分以下、更に好ましくは２６分以下、最も好ましくは２５分以下である。上記ピークトップの保持時間が上記下限以上であると、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の疎水性をより一層大きくすることができ、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。上記ピークトップの保持時間が上記上限以下であると、エタノール等のアルコール溶媒への溶解性をより一層良好にすることができるので、塗工性及び加工性をより一層高めることができる。なお、本願の第２の発明では、上記ピークトップの保持時間は５分以上３０分以内である。
　なお、上述の条件１又は条件２で足場材料のＨＰＬＣ測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間は、例えば、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の構造や、分子量等により調整することができる。具体的には、後述するようにペプチド含有（メタ）アクリル共重合体中の疎水性の（メタ）アクリレート化合物の割合を多くしたり、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の分子量を適度に大きくしたりすること等により、上記保持時間を長くすることができる。
　以下、上記足場材料の詳細を更に説明する。なお、本明細書において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」と「メタクリル」との一方又は双方を意味し、「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート」と「メタクリレート」との一方又は双方を意味する。
　（ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体）
　上記足場材料は、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含む。上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体は、ペプチドが結合した（メタ）アクリル共重合体である。上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体は、（メタ）アクリル共重合体部と、該（メタ）アクリル共重合体部に結合したペプチド部とを有する。上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　＜（メタ）アクリル共重合体部＞
　上記（メタ）アクリル共重合体部は、下記式（Ａ１）又は下記式（Ａ２）で表される（メタ）アクリレート化合物（Ａ）に由来する構造単位を有することが好ましい。これにより、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の疎水性をより一層大きくすることができる。また、上述の条件１又は条件２で足場材料のＨＰＬＣ測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間を大きくすることができる。上記（メタ）アクリレート化合物（Ａ）は、下記式（Ａ１）で表される（メタ）アクリレート化合物を含んでいてもよく、下記式（Ａ２）で表される（メタ）アクリレート化合物を含んでいてもよく、下記式（Ａ１）で表される（メタ）アクリレート化合物と、下記式（Ａ２）で表される（メタ）アクリレート化合物との双方を含んでいてもよい。上記（メタ）アクリレート化合物（Ａ）が、下記式（Ａ１）で表される（メタ）アクリレート化合物と下記式（Ａ２）で表される（メタ）アクリレート化合物との双方を含む場合に、下記式（Ａ１）中のＲと下記式（Ａ２）中のＲとは、同一であってもよく、異なっていてもよい。上記（メタ）アクリレート化合物（Ａ）は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。また、下記式（Ａ１）で表される（メタ）アクリレート化合物及び下記式（Ａ２）で表される（メタ）アクリレート化合物はそれぞれ、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記式（Ａ１）中、Ｒは、炭素数が２以上１８以下の炭化水素基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記式（Ａ２）中、Ｒは、炭素数が２以上１８以下の炭化水素基を表す。
　上記式（Ａ１）中のＲ及び上記式（Ａ２）中のＲはそれぞれ、脂肪族炭化水素基であってもよく、芳香族炭化水素基であってもよい。ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の溶解性をより一層高める観点からは、上記式（Ａ１）中のＲ及び上記式（Ａ２）中のＲはそれぞれ、脂肪族炭化水素基であることが好ましい。上記脂肪族炭化水素基は、直鎖状であってもよく、分岐構造を有してもよく、二重結合を有していてもよく、二重結合を有していなくてもよい。上記式（Ａ１）中のＲ及び上記式（Ａ２）中のＲはそれぞれ、アルキル基であってもよく、アルキレン基であってもよい。
　上記式（Ａ１）中のＲの炭素数及び上記式（Ａ２）中のＲの炭素数はそれぞれ、好ましくは４以上、より好ましくは６以上、更に好ましくは８以上、特に好ましくは１０以上、好ましくは１６以下、より好ましくは１４以下であり、最も好ましくは１２である。上記炭素数が上記下限以上であると、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の疎水性をより一層大きくすることができる。また、上述の条件１又は条件２でペプチド含有（メタ）アクリル共重合体のＨＰＬＣ測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間をより大きくすることができる。上記炭素数が上記上限以下であると、上述の条件１又は条件２でペプチド含有（メタ）アクリル共重合体のＨＰＬＣ測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間をより小さくすることができる。また、エタノール等のアルコール溶媒へのペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の溶解性をより一層良好にすることができるので、塗工性及び加工性をより一層高めることができる。特に、上記炭素数が１２であると、本発明の効果を更により一層効果的に発揮させることができ、また、塗工性及び加工性を更により一層高めることができる。
　上記（メタ）アクリル共重合体部の全構造単位１００モル％中、上記（メタ）アクリレート化合物（Ａ）に由来する構造単位の含有率は、好ましくは２５モル％以上、より好ましくは３０モル％以上、更に好ましくは４０モル％以上、特に好ましくは５０モル％以上、好ましくは９８モル％以下、より好ましくは９５モル％以下、更に好ましくは９０モル％以下、特に好ましくは８０モル％以下である。上記（メタ）アクリル共重合体部の全構造単位１００モル％中、上記（メタ）アクリレート化合物（Ａ）に由来する構造単位の含有率は、好ましくは２５モル％以上、９８モル％以下、より好ましくは３０モル％以上、９５モル％以下、更に好ましくは４０モル％以上、９０モル％以下、特に好ましくは５０モル％以上、８０モル％以下である。上記含有率が上記下限以上であると、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の疎水性をより一層大きくすることができる。また、上述の条件１又は条件２でペプチド含有（メタ）アクリル共重合体のＨＰＬＣ測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間をより大きくすることができる。上記含有率が上記上限以下であると、上述の条件１又は条件２でペプチド含有（メタ）アクリル共重合体のＨＰＬＣ測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間をより小さくすることができる。また、エタノール等のアルコール溶媒へのペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の溶解性をより一層良好にすることができるので、塗工性及び加工性をより一層高めることができる。
　上記（メタ）アクリル共重合体部は、アミノ基又はカルボキシル基と反応可能な官能基を有する（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）に由来する構造単位を有することが好ましい。上記（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）は、アミノ基と反応可能な官能基を有していてもよく、カルボキシル基と反応可能な官能基を有していてもよく、アミノ基と反応可能な官能基と、カルボキシル基と反応可能な官能基とを有していてもよい。上記（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記アミノ基又はカルボキシル基と反応可能な官能基としては、カルボキシル基、チオール基、アミノ基、及びシアノ基等が挙げられる。
　本発明の効果を効果的に発揮する観点から、上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体において、上記ペプチド部が、上記アミノ基又はカルボキシル基と反応可能な官能基と結合していることが好ましい。より具体的には、上記ペプチド部を構成するアミノ酸のカルボキシル基又はアミノ基が、上記アミノ基又はカルボキシル基と反応可能な官能基と結合していることが好ましい。
　上記アミノ基又はカルボキシル基と反応可能な官能基は、カルボキシル基又はアミノ基であることが好ましい。上記（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）は、カルボキシル基又はアミノ基を有することが好ましい。
　上記（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）としては、（メタ）アクリル酸、３－ブテン酸、４－ペンテン酸、５－ヘキセン酸、６－ヘプテン酸、７－オクテン酸、ベンゼンアクリル酸、（メタ）アクリロイルオキシエチルコハク酸、（メタ）アクリロイルオキシエチルフタル酸、（メタ）アクリロイルオキシプロピルコハク酸、（メタ）アクリロイルオキシプロピルフタル酸、（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロコハク酸、（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸、（メタ）アクリロイルオキシプロピルヘキサヒドロコハク酸、及び（メタ）アクリロイルオキシプロピルヘキサヒドロフタル酸等が挙げられる。
　上記（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）は、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリロイルオキシエチルコハク酸、（メタ）アクリロイルオキシプロピルコハク酸、（メタ）アクリロイロキシエチルヘキサヒドロコハク酸、（メタ）アクリロイルオキシプロピルヘキサヒドロコハク酸、又はブテン酸であることが好ましく、（メタ）アクリル酸であることがより好ましい。この場合には、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。
　上記（メタ）アクリル共重合体部の全構造単位１００モル％中、上記（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）に由来する構造単位の含有率は、好ましくは２モル％以上、より好ましくは５モル％以上、更に好ましくは１０モル％以上、好ましくは７５モル％以下、より好ましくは７０モル％以下、更に好ましくは６０モル％以下である。上記含有率が上記下限以上であると、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体のアルコール溶媒への溶解性をより高めることができる。上記含有率が上記上限以下であると、細胞の培養安定性を長期間に亘ってより一層維持しやすくなる。
　上記（メタ）アクリル共重合体部の全構造単位１００モル％中、上記（メタ）アクリレート化合物（Ａ）に由来する構造単位と上記（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）に由来する構造単位との合計含有率は、好ましくは５０モル％以上、より好ましくは６５モル％以上、より一層好ましくは８０モル％以上、更に好ましくは９０モル％以上、特に好ましくは９５モル％以上、最も好ましくは１００モル％である。上記合計含有率が上記下限以上であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。なお、上記合計含有率は、１００モル％以下であってもよく、９０モル％以下であってもよい。
　上記（メタ）アクリル共重合体部は、本発明の目的に反しない限り、上記（メタ）アクリレート化合物（Ａ）及び上記（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）の双方とは異なる（メタ）アクリレート化合物に由来する構造単位を含んでいてもよい。また、上記（メタ）アクリル共重合体部は、本発明の目的に反しない限り、（メタ）アクリレート化合物と共重合可能なビニル化合物に由来する構造単位を含んでいてもよい。
　上記（メタ）アクリル共重合体部における上記（メタ）アクリレート化合物（Ａ）に由来する構造単位の含有率、上記（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）に由来する構造単位の含有率は、例えばＮＭＲ（核磁気共鳴）により測定することができる。
　＜ペプチド部＞
　上記ペプチド部は、ペプチドに由来する構造部分である。上記ペプチド部は、アミノ酸配列を有する。上記ペプチド部を構成するペプチドは、オリゴペプチドであってもよく、ポリペプチドであってもよい。上記ペプチドは、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記ペプチド部のアミノ酸残基の数は、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、更に好ましくは５個以上、好ましくは１０個以下、より好ましくは８個以下、更に好ましくは６個以下である。上記アミノ酸残基の数が上記下限以上及び上記上限以下であると、播種後の細胞との接着性をより一層高めることができ、細胞の増殖率をより一層高めることができる。ただし、上記ペプチド部のアミノ酸残基の数は１０個を超えていてもよく、１５個を超えていてもよい。
　上記ペプチド部は、細胞接着性のアミノ酸配列を有することが好ましい。なお、細胞接着性のアミノ酸配列とは、ファージディスプレイ法、セファローズビーズ法、又はプレートコート法によって細胞接着活性が確認されているアミノ酸配列をいう。上記ファージディスプレイ法としては、例えば、「The Journal of Cell Biology, Volume 130, Number 5, September 1995 1189-1196」に記載の方法を用いることができる。上記セファローズビーズ法としては、例えば「蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４５　Ｎｏ．１５　（２０００）　２４７７」に記載の方法を用いることができる。上記プレートコート法としては、例えば「蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４５　Ｎｏ．１５　（２０００）　２４７７」に記載の方法を用いることができる。
　上記細胞接着性のアミノ酸配列としては、例えば、ＲＧＤ配列（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）、ＹＩＧＳＲ配列（Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ）、ＰＤＳＧＲ配列（Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ）、ＨＡＶ配列（Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｖａｌ）、ＡＤＴ配列（Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ）、ＱＡＶ配列（Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ）、ＬＤＶ配列（Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ）、ＩＤＳ配列（Ｉｌｅ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ）、ＲＥＤＶ配列（Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ）、ＩＤＡＰＳ配列（Ｉｌｅ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ）、ＫＱＡＧＤＶ配列（Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｖａｌ）、及びＴＤＥ配列（Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ）等が挙げられる。また、上記細胞接着性のアミノ酸配列としては、「病態生理、第９巻　第７号、５２７～５３５頁、１９９０年」、及び「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻　第１号、５８～６６頁、１９９２年」に記載されている配列等も挙げられる。上記ペプチド部は、上記細胞接着性のアミノ酸配列を１種のみ有していてもよく、２種以上を有してもよい。
　上記細胞接着性のアミノ酸配列は、上述した細胞接着性のアミノ酸配列の内の少なくともいずれかを有することが好ましく、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、又はＰＤＳＧＲ配列を少なくとも有することがより好ましく、ＲＧＤ配列を有することが更に好ましく、下記式（１）で表されるＲＧＤ配列を少なくとも有することが特に好ましい。この場合には、播種後の細胞との接着性をより一層高めることができ、細胞の増殖率をより一層高めることができる。
　Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｘ　　　・・・式（１）
　上記式（１）中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、又はＡｓｎを表す。
　上記ペプチド部は、直鎖状であってもよく、環状ペプチド骨格を有していてもよい。上記環状ペプチド骨格とは、複数個のアミノ酸により構成された環状骨格である。本発明の効果を一層効果的に発揮させる観点からは、上記環状ペプチド骨格は、４個以上のアミノ酸により構成されることが好ましく、５個以上のアミノ酸により構成されることが好ましく、１０個以下のアミノ酸により構成されることが好ましい。
　上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体において、上記ペプチド部の含有率は、好ましくは０．５モル％以上、より好ましくは１モル％以上、更に好ましくは５モル％以上、好ましくは２５モル％以下、より好ましくは２０モル％以下、更に好ましくは１５モル％以下である。上記ペプチド部の含有率が上記下限以上であると、播種後の細胞との接着性をより一層高めることができ、細胞の増殖率をより一層高めることができる。また、上記ペプチド部の含有率が上記上限以下であると、細胞の培養安定性をより一層高めることができ、また、製造コストを抑えることができる。なお、上記ペプチド部の含有率（モル％）は、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を構成する各構造単位の物質量の総和に対する上記ペプチド部の物質量である。
　上記ペプチド部の含有率は、例えばＮＭＲ（核磁気共鳴）により測定することができる。
　＜ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の他の詳細＞
　上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の数平均分子量は、好ましくは５０００以上、より好ましくは１００００以上、更に好ましくは５００００以上、好ましくは５００００００以下、より好ましくは２５０００００以下、更に好ましくは１００００００以下である。上記数平均分子量が上記下限以上であると、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の水への溶解性をより一層低下させることができ、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。上記数平均分子量が上記上限以下であると、アルコール溶媒への溶解性をより一層高めることができる。
　なお、上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の数平均分子量は、例えば以下の方法により測定することができる。上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の０．２重量％溶液を調製する。次に、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定装置（ＡＰＣシステム、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて、以下の測定条件により評価する。
　カラム：ＨＳＰｇｅｌ　ＨＲ　ＭＢ－Ｍ　６．０ｍｍ×１５０ｍｍ
　流量：０．５ｍＬ／分
　カラム温度：４０℃
　注入量：１０μＬ
　検出器：ＲＩ、ＰＤＡ
　標準試料：ポリスチレン
　上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の製造方法は特に限定されない。上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体は、例えば、以下のようにして作製することができる。
　（メタ）アクリレート化合物（Ａ）と（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）とを含むモノマー混合物を重合させて（メタ）アクリレート共重合体を得る。得られた（メタ）アクリレート共重合体と、ペプチドとを反応させて、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を得る。
　（細胞培養用足場材料の他の詳細）
　上記足場材料は、細胞を培養するために用いられる。上記足場材料は、細胞を培養する際の該細胞の足場として用いられる。
　上記細胞としては、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ及びサル等の動物細胞が挙げられる。また、上記細胞としては、体細胞等が挙げられ、例えば、幹細胞、前駆細胞及び成熟細胞等が挙げられる。上記体細胞は、癌細胞であってもよい。
　上記幹細胞としては、体性幹細胞、胚性幹細胞等が挙げられ、例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、胚性がん細胞、胚性生殖幹細胞、及びｍＧＳ細胞等が挙げられる。
　上記成熟細胞としては、神経細胞、心筋細胞、網膜細胞及び肝細胞等が挙げられる。
　上記足場材料は、細胞の二次元培養（平面培養）、三次元培養又は浮遊培養に用いられることが好ましく、二次元培養（平面培養）又は三次元培養に用いられることがより好ましく、二次元培養に用いられることが更に好ましい。
　上記足場材料は、無血清培地培養に用いられることが好ましい。上記足場材料は上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含むので、フィーダー細胞や接着タンパク質を含まない無血清培地培養であっても、細胞の接着性を高めることができ、特に、細胞播種後の初期定着率を高めることができる。また、上記足場材料は上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含むので、無血清培地培養であっても、本発明の効果を発揮することができる。
　上記足場材料１００重量％中、上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の含有量は、好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、更に好ましくは９７．５重量％以上、特に好ましくは９９重量％以上、最も好ましくは１００重量％（全量）である。上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の含有量が上記下限以上であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。ただし、上記足場材料１００重量％中、上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の含有量は、１００重量％以下であってもよく、９８重量％以下であってもよい。
　上記足場材料は、上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体以外の成分を含んでいてもよい。上記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体以外の成分としては、ポリオレフィン樹脂、ポリエーテル樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリエステル、エポキシ樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリカーボネート樹脂、多糖類、セルロース、ポリペプチド、合成ペプチド等が挙げられる。
　上記足場材料は、動物由来の原料を実質的に含まないことが好ましい。動物由来の原料を含まないことにより、安全性が高く、かつ、製造時に品質のばらつきが少ない足場材料を提供することができる。なお、「動物由来の原料を実質的に含まない」とは、上記足場材料中における動物由来の原料が、３重量％以下であることを意味する。上記足場材料では、足場材料中における動物由来の原料が、１重量％以下であることが好ましく、０重量％であることが最も好ましい。すなわち、上記足場材料は、動物由来の原料を全く含まないことが最も好ましい。
　上記足場材料の形状は特に限定されない。上記足場材料の形状は、粒子状であってもよく、繊維状であってもよく、多孔体状であってもよく、膜状であってもよい。
　上記足場材料は、樹脂膜であることが好ましい。上記樹脂膜は、上記足場材料により形成された樹脂膜であることが好ましい。上記樹脂膜は、膜状の足場材料である。
　上記樹脂膜の厚みは特に限定されない。上記樹脂膜の平均厚みは、１０ｎｍ以上であってもよく、５０ｎｍ以上であってもよく、５００ｎｍ以上であってもよく、１０００μｍ以下であってもよく、５００μｍ以下であってもよい。
　（細胞培養用容器）
　細胞培養用容器は、細胞の培養領域の少なくとも一部に、上述した樹脂膜を備えることが好ましい。上記細胞培養用容器は、容器本体と、上記樹脂膜とを備え、上記容器本体の表面上に、該樹脂膜が配置されていることが好ましい。上記樹脂膜は、膜状の足場材料であることが好ましく、足場材料層であることが好ましい。
　図１は、本発明の一実施形態に係る細胞培養用容器を模式的に示す断面図である。
　細胞培養用容器１は、容器本体２と、樹脂膜３とを備える。容器本体２の表面２ａ上に樹脂膜３が配置されている。容器本体２の底面上に樹脂膜３が配置されている。細胞培養用容器１に液体培地を添加し、また、細胞塊等の細胞を樹脂膜３の表面上に播種することで、細胞を平面培養することができる。
　なお、容器本体は、第１の容器本体と、該第１の容器本体の底面上にカバーガラス等の第２の容器本体とを備えていてもよい。第１の容器本体と第２の容器本体とは分離可能であってもよい。この場合、第２の容器本体の表面上に、樹脂膜３が配置されていてもよい。
　上記容器本体として、従来公知の容器本体（容器）を用いることができる。上記容器本体の形状及び大きさは特に限定されない。上記容器本体としては、例えば、２～３８４ウェルプレート、単層フラスコ、多層フラスコ、多面フラスコ、ディッシュ、ローラーボトル、バッグ、インサートカップ、マイクロ流路チップ等を用いることができる。
　上記容器本体の材質は特に限定されないが、合成樹脂、金属及びガラス等が挙げられる。上記合成樹脂としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリイソプレン、シクロオレフィンポリマー、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミドイミド、（メタ）アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン等が挙げられる。
　（細胞培養用マイクロキャリア）
　細胞培養用マイクロキャリア（以下、「マイクロキャリア」と略記することがある）は、基材粒子と、該基材粒子の外表面とを被覆する被覆層とを備え、上記被覆層が、上記足場材料により形成されていることが好ましい。上記被覆層は、足場材料層であることが好ましい。上記基材粒子としては、マイクロキャリアで用いられている従来公知の基材粒子を使用可能である。上記基材粒子としては、樹脂粒子等が挙げられる。
　図２は、本発明の一実施形態に係る細胞培養用マイクロキャリアを模式的に示す断面図である。
　図２に示す細胞培養用マイクロキャリア５は、基材粒子６と、基材粒子６の外表面を被覆する被覆層７とを備える。被覆層７は、基材粒子６の表面上に配置されており、基材粒子６の表面に接している。被覆層７は、基材粒子６の外表面全体を被覆している。
　（細胞の培養方法）
　上記足場材料、上記樹脂膜、上記マイクロキャリアを用いて細胞を培養することができる。上記細胞の培養方法は、上記足場材料を用いる細胞の培養方法である。上記細胞の培養方法は、上記樹脂膜を用いる細胞の培養方法であることが好ましく、上記マイクロキャリアを用いる細胞の培養方法であることが好ましい。上記細胞としては、上述した細胞が挙げられる。
　上記細胞の培養方法は、上記足場材料上に細胞を播種する工程を備えることが好ましい。上記細胞の培養方法は、上記樹脂膜上に細胞を播種する工程を備えることが好ましい。上記細胞の培養方法は、上記マイクロキャリア上に細胞を播種する工程を備えることが好ましい。上記細胞は、細胞塊であってもよい。上記細胞塊は、コンフルエントになった培養容器に細胞剥離剤を添加し、ピペッティングにより均一に破砕処理することで得ることができる。細胞剥離剤としては、特に限定されないが、エチレンジアミン／リン酸緩衝溶液が好ましい。細胞塊の大きさは５０μｍ～２００μｍであることが好ましい。
　以下に実施例及び比較例を掲げて本発明を更に詳しく説明する。本発明はこれら実施例のみに限定されない。
　なお、得られたペプチド含有（メタ）アクリル共重合体における構造単位の含有率、及びペプチド部の含有率は、該共重合体をＤＭＳＯ－ｄ６（ジメチルスルホキサイド）に溶解した後、１Ｈ－ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）により測定した。
　（実施例１）
　ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の作製：
　アクリル酸ブチル４．５重量部と、アクリル酸７．０重量部とをテトラヒドロフラン２７重量部に溶解させてアクリルモノマー溶液を得た。得られたアクリルモノマー溶液にＩｒｇａｃｕｒｅ１８４（ＢＡＳＦ社製）０．０５７５重量部を溶解させ、得られた液をＰＥＴフィルム上に塗布した。塗布物を２５℃にて、ＵＶコンベア装置（アイグラフィックス社製「ＥＣＳ３０１Ｇ１」）を用い、波長３６５ｎｍの光を積算光量２０００ｍＪ／ｃｍ２で照射することで（メタ）アクリル共重合体溶液を得た。得られた（メタ）アクリル共重合体溶液を８０℃で３時間真空乾燥し、（メタ）アクリル共重合体を得た。
　ペプチドとしてＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓのアミノ酸配列を有する環状のペプチド（アミノ酸残基数５個、ＡｒｇとＬｙｓとが結合することにより環状骨格を形成、ＰｈｅはＤ体、表ではｃ－ＲＧＤｆＫと記載）を用意した。縮合剤として１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を用意した。（メタ）アクリル共重合体５０重量部とペプチド１０重量部とを１０００重量部のＤＭＦ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）に溶解して、第１の溶液を調製した。また、縮合剤１重量部を１０００重量部のＤＭＦに混合して、第２の溶液を調製した。第１の溶液と第２の溶液とを混合して、（メタ）アクリル共重合体とペプチドと縮合剤とを含む溶液を調製した。得られた溶液を４０℃で２時間反応させ、（メタ）アクリル共重合体のアクリル酸に由来する構造単位におけるカルボキシル基と、ペプチドのＬｙｓのアミノ基とを脱水縮合させ、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含む溶液を得た。
　塗工液の作製：
　得られたペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含む溶液をＤＭＦで１００倍希釈し、イオン交換樹脂（オルガノ社製）が充填されたカラムに０．３ｍＬ／分の速度で滴下して洗浄した。洗浄後の溶液を６０℃、３時間の真空乾燥をして得られた乾固物をエタノールに溶解し、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体とエタノールとを含む塗工液を得た。なお、塗工液中のペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の含有量は０．１重量％とした。
　細胞培養用容器の作製：
　得られた塗工液２０μＬをキャストコート法で６ウェルプレートの各ウェルに塗工した後、６０℃、３時間の真空乾燥でエタノールを除去した。このようにして、各ウェルの底面に足場材料により形成された樹脂膜（膜状の足場材料）が配置された細胞培養用容器を得た。
　（実施例２～１０及び比較例１～６）
　（メタ）アクリレート化合物の種類及び配合量を変更したこと以外は実施例１と同様にして、表１～３に示す構成を備えるペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を得た。また、得られたペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、細胞培養用容器を得た。なお、比較例１、３ではライトアクリレート（ＭＴＧ－Ａ、共栄社化学社製、メトキシ－トリエチレングルコールアクリレート）を配合に使用し、比較例７では、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体に代えてＳｙｎｔｈｅｍａｘビトロネクチン基質（コーニング社製）を用いた。
　（評価）
　（１）ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の数平均分子量
　得られたペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の数平均分子量を、上述した方法で測定した。
　（２）ピークトップの保持時間（条件１）
　条件１のＨＰＬＣ測定は、以下のようにして行い、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間を求めた。
　測定サンプルは、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体（足場材料からなる樹脂膜）を、０．１重量％ギ酸水溶液及びイソプロピルアルコールの混合液（０．１重量％ギ酸水溶液／イソプロピルアルコール＝７／３［体積比］）を溶媒として濃度：２ｍｇ／ｍＬに調整することにより得た。
　測定機器としては、ＨＰＬＣ装置（島津製作所社製、高圧グラジエントＨＰＬＣシステム　Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）、ＨＰＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ社製、ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標）　Ｃ１８［内径３．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、充填剤粒径３．５μｍ］）、蒸発光散乱検出器（島津製作所社製、ＥＬＳＤ＿ＬＴＩＩ）を用いた。分析は、以下の手順で行った。
　移動相Ａ（Ａ液）として０．１重量％ギ酸水溶液を使用し、移動相Ｂ（Ｂ液）としてイソプロピルアルコールを使用した。測定開始時はＨＰＬＣ装置内部を移動相Ａ／移動相Ｂが体積比で７／３の混合溶媒で満たした状態とした。この状態で上記測定サンプル（注入量：２０μＬ）を注入した。そして、サンプル注入直後から１５分かけて移動相中の移動相Ｂの割合が体積比で１００％になるように一定速度で移動相Ｂの割合を増加させた。１５分後（この時点で移動相は完全に移動相Ｂに置換される）から１５分間は、移動相Ｂを流した。カラム温度は４０℃とし、送液流量は総流量０．３ｍＬ／分とした。
　蒸発光散乱検出器のネブライザーガスとして窒素ガスを使用した。ガス供給圧力は３５０ｋＰａとし、ドリフトチューブ温度は４０℃とした。なお、ベースラインの決定は、足場材料を溶解すること以外は、分析サンプルの調製と同様の方法で準備した空試験液を分析して行った。
　（３）ピークトップの保持時間（条件２）
　条件２のＨＰＬＣ測定は、以下の点以外は、条件１と同様にして行い、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間を求めた。
　測定サンプルは、ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体（足場材料からなる樹脂膜）を、ＴＨＦ及びＩＰＡの混合液（ＴＨＦ：ＩＰＡ＝７：３（体積比））を溶媒として濃度：２ｍｇ／ｍＬに調整し得た。分析は、以下の手順で行った。
　移動相Ａ（Ａ液）として０．１ｗｔ／ｖｏｌギ酸メタノールを使用し、移動相Ｂ（Ｂ液）としてＴＨＦ及びイソプロピルアルコールの混合液（ＴＨＦ：ＩＰＡ＝７：３［体積比］）を使用した。測定開始時は、移動相Ａが体積比で１００％とし、０分～２分は移動相Ａを体積比１００％一定で流した。２分～５分にかけて、５分時点で移動相Ａ／移動相Ｂが体積比で９０％／１０％になるように一定速度で移動相Ｂの割合を増加させた。５分～１７分にかけて、１７分時点で移動相Ｂが体積比で１００％になるように一定速度で移動相Ｂの割合を増加させた。１７分～３０分にかけて、移動相Ｂを体積比１００％一定で流した。
　（４）細胞の培養安定性（長期の培養安定性）
　以下の液体培地を用意した。
　Ｒ－ＳＴＥＭ（ロート製薬社製）
　得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて３７℃のインキュベーター内で１時間静置後、細胞培養用容器からリン酸緩衝生理食塩水を除去した。
　液体培地１．５ｍＬに５×１０４個の細胞（ロンザ社製、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞、型番：ＰＴ－５００６）を含む細胞懸濁液を用意した。この細胞懸濁液を、６ウェルプレートの各ウェルに播種した。次いで、６ウェルプレートを左右に５回振り、３７℃及びＣＯ２濃度５％のインキュベーター内に入れて培養を行った。
　細胞の播種から２４時間後、４８時間後、７２時間後の細胞数を、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ　ＮＣ－３０００（エムエステクノシステムズ社製）を用いてカウントした。播種２４時間後から４８時間後の間の細胞の倍化時間をＴ１とし、播種４８時間後から７２時間後の間の細胞の倍化時間をＴ２としたときに、Ｔ１及びＴ２をそれぞれ以下の式により算出した。
　Ｔ１＝２４ｌｏｇ２／（ｌｏｇ（Ｎ（４８）／Ｎ（２４））
　Ｔ２＝２４ｌｏｇ２／（ｌｏｇ（Ｎ（７２）／Ｎ（４８））
　Ｔ１：播種２４時間後から４８時間後の細胞の倍化時間
　Ｔ２：播種４８時間後から７２時間後の細胞の倍化時間
　Ｎ（２４）：播種２４時間後の細胞数（ｃｅｌｌｓ）
　Ｎ（４８）：播種４８時間後の細胞数（ｃｅｌｌｓ）
　Ｎ（７２）：播種７２時間後の細胞数（ｃｅｌｌｓ）
　倍化時間（Ｔ１）及び倍化時間（Ｔ２）から、Ｔ１のＴ２に対する比（Ｔ１／Ｔ２）を算出した。細胞の培養安定性を以下の基準で評価した。比（Ｔ１／Ｔ２）が大きいほど、細胞の増殖スピードが低下していないことを意味する。
　＜細胞の培養安定性（長期の培養安定性）の判定基準＞
　○○：比（Ｔ１／Ｔ２）が０．９以上
　○：比（Ｔ１／Ｔ２）が０．７以上０．９未満
　×：比（Ｔ１／Ｔ２）が０．７未満
　図３は、実施例１，８及び比較例２で得られた細胞培養用足場材料を用いて細胞培養を行った際の細胞の播種後２４時間、４８時間及び７２時間の位相差顕微鏡写真である。なお、実施例１では上記比（Ｔ１／Ｔ２）が０．８５であり、実施例８では上記比（Ｔ１／Ｔ２）が０．９９であり、比較例２では上記比（Ｔ１／Ｔ２）が０．５であった。
　（５）エタノールへの溶解性
　得られた足場材料のエタノールに対する溶解度を、以下の方法で測定した。足場材料をエタノールと混合し６０℃で撹拌し３０分後に目視で足場材料の溶け残りの有無、溶液の透明度を確認した。足場材料の溶け残りが無く、溶液が透明となる最大溶液濃度を溶解度として規定した。なお、エタノールへの溶解性は以下の基準で評価した。
　＜エタノールへの溶解性の判定基準＞
　○○：溶解度が１重量％以上
　○：溶解度が０．１重量％以上１重量％未満
　×：溶解度が０．１重量％未満
　詳細及び結果を下記の表１～３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　１…細胞培養用容器
　２…容器本体
　２ａ…表面
　３…樹脂膜
　５…細胞培養用マイクロキャリア
　６…基材粒子
　７…被覆層

Claims (9)

  1. 　細胞培養用足場材料であって、
    　（メタ）アクリル共重合体部と、前記（メタ）アクリル共重合体部に結合したペプチド部とを有するペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含み、
    　下記の条件１で前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の高速液体クロマトグラフィー測定をしたときに、シグナルの中で最も面積の大きいメインピークのピークトップが保持時間４分以内に検出されない、細胞培養用足場材料。
    　［条件１］
    　カラム：Ｃ１８（内径３．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、充填剤粒径３．５μｍ）
    　カラム温度：４０℃
    　流量：０．３ｍＬ／分
    　検出器：蒸発光散乱検出器
    　移動相Ａ（Ａ液）：０．１重量％ギ酸水溶液
    　移動相Ｂ（Ｂ液）：イソプロピルアルコール
    　保持時間０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝７０％／３０％
    　保持時間０分～１５分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝７０％／３０％から０％／１００％に変化
    　保持時間１５分～３０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝０％／１００％を維持
  2. 　前記条件１で前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の高速液体クロマトグラフィー測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間が、５分以上３０分以内である、請求項１に記載の細胞培養用足場材料。
  3. 　細胞培養用足場材料であって、
    　（メタ）アクリル共重合体部と、前記（メタ）アクリル共重合体部に結合したペプチド部とを有するペプチド含有（メタ）アクリル共重合体を含み、
    　下記の条件２で前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の高速液体クロマトグラフィー測定をしたときに、検出されるシグナルの中で最も面積の大きいメインピークにおけるピークトップの保持時間が、５分以上３０分以内である、細胞培養用足場材料。
    　［条件２］
    　カラム：Ｃ１８（内径３．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、充填剤粒径３．５μｍ）
    　カラム温度：４０℃
    　流量：０．３ｍＬ／分
    　検出器：蒸発光散乱検出器
    　移動相Ａ（Ａ液）：０．１ｗｔ／ｖｏｌギ酸メタノール
    　移動相Ｂ（Ｂ液）：ＴＨＦ／イソプロピルアルコール＝７／３（体積比）
    　保持時間０分～２分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝１００％／０％を維持
    　保持時間２分～５分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝１００％／０％から９０％／１０％に変化
    　保持時間５分～１７分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝９０％／１０％から０％／１００％に変化
    　保持時間１７分～３０分：Ａ液／Ｂ液（体積比）＝０％／１００％を維持
  4. 　前記（メタ）アクリル共重合体部が、下記式（Ａ１）又は下記式（Ａ２）で表される（メタ）アクリレート化合物（Ａ）に由来する構造単位を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　前記式（Ａ１）中、Ｒは、炭素数が２以上１８以下の炭化水素基を表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　前記式（Ａ２）中、Ｒは、炭素数が２以上１８以下の炭化水素基を表す。
  5. 　前記（メタ）アクリル共重合体部が、アミノ基又はカルボキシル基と反応可能な官能基を有する（メタ）アクリレート化合物（Ｂ）に由来する構造単位を有し、
    　前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体において、前記ペプチド部が、前記アミノ基又はカルボキシル基と反応可能な官能基と結合している、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
  6. 　前記（メタ）アクリル共重合体部の全構造単位１００モル％中、前記（メタ）アクリレート化合物（Ａ）に由来する構造単位の含有率が、２５モル％以上９８モル％以下である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
  7. 　前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体の数平均分子量が、５０００以上である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
  8. 　前記ペプチド含有（メタ）アクリル共重合体において、前記ペプチド部の含有率が、０．５モル％以上２５モル％以下である、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
  9. 　前記ペプチド部が、ＲＧＤ配列を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞培養用足場材料。
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