WO2024058198A1 - 人工多能性幹細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2024058198A1
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acetal resin
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晃彦 ▲柳▼澤
聡 羽根田
博貴 井口
仁志 井上
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積水化学工業株式会社
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    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing induced pluripotent stem cells.
  • iPS cells Induced pluripotent stem cells
  • iPS cells are attracting attention in research fields such as academic fields, drug discovery fields, and regenerative medicine fields.
  • iPS cells can be produced by introducing reprogramming factors (eg, OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC) into somatic cells (eg, Patent Document 1).
  • reprogramming factors eg, OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC
  • a widely used method for producing iPS cells is to culture somatic cells into which reprogramming factors have been introduced on laminin-coated plates (for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Laminin acts as a cell scaffolding material.
  • Patent Document 2 describes a scaffold material for cell culture that includes a peptide-containing polyvinyl alcohol derivative having a polyvinyl alcohol derivative part and a peptide part. Moreover, the example of Patent Document 2 describes that iPS cells were cultured using the above-mentioned scaffold material. However, Patent Document 2 does not describe establishing iPS cells from somatic cells.
  • CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310 Kyoto University iPS Cell Research Institute, https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/img/protocol/hipsprotocolFf_140311 .pdf, English version URL: https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/img/protocol/Ff-iPSC-culture_protocol_E_v140311.pdf) (8) iPS cell induction protocol from human peripheral blood mononuclear cells/monocytes using SRV(TM) iPSC-4 Vector (TKB_P-008-02) (Tokiwa Bio Co., Ltd., http://tokiwa-bio.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing induced pluripotent stem cells that easily yields induced pluripotent stem cells that are undifferentiated and have high differentiation potential.
  • a step of introducing a reprogramming factor into a somatic cell and a step of culturing the somatic cell into which the reprogramming factor has been introduced in the presence of a cell scaffold material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • a method for producing induced pluripotent stem cells comprising:
  • the method for producing induced pluripotent stem cells includes, before the step of introducing a reprogramming factor into the somatic cells, The method includes a step of culturing in the presence of a cell scaffold material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • a Sendai virus vector is used to introduce the reprogramming factors into the somatic cells.
  • the reprogramming factor is mRNA.
  • the mRNA is introduced into the somatic cells by a plasma gene transfer method.
  • the present invention it is possible to provide a method for producing induced pluripotent stem cells in which induced pluripotent stem cells with high undifferentiation and differentiation potential are easily obtained.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the number of passages after culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced and the survival rate of the virus.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the number of culture days after culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced and the cumulative cell number.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the number of passages after culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced and the survival rate of the cells.
  • FIG. 4 is a micrograph of cells (iPS cells) obtained by culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced. Fluorescence indicates TRA-1-60 expression.
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the number of passages after culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced and the survival rate of the virus.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the number of culture days after culturing somatic cells into which reprogramming factors have been
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the number of passages after culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced and the expression levels of Nanog and Oct3/4.
  • FIG. 6 is a micrograph of cells 39 days after the initiation of differentiation induction of iPS cells. In Examples 1 to 3, formation of embryoid bodies was observed, and in Comparative Examples 1 to 3, formation of embryoid bodies was not observed.
  • FIG. 7 is a diagram showing the expression levels of endodermal markers (AFP, FOXA2, GATA4, GATA6, SOX17, SOX7).
  • FIG. 8 is a diagram showing the expression levels of mesoderm markers (KDR, T).
  • FIG. 9 is a diagram showing the expression levels of ectodermal markers (NES, PAX6, SOX1).
  • FIG. 10 is a radar chart summarizing the differentiation scores into each germ layer.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of an experiment of introducing mRNA (reprogramming factor) into somatic cells.
  • FIG. 12 is a micrograph of cells in a fluorescent field 14 days after mRNA (reprogramming factor) was introduced into somatic cells by plasma gene transfer method.
  • FIG. 13 is a diagram showing the relationship between FITC fluorescence intensity and cell number.
  • FIG. 14 shows the expression levels (relative quantitative values) of NANOG, OCT3/4, and SOX2.
  • FIG. 15 is a micrograph of the cells after immunostaining in a fluorescent field.
  • FIG. 16 is a diagram showing the expression levels (relative quantitative values) of endodermal markers (FOXA2, SOX17), mesodermal markers (T), and ectodermal markers (PAX6).
  • the method for producing induced pluripotent stem cells includes a step of introducing a reprogramming factor into a somatic cell, and a step of introducing a reprogramming factor into a somatic cell into which the somatic cell has been introduced with the reprogramming factor in the presence of a cell scaffolding material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin. and a step of culturing under.
  • induced pluripotent stem cells Since the method for producing induced pluripotent stem cells according to the present invention has the above-mentioned configuration, induced pluripotent stem cells with high undifferentiation and differentiation ability are easily obtained.
  • a widely used method for producing induced pluripotent stem cells is to culture somatic cells into which reprogramming factors have been introduced on a plate coated with laminin (cell scaffolding material).
  • laminin cell scaffolding material
  • the present inventors cultivated somatic cells into which reprogramming factors had been introduced in the presence of a cell scaffold material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin, thereby producing induced pluripotent stem cells with high undifferentiation and differentiation potential. I found that it is easy to obtain.
  • the expression level of TRA-1-60 an undifferentiation marker, is lower than the conventional method of culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced on laminin to establish induced pluripotent stem cells.
  • the induced pluripotent stem cells obtained by the present invention can form embryoid bodies more efficiently than the induced pluripotent stem cells obtained by culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced on laminin. and can maintain differentiation potential.
  • the method for producing induced pluripotent stem cells according to the present invention preferably includes a step of culturing somatic cells before the step of introducing a reprogramming factor into the somatic cells.
  • induced pluripotent stem cells may be referred to as "iPS cells”.
  • the "step of culturing somatic cells” provided before the step of introducing the reprogramming factor into the somatic cells may be referred to as “step (1).”
  • the above-mentioned “step of introducing the reprogramming factor into somatic cells” may be referred to as “step (2)”
  • the above-mentioned “somatic cells into which the reprogramming factor has been introduced are treated with peptide-containing polyvinyl acetate.
  • the step of culturing in the presence of a cell scaffold material containing resin” may be referred to as "step (3).”
  • the method for producing iPS cells according to the present invention includes step (2) and step (3).
  • the method for producing iPS cells according to the present invention preferably includes step (1), step (2), and step (3).
  • somatic cells As the somatic cells, conventionally known somatic cells used for establishing iPS cells can be used.
  • the somatic cells are preferably animal cells, more preferably mammalian cells, and even more preferably human cells.
  • somatic cells examples include blood cells, fibroblasts, hepatocytes, pancreatic cells, intestinal epithelial cells, smooth muscle cells, and dental pulp cells.
  • the sources of the somatic cells include peripheral blood, umbilical cord blood, skin tissue, teeth, and the like.
  • the blood cells include nucleated cells such as mononuclear cells, neutrophils, eosinophils, basophils, and lymphocytes.
  • the blood cells may be vascular endothelial progenitor cells, blood stem/progenitor cells, T cells, or B cells.
  • the somatic cells are preferably blood cells or fibroblasts, more preferably blood cells, and even more preferably mononuclear cells.
  • the peptide-conjugated polyvinyl acetal resin has a polyvinyl acetal resin part and a peptide part.
  • the peptide-containing polyvinyl acetal resin is a polyvinyl acetal resin to which a peptide is bonded.
  • the polyvinyl acetal resin portion and the peptide portion are preferably bonded via a linker portion. Therefore, it is preferable that the peptide-containing polyvinyl acetal resin has a polyvinyl acetal resin part, a peptide part, and a linker part.
  • step (3) a cell scaffold material containing the above peptide-containing polyvinyl acetal resin is used.
  • the cell scaffold material in step (3) contains the peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • step (1) is preferably a step of culturing somatic cells in the presence of a cell scaffold material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • the cell scaffold material in step (1) preferably contains the peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • peptide-containing polyvinyl acetal resin (1) the above-mentioned peptide-containing polyvinyl acetal resin used in step (1) may be referred to as “peptide-containing polyvinyl acetal resin (1).”
  • polyvinyl acetal resin part, peptide part, and linker part that the peptide-containing polyvinyl acetal resin (1) has are referred to as “polyvinyl acetal resin part (1),” “peptide part (1),” and “linker part (1),” respectively. It may be written as
  • peptide-containing polyvinyl acetal resin (3) the above-mentioned peptide-containing polyvinyl acetal resin used in step (3) may be referred to as “peptide-containing polyvinyl acetal resin (3).”
  • polyvinyl acetal resin part, peptide part, and linker part of the peptide-containing polyvinyl acetal resin (3) are referred to as “polyvinyl acetal resin part (3)", “peptide part (3)”, and “linker part (3)”, respectively. It may be written as
  • peptide-containing polyvinyl acetal resin used in step (1) and step (3)
  • peptide-containing polyvinyl acetal resin common explanations for the polyvinyl acetal resin portion, peptide portion, and linker portion of the peptide-containing polyvinyl acetal resin used in step (1) and step (3) are simply “polyvinyl acetal resin portion” and “peptide portion”. and "linker section”.
  • the peptide-containing polyvinyl acetal resin (1) and the peptide-containing polyvinyl acetal resin (3) may be the same or different.
  • the polyvinyl acetal resin part (1) and the polyvinyl acetal resin part (3) may be the same or different.
  • the peptide portion (1) and the peptide portion (3) may be the same or different.
  • the linker part (1) and the linker part (3) may be the same or different.
  • the peptide-containing polyvinyl acetal resin has a polyvinyl acetal resin portion.
  • the polyvinyl acetal resin part is a structural part derived from the polyvinyl acetal resin in the peptide-containing polyvinyl acetal resin. Only one kind of the above polyvinyl acetal resin may be used, or two or more kinds thereof may be used in combination.
  • the polyvinyl acetal resin part has an acetal group, a hydroxyl group, and an acetyl group in the side chain.
  • the polyvinyl acetal resin part does not need to have an acetyl group, for example.
  • all of the acetyl groups in the polyvinyl acetal resin part may be bonded to a linker, so that the polyvinyl acetal resin part does not need to have any acetyl groups.
  • the above polyvinyl acetal resin can be synthesized by acetalizing polyvinyl alcohol with an aldehyde.
  • the above aldehyde used for acetalizing polyvinyl alcohol is not particularly limited.
  • examples of the aldehyde include aldehydes having 1 to 10 carbon atoms.
  • the aldehyde may or may not have a chain aliphatic group, a cyclic aliphatic group, or an aromatic group.
  • the aldehyde may be a chain aldehyde or a cyclic aldehyde.
  • the above aldehydes may be used alone or in combination of two or more.
  • the above aldehyde should be formaldehyde, acetaldehyde, propionaldehyde, butyraldehyde, or pentanal. is preferred, and butyraldehyde is more preferred. Therefore, it is more preferable that the polyvinyl acetal resin is a polyvinyl butyral resin.
  • the polyvinyl acetal resin part (1) is preferably a polyvinyl butyral resin part
  • the polyvinyl acetal resin part (3) is preferably a polyvinyl butyral resin part.
  • the peptide-containing polyvinyl acetal resin (1) has a polyvinyl butyral resin part and a peptide part. It is preferable that it is a peptide-containing polyvinyl butyral resin having the following. From the viewpoint of exhibiting the effects of the present invention even more effectively, the peptide-containing polyvinyl acetal resin (3) is preferably a peptide-containing polyvinyl butyral resin having a polyvinyl butyral resin part and a peptide part.
  • the degree of acetalization (degree of butyralization in the case of a polyvinyl butyral resin portion) of the polyvinyl acetal resin portion (1) is preferably 40 mol% or more, more preferably 50 mol%. % or more, preferably 90 mol% or less, more preferably 85 mol% or less.
  • the degree of acetalization is equal to or higher than the lower limit, the peptide-containing polyvinyl acetal resin (1) becomes difficult to swell in the medium.
  • the degree of acetalization is below the upper limit, the solubility in a solvent can be improved.
  • the degree of acetalization (degree of butyralization in the case of a polyvinyl butyral resin portion) of the polyvinyl acetal resin portion (3) is preferably 40 mol % or more, more preferably 50 mol %. % or more, preferably 90 mol% or less, more preferably 85 mol% or less.
  • the degree of acetalization is equal to or higher than the lower limit, the peptide-containing polyvinyl acetal resin (3) becomes difficult to swell in the medium.
  • the degree of acetalization is below the upper limit, the solubility in a solvent can be improved.
  • the content of hydroxyl groups (amount of hydroxyl groups) in the polyvinyl acetal resin portion (1) is preferably 15 mol% or more, more preferably 20 mol% or more, and preferably 45 mol%.
  • the content is more preferably 30 mol% or less, and even more preferably 25 mol% or less.
  • the content of hydroxyl groups (amount of hydroxyl groups) in the polyvinyl acetal resin portion (3) is preferably 15 mol% or more, more preferably 20 mol% or more, and preferably 45 mol%.
  • the content is more preferably 30 mol% or less, and even more preferably 25 mol% or less.
  • the degree of acetylation (acetyl group amount) of the polyvinyl acetal resin portion (1) is preferably 1 mol% or more, more preferably 2 mol% or more, and preferably 5 mol%.
  • the content is more preferably 4 mol% or less.
  • the degree of acetylation (acetyl group amount) of the polyvinyl acetal resin portion (3) is preferably 1 mol% or more, more preferably 2 mol% or more, and preferably 5 mol%.
  • the content is more preferably 4 mol% or less.
  • the degree of acetalization, degree of acetylation, and amount of hydroxyl groups in the polyvinyl acetal resin part can be measured by 1 H-NMR (nuclear magnetic resonance spectrum).
  • the peptide-containing polyvinyl acetal resin has a peptide portion.
  • the peptide portion is a structural portion derived from a peptide in the peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • the peptide portion has an amino acid sequence.
  • the peptide constituting the peptide portion may be an oligopeptide or a polypeptide. The above peptides may be used alone or in combination of two or more.
  • the number of amino acid residues in the peptide portion (1) is preferably 3 or more, more preferably 4 or more, even more preferably 5 or more, preferably 10 or less, more preferably 8 or less, and still more preferably 6 or less.
  • the number of the amino acid residues is at least the above lower limit and below the above upper limit, the adhesion to cells after seeding can be further improved, and the cell proliferation rate can be further increased.
  • the number of amino acid residues in the peptide portion (1) may exceed 10 or may exceed 15.
  • the number of amino acid residues in the peptide portion (3) is preferably 3 or more, more preferably 4 or more, even more preferably 5 or more, preferably 10 or less, more preferably 8 or less, and still more preferably 6 or less.
  • the number of the amino acid residues is at least the above lower limit and below the above upper limit, the adhesion to cells after seeding can be further improved, and the cell proliferation rate can be further increased.
  • the number of amino acid residues in the peptide portion (3) may exceed 10 or may exceed 15.
  • the peptide portion (1) preferably has a cell-adhesive amino acid sequence.
  • the peptide portion (3) preferably has a cell-adhesive amino acid sequence.
  • the cell-adhesive amino acid sequence refers to an amino acid sequence whose cell-adhesive activity has been confirmed by a phage display method, a sepharose bead method, or a plate coating method.
  • the phage display method for example, the method described in "The Journal of Cell Biology, Volume 130, Number 5, September 1995 1189-1196" can be used.
  • the Sepharose bead method for example, the method described in "Protein Nucleic Acid Enzyme Vol. 45 No. 15 (2000) 2477” can be used.
  • the plate coating method for example, the method described in "Protein Nucleic Acid Enzyme Vol. 45 No. 15 (2000) 2477” can be used.
  • cell-adhesive amino acid sequences examples include RGD sequence (Arg-Gly-Asp), YIGSR sequence (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg), PDSGR sequence (Pro-Asp-Ser-Gly-Arg), HAV sequence (His-Ala-Val), ADT sequence (Ala-Asp-Thr), QAV sequence (Gln-Ala-Val), LDV sequence (Leu-Asp-Val), IDS sequence (Ile-Asp-Ser), REDV sequence (Arg-Glu-Asp-Val), IDAPS sequence (Ile-Asp-Ala-Pro-Ser), KQAGDV sequence (Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val), and TDE sequence (Thr-Asp- Glu), etc.
  • RGD sequence Arg-Gly-Asp
  • YIGSR sequence Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg
  • PDSGR sequence Pro-Asp-Ser
  • the above-mentioned cell-adhesive amino acid sequences are described in "Pathophysiology, Vol. 9, No. 7, pp. 527-535, 1990” and “Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center Journal, Vol. 8, No. 1, 58- 66, 1992", and the like.
  • the peptide portion may have only one type of the above cell-adhesive amino acid sequence, or may have two or more types.
  • the cell-adhesive amino acid sequence preferably has at least one of the cell-adhesive amino acid sequences described above, more preferably has at least an RGD sequence, a YIGSR sequence, or a PDSGR sequence, and preferably has an RGD sequence. It is more preferable, and it is particularly preferable to have at least an RGD sequence represented by the following formula (1). In this case, the adhesion to cells after seeding can be further improved, and the proliferation rate of cells can be further increased.
  • X represents Gly, Ala, Val, Ser, Thr, Phe, Met, Pro, or Asn.
  • the peptide portion (1) may be linear or may have a cyclic peptide skeleton.
  • the peptide portion (3) may be linear or may have a cyclic peptide skeleton.
  • the above-mentioned cyclic peptide skeleton is a cyclic skeleton composed of a plurality of amino acids. From the viewpoint of exhibiting the effects of the present invention more effectively, the cyclic peptide skeleton is preferably composed of 4 or more amino acids, more preferably 5 or more amino acids, and 10 or more amino acids. It is preferably composed of the following amino acids.
  • the content of the peptide moiety (1) is preferably 0.05 mol% or more, more preferably 0.1 mol% or more, even more preferably 0.15 mol% or more. , particularly preferably 0.2 mol% or more, preferably 25 mol% or less, more preferably 20 mol% or less, still more preferably 15 mol% or less, particularly preferably 10 mol% or less.
  • the content of the peptide portion (1) is equal to or higher than the lower limit, the adhesion to cells after seeding can be further improved, and the cell proliferation rate can be further increased.
  • manufacturing cost can be held down as the content rate of the said peptide part (1) is below the said upper limit.
  • the content of the peptide moiety (3) is preferably 0.05 mol% or more, more preferably 0.1 mol% or more, even more preferably 0.15 mol% or more. , particularly preferably 0.2 mol% or more, preferably 25 mol% or less, more preferably 20 mol% or less, still more preferably 15 mol% or less, particularly preferably 10 mol% or less.
  • the content of the peptide portion (3) is equal to or higher than the lower limit, the adhesion to cells after seeding can be further improved, and the cell proliferation rate can be further increased.
  • manufacturing costs can be held down as the content rate of the said peptide part (3) is below the said upper limit.
  • the content (mol %) of the peptide moiety is the amount of the peptide moiety relative to the total amount of each structural unit constituting the peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • the content of the peptide moiety can be measured, for example, by NMR (nuclear magnetic resonance).
  • the peptide-containing polyvinyl acetal resin preferably has a linker portion.
  • the linker portion is a structural portion derived from a linker in the peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • the linker portion is usually located between the polyvinyl acetal resin portion and the peptide portion.
  • the polyvinyl acetal resin portion and the peptide portion are bonded via the linker portion.
  • the linker portion is formed by a linker (crosslinking agent). Only one type of the above linker may be used, or two or more types may be used in combination.
  • the linker is preferably a compound having a functional group capable of bonding with the peptide, and more preferably a compound having a functional group capable of condensing with the carboxyl group or amino group of the peptide.
  • Examples of functional groups that can be condensed with the carboxyl group or amino group of the peptide include carboxyl group, thiol group, amino group, hydroxyl group, and cyano group.
  • the linker is preferably a compound having a carboxyl group or an amino group, and more preferably a compound having a carboxyl group.
  • Examples of the linker having a carboxyl group include (meth)acrylic acid and acrylamide containing a carboxyl group.
  • a carboxylic acid (carboxylic acid monomer) having a polymerizable unsaturated group as the linker having a carboxyl group, the carboxylic acid monomer can be polymerized by graft polymerization when the linker is introduced, and therefore the number of carboxyl groups that can react with the peptide can be increased.
  • the linker is preferably (meth)acrylic acid, more preferably acrylic acid.
  • the number average molecular weight of the peptide-containing polyvinyl acetal resin (1) is preferably 10,000 or more, more preferably 50,000 or more, even more preferably 100,000 or more, preferably 5,000,000 or less, more preferably 2,500,000 or less, still more preferably 1,000,000 or less. .
  • the number average molecular weight is equal to or higher than the lower limit, the cell scaffold material becomes difficult to elute into the liquid medium during cell culture, and the cell scaffold material becomes difficult to peel off from the container etc. during cell culture.
  • solubility in an alcohol solvent can be improved.
  • the number average molecular weight of the peptide-containing polyvinyl acetal resin (3) is preferably 10,000 or more, more preferably 50,000 or more, even more preferably 100,000 or more, preferably 5,000,000 or less, more preferably 2,500,000 or less, still more preferably 1,000,000 or less. .
  • the number average molecular weight is equal to or higher than the lower limit, the cell scaffold material becomes difficult to elute into the liquid medium during cell culture, and also becomes difficult to peel off from the container etc. during cell culture.
  • solubility in an alcohol solvent can be improved.
  • the number average molecular weight of the peptide-containing polyvinyl acetal resin can be measured, for example, by the following method.
  • the above peptide-containing polyvinyl acetal resin is dissolved in tetrahydrofuran (THF) to prepare a 0.2% by weight solution of the peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • evaluation is performed under the following measurement conditions using a gel permeation chromatography (GPC) measuring device (APC system, manufactured by Waters).
  • GPC gel permeation chromatography
  • Examples of methods for obtaining the peptide-containing polyvinyl acetal resin include the following methods.
  • the polyvinyl acetal resin and the linker are reacted to obtain a reaction product in which the polyvinyl acetal resin and the linker are bonded.
  • the obtained reaction product is reacted with a peptide to obtain a peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • a culture vessel equipped with a cell scaffolding material containing the above-mentioned peptide-containing polyvinyl acetal resin can be produced, for example, by the method (A) or (B) below.
  • A) After applying a liquid containing the peptide-containing polyvinyl acetal resin and a solvent onto the surface of a container (cultivation container main body), the solvent is evaporated.
  • B) A layer containing a reactant in which a polyvinyl acetal resin and a linker are bonded is placed on the surface of the container (culture container main body). A solution containing the peptide is added onto the surface of the layer containing the reactant, and the reactant and the peptide are allowed to react.
  • Step (1) The method for producing iPS cells preferably includes a step of culturing somatic cells (step (1)).
  • step (1) is a step of pre-culturing somatic cells.
  • Step (1) may be a step of culturing somatic cells in the absence of a cell scaffold, or may be a step of culturing the somatic cells in the presence of a cell scaffold.
  • Step (1) may be a step of culturing somatic cells in suspension.
  • step (1) is preferably a step of culturing somatic cells in the presence of a cell scaffold.
  • the cell scaffold material is placed, for example, on the surface of the culture substrate body.
  • Step (1) is, for example, a step of culturing somatic cells using a culture substrate including the culture substrate main body and the cell scaffold material.
  • the shape and size of the culture substrate body are not particularly limited.
  • Examples of the culture substrate body include containers, fibers, nonwoven fabrics, hollow fibers, particles, films, and porous membranes.
  • the culture substrate used in step (1) is preferably a culture container.
  • the cell scaffolding material is placed on the bottom surface of the culture container body.
  • the culture container may be a culture dish or a plate having a plurality of wells.
  • cell scaffolding material used in step (1) examples include peptide-containing polyvinyl acetal resin, laminin, vitronectin, and collagen.
  • Commercially available cell scaffolding materials used in step (1) include "iMatrix-511" manufactured by Nippi, "Matrigel” manufactured by Corning, and the like.
  • step (1) is preferably a step of culturing somatic cells in the presence of a cell scaffold material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • somatic cells are cultured in the presence of a cell scaffold containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin in step (1), some somatic cells adhere to the cell scaffold and some somatic cells float without adhering to the cell scaffold. exists.
  • useful cytokines are released from somatic cells adhering to the cell scaffolding material containing the peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • step (1) it is possible that it is secreted.
  • the above is an estimate, and the reason why the effects of the present invention are more effectively exhibited by using a cell scaffolding material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin in step (1) is not limited to this.
  • the peptide-containing polyvinyl acetal resin is preferably present at least on the surface that adheres to somatic cells (the surface that adheres to somatic cells).
  • a conventionally known medium can be used as the medium for culturing somatic cells in step (1).
  • the medium is preferably a liquid medium.
  • a commercially available medium or a self-prepared medium may be used.
  • the medium for example, the medium described in the above-mentioned Non-Patent Document 1 can be used.
  • the final concentrations of cytokines are 45 to 55 ng/mL for IL-6, 45 to 55 ng/mL for SCF, 9 to 11 ng/mL for TPO, and 18 to 18 ng/mL for Flt-3L.
  • a medium containing 22 ng/mL, 18 to 22 ng/mL of IL-3, and 9 to 11 ng/mL of G-CSF is preferably used.
  • a medium having the above-mentioned cytokine concentration can be obtained, for example, by adding these cytokines to the above-mentioned commercially available products so as to have the above-mentioned final concentration.
  • the culture temperature in step (1) is preferably 35°C or higher, preferably 38°C or lower.
  • the CO 2 concentration during culturing in step (1) is preferably 4% or more, preferably 6% or less.
  • the culture conditions in step (1) are 37° C. and 5% CO 2 concentration.
  • the culturing time in step (1) can be, for example, 4 to 6 days (preferably 5 days).
  • the medium may or may not be replaced. When replacing the medium, it can be replaced with fresh medium, for example, once a day.
  • Step (2) The method for producing iPS cells described above includes a step (step (2)) of introducing a reprogramming factor into somatic cells. In step (2), it is preferable to introduce a reprogramming factor into the somatic cells obtained in step (1).
  • step (2) includes a step of collecting somatic cells after step (1) and a step of introducing a reprogramming factor into the collected somatic cells. It is preferable to have one.
  • somatic cells that have adhered to the cell scaffold material after step (1) may be collected, or somatic cells that have not adhered to the cell scaffold material after step (1) may be collected. Alternatively, somatic cells that have adhered to the cell scaffold material after step (1) and somatic cells that have not adhered may be collected.
  • a conventionally known resetting factor can be used as the resetting factor (nuclear resetting factor).
  • Genes included in the above reprogramming factors include Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, and ECAT15. -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1, etc.
  • the above-mentioned initialization factors may be used alone or in combination of two or more.
  • the reprogramming factor preferably includes an Oct family gene, a Sox family gene, a Klf family gene, a Myc family gene, a Lin28 family gene, or a Nanog family gene.
  • the reprogramming factor more preferably includes Oct family genes, Klf family genes, and Sox family genes, even more preferably Oct3/4, Sox2, and Klf4, and Oct3/4, Sox2, Klf4, and c- It is more preferable to contain Myc, and even more preferably to contain Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Lin28 and Nanog.
  • Examples of methods for introducing the reprogramming factor into somatic cells include methods using vectors and methods using mRNA.
  • the vectors include viral vectors such as Sendai virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors, as well as non-viral vectors such as episomal vectors and plasmid vectors.
  • a vector is preferably used, and a Sendai virus vector is more preferably used. That is, in step (2), it is more preferable to introduce the reprogramming factor into somatic cells using a Sendai virus vector. Safety can be increased when Sendai virus vectors are used.
  • Sendai virus vectors examples include the "CytoTune-iPS” series manufactured by ID Pharma and the “SRV iPSC Vector” series manufactured by Tokiwa Bio.
  • step (2) it is preferable to infect with a viral vector (especially Sendai virus vector) at an MOI (Multiplicity of Infection) of 1 or more and 6 or less, and more preferably at an MOI of 3 or more and 4 or less.
  • the infection time is preferably 15 minutes or more and 4 hours or less, more preferably 30 minutes or more and 4 hours or less.
  • step (2) using a vector after introducing the reprogramming factor into somatic cells, the process may proceed to step (3) without culturing the cells into which the reprogramming factor has been introduced. After that, the process may proceed to step (3) through a step of culturing the somatic cells into which the reprogramming factor has been introduced.
  • the step (2) of culturing the somatic cells into which the reprogramming factor has been introduced is performed in the absence of a cell scaffold material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • the culture time of the step (2) of culturing the somatic cells into which the reprogramming factor has been introduced is preferably 7 days or more, and preferably 30 days or less.
  • Method using mRNA In the method for introducing the reprogramming factor into somatic cells, it is also preferable to use mRNA. It is also preferable that the reprogramming factor is mRNA. In this case, safety can be improved because mRNA (reprogramming factor) can be introduced into somatic cells without using a virus.
  • Methods for introducing mRNA (reprogramming factors) into somatic cells include plasma gene transfer, electroporation, lipofection, and the like.
  • the method for introducing mRNA (reprogramming factor) into somatic cells is preferably a plasma gene transfer method. That is, it is preferable to introduce mRNA (reprogramming factor) into somatic cells by plasma gene transfer method. In this case, mRNA (reprogramming factor) can be introduced into somatic cells while suppressing damage to the genome of somatic cells. Note that conventionally known conditions can be employed as conditions for plasma irradiation in the plasma gene introduction method.
  • mRNA (reprogramming factor) into somatic cells is preferably carried out in the presence of a cell scaffolding material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • mRNA (reprogramming factor) is introduced into somatic cells that are adhered to a cell scaffold containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • the efficiency of introducing mRNA into somatic cells can be further increased compared to the case where it is carried out in the presence of a cell scaffold material containing protein.
  • the above step (1) and the above step (2) may be performed using the same culture substrate, and the above step (2) and the above step (3) may be performed using the same culture medium.
  • the above step (1), the above step (2), and the above step (3) may be performed using the same culture substrate.
  • Step (3) The method for producing iPS cells described above includes a step (step (3)) of culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced in the presence of a cell scaffold material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • step (3) the somatic cells obtained in step (2) are cultured in the presence of the cell scaffold material.
  • the cell scaffold material is placed, for example, on the surface of the culture substrate body.
  • Step (3) is, for example, a step of culturing somatic cells using a culture substrate including the culture substrate main body and the cell scaffold material.
  • the shape and size of the culture substrate body are not particularly limited.
  • Examples of the culture substrate body include containers, fibers, nonwoven fabrics, hollow fibers, particles, films, and porous membranes.
  • the culture substrate used in step (3) is preferably a culture container.
  • the cell scaffolding material is placed on the bottom surface of the culture container body.
  • the culture container may be a culture dish or a plate having a plurality of wells.
  • the cell scaffolding material used in step (3) contains a peptide-containing polyvinyl acetal resin.
  • the peptide-containing polyvinyl acetal resin is preferably present at least on the surface that adheres to somatic cells (the surface that adheres to somatic cells).
  • step (3) the somatic cells into which the reprogramming factor has been introduced are preferably cultured on the surface of the cell scaffold material. In step (3), it is preferable to perform adhesive culture.
  • a conventionally known medium can be used as the medium for culturing somatic cells in step (3).
  • the medium is preferably a liquid medium.
  • a commercially available medium or a self-prepared medium may be used.
  • the medium for example, the medium described in the above-mentioned Non-Patent Document 1 can be used.
  • the culture temperature in step (3) is preferably 36°C or higher, preferably 38°C or lower.
  • the CO 2 concentration during culturing in step (3) is preferably 4% or more, preferably 6% or less.
  • the culture conditions in step (3) are 37° C. and 5% CO 2 concentration.
  • the medium may or may not be replaced. When replacing the medium, it can be replaced with a fresh medium once every two days, for example.
  • iPS cells are induced, for example, in about 14 days from the start of culturing in step (3), and a cell population containing iPS cells can be obtained.
  • TRA-1-60 is an antigen specific to iPS cells or ES cells and is not detected in somatic cells, so it is a suitable marker to confirm whether it is induced in iPS cells (for example, WO2018/155595A1, Japanese Patent Application Publication No. 2019-162054, Elayne M Chan1 et al. (Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells, nature biotechnology volume 27 number 11 November 2009)).
  • Culture vessel (S) (a plate equipped with a cell scaffolding material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin, produced by the following production method (S))
  • Culture container (L) (Plate coated with "Laminin 511E8 fragment (iMatrix-511)” manufactured by Nippi, "mircroplate with lid, Flat bottom, TC treated polystylene” manufactured by IWAKI)
  • Culture container (F) floating culture plate, "floating culture plate” manufactured by Corning)
  • polyvinyl acetal resin having a linker (acrylic acid) (polyvinyl butyral resin having a linker).
  • polyvinyl acetal resin having a linker may be referred to as “polyvinyl acetal resin (X)”.
  • Dimethylformamide (DMF) was prepared as the first solvent.
  • Dimethylformamide (DMF) was prepared as a second solvent.
  • a peptide a cyclic peptide having the amino acid sequence Arg-Gly-Asp-Phe-Lys (5 amino acid residues, Arg and Lys bond to form a cyclic skeleton, Phe is D-form) was prepared.
  • 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride was prepared as a condensing agent.
  • a first solution was prepared by mixing 50 parts by weight of polyvinyl acetal resin (X) and 2 parts by weight of peptide with 1000 parts by weight of the first solvent.
  • a condensing agent 1 part by weight was mixed with 1000 parts by weight of the second solvent to prepare a second solution.
  • the obtained solution containing the peptide-containing polyvinyl acetal resin was diluted 100 times with DMF, and the diluted solution was added dropwise to a column filled with an ion exchange resin (manufactured by Organo) at a rate of 0.3 mL/min for washing.
  • the dried solution obtained by vacuum drying at 60°C for 3 hours after washing was dissolved in butanol (alcohol solvent), and 5 parts by weight of acetic acid (pH adjuster) was added to 100 parts by weight of butanol (alcohol solvent). Parts by weight were added to obtain a coating liquid containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin and butanol.
  • the content of the peptide-containing polyvinyl acetal resin in the coating liquid was 0.1% by weight.
  • Preparation of culture container (S) 100 ⁇ L of the resulting coating solution was applied to each well of a 6-well plate (bottom area of each well: 9.5 cm 2 ) by cast coating, and the alcohol solvent was removed by vacuum drying at 60° C. for 3 hours. .
  • a culture vessel (S) was obtained in which a cell scaffolding material (resin film that is a layer of dried material of the coating solution) containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin was placed on the bottom of each well.
  • a cell scaffolding material resin film that is a layer of dried material of the coating solution
  • the content of the peptide moiety was 1 mol%.
  • the number average molecular weight of the peptide-containing polyvinyl acetal resin was 50,000.
  • the following culture medium was prepared.
  • Medium (1) (produced by the following production method (1), equivalent to the mononuclear cell culture medium for Non-Tcells described in Non-Patent Document 1)
  • Medium (2) (produced by the following production method (1), equivalent to the mononuclear cell culture medium for Non-Tcells described in Non-Patent Document 1, same as medium (1))
  • Medium (3) (produced by the following production method (3), equivalent to the maintenance culture medium StemFit described in Non-Patent Document 1)
  • Example 1 Blood-derived mononuclear cells were prepared as somatic cells. In addition, 1.5 mL of medium (1) per well was added to the culture container (S). Next, 1.0 ⁇ 10 6 cells/well of mononuclear cells were seeded in the culture container (S), and cultured in an incubator at 37° C. and a CO 2 concentration of 5% for 5 days. Note that on the third day from the start of culture, 0.75 mL of the liquid in the culture container was replaced with 0.75 mL of fresh liquid medium.
  • step (3) After introducing the reprogramming factor into the somatic cells, step (3) was performed.
  • Process (3) 0.75 mL of medium (2) per well was added to the culture container (S).
  • the somatic cells into which the reprogramming factors obtained in step (2) were introduced were seeded onto the cell scaffold material in the culture container (S) at a cell number of 1.5 x 10 5 cells/well, and incubated at 37°C in an incubator. and adherent culture under conditions of 5% CO 2 concentration.
  • 0.5 mL of fresh medium (3) was added to the culture container (S) on the 1st, 3rd, 5th, and 7th day from the start of the culture in step (3).
  • the liquid in the culture container (S) was replaced with 0.75 mL of fresh medium (3) at least once every two days.
  • Steps (1) to (3) were carried out in the same manner as in Example 1, except that the type of culture container used in step (1) or (3) was changed as shown in the table below.
  • the colony morphology was confirmed on the 14th day after the start of culture in step (3), and it was found to be iPS cell colony morphology.
  • the number used with P means the number of passages after starting step (3).
  • P0 is the 0th passage, specifically the somatic cells obtained in step (2) (the somatic cells seeded in the culture vessel at the start of step (3)). Note that the cells were passaged as follows.
  • Cell passaging The cell population 14 days after starting step (3) was made into single cells using a detachment agent ("TrypLE Select" manufactured by Thermo Fisher Scientific). From the obtained single cells, the total number of cells present in each well of the cell culture container was calculated using a fully automated cell counter. Furthermore, based on the calculated total cell number, cells were passaged by seeding 1 ⁇ 10 4 cells to 50 ⁇ 10 4 cells into the same type of culture container. Note that the cells were passaged once or twice a week, and medium (3) was used as the medium. During subculture, ROCK inhibitor (Y-27632) was added to the medium (3) at a final concentration of 10 ⁇ mol/L. Furthermore, from the day after subculturing, the culture medium was replaced at least once every 3 days.
  • a detachment agent manufactured by Thermo Fisher Scientific.
  • SS, LS, FS, LL, FL, and SL mean the type of culture vessel used in step (1) with the first letter and the type of culture vessel used in step (3) with the second letter. means the type of culture vessel used.
  • LS means that a culture container (L) was used in step (1) and a culture container (S) was used in step (3).
  • Virus survival rate During cell passage, a portion of single cells was collected into a 1.5 mL tube. The collected single cells were measured by flow cytometry ("Attune NxT Flow Cytometer" manufactured by Thermo Fisher Scientific). The percentage of GFP-positive cells contained in the main cell population developed in the FSC-SSC dot plot was analyzed. The results are shown in Figure 1. The smaller the GFP positivity rate on the vertical axis of FIG. 1, the lower the virus survival rate. As shown in FIG. 1, Example 1 was particularly excellent in terms of virus survival rate.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the number of culture days after culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced (the number of culture days after starting step (3)) and the cumulative cell number.
  • Example 3 is a diagram showing the relationship between the number of passages after culturing somatic cells into which reprogramming factors have been introduced (the number of passages after starting step (3)) and the survival rate of the cells.
  • the cell proliferation results of Example 1 were comparable to those of Comparative Examples 1 to 3.
  • the cell viability results of Examples 1 to 3 were comparable to those of Comparative Examples 1 to 3.
  • Undifferentiated (cell surface marker) 4-1
  • Microscopic Observation Using P3 cells in culture, undifferentiation markers on the cell surface were stained according to the following procedure to evaluate undifferentiation.
  • An antibody against TRA-1-60 labeled with NL557 fluorescent dye ("Glo LIVE anti TRA-1-60 NL557” manufactured by R&D Systems) was prepared. Further, an antibody-containing medium (3) was prepared in which this antibody was diluted 50 times with medium (3).
  • P3 cells being cultured were seeded in the culture container used in step (3), and on the 6th day after seeding, the medium (3) in the culture container was replaced with the antibody-containing medium (3). Next, the cells were cultured for 1 hour in an incubator at 37° C. and a CO 2 concentration of 5%.
  • the wells of the culture vessel were washed once with 1 ⁇ DPBS.
  • the wells were observed and photographed in the fluorescent field or bright field using a fluorescence microscope ("BZ-X800" manufactured by Keyence Corporation).
  • the results are shown in Figure 4.
  • the fluorescence field and the bright field are the results of imaging at a magnification of 20x
  • the fluorescence x100 is the result of imaging at a magnification of 100x.
  • the fluorescence field and bright field images in Figure 4 are images obtained by automatically capturing the entire field within the well and combining the entire well into one image using Keyence's image software. be.
  • Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 3 there was no significant difference in the area occupied by cells within the wells.
  • Examples 1 to 3 the number of cells labeled with the above antibody was greater than in Comparative Examples 1 to 3. Furthermore, in Examples 1 to 3, the cells were labeled more brightly than in Comparative Examples 1 to 3, and especially in Example 1, the cells were labeled more brightly than in Examples 2 and 3. Ta.
  • Cells at P6 were made into single cells using a detachment agent ("TrypLE Select” manufactured by Thermo Fisher Scientific) in the same manner as in the "cell passaging" procedure described above.
  • the obtained single cells were subjected to a fully automatic cell counter, and the cell concentration was calculated.
  • 5 ⁇ 10 5 cells were collected into a 1.5 mL tube, and the 1.5 mL tube was centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and 1 ⁇ DPBS was added to a 1.5 mL tube. Then, centrifugation and supernatant removal were performed again under the above conditions. Blocking was then performed with DPBS containing 1% by weight BSA.
  • Undifferentiated (gene expression marker) Using cells P0, P1, P3, and P7, relative quantification of undifferentiated marker genes expressed in each cell was performed. Relative quantification was performed using a PCR device (“QuatnStudio3 Real-time PCR System” manufactured by Thermo Fisher Scientific). Specifically, the evaluation was performed using the following procedure. At the time of subculture, the cell population was detached from the culture container to form a single cell, and 2 ⁇ 10 5 cells were collected into a 1.5 mL tube. Next, cell lysis, cDNA synthesis, and quantitative PCR were performed using the "TaqMan Fast Advanced Cells-to-Ct Kit” manufactured by Thermo Fisher Scientific.
  • the target gene expression markers were NANOG and OCT3/4, and "TaqMan Gene Expression Assay” manufactured by Thermo Fisher Scientific was used as the respective primers and detection reagents. Note that the relative quantitative value was calculated based on the gene amount of cells at P0 of FL. The results are shown in Figure 5. In FIG. 5, the results are shown in the order of P0, P1, P3, and P7 from left to right.
  • P3 cells (iPS cells, single cells) cultured in step (3) were seeded at a cell number of 1.5 ⁇ 10 4 cells/well, centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes, and then incubated in an incubator. , 37° C. and a CO 2 concentration of 5%. The culture medium was replaced the day after seeding and every other day thereafter.
  • Target gene expression markers include AFP, FOXA2, GATA4, GATA6, SOX17, and SOX7 as endoderm markers, KDR and T as mesoderm markers, and NES, PAX6, and SOX1 as ectoderm markers. did.
  • "TaqMan Gene Expression Assay” manufactured by Thermo Fisher Scientific was used for each primer and detection reagent. Note that the relative quantitative value was calculated for each gene expression based on the gene amount of P0 cells.
  • FIG. 10 shows a radar chart summarizing the differentiation score into each germ layer, which is scored based on the presence or absence of an increase in markers. Scores are evaluated as 1, 3, and 2 for each increase in one marker for endoderm, mesoderm, and ectoderm, respectively.
  • Culture vessel (S1) (a plate equipped with a cell scaffolding material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin, produced by the following production method (S1))
  • Culture container (L1) (Plate coated with "Laminin 511E8 fragment (iMatrix-511)” manufactured by Nippi, "mircroplate with lid, Flat bottom, TC treated polystylene” manufactured by IWAKI)
  • Culture container (R1) plate coated with Takara Bio's “RetroNectin (T100A)", Corning's "Falcon Cell Culture 48-well Multiwell Plate (353078)"
  • Culture container (V1) (Plate coated with "Vitronectin (220-02041)” manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd., "Falcon Cell Culture 48-well Multiwell Plate (353078)” manufactured by Corning)
  • TransAct manufactured by Milteny
  • Example 4 an iPS cell establishment test was conducted using the following mRNA.
  • Example 4 Peripheral blood mononuclear cells (“Human PBMC 10M Healthy Japanese (Cat#:93210-10M)” manufactured by Precision for medicine) were prepared as somatic cells. Additionally, 0.4 mL of medium (1) per well was added to the culture container (S1). Next, 5.0 ⁇ 10 5 cells/well of peripheral blood mononuclear cells were seeded in a culture container (S1), and cultured in an incubator at 37° C. and a CO 2 concentration of 5% for 5 days. In addition, on the third day from the start of culture, 0.2 mL of the medium (1) in the culture container (S1) was replaced with 0.2 mL of fresh medium (1).
  • Process (2) The medium (1) was removed from the culture container (S1) after 5 days of culture in step (1). Next, 0.8 ⁇ g/well of mRNA (“ReproRNA-OKSGM” manufactured by STEMCELL Technologies, C/N: ST-05931) was added to the culture container (S1), and transferred to peripheral blood mononuclear cells by plasma gene transfer method. mRNA was introduced. Note that the conditions for plasma irradiation were as follows.
  • Process (3) The following media (3A) and (3B) were prepared.
  • Medium (3A) Recombinant B18R Protein (manufactured by STEMCELL Technologies) was added in an amount of 0.175 ⁇ g to 1 mL of medium (1). A medium (3A) was thus obtained.
  • Example 5 As culture vessels, the above-mentioned culture vessels (S1) and (L1), and the following culture vessels (S2) and (S3) were prepared.
  • Culture container (S2) a plate equipped with a cell scaffolding material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin, produced by the following production method (S2)
  • Culture vessel (S3) a plate equipped with a cell scaffolding material containing a peptide-containing polyvinyl acetal resin, produced by the following production method (S3))
  • Medium (4A) "Fibroblast Growth Medium (Ready-to-use)" manufactured by Takara Bio Inc. was used as the medium (4A).
  • Medium (4A+) To 1 mL of medium (4A), 0.175 ⁇ g of Recombinant B18R Protein (manufactured by STEMCELL Technologies) and 10 ⁇ L of penicillin-streptomycin mixed solution (manufactured by Nacalai Tesque) were added. A medium (4A+) was thus obtained.
  • Medium (4B) "StemFit AK02N” manufactured by Ajinomoto Co., Ltd. was used as the culture medium (4B).
  • Human fibroblasts (“Normal Human Dermal Fibroblasts (Children)” manufactured by Takara Bio Inc.) were prepared as somatic cells. Additionally, 0.2 mL of medium (4A) per well was added to the culture container (S1). Next, 1.0 ⁇ 10 3 cells/well of human fibroblasts were seeded in a culture container (S1), and cultured in an incubator at 37° C. and a CO 2 concentration of 5% for 6 days. In addition, on the third day from the start of culture, 0.2 mL of the medium (4A) in the culture container (S1) was replaced with 0.2 mL of fresh medium (4A).
  • Process (2) The medium (4A) was removed from the culture container (S1) after 6 days of culture in step (1). Next, 0.8 ⁇ g/well of mRNA (“ReproRNA-OKSGM” manufactured by STEMCELL Technologies, C/N: ST-05931) was added to the culture container (S1), and the mRNA was transferred to human fibroblasts by plasma gene transfer method. introduced. Note that the conditions for plasma irradiation were as follows.
  • Process (3) Add 0.4 mL of medium (4A+) per well to a culture container (S1), and incubate the somatic cells into which mRNA (reprogramming factor) has been introduced in an incubator at 37°C and a CO2 concentration of 5%. cultivated under. After 1 day of culture, the entire volume of medium was replaced with 0.4 mL of fresh medium (4A+). On the fourth day from the start of culture in step (3), the entire volume of the medium was replaced with fresh medium (4A+) containing 0.8 ⁇ g of Puromycin per mL.
  • the number of iPS cell colonies was confirmed on the 14th day after the start of culture in step (3). In addition, colonies were peeled off by pipetting and collected into a culture container (S2) (P1). 0.1 mL of the medium (4B) per well was added to the culture container (S2), and cultured in an incubator at 37° C. and a CO 2 concentration of 5%. The entire volume of medium was replaced with fresh medium (4B) every 2 days. On the 6th day after starting the culture in the culture container (S2), single cells were separated using a detachment agent ("TrypLE Select" manufactured by Thermo Fisher Scientific). The cells were passaged (P2) by seeding 2 ⁇ 10 4 cells from the obtained single cells into a culture container (S3).
  • the cells were passaged once a week, and medium (4B) was used as the medium (P3 to P7).
  • ROCK inhibitor (Y-27632) was added to the medium (4B) at a final concentration of 10 ⁇ mol/L. Furthermore, from the day after subculturing, the medium was replaced once every two days.
  • Steps (1) to (3) were performed in the same manner as in Example 5, except that the culture container (L1) was used instead of the culture container (S1).
  • Undifferentiated (cell surface marker) (1-1) Microscopic Observation Using cells 14 days after plasma irradiation, undifferentiation markers on the cell surface were stained according to the following procedure to evaluate undifferentiation.
  • a TRA-1-60 antibody labeled with NL557 fluorescent dye (“Glo LIVE anti TRA-1-60 NL557” manufactured by R&D Systems) was prepared. Further, an antibody-containing medium was prepared by diluting this antibody 50 times with medium (4B). The medium (4B) in the culture container was replaced with the above antibody-containing medium, and cultured in an incubator at 37° C. and a CO 2 concentration of 5% for 1 hour. After 1 hour of culture, the wells of the culture vessel were washed once with 1 ⁇ DPBS.
  • FIG. 12 is a photographic result of a fluorescent field at a magnification of 100 times.
  • Example 5 cells labeled with the above antibody (TRA-1-60 positive cells) were successfully obtained.
  • Comparative Example 4 almost no TRA-1-60 positive cells were obtained. Therefore, the subsequent evaluation was performed only on the cells obtained in Example 5.
  • TRA-1-60 antibody labeled with an FITC fluorescent dye (“TRA-1-60 FITC Antibody” manufactured by BD) was prepared. Cells at day 7 of P3 were reacted with this antibody, and the expression of TRA-1-60 was analyzed using flow cytometry ("Attune NxT Flow Cytometer” manufactured by Thermo Fisher Scientific). Specifically, the evaluation was performed using the following procedure.
  • Cells at the 7th day of P3 were made into single cells using a detachment agent ("TrypLE Select” manufactured by Thermo Fisher Scientific) in the same manner as in the above-mentioned "cell passaging” procedure.
  • the obtained single cells (5 ⁇ 10 5 cells) were collected into a 1.5 mL tube, and the 1.5 mL tube was centrifuged at 300 ⁇ g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed and Pharmingen Stain Buffer (FBS) manufactured by BD was added to a 1.5 mL tube. Then, centrifugation and removal of the supernatant were performed again under the above conditions. Next, blocking was performed using Pharmingen Stain Buffer (FBS) manufactured by BD.
  • FBS Pharmingen Stain Buffer
  • the horizontal axis shows the fluorescence intensity of the FITC fluorescent dye
  • the vertical axis shows the number of cells.
  • the histogram plot on the left in FIG. 13 (without coloring) is a histogram plot when the cells were not reacted with the above antibody
  • the histogram plot on the right in FIG. This is a histogram plot when reacting with
  • the maximum value of the fluorescence intensity in the left histogram plot (without coloring) in FIG. 13 was set as the boundary value between the negative region and the positive region in the right histogram plot (with coloring).
  • the percentage (%) of the number of cells included in the negative and positive regions in the histogram plot (colored) on the right side is shown as "FITC-A-" and "FITC-A+", respectively.
  • the target gene expression markers were NANOG, OCT3/4, and SOX2, and "TaqMan Gene Expression Assay” manufactured by Thermo Fisher Scientific was used as the respective primers and detection reagents.
  • the expression level of each gene expression marker was standardized by the ⁇ CT method using the housekeeping gene 18S. Note that the relative quantitative value was calculated by setting the expression level in a human fibroblast-derived iPS cell line (253G1) established at Kyoto University as 1. The results are shown in FIG.
  • each germ layer differentiation medium (Ectoderm Medium, Mesoderm Medium, Endoderm Medium) of "Trilineage Differentiation Kit” manufactured by Stemcell Technologies was prepared. The above medium was added to each well of the culture container (S3). Note that ROCK inhibitor (Y-27632) was added in advance to the medium used for cell seeding to a final concentration of 10 ⁇ mol/L. Cells at the 7th day of P7 were made into single cells using a detachment agent ("TrypLE Select" manufactured by Thermo Fisher Scientific) in the same manner as in the "cell passaging" procedure described above.
  • cells were seeded at a cell number of 8 x 10 5 cells/well, and for mesoderm differentiation induction at a cell number of 2 x 10 5 cells/well, and incubated at 300 x g and for 5 minutes. After centrifugation, adherent culture was performed in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 concentration. Note that the medium was replaced once a day. For comparison, three germ layer differentiation was induced in the same manner using an iPS cell line (253G1).
  • Immunostaining for endodermal differentiation induction and mesodermal differentiation induction was performed on the 5th day from the start of culture in each differentiation medium, and immunostaining for ectodermal differentiation induction was performed on the 7th day from the start of culture in the differentiation medium.
  • the blocking solution was removed, Wash buffer was added, and the solution was left to stand for 5 minutes, and then the solution was removed. After adding Wash buffer again and leaving it for 5 minutes, the solution was removed. Thereafter, 300 ⁇ L/well of a primary antibody-containing solution was added and left to stand for 2 hours. Each primary antibody-containing solution was prepared by diluting it with a blocking solution. The primary antibody-containing solution was removed, Wash buffer was added at 2 mL/well, left to stand for 5 minutes, and then removed. Wash buffer was added again, and the solution was removed after standing for 5 minutes. Thereafter, a secondary antibody-containing solution was added and incubated overnight in a refrigerator. The next day, staining was performed for 3 minutes with DAPI diluted 1000 times with Wash buffer.
  • Figure 16 shows the results of evaluating the gene expression of each of the markers described above by qPCR.
  • “253G1” and “Example 5" show the results of negative control
  • “253G1 (inside)” and “Example 5 (inside)” show the results after endodermal differentiation induction
  • “253G1 (inside)” show the results after endodermal differentiation induction
  • “Middle)” and “Example 5 (Middle)” show the results after inducing mesodermal differentiation
  • “253G1 (Outside)” and “Example 5 (Outside)” show the results after inducing ectodermal differentiation.

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Abstract

未分化性及び分化能の高い人工多能性幹細胞が得られやすい人工多能性幹細胞の製造方法を提供する。　本発明に係る人工多能性幹細胞の製造方法は、体細胞に初期化因子を導入する工程と、前記初期化因子が導入された体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養する工程とを備える。

Description

人工多能性幹細胞の製造方法
　本発明は、人工多能性幹細胞の製造方法に関する。
　学術分野、創薬分野及び再生医療分野等の研究分野において、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が注目されている。ｉＰＳ細胞は、体細胞に初期化因子（例えば、OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC）を導入することにより作製することができる（例えば、特許文献１）。
　ｉＰＳ細胞の作製方法として、初期化因子が導入された体細胞を、ラミニンがコーティングされたプレート上で培養する方法が広く行われている（例えば、非特許文献１，２）。ラミニンは細胞足場材としての役割を果たす。
　ところで、下記の特許文献２には、ポリビニルアルコール誘導体部及びペプチド部を有するペプチド含有ポリビニルアルコール誘導体を含む細胞培養用足場材料が記載されている。また、特許文献２の実施例には、上記足場材料を用いてｉＰＳ細胞を培養したことが記載されている。しかしながら、特許文献２には、体細胞からｉＰＳ細胞を樹立することについての記載はない。
特開２０１９－１６２０５４号公報 ＷＯ２０２０／２３０８８５Ａ１
プロトコール　フィーダーフリーでのヒトｉＰＳ細胞の樹立・維持培養、CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310（京都大学ｉＰＳ細胞研究所、https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/img/protocol/hipsprotocolFf_140311.pdf、英語版のＵＲＬ：https://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/img/protocol/Ff-iPSC-culture_protocol_E_v140311.pdf） (8) SRV(TM）iPSC-4 Vectorを用いたヒト末梢血単核球・単球からのiPS細胞誘導プロトコル(TKB_P-008-02)（ときわバイオ株式会社、http://tokiwa-bio.com/jp/wp/wp-content/uploads/2022/02/8_%E3%83%92%E3%83%88%E6%9C%AB%E6%A2%A2%E8%A1%80%E5%8D%98%E6%A0%B8%E7%90%83%E3%83%BB%E5%8D%98%E7%90%83%E3%81%8B%E3%82%89%E3%81%AEiPS%E7%B4%B0%E8%83%9E%E8%AA%98%E5%B0%8E%E3%83%97%E3%83%AD%E3%83%88%E3%82%B3%E3%83%AB_02.pdf）
　未分化性及び分化能の高いｉＰＳ細胞の樹立効率を高めるために様々な試みがなされている。しかしながら、未分化性及び分化能の高いｉＰＳ細胞を効率よく得ることは未だに困難である。ｉＰＳ細胞の未分化性が低いと、ｉＰＳ細胞の培養中に意図せずに分化が進むことがある。
　本発明の目的は、未分化性及び分化能の高い人工多能性幹細胞が得られやすい人工多能性幹細胞の製造方法を提供することである。
　本発明の広い局面によれば、体細胞に初期化因子を導入する工程と、前記初期化因子が導入された体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養する工程とを備える、人工多能性幹細胞の製造方法が提供される。
　本発明に係る人工多能性幹細胞の製造方法のある特定の局面では、前記人工多能性幹細胞の製造方法は、前記体細胞に初期化因子を導入する工程よりも前に、体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養する工程を備える。
　本発明に係る人工多能性幹細胞の製造方法のある特定の局面では、前記体細胞に初期化因子を導入する工程において、センダイウイルスベクターを用いて前記体細胞に初期化因子を導入する。
　本発明に係る人工多能性幹細胞の製造方法のある特定の局面では、前記初期化因子が、ｍＲＮＡである。
　本発明に係る人工多能性幹細胞の製造方法のある特定の局面では、前記ｍＲＮＡをプラズマ遺伝子導入法により前記体細胞に導入する。
　本発明によれば、未分化性及び分化能の高い人工多能性幹細胞が得られやすい人工多能性幹細胞の製造方法を提供することができる。
図１は、初期化因子を導入した体細胞を培養してからの継代数と、ウイルスの残存率との関係を示す図である。 図２は、初期化因子を導入した体細胞を培養してからの培養日数と、累積細胞数との関係を示す図である。 図３は、初期化因子を導入した体細胞を培養してからの継代数と、細胞の生存率との関係を示す図である。 図４は、初期化因子を導入した体細胞を培養して得られた細胞（ｉＰＳ細胞）の顕微鏡写真である。蛍光は、TRA-1-60の発現を示している。 図５は、初期化因子を導入した体細胞を培養してからの継代数と、Nanog及びOct3/4の発現量との関係を示す図である。 図６は、ｉＰＳ細胞の分化誘導の開始から３９日目の細胞の顕微鏡写真である。実施例１～３では、胚様体の形成が認められており、比較例１～３では、胚様体の形成が認められていない。 図７は、内胚葉マーカー（AFP、FOXA2、GATA4、GATA6、SOX17、SOX7）の発現量を示す図である。 図８は、中胚葉マーカー（KDR、T）の発現量を示す図である。 図９は、外胚葉マーカー（NES、PAX6、SOX1）の発現量を示す図である。 図１０は、各胚葉への分化スコアをまとめたレーダーチャートである。 図１１は、ｍＲＮＡ（初期化因子）の体細胞への導入実験の結果を示す図である。 図１２は、ｍＲＮＡ（初期化因子）をプラズマ遺伝子導入法により体細胞に導入してから１４日目の細胞の蛍光視野での顕微鏡写真である。 図１３は、FITC蛍光強度と、細胞数との関係を示す図である。 図１４は、NANOG、OCT3/4、及びSOX2の発現量（相対定量値）を示す図である。 図１５は、免疫染色後の細胞の蛍光視野での顕微鏡写真である。 図１６は、内胚葉マーカー（FOXA2、SOX17）、中胚葉マーカー（T）、外胚葉マーカー（PAX6）の発現量（相対定量値）を示す図である。
　以下、本発明の詳細を説明する。
　本発明に係る人工多能性幹細胞の製造方法は、体細胞に初期化因子を導入する工程と、上記初期化因子が導入された体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養する工程とを備える。
　本発明に係る人工多能性幹細胞の製造方法では、上記の構成が備えられているので、未分化性及び分化能の高い人工多能性幹細胞が得られやすい。
　従来、人工多能性幹細胞の作製方法として、初期化因子が導入された体細胞を、ラミニン（細胞足場材）がコーティングされたプレート上で培養する方法が広く行われている。本発明者らは、初期化因子が導入された体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養することにより、未分化性及び分化能の高い人工多能性幹細胞が得られやすいことを見出した。特に、本発明では、初期化因子が導入された体細胞をラミニン上で培養して人工多能性幹細胞を樹立する従来の方法と比べて、未分化マーカーであるTRA-1-60の発現量の高い人工多能性幹細胞を得ることができる。また、本発明で得られる人工多能性幹細胞では、初期化因子が導入された体細胞をラミニン上で培養して得られる人工多能性幹細胞と比べて、胚様体を効率的に形成させることができ、分化能を維持することができる。
　本発明に係る人工多能性幹細胞の製造方法は、上記体細胞に初期化因子を導入する工程よりも前に、体細胞を培養する工程を備えることが好ましい。
　本明細書において、「人工多能性幹細胞」を「ｉＰＳ細胞」と称することがある。本明細書において、上記体細胞に初期化因子を導入する工程よりも前に備えられる上記「体細胞を培養する工程」を「工程（１）」と称することがある。また、本明細書において、上記「体細胞に初期化因子を導入する工程」を「工程（２）」と称することがあり、上記「初期化因子が導入された体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養する工程」を「工程（３）」と称することがある。
　したがって、本発明に係るｉＰＳ細胞の製造方法は、工程（２）と工程（３）とを備える。本発明に係るｉＰＳ細胞の製造方法は、工程（１）と工程（２）と工程（３）とを備えることが好ましい。
　まず、本発明で使用可能な体細胞及びペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂について説明する。
　（体細胞）
　上記体細胞として、ｉＰＳ細胞を樹立するために用いられる従来公知の体細胞を使用可能である。上記体細胞は、動物細胞であることが好ましく、哺乳動物細胞であることがより好ましく、ヒト細胞であることが更に好ましい。
　上記体細胞としては、血液細胞、繊維芽細胞、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞、及び歯髄細胞等が挙げられる。上記体細胞の由来としては、末梢血、臍帯血、皮膚組織、及び歯等が挙げられる。
　上記血液細胞としては、単核球細胞、好中球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球等の有核細胞が挙げられる。上記血液細胞は、血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。
　上記体細胞は、血液細胞又は繊維芽細胞であることが好ましく、血液細胞であることがより好ましく、単核球細胞であることが更に好ましい。
　（ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂）
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（peptide-conjugated polyvinyl acetal resin）は、ポリビニルアセタール樹脂部とペプチド部とを有する。上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂は、ペプチドが結合したポリビニルアセタール樹脂である。上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂では、上記ポリビニルアセタール樹脂部と上記ペプチド部とが、リンカー部を介して結合していることが好ましい。したがって、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂は、ポリビニルアセタール樹脂部と、ペプチド部と、リンカー部とを有することが好ましい。
　工程（３）では、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材が用いられる。工程（３）における上記細胞足場材は、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む。また、後述するように、工程（１）は、体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養する工程であることが好ましい。工程（１）における上記細胞足場材は、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含むことが好ましい。
　本明細書において、工程（１）で用いられる上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を「ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（１）」と記載することがある。また、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（１）が有するポリビニルアセタール樹脂部、ペプチド部及びリンカー部をそれぞれ、「ポリビニルアセタール樹脂部（１）」、「ペプチド部（１）」及び「リンカー部（１）」と記載することがある。
　本明細書において、工程（３）で用いられる上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を「ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（３）」と記載することがある。また、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（３）が有するポリビニルアセタール樹脂部、ペプチド部及びリンカー部をそれぞれ、「ポリビニルアセタール樹脂部（３）」、「ペプチド部（３）」及び「リンカー部（３）」と記載することがある。
　以下の説明において、工程（１）及び工程（３）で用いられるペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂の共通の構成については、単に「ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂」として説明する。また、工程（１）及び工程（３）で用いられるペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂が有するポリビニルアセタール樹脂部、ペプチド部及びリンカー部の共通の説明については、単に「ポリビニルアセタール樹脂部」、「ペプチド部」及び「リンカー部」として説明する。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（１）と上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（３）とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。上記ポリビニルアセタール樹脂部（１）と上記ポリビニルアセタール樹脂部（３）とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。上記ペプチド部（１）と上記ペプチド部（３）とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。上記リンカー部（１）と上記リンカー部（３）とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。
　＜ポリビニルアセタール樹脂部＞
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂は、ポリビニルアセタール樹脂部を有する。上記ポリビニルアセタール樹脂部は、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂において、ポリビニルアセタール樹脂に由来する構造部分である。上記ポリビニルアセタール樹脂は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記ポリビニルアセタール樹脂部は、側鎖にアセタール基と、水酸基と、アセチル基とを有することが好ましい。ただし、上記ポリビニルアセタール樹脂部は、例えば、アセチル基を有していなくてもよい。例えば、ポリビニルアセタール樹脂部のアセチル基の全てが、リンカーと結合することによって、上記ポリビニルアセタール樹脂部がアセチル基を有していなくてもよい。
　上記ポリビニルアセタール樹脂は、ポリビニルアルコールをアルデヒドによりアセタール化することによって合成することができる。
　ポリビニルアルコールのアセタール化に用いられる上記アルデヒドは、特に限定されない。上記アルデヒドとしては、例えば、炭素数が１～１０のアルデヒドが挙げられる。上記アルデヒドは、鎖状脂肪族基、環状脂肪族基又は芳香族基を有していてもよく、有していなくてもよい。上記アルデヒドは、鎖状アルデヒドであってもよく、環状アルデヒドであってもよい。上記アルデヒドは、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　細胞足場材と細胞との接着性をより一層高める観点及び本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記アルデヒドは、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、又はペンタナールであることが好ましく、ブチルアルデヒドであることがより好ましい。したがって、上記ポリビニルアセタール樹脂は、ポリビニルブチラール樹脂であることがより好ましい。上記ポリビニルアセタール樹脂部（１）は、ポリビニルブチラール樹脂部であることが好ましく、上記ポリビニルアセタール樹脂部（３）は、ポリビニルブチラール樹脂部であることが好ましい。細胞足場材と細胞との接着性をより一層高める観点及び本発明の効果をより一層効果的に発揮させる観点からは、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（１）は、ポリビニルブチラール樹脂部とペプチド部とを有するペプチド含有ポリビニルブチラール樹脂であることが好ましい。本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（３）は、ポリビニルブチラール樹脂部とペプチド部とを有するペプチド含有ポリビニルブチラール樹脂であることが好ましい。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（１）において、上記ポリビニルアセタール樹脂部（１）のアセタール化度（ポリビニルブチラール樹脂部の場合にはブチラール化度）は、好ましくは４０モル％以上、より好ましくは５０モル％以上、好ましくは９０モル％以下、より好ましくは８５モル％以下である。上記アセタール化度が上記下限以上であると、培地中でペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（１）が膨潤しにくくなる。上記アセタール化度が上記上限以下であると、溶剤への溶解性を良好にすることができる。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（３）において、上記ポリビニルアセタール樹脂部（３）のアセタール化度（ポリビニルブチラール樹脂部の場合にはブチラール化度）は、好ましくは４０モル％以上、より好ましくは５０モル％以上、好ましくは９０モル％以下、より好ましくは８５モル％以下である。上記アセタール化度が上記下限以上であると、培地中でペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（３）が膨潤しにくくなる。上記アセタール化度が上記上限以下であると、溶剤への溶解性を良好にすることができる。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（１）において、上記ポリビニルアセタール樹脂部（１）の水酸基の含有率（水酸基量）は、好ましくは１５モル％以上、より好ましくは２０モル％以上、好ましくは４５モル％以下、より好ましくは３０モル％以下、更に好ましくは２５モル％以下である。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（３）において、上記ポリビニルアセタール樹脂部（３）の水酸基の含有率（水酸基量）は、好ましくは１５モル％以上、より好ましくは２０モル％以上、好ましくは４５モル％以下、より好ましくは３０モル％以下、更に好ましくは２５モル％以下である。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（１）において、上記ポリビニルアセタール樹脂部（１）のアセチル化度（アセチル基量）は、好ましくは１モル％以上、より好ましくは２モル％以上、好ましくは５モル％以下、より好ましくは４モル％以下である。上記アセチル化度が上記下限以上及び上記上限以下であると、ポリビニルアセタール樹脂とリンカーとの反応効率を高めることができる。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（３）において、上記ポリビニルアセタール樹脂部（３）のアセチル化度（アセチル基量）は、好ましくは１モル％以上、より好ましくは２モル％以上、好ましくは５モル％以下、より好ましくは４モル％以下である。上記アセチル化度が上記下限以上及び上記上限以下であると、ポリビニルアセタール樹脂とリンカーとの反応効率を高めることができる。
　上記ポリビニルアセタール樹脂部のアセタール化度、アセチル化度及び水酸基量は、１Ｈ－ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）により測定することができる。
　＜ペプチド部＞
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂は、ペプチド部を有する。上記ペプチド部は、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂において、ペプチドに由来する構造部分である。上記ペプチド部は、アミノ酸配列を有する。上記ペプチド部を構成するペプチドは、オリゴペプチドであってもよく、ポリペプチドであってもよい。上記ペプチドは、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記ペプチド部（１）のアミノ酸残基の数は、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、更に好ましくは５個以上、好ましくは１０個以下、より好ましくは８個以下、更に好ましくは６個以下である。上記アミノ酸残基の数が上記下限以上及び上記上限以下であると、播種後の細胞との接着性をより一層高めることができ、細胞の増殖率をより一層高めることができる。ただし、上記ペプチド部（１）のアミノ酸残基の数は１０個を超えていてもよく、１５個を超えていてもよい。
　上記ペプチド部（３）のアミノ酸残基の数は、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、更に好ましくは５個以上、好ましくは１０個以下、より好ましくは８個以下、更に好ましくは６個以下である。上記アミノ酸残基の数が上記下限以上及び上記上限以下であると、播種後の細胞との接着性をより一層高めることができ、細胞の増殖率をより一層高めることができる。ただし、上記ペプチド部（３）のアミノ酸残基の数は１０個を超えていてもよく、１５個を超えていてもよい。
　上記ペプチド部（１）は、細胞接着性のアミノ酸配列を有することが好ましい。上記ペプチド部（３）は、細胞接着性のアミノ酸配列を有することが好ましい。なお、細胞接着性のアミノ酸配列とは、ファージディスプレイ法、セファローズビーズ法、又はプレートコート法によって細胞接着活性が確認されているアミノ酸配列をいう。上記ファージディスプレイ法としては、例えば、「The Journal of Cell Biology, Volume 130, Number 5, September 1995 1189-1196」に記載の方法を用いることができる。上記セファローズビーズ法としては、例えば「蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４５　Ｎｏ．１５　（２０００）　２４７７」に記載の方法を用いることができる。上記プレートコート法としては、例えば「蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４５　Ｎｏ．１５　（２０００）　２４７７」に記載の方法を用いることができる。
　上記細胞接着性のアミノ酸配列としては、例えば、ＲＧＤ配列（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）、ＹＩＧＳＲ配列（Ｔｙｒ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ）、ＰＤＳＧＲ配列（Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ）、ＨＡＶ配列（Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｖａｌ）、ＡＤＴ配列（Ａｌａ－Ａｓｐ－Ｔｈｒ）、ＱＡＶ配列（Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｖａｌ）、ＬＤＶ配列（Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ）、ＩＤＳ配列（Ｉｌｅ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ）、ＲＥＤＶ配列（Ａｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ）、ＩＤＡＰＳ配列（Ｉｌｅ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ）、ＫＱＡＧＤＶ配列（Ｌｙｓ－Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｖａｌ）、及びＴＤＥ配列（Ｔｈｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ）等が挙げられる。また、上記細胞接着性のアミノ酸配列としては、「病態生理、第９巻　第７号、５２７～５３５頁、１９９０年」、及び「大阪府立母子医療センター雑誌、第８巻　第１号、５８～６６頁、１９９２年」に記載されている配列等も挙げられる。上記ペプチド部は、上記細胞接着性のアミノ酸配列を１種のみ有していてもよく、２種以上を有してもよい。
　上記細胞接着性のアミノ酸配列は、上述した細胞接着性のアミノ酸配列の内の少なくともいずれかを有することが好ましく、ＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、又はＰＤＳＧＲ配列を少なくとも有することがより好ましく、ＲＧＤ配列を有することが更に好ましく、下記式（１）で表されるＲＧＤ配列を少なくとも有することが特に好ましい。この場合には、播種後の細胞との接着性をより一層高めることができ、細胞の増殖率をより一層高めることができる。
　Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｘ　　　・・・式（１）
　上記式（１）中、Ｘは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、又はＡｓｎを表す。
　上記ペプチド部（１）は、直鎖状であってもよく、環状ペプチド骨格を有していてもよい。上記ペプチド部（３）は、直鎖状であってもよく、環状ペプチド骨格を有していてもよい。上記環状ペプチド骨格とは、複数個のアミノ酸により構成された環状骨格である。本発明の効果を一層効果的に発揮させる観点からは、上記環状ペプチド骨格は、４個以上のアミノ酸により構成されることが好ましく、５個以上のアミノ酸により構成されることがより好ましく、１０個以下のアミノ酸により構成されることが好ましい。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（１）において、上記ペプチド部（１）の含有率は、好ましくは０．０５モル％以上、より好ましくは０．１モル％以上、更に好ましくは０．１５モル％以上、特に好ましくは０．２モル％以上、好ましくは２５モル％以下、より好ましくは２０モル％以下、更に好ましくは１５モル％以下、特に好ましくは１０モル％以下である。上記ペプチド部（１）の含有率が上記下限以上であると、播種後の細胞との接着性をより一層高めることができ、細胞の増殖率をより一層高めることができる。また、上記ペプチド部（１）の含有率が上記上限以下であると、製造コストを抑えることができる。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（３）において、上記ペプチド部（３）の含有率は、好ましくは０．０５モル％以上、より好ましくは０．１モル％以上、更に好ましくは０．１５モル％以上、特に好ましくは０．２モル％以上、好ましくは２５モル％以下、より好ましくは２０モル％以下、更に好ましくは１５モル％以下、特に好ましくは１０モル％以下である。上記ペプチド部（３）の含有率が上記下限以上であると、播種後の細胞との接着性をより一層高めることができ、細胞の増殖率をより一層高めることができる。また、上記ペプチド部（３）の含有率が上記上限以下であると、製造コストを抑えることができる。
　上記ペプチド部の含有率（モル％）は、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を構成する各構造単位の物質量の総和に対する上記ペプチド部の物質量である。
　上記ペプチド部の含有率は、例えばＮＭＲ（核磁気共鳴）により測定することができる。
　＜リンカー部＞
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂は、リンカー部を有することが好ましい。上記リンカー部は、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂において、リンカーに由来する構造部分である。上記リンカー部は、通常、上記ポリビニルアセタール樹脂部と上記ペプチド部との間に位置する。上記ポリビニルアセタール樹脂部と上記ペプチド部とが、上記リンカー部を介して結合している。上記リンカー部は、リンカー（架橋剤）によって形成される。上記リンカーは、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記リンカーは、上記ペプチドと結合可能な官能基を有する化合物であることが好ましく、上記ペプチドのカルボキシル基又はアミノ基と縮合可能な官能基を有する化合物であることがより好ましい。
　上記ペプチドのカルボキシル基又はアミノ基と縮合可能な官能基としては、カルボキシル基、チオール基、アミノ基、水酸基及びシアノ基等が挙げられる。
　ペプチドと良好に反応させる観点からは、上記リンカーは、カルボキシル基又はアミノ基を有する化合物であることが好ましく、カルボキシル基を有する化合物であることがより好ましい。
　上記カルボキシル基を有するリンカーとしては、（メタ）アクリル酸及びカルボキシル基含有アクリルアミド等が挙げられる。上記カルボキシル基を有するリンカーとして重合性不飽和基を有するカルボン酸（カルボン酸モノマー）を用いることにより、リンカーの導入時にグラフト重合により該カルボン酸モノマーを重合させることができるため、ペプチドと反応させることができるカルボキシル基の個数を増やすことができる。
　ポリビニルアセタール樹脂とペプチドとを良好に結合させる観点からは、上記リンカーは、（メタ）アクリル酸であることが好ましく、アクリル酸であることがより好ましい。
　＜ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂の他の詳細＞
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（１）の数平均分子量は、好ましくは１００００以上、より好ましくは５００００以上、更に好ましくは１０００００以上、好ましくは５００００００以下、より好ましくは２５０００００以下、更に好ましくは１００００００以下である。上記数平均分子量が上記下限以上であると、細胞培養中に細胞足場材が液体培地中へ溶出しにくくなり、また、細胞培養中に細胞足場材が容器等から剥離しにくくなる。上記数平均分子量が上記上限以下であると、アルコール溶媒への溶解性を高めることができる。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂（３）の数平均分子量は、好ましくは１００００以上、より好ましくは５００００以上、更に好ましくは１０００００以上、好ましくは５００００００以下、より好ましくは２５０００００以下、更に好ましくは１００００００以下である。上記数平均分子量が上記下限以上であると、細胞培養中に細胞足場材が液体培地中へ溶出しにくくなり、また、細胞培養中に細胞足場材が容器等から剥離しにくくなる。上記数平均分子量が上記上限以下であると、アルコール溶媒への溶解性を高めることができる。
　なお、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂の数平均分子量は、例えば以下の方法により測定することができる。上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂の０．２重量％溶液を調製する。次に、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定装置（ＡＰＣシステム、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて、以下の測定条件により評価する。
　カラム：ＨＳＰｇｅｌ　ＨＲ　ＭＢ－Ｍ　６．０×１５０ｍｍ
　流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム温度：４０℃
　注入量：１０μＬ
　検出器：ＲＩ、ＰＤＡ
　標準試料：ポリスチレン
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を得る方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
　ポリビニルアセタール樹脂と、リンカーとを反応させて、ポリビニルアセタール樹脂とリンカーとが結合した反応物を得る。得られた反応物と、ペプチドとを反応させて、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を得る。
　上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材を備える培養容器は、例えば、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の方法で作製することができる。（Ａ）上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂と溶媒とを含む液を、容器（培養容器本体）の表面上に塗工した後、溶媒を揮発させる。（Ｂ）容器（培養容器本体）の表面上に、ポリビニルアセタール樹脂とリンカーとが結合した反応物を含む層を配置する。上記反応物を含む層の表面上にペプチドを含む液を添加し、反応物とペプチドとを反応させる。
　以下、本発明に係るｉＰＳ細胞の製造方法の詳細について、更に説明する。
　（工程（１））
　上記ｉＰＳ細胞の製造方法は、体細胞を培養する工程（工程（１））を備えることが好ましい。工程（１）は、体細胞を前培養する工程であることが好ましい。工程（１）は、体細胞を、細胞足場材の非存在下で培養する工程であってもよく、細胞足場材の存在下で培養する工程であってもよい。工程（１）は、体細胞を浮遊培養する工程であってもよい。本発明の効果を効果的に発揮させる観点からは、工程（１）は、体細胞を、細胞足場材の存在下で培養する工程であることが好ましい。上記細胞足場材は、例えば、培養基材本体の表面上に配置されている。工程（１）は、例えば、上記培養基材本体と上記細胞足場材とを備える培養基材を用いて、体細胞を培養する工程である。
　上記培養基材本体の形状及び大きさは特に限定されない。上記培養基材本体としては、例えば、容器、繊維、不織布、中空糸、粒子、フィルム、及び多孔質膜等が挙げられる。
　工程（１）で用いられる培養基材は、培養容器であることが好ましい。この場合に、上記細胞足場材は、培養容器本体の底面に配置されていることが好ましい。上記培養容器は、培養ディッシュであってもよく、複数のウェルを有するプレートであってもよい。
　工程（１）で用いられる細胞足場材としては、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂、ラミニン、ビトロネクチン及びコラーゲン等が挙げられる。工程（１）で用いられる細胞足場材の市販品としては、ニッピ社製「iMatrix-511」、コーニング社製「Matrigel」等が挙げられる。
　本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、工程（１）は、体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養する工程であることが好ましい。工程（１）において体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養したとき、細胞足場材に接着する体細胞と、細胞足場材に接着せずに浮遊する体細胞とが存在する。上記細胞足場材を用いることにより本発明の効果がより一層効果的に発揮される理由は定かではないが、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材に接着している体細胞から有用なサイトカインが分泌している可能性が考えられる。ただし、上記は推定であり、工程（１）においてペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材を用いることにより、本発明の効果がより一層効果的に発揮される理由は、これに限定されない。
　工程（１）で用いられる上記細胞足場材において、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂は、体細胞と接着する表面（体細胞との接着面）に少なくとも存在することが好ましい。
　工程（１）で体細胞を培養するための培地として、従来公知の培地を使用可能である。上記培地は、液体培地であることが好ましい。上記培地として、市販品の培地を用いてもよく、自家調製した培地を用いてもよい。上記培地としては、例えば、上述の非特許文献１に記載の培地を用いることができる。
　培地の市販品としては、味の素社製「Stem Fit」、STEMCELL Technologies社製「StemSpan-ACF」、「TeSR E8」及び「mTeSR1」、Lonza社製「X-VIVO 10」、並びに、Thermo Fisher Scientific社製「StemFlex」及び「Essential 8」等が挙げられる。また、上記培地として、上記市販品に各種サイトカインを添加した培地を用いてもよい。
　上記体細胞として単核球細胞を用いる場合、サイトカインの終濃度として、ＩＬ－６を４５～５５ｎｇ／ｍＬ、ＳＣＦを４５～５５ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯを９～１１ｎｇ／ｍＬ、Ｆｌｔ－３Ｌを１８～２２ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－３を１８～２２ｎｇ／ｍＬ、Ｇ－ＣＳＦを９～１１ｎｇ／ｍＬで含む培地が好適に用いられる。上記サイトカイン濃度を有する培地は、例えば、上記市販品にこれらのサイトカインを上記終濃度となるように添加することにより得ることができる。
　工程（１）の培養温度は、好ましくは３５℃以上、好ましくは３８℃以下である。工程（１）の培養時のＣＯ２濃度は、好ましくは４％以上、好ましくは６％以下である。例えば、工程（１）の培養条件は、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件である。工程（１）の培養時間は、例えば、４日間～６日間（好ましくは５日間）とすることができる。工程（１）の培養時には、培地の交換を行ってもよく、行わなくてもよい。培地の交換を行う場合には、例えば、１日１回の頻度で新鮮な培地に交換することができる。
　（工程（２））
　上記ｉＰＳ細胞の製造方法は、体細胞に初期化因子を導入する工程（工程（２））を備える。工程（２）では、工程（１）で得られた体細胞に初期化因子を導入することが好ましい。
　本発明の効果をより一層効果的に発揮する観点からは、工程（２）は、工程（１）後に体細胞を採取する工程と、採取された体細胞に初期化因子を導入する工程とを備えることが好ましい。
　上記体細胞を採取する工程では、工程（１）後の細胞足場材に接着している体細胞を採取してもよく、工程（１）後の細胞足場材に接着していない体細胞を採取してもよく、工程（１）後の細胞足場材に接着している体細胞と接着していない体細胞とを採取してもよい。上記体細胞を採取する工程では、培養容器内の溶液（体細胞含有液）をピペッティングしてチューブへ回収することが好ましい。その後、培養容器内にＤＰＢＳ（－）を添加して得られた液を、上記溶液を回収したチューブへ回収してもよく、回収しなくてもよい。
　上記初期化因子（核初期化因子）として、従来公知の初期化因子を用いることができる。
　上記初期化因子に含まれる遺伝子としては、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等が挙げられる。上記初期化因子は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
　上記初期化因子は、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Lin28ファミリー遺伝子、又はNanogファミリー遺伝子を含むことが好ましい。
　上記初期化因子は、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子を含むことがより好ましく、Oct3/4、Sox2及びKlf4を含むことがより一層好ましく、Oct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycを含むことが更に好ましく、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28及びNanogを含むことが更に好ましい。
　上記初期化因子の体細胞への導入方法として、従来公知の導入方法を用いることができる。
　上記初期化因子を体細胞に導入する方法としては、ベクターを用いる方法及びｍＲＮＡを用いる方法等が挙げられる。上記ベクターとしては、センダイウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクター、並びに、エピゾーマルベクター及びプラスミドベクター等の非ウイルス性ベクター等が挙げられる。
　ベクターを用いる方法：
　上記初期化因子を体細胞に導入する方法では、ベクターを用いることが好ましく、センダイウイルスベクターを用いることがより好ましい。すなわち、工程（２）において、センダイウイルスベクターを用いて体細胞に初期化因子を導入することがより好ましい。センダイウイルスベクターを用いる場合には、安全性を高めることができる。
　上記センダイウイルスベクターの市販品としては、ＩＤファーマ社製「CytoTune-iPS」シリーズ、及びときわバイオ社製「SRV iPSC Vector」シリーズ等が挙げられる。
　工程（２）では、ウイルスベクター（特にセンダイウイルスベクター）を１以上６以下のＭＯＩ（Multiplicity of Infection）で感染させることが好ましく、３以上４以下のＭＯＩで感染させることがより好ましい。また、感染時間は、１５分間以上４時間以下であることが好ましく、３０分間以上４時間以下であることがより好ましい。
　ベクターを用いる工程（２）では、体細胞に初期化因子を導入した後、初期化因子が導入された細胞を培養することなく工程（３）に進んでもよく、体細胞に初期化因子を導入した後、初期化因子が導入された体細胞を培養する工程を経て、工程（３）に進んでもよい。工程（２）における上記初期化因子が導入された体細胞を培養する工程は、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の非存在下で行われる培養である。工程（２）における上記初期化因子が導入された体細胞を培養する工程の培養時間は、好ましくは７日以上、好ましくは３０日以下である。
　ｍＲＮＡを用いる方法：
　上記初期化因子を体細胞に導入する方法では、ｍＲＮＡを用いることも好ましい。上記初期化因子は、ｍＲＮＡであることも好ましい。この場合には、ウイルスを用いずにｍＲＮＡ（初期化因子）を体細胞に導入することができるので、安全性を高めることができる。
　ｍＲＮＡ（初期化因子）を体細胞に導入する方法としては、プラズマ遺伝子導入法、電気穿孔法及びリポフェクション法等が挙げられる。
　ｍＲＮＡ（初期化因子）を体細胞に導入する方法は、プラズマ遺伝子導入法であることが好ましい。すなわち、ｍＲＮＡ（初期化因子）をプラズマ遺伝子導入法により体細胞に導入することが好ましい。この場合には、体細胞のゲノムの損傷を抑えつつ、ｍＲＮＡ（初期化因子）を体細胞に導入することができる。なお、プラズマ遺伝子導入法におけるプラズマ照射の条件として、従来公知の条件を採用可能である。
　ｍＲＮＡ（初期化因子）の体細胞への導入は、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で行うことが好ましい。ｍＲＮＡ（初期化因子）を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材に接着している体細胞に導入することが好ましい。この場合、理由は定かではないが、タンパク質を含む細胞足場材の存在下で行う場合と比べて、ｍＲＮＡの体細胞への導入効率をより一層高めることができる。
　ｍＲＮＡを用いる工程（２）では、上記工程（１）と上記工程（２）とを同じ培養基材を用いて行ってもよく、上記工程（２）と上記工程（３）とを同じ培養基材を用いて行ってもよく、上記工程（１）と上記工程（２）と上記工程（３）とを同じ培養基材を用いて行ってもよい。
　（工程（３））
　上記ｉＰＳ細胞の製造方法は、初期化因子が導入された体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養する工程（工程（３））を備える。工程（３）では、工程（２）で得られた体細胞を、上記細胞足場材の存在下で培養する。上記細胞足場材は、例えば、培養基材本体の表面上に配置されている。工程（３）は、例えば、上記培養基材本体と上記細胞足場材とを備える培養基材を用いて、体細胞を培養する工程である。
　上記培養基材本体の形状及び大きさは特に限定されない。上記培養基材本体としては、例えば、容器、繊維、不織布、中空糸、粒子、フィルム、及び多孔質膜等が挙げられる。
　工程（３）で用いられる培養基材は、培養容器であることが好ましい。この場合に、上記細胞足場材は、培養容器本体の底面に配置されていることが好ましい。上記培養容器は、培養ディッシュであってもよく、複数のウェルを有するプレートであってもよい。
　工程（３）で用いられる細胞足場材は、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む。工程（３）で用いられる細胞足場材において、上記ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂は、体細胞と接着する表面（体細胞との接着面）に少なくとも存在することが好ましい。
　工程（３）では、初期化因子を導入した体細胞を上記細胞足場材の表面上で培養することが好ましい。工程（３）では、接着培養を行うことが好ましい。
　工程（３）で体細胞を培養するための培地として、従来公知の培地を使用可能である。上記培地は、液体培地であることが好ましい。上記培地として、市販品の培地を用いてもよく、自家調製した培地を用いてもよい。上記培地としては、例えば、上述の非特許文献１に記載の培地を用いることができる。
　培地の市販品としては、味の素社製「Stem Fit」、STEMCELL Technologies社製「StemSpan-ACF」、「TeSR-E8」及び「mTeSR1」、Lonza社製「X-VIVO 10」、並びに、Thermo Fisher Scientific社製「StemFlex」及び「Essential 8」等が挙げられる。また、上記培地として、上記市販品の各種サイトカインを添加した培地を用いてもよい。
　工程（３）の培養温度は、好ましくは３６℃以上、好ましくは３８℃以下である。工程（３）の培養時のＣＯ２濃度は、好ましくは４％以上、好ましくは６％以下である。例えば、工程（３）の培養条件は、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件である。また、工程（３）の培養時には、培地の交換を行ってもよく、行わなくてもよい。培地の交換を行う場合には、例えば、２日間に１回の頻度で新鮮な培地に交換することができる。
　工程（３）の培養開始から、例えば、１４日間程度でｉＰＳ細胞が誘導され、ｉＰＳ細胞を含む細胞集団を得ることができる。
　体細胞がｉＰＳ細胞に誘導されたか否かは、例えば、細胞の形態を観察したり、フローサイトメーターにより細胞に未分化マーカーが発現しているかを分析したりすることにより、確かめることができる。上記未分化マーカーとしては、TRA-1-60及びSSEA4等が知られている。特に、TRA-1-60は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞に特異的な抗原であり、体細胞では検出されないことから、ｉＰＳ細胞に誘導されたか否かを確かめるために好適なマーカーである（例えば、ＷＯ２０１８／１５５５９５Ａ１、特開２０１９－１６２０５４号公報、Elayne M Chan1 et al.(Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells, nature biotechnology volume 27 number 11 november 2009)）。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。本発明は以下の実施例に限定されない。
　培養容器として、以下を用意した。
　培養容器（Ｓ）（ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材を備えるプレート、下記の作製方法（Ｓ）により作製）
　培養容器（Ｌ）（ニッピ社製「ラミニン511E8フラグメント（iMatrix-511）」がコーティングされたプレート、IWAKI社製「mircroplate with lid, Flat bottom, TC treated polystylene」）
　培養容器（Ｆ）（浮遊培養用プレート、Corning社製「浮遊培養プレート」）
　［培養容器の作製方法（Ｓ）］
　ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む塗工液の作製：
　ポリビニルアセタール樹脂として、アセタール化度（ブチラール化度）６５モル％、水酸基量３２モル％、アセチル基量３モル％のポリビニルブチラール樹脂を用意した。アクリル酸３０重量部とポリビニルアセタール樹脂７０重量部とをテトラヒドロフラン２５５重量部に溶解させてポリマー混合溶液を得た。得られたポリマー混合溶液にパーブチルＯ（日油社製）０．０１５重量部を溶解させ、９０℃で６時間反応させた。次いで、反応後の溶液を３００００重量部の水に混合した。得られた沈殿物を８０℃で３時間真空乾燥し、リンカー（アクリル酸）を有するポリビニルアセタール樹脂（リンカーを有するポリビニルブチラール樹脂）を作製した。以下、「リンカーを有するポリビニルアセタール樹脂」を「ポリビニルアセタール樹脂（Ｘ）」と記載することがある。
　第１の溶媒としてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用意した。第２の溶媒としてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用意した。ペプチドとして、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓのアミノ酸配列を有する環状のペプチド（アミノ酸残基数５個、ＡｒｇとＬｙｓとが結合することにより環状骨格を形成、ＰｈｅはＤ体）を用意した。縮合剤として１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を用意した。第１の溶媒１０００重量部にポリビニルアセタール樹脂（Ｘ）５０重量部とペプチド２重量部とを混合して、第１の溶液を調製した。また、第２の溶媒１０００重量部に縮合剤１重量部を混合して、第２の溶液を調製した。第１の溶液と第２の溶液とを混合して、ポリビニルアセタール樹脂（Ｘ）とペプチドと縮合剤とを含む溶液を調製した。
　得られた溶液を４０℃で２時間反応させ、ポリビニルアセタール樹脂（Ｘ）のアクリル酸に由来する構造単位におけるカルボキシル基と、ペプチドのＬｙｓのアミノ基とを脱水縮合させ、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む溶液を得た。
　得られたペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む溶液をＤＭＦで１００倍希釈し、イオン交換樹脂（オルガノ社製）が充填されたカラムに０．３ｍＬ／ｍｉｎの速度で滴下して洗浄した。洗浄後の溶液を６０℃、３時間の真空乾燥をして得られた乾固物をブタノール（アルコール溶媒）に溶解後、ブタノール（アルコール溶媒）１００重量部に対して酢酸（ｐＨ調整剤）５重量部を添加して、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂とブタノールとを含む塗工液を得た。なお、塗工液中のペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂の含有量は０．１重量％とした。
　培養容器（Ｓ）の作製：
　得られた塗工液１００μＬをキャストコート法で６ウェルプレート（各ウェルの底面積：９．５ｃｍ２）の各ウェルに塗工した後、６０℃、３時間の真空乾燥でアルコール溶媒を除去した。このようにして各ウェルの底面に、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材（塗工液の乾燥物層である樹脂膜）が配置された培養容器（Ｓ）を得た。なお、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂において、ペプチド部の含有率は１モル％であった。また、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂の数平均分子量は５００００であった。
　培地として、以下を用意した。
　培地（１）（下記の作製方法（１）により作製、非特許文献１に記載のNon－Tcell用単核球培養培地に相当）
　培地（２）（下記の作製方法（１）により作製、非特許文献１に記載のNon－Tcell用単核球培養培地に相当、培地（１）と同一）
　培地（３）（下記の作製方法（３）により作製、非特許文献１に記載の維持培養培地StemFitに相当）
　［培地の作製方法（１）］
　味の素社製「Stem Fit AK02N用A液」４００ｍＬと、味の素社製「Stem Fit AK02N用B液」１００ｍＬとを混合した。得られた混合液に、サイトカインの終濃度として、ＩＬ－６を５０ｎｇ／ｍＬ、ＳＣＦを５０ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯを１０ｎｇ／ｍＬ、Ｆｌｔ－３Ｌを２０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ－３を２０ｎｇ／ｍＬ、Ｇ－ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。このようにして、培地（１）を得た。
　［培地の作製方法（３）］
　味の素社製「Stem Fit AK02N用A液」４００ｍＬと、味の素社製「Stem Fit AK02N用B液」１００ｍＬと、味の素社製「Stem Fit AK02N用C液」２ｍＬとを混合した。このようにして、培地（３）を得た。
　以下の実施例１～３及び比較例１～３では、下記に特記している部分を除き、非特許文献１に記載のプロトコルに従って細胞培養及びセンダイウイルスベクターを用いた初期化因子の導入を行った。
　（実施例１）
　工程（１）：
　体細胞として、血液由来単核球細胞を用意した。また、培養容器（Ｓ）に、１ウェルあたり１．５ｍＬの培地（１）を添加した。次いで、培養容器（Ｓ）に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの単核球細胞を播種し、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で５日間培養した。なお、培養開始から３日目に、培養容器内の液体０．７５ｍＬを新鮮な液体培地０．７５ｍＬと交換した。
　工程（２）：
　工程（１）での５日間の培養後の体細胞を１５ｍＬチューブに採取した。次いで、採取した体細胞を３×１０５ｃｅｌｌｓの細胞数で１．５ｍＬチューブに収容し、１．５ｍＬチューブを３００×ｇ及び５分間の条件で遠心した。遠心後、上清を除去し、１．５ｍＬチューブに培地（２）を適量添加した。次いで、１．５ｍＬチューブに、ＭＯＩ＝３となるように、センダイウイルスベクター（ときわバイオ社製「SRVTMiPSC-4 Vector」）を添加した。次いで、１．５ｍＬチューブを３７℃インキュベーター内で２時間静置した。次いで、１．５ｍＬチューブに、培地（２）を１ｍＬ添加した後、３００×ｇ及び５分間の条件で遠心した。遠心後、上清を除去してタッピングした。上述の培地（２）の添加、遠心、及び上清の除去の工程をさらに２回繰り返した。次いで、１．５ｍＬチューブに、培地（２）を０．１ｍＬ添加してよく混和した。このようにして、体細胞へ初期化因子を導入した。
　体細胞に初期化因子を導入した後、工程（３）を実施した。
　工程（３）：
　培養容器（Ｓ）に、１ウェルあたり０．７５ｍＬの培地（２）を添加した。工程（２）で得られた初期化因子を導入した体細胞を、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で培養容器（Ｓ）における細胞足場材上に播種し、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で接着培養した。なお、工程（３）の培養開始から、１日目、３日目、５日目及び７日目に、培養容器（Ｓ）に新鮮な培地（３）を０．５ｍＬ添加した。また、工程（３）の培養開始から９日目以降は、２日間に１回以上の頻度で培養容器（Ｓ）内の液体を新鮮な培地（３）０．７５ｍＬに交換した。工程（３）の培養開始から１４日目にコロニー形態を確認したところ、ｉＰＳ細胞のコロニー形態であった。
　（実施例２，３及び比較例１～３）
　工程（１）又は（３）で用いる培養容器の種類を下記の表のように変更したこと以外は実施例１と同様にして工程（１）～（３）を行った。実施例２，３及び比較例１～３において、工程（３）の培養開始から１４日目にコロニー形態を確認したところ、ｉＰＳ細胞のコロニー形態であった。
　（評価）
　以下の説明及び図において、Ｐと共に用いられている数字は、工程（３）を開始してからの継代数を意味する。Ｐ０は、０継代目であり、具体的には、工程（２）で得られた体細胞（工程（３）の開始時に培養容器に播種した体細胞）である。なお、細胞の継代は、以下のようにして行った。
　細胞の継代：
　工程（３）を開始してから１４日目の細胞集団を、剥離剤（Thermo Fisher Scientific社製「TrypLE Select」）を用いてシングル細胞とした。得られたシングル細胞から、全自動細胞カウンターにより細胞培養容器の各ウェル内に存在する総細胞数を算出した。また、算出した総細胞数に基づいて、１×１０４ｃｅｌｌｓ～５０×１０４ｃｅｌｌｓの細胞を、同じ種類の培養容器に播種することで、細胞の継代を行った。なお、細胞の継代は、１週間に１回又は２回行い、培地は、培地（３）を使用した。継代時は、培地（３）にＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）を最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。また、継代を行った翌日以降は、３日間に１回以上の頻度で培地交換を行った。
　以下の説明及び図において、ＳＳ、ＬＳ、ＦＳ、ＬＬ、ＦＬ、ＳＬは、１文字目が工程（１）で用いられた培養容器の種類を意味し、２文字目が工程（３）で用いられた培養容器の種類を意味する。例えば、ＬＳは、工程（１）で培養容器（Ｌ）が用いられ、工程（３）で培養容器（Ｓ）が用いられたことを意味する。
　（１）ウイルスの残存率
　細胞の継代時にシングル細胞の一部を１．５ｍＬチューブに回収した。回収したシングル細胞をフローサイトメトリー（Thermo Fisher Scientific社製「Attune NxT Flow Cytometer」）にて測定した。ＦＳＣ－ＳＳＣのドットプロットに展開されたメインの細胞集団に含まれるＧＦＰ陽性細胞の割合を分析した。結果を図１に示す。図１の縦軸のＧＦＰ陽性率が小さいほどウイルスの残存率が少ないことを意味する。図１に示すように、実施例１がウイルスの残存率の結果に特に優れていた。
　（２）細胞の増殖性及び細胞の生存率
　工程（３）を開始してからの培養日数に応じて、以下の手順で、細胞の増殖性及び細胞の生存率を評価した。継代時に回収した細胞を全自動細胞カウンターでカウントした。得られた結果からウェル内の細胞数及び細胞の生存率を算出した。また、ウェル内の細胞数を播種した細胞数で除して、その期間の細胞増殖率を算出し、評価期間中に全細胞数を継代した際に得られる理論上の累積細胞数を算出した。結果を図２及び図３に示す。図２は、初期化因子を導入した体細胞を培養してからの培養日数（工程（３）を開始してからの培養日数）と、累積細胞数との関係を示す図である。図３は、初期化因子を導入した体細胞を培養してからの継代数（工程（３）を開始してからの継代数）と、細胞の生存率との関係を示す図である。図２及び図３に示すように、実施例１の細胞の増殖性の結果は、比較例１～３の細胞の増殖性の結果と比べて同等であった。また、実施例１～３の細胞の生存率の結果は、比較例１～３の細胞の生存率の結果と比べて同等であった。
　（３）倍加時間
　Ｐ５の細胞回収時～Ｐ８の細胞回収時の細胞の倍加時間（細胞数が２倍に増えるために要する時間の平均）を以下の手順で算出した。まず、上記「（２）細胞の増殖性及び細胞の生存率」で求めたＰ８の細胞回収時の累積細胞数を、Ｐ５の細胞回収時の累積細胞数で除し、細胞増殖倍率を算出した。算出した細胞増殖倍率と培養時間（１日＝２４時間とする）とから、倍加時間を算出した。結果を下記表に示す。表に示すように、実施例１が倍加時間の結果に特に優れていた。
　（４）未分化性（細胞表面マーカー）
　（４－１）顕微鏡観察
　培養中のＰ３の細胞を用いて、以下の手順で、細胞表面の未分化マーカーを染色し、未分化性を評価した。TRA-1-60に対する抗体であって、NL557蛍光色素で標識された抗体（R&D Systems社製「Glo LIVE anti TRA-1-60 NL557」）を用意した。また、この抗体を培地（３）で５０倍希釈した抗体含有培地（３）を用意した。培養中のＰ３の細胞を工程（３）で用いた培養容器に播種し、播種から６日目に、培養容器中の培地（３）を上記抗体含有培地（３）と交換した。次いで、インキュベーターで３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で１時間培養した。１時間の培養後、培養容器のウェルを１×ＤＰＢＳで１回洗浄した。蛍光顕微鏡（キーエンス社製「BZ-X800」）を用いて、蛍光視野又は明視野でウェルを観察し、撮影した。結果を図４に示す。図４中、蛍光視野及び明視野は倍率２０倍での撮影結果であり、蛍光×１００は、倍率１００倍での撮影結果である。なお、図４中の蛍光視野及び明視野の画像は、ウェル内の全視野を全面一括自動撮影により取得し、キーエンス社製の画像ソフトでウェル全体を１枚に結合することにより得た画像である。実施例１～３及び比較例１～３では、ウェル内を細胞が占める面積に大きな差はなかった。一方で、実施例１～３では、比較例１～３と比べて、上記抗体で標識された細胞の数が多かった。また、実施例１～３では、比較例１～３と比べて、細胞がより明るく標識されており、特に実施例１では、実施例２，３と比べても、細胞がより明るく標識されていた。
　（４－２）フローサイトメトリー測定
　TRA-1-60に対する抗体であって、PE蛍光色素で標識された抗体（Thermo Fisher Scientific社製「TRA-1-60 PE Antibody」）を用意した。また、SSEA4に対する抗体であって、PE蛍光色素で標識された抗体（Thermo Fisher Scientific社製「SSEA4 PE Antibody」）を用意した。Ｐ６の細胞をこれらの抗体と接触させた。次いで、フローサイトメトリー（Thermo Fisher Scientific社製「Attune NxT Flow Cytometer」）を用いて、TRA-1-60の陽性率及びそのＭＦＩ、並びに、SSEA4の陽性率及びそのＭＦＩを求めた。なお、ＭＦＩとは、平均蛍光強度（ｍｅｄｉａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）である。具体的には、以下の手順で評価した。
　Ｐ６の細胞を、上述した「細胞の継代」の手順と同様にして、剥離剤（Thermo Fisher Scientific社製「TrypLE Select」）を用いてシングル細胞とした。得られたシングル細胞を全自動細胞カウンターに供し、細胞濃度を算出した。次いで、５×１０５ｃｅｌｌｓの細胞を１．５ｍＬチューブに採取し、この１．５ｍＬチューブを３００×ｇ及び５分間の条件で遠心した。遠心後、上清を除去して、１．５ｍＬチューブに１×ＤＰＢＳを添加した。次いで、再度、上記の条件で、遠心及び上清の除去を行った。次いで、１重量％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳでブロッキングを実施した。次いで、１．５ｍＬチューブに、上述した２種類の抗体（Thermo Fisher Scientific社製「TRA-1-60 PE Antibody」及びThermo Fisher Scientific社製「SSEA4 PE Antibody」）を適量で含む抗体溶液を添加し、暗所及び室温で１時間インキュベーションした。次いで、１．５ｍＬチューブを３００×ｇ及び５分間の条件で遠心した後、上清を除去し、１×ＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、１．５ｍＬチューブに１重量％ＢＳＡ含有ＰＢＳを０．４ｍＬ加えて混和し、フローサイトメトリーにて測定した。ＦＳＣ－ＳＳＣのドットプロットに展開されたメインの細胞集団に含まれるTRA-1-60陽性細胞の割合及びSSEA4陽性細胞の割合を分析した。結果を下記表に示す。
　（５）未分化性（遺伝子発現マーカー）
　Ｐ０，Ｐ１，Ｐ３，Ｐ７の細胞を用いて、各細胞に発現する未分化マーカー遺伝子の相対的定量を実施した。相対的定量はＰＣＲ装置（Thermo Fisher Scientific社製「QuatnStudio3リアルタイムPCRシステム」）を用いて行った。具体的には、以下の手順で評価した。継代時に、培養容器から細胞集団を剥離してシングル化し、２×１０５ｃｅｌｌｓの細胞を１．５ｍＬチューブに採取した。次いで、Thermo Fisher Scientific社製「TaqMan Fast Advanced Cells-to-Ct Kit」を用いて、細胞の溶解、ｃＤＮＡの合成、及び定量ＰＣＲを実施した。ターゲットの遺伝子発現マーカーは、NANOG及びOCT3/4とし、それぞれのプライマー及び検出用試薬として、Thermo Fisher Scientific社製「TaqMan Gene Expression Assay」を用いた。なお、相対定量値は、ＦＬのＰ０の細胞の遺伝子量を基準として算出した。結果を図５に示す。図５中、左側から右側に向けて、Ｐ０，Ｐ１，Ｐ３，Ｐ７の順の結果である。
　（６）分化能（胚様体の形成）
　（６－１）顕微鏡観察
　ｉＰＳ細胞の分化誘導：
　９６ウェルプレート（Corning社製「超低吸着丸底96wel plate」）を用意した。また、培地としてThermo Fisher Scientific社製「Essential 6」を用意した。上記９６ウェルプレートにウェルに上記培地を添加した。なお、細胞の播種時に使用する培地には、あらかじめＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）を最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。工程（３）で培養したＰ３の細胞（ｉＰＳ細胞、シングル細胞）を、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種し、３００×ｇ及び５分間の条件で遠心した後、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で浮遊培養した。なお、培地交換は、播種翌日及びその後は隔日で行った。
　顕微鏡観察：
　播種後３９日目まで、培養している細胞を顕微鏡で観察した。３９日目の細胞の様子（ｎ＝２）を図６に示す。実施例１～３では、細胞の凝集が見られ、胚様体の形成が認められた。一方、比較例１～３では、胚様体の形成が認められなかった。
　（６－２）遺伝子発現（ｑＰＣＲ）
　以下のようにして、実施例１～３で得られた胚様体における三胚葉マーカーを評価した。播種時のシングル細胞（培養開始時（０日目）の細胞）、培養開始から１１日目の細胞（胚様体）、培養開始から１８日目の細胞（胚様体）、及び培養開始から３９日目の細胞（胚様体）を回収し、それらの胚様体を、細胞剥離用酵素含有液（Accumax）で処理し、シングル細胞にした。次いで、Thermo Fisher Scientific社製「TaqMan Fast Advanced Cells-to-Ct Kit」を用いて、細胞の溶解、ｃＤＮＡの合成、及び定量ＰＣＲを実施した。ターゲットの遺伝子発現マーカーは、内胚葉マーカーとして、AFP、FOXA2、GATA4、GATA6、SOX17、SOX7を設定し、中胚葉マーカーとして、KDR、Tを設定し、外胚葉マーカーとしてNES、PAX6、SOX1を設定した。また、それぞれのプライマー及び検出用試薬には、Thermo Fisher Scientific社製「TaqMan Gene Expression Assay」を用いた。なお、相対定量値は、各遺伝子発現とも、Ｐ０の細胞の遺伝子量を基準として算出した。
　ｑＰＣＲにより、上述した各マーカーの遺伝子発現を評価した結果を図７～９に示す。また、マーカーの上昇の有無でスコア化し、各胚葉への分化スコアをまとめたレーダーチャートを図１０に示す。スコアは、内胚葉、中胚葉、外胚葉につき、１マーカーの上昇に対してそれぞれ１、３、２として評価している。
　詳細及び結果を下記の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、実験例１～４として、以下のｍＲＮＡの体細胞への導入実験を行った。
　培養容器として、以下を用意した。
　培養容器（Ｓ１）（ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材を備えるプレート、下記の作製方法（Ｓ１）により作製）
　培養容器（Ｌ１）（ニッピ社製「ラミニン511E8フラグメント（iMatrix-511）」がコーティングされたプレート、IWAKI社製「mircroplate with lid, Flat bottom, TC treated polystylene」）
　培養容器（Ｒ１）（タカラバイオ社製「レトロネクチン（T100A）」がコーティングされたプレート、Corning社製「Falcon セルカルチャー 48ウェル マルチウェルプレート（353078）」）
　培養容器（Ｖ１）（富士フィルム和光純薬社製「ビトロネクチン（220-02041）」がコーティングされたプレート、Corning社製「Falcon セルカルチャー 48ウェル マルチウェルプレート（353078）」）
　［培養容器の作製方法（Ｓ１）］
　塗工液１０μＬをキャスト法で４８ウェルプレート（各ウェルの底面積：０．７５ｃｍ２）の各ウェルに塗工したこと以外は、上述の「培養容器の作製方法（Ｓ）」と同様にして、培養容器（Ｓ１）を得た。
　（実験例１）
　ｍＲＮＡ－ｅＧＦＰの体細胞への導入：
　体細胞として、ヒト末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞（Lonza社製「2W-300」）を用意した。また、培養容器（Ｓ１）に、１ウェルあたり０．２ｍＬの培地（１）を添加した。次いで、培養容器（Ｓ１）に１．４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＣＤ８＋Ｔ細胞を播種し、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で２日間培養した。次いで、培養容器（Ｓ１）に２μｇ／ｗｅｌｌのｍＲＮＡ－ｅＧＦＰ(TriLink BioTechnologies社製「CleanCap EGFP mRNA」)を添加し、プラズマ遺伝子導入法により、ＣＤ８＋Ｔ細胞にｍＲＮＡ－ｅＧＦＰを導入した。なお、プラズマ照射の条件は、以下の通りとした。
　電源周波数：５０ｋＨｚ
　放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
　放電時間：３０ｍｓｅｃ
　電極端部と培養容器の上面との離間距離：１ｍｍ
　次いで、培養容器（Ｓ１）に、１ウェルあたり０．２ｍＬのTransAct(Milteny社製）を添加して、３０時間培養した。
　導入効率の評価（フローサイトメトリー測定）：
　３０時間培養した後の細胞を、培養容器からピペッティングにより剥離して、シングル細胞とした。得られたシングル細胞をフローサイトメトリー（Thermo Fisher Scientific社製「Attune NxT Flow Cytometer」）を用いて測定し、生細胞数（Ｒ１）と、ＧＰＰ蛍光を有する細胞数（Ｒ２）とを求めた。下記式により、ｍＲＮＡ－ｅＧＦＰの導入効率を算出した。
　導入効率（％）＝（Ｒ２／Ｒ１）×１００
　Ｒ１：生細胞数
　Ｒ２：ＧＦＰ蛍光を有する細胞数
　（実験例２～４）
　培養容器の種類を図１１に記載のように変更したこと以外は、実験例１と同様にして、ｍＲＮＡ－ｅＧＦＰの導入効率を算出した。
　（結果）
　図１１に示すように、培養容器（Ｓ１）を用いた場合には、培養容器（Ｌ１），（Ｖ１），（Ｒ１）を用いた場合と比べて、ｍＲＮＡ－ｅＧＦＰの体細胞への導入効率が高くなった。すなわち、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下では、タンパク質を含む細胞足場材の存在下と比べて、ｍＲＮＡの体細胞への導入効率をより一層高めることができていた。
　また、実施例４として、以下のｍＲＮＡを用いたｉＰＳ細胞の樹立試験を行った。
　（実施例４）
　工程（１）：
　体細胞として、末梢血単核細胞（Precision for medicine社製「Human PBMC 10M Healthy Japanese(Cat#:93210-10M)」）を用意した。また、培養容器（Ｓ１）に、１ウェルあたり０．４ｍＬの培地（１）を添加した。次いで、培養容器（Ｓ１）に５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの末梢血単核細胞を播種し、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で５日間培養した。なお、培養開始から３日目に、培養容器（Ｓ１）内の培地（１）０．２ｍＬを新鮮な培地（１）０．２ｍＬと交換した。
　工程（２）：
　工程（１）での５日間の培養後の培養容器（Ｓ１）から、培地（１）を除去した。次いで、培養容器（Ｓ１）に０．８μｇ／ｗｅｌｌのｍＲＮＡ（STEMCELL Technologies社製「ReproRNA-OKSGM」、C/N: ST-05931）を添加し、プラズマ遺伝子導入法により、末梢血単核細胞にｍＲＮＡを導入した。なお、プラズマ照射の条件は、以下の通りとした。
　電源周波数：５０ｋＨｚ
　放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
　放電時間：３０ｍｓｅｃ
　電極端部と培養容器の上面との離間距離：１ｍｍ
　工程（３）：
　以下の培地（３Ａ），（３Ｂ）を用意した。
　培地（３Ａ）：
　培地（１）１ｍＬに対して、Recombinant B18R Protein（STEMCELL Technologies社製）を０．１７５μｇの量で添加した。このようにして培地（３Ａ）を得た。
　培地（３Ｂ）：
　培地（３）１ｍＬに対して、Recombinant B18R Protein（STEMCELL Technologies社製）を０．１７５μｇの量で添加した。このようにして、培地（３Ｂ）を得た。
　培養容器（Ｓ１）に、１ウェルあたり０．２ｍＬの培地（３Ａ）を添加して、ｍＲＮＡ（初期化因子）が導入された体細胞を、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で１日間接着培養した。１日間の接着培養後、１ウェルあたり０．１３３ｍＬの培地（３Ｂ）を添加して、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で培養した。工程（３）の培養開始から８日目までは、２～３日おきに培地（３Ｂ）を１ウェルあたり０．１３５ｍＬ添加し、工程（３）の培養開始から９日目以降は、２～３日おきに培地（３Ｂ）の全量を新鮮な培地（３Ｂ）と交換した。
　（評価）
　（１）顕微鏡観察
　TRA-1-60に対する抗体であって、NL557蛍光色素で標識された抗体（R&D Systems社製「Human Glo LIVE anti TRA-1-60(R) Northern Lights NL557-conjugated Antibody」）を用意した。また、この抗体を培地（３Ｂ）で５０倍希釈した抗体含有培地（３Ｂ）を用意した。工程（３）の培養開始から３５日目に、培養容器（Ｓ１）中の培地（３Ｂ）を上記抗体含有培地（３Ｂ）と交換した。次いで、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で３０分間培養した。３０分間の培養後、培養容器（Ｓ１）のウェルをＰＢＳで洗浄し、新たな培地（３Ｂ）に交換した。蛍光顕微鏡（キーエンス社製「BZ-X800」）を用いて、蛍光視野又は明視野でウェルを観察し、撮影した。その結果、ｉＰＳ細胞のコロニー形態が観察され、また、抗体で標識された細胞も多く観察された。
　（実施例５）
　培養容器として、上述した培養容器（Ｓ１）及び培養容器（Ｌ１）と、以下の培養容器（Ｓ２）、（Ｓ３）とを用意した。
　培養容器（Ｓ２）（ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材を備えるプレート、下記の作製方法（Ｓ２）により作製）
　培養容器（Ｓ３）（ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材を備えるプレート、下記の作製方法（Ｓ３）により作製）
　［培養容器の作製方法（Ｓ２）］
　塗工液１０μＬをキャスト法で９６ウェルプレート（各ウェルの底面積：０．３２ｃｍ２）の各ウェルに塗工したこと以外は、上述の「培養容器の作製方法（Ｓ）」と同様にして、培養容器（Ｓ２）を得た。
　［培養容器の作製方法（Ｓ３）］
　塗工液１００μＬをキャスト法で１２ウェルプレート（各ウェルの底面積：３．８ｃｍ２）の各ウェルに塗工したこと以外は、上述の「培養容器の作製方法（Ｓ）」と同様にして、培養容器（Ｓ３）を得た。
　以下の培地（４Ａ）、（４Ａ＋）、（４Ｂ）、（４Ｂ＋）を用意した。
　培地（４Ａ）：
　タカラバイオ社製「線維芽細胞増殖培地：Fibroblast Growth Medium　(Ready-to-use)」を培地（４Ａ）として使用した。
　培地（４Ａ＋）：
　培地（４Ａ）１ｍＬに対して、Recombinant B18R Protein（STEMCELL Technologies社製）を０．１７５μｇの量で添加し、かつ、ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク社製）を１０μＬの量で添加した。このようにして培地（４Ａ＋）を得た。
　培地（４Ｂ）：
　味の素社製「StemFit AK02N」を培地（４Ｂ）として使用した。
　培地（４Ｂ＋）：
　培地（４Ｂ）１ｍＬに対して、Recombinant B18R Protein（STEMCELL Technologies社製）を０．１７５μｇの量で添加し、かつ、ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク社製）を１０μＬの量で添加した。このようにして培地（４Ａ＋）を得た。
　工程（１）：
　体細胞として、ヒト線維芽細胞（タカラバイオ社製「正常ヒト皮膚線維芽細胞（小児）」）を用意した。また、培養容器（Ｓ１）に、１ウェルあたり０．２ｍＬの培地（４Ａ）を添加した。次いで、培養容器（Ｓ１）に１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのヒト線維芽細胞を播種し、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で６日間培養した。なお、培養開始から３日目に、培養容器（Ｓ１）内の培地（４Ａ）０．２ｍＬを新鮮な培地（４Ａ）０．２ｍＬと交換した。
　工程（２）：
　工程（１）での６日間培養後の培養容器（Ｓ１）から、培地（４Ａ）を除去した。次いで、培養容器（Ｓ１）に０．８μｇ／ｗｅｌｌのｍＲＮＡ（STEMCELL Technologies社製「ReproRNA-OKSGM」、C/N: ST-05931）を添加し、プラズマ遺伝子導入法により、ヒト線維芽細胞にｍＲＮＡを導入した。なお、プラズマ照射の条件は、以下の通りとした。
　電源周波数：５０ｋＨｚ
　放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
　放電時間：３０ｍｓｅｃ
　電極端部と培養容器の上面との離間距離：１ｍｍ
　工程（３）：
　培養容器（Ｓ１）に、１ウェルあたり０．４ｍＬの培地（４Ａ＋）を添加して、ｍＲＮＡ（初期化因子）が導入された体細胞を、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で培養した。１日間の培養後、培地の全量を０．４ｍＬの新鮮な培地（４Ａ＋）と交換した。工程（３）の培養開始から４日目に、培地の全量を、１ｍＬあたり０．８μｇのＰｕｒｏｍｙｃｉｎを含む新鮮な培地（４Ａ＋）と交換した。
　工程（３）の培養開始から７日目に、培地の全量を新鮮な培地（４Ｂ＋）と交換した。その後、工程（３）の培養開始から１４日目までは、３日おきに培地の全量を新鮮な培地（４Ｂ＋）と交換した。
　工程（３）の培養開始から１４日目にｉＰＳ細胞のコロニー数を確認した。また、コロニーをピペッティングにより剥がし、培養容器（Ｓ２）へ回収した（Ｐ１）。培養容器（Ｓ２）に培地（４Ｂ）を１ウェルあたり０．１ｍＬ添加し、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で培養した。２日おきに培地の全量を新鮮な培地（４Ｂ）と交換した。培養容器（Ｓ２）で培養を開始してから６日目に剥離剤（Thermo Fisher Scientific社製「TrypLE Select」）を用いてシングル細胞とした。得られたシングル細胞から、２×１０４ｃｅｌｌｓの細胞を、培養容器（Ｓ３）に播種することで、細胞の継代を行った（Ｐ２）。なお、細胞の継代は、１週間に１回行い、培地は、培地（４Ｂ）を使用した（Ｐ３～Ｐ７）。継代時は、培地（４Ｂ）にＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）を最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。また、継代を行った翌日以降は、２日間に１回の頻度で培地交換を行った。
　（比較例４）
　培養容器（Ｓ１）に代えて、培養容器（Ｌ１）を用いたこと以外は、実施例５と同様にして工程（１）から工程（３）の１４日目までを行った。
　（評価）
　（１）未分化性（細胞表面マーカー）
　（１－１）顕微鏡観察
　プラズマ照射後１４日目の細胞を用いて、以下の手順で、細胞表面の未分化マーカーを染色し、未分化性を評価した。NL557蛍光色素で標識されたTRA-1-60抗体（R&D Systems社製「Glo LIVE anti TRA-1-60 NL557」）を用意した。また、この抗体を培地（４Ｂ）で５０倍希釈した抗体含有培地を用意した。培養容器中の培地（４Ｂ）を上記抗体含有培地と交換し、インキュベーターで３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で１時間培養した。１時間の培養後、培養容器のウェルを１×ＤＰＢＳで１回洗浄した。蛍光顕微鏡（キーエンス社製「BZ-X800」）を用いて、蛍光視野で培養容器を観察し、撮影した。結果を図１２に示す。図１２は、倍率１００倍での蛍光視野の撮影結果である。
　図１２に示すように、実施例５では、上記抗体で標識された細胞（ＴＲＡ－１－６０陽性細胞）が良好に得られた。一方、比較例４では、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞がほとんど得られなかった。そのため、以降の評価は実施例５で得られた細胞のみに対して実施した。
　（１－２）フローサイトメトリー測定
　FITC蛍光色素で標識されたTRA-1-60抗体（ＢＤ社製「TRA-1-60 FITC　Antibody」）を用意した。Ｐ３の７日目時点の細胞をこの抗体と反応させ、フローサイトメトリー（Thermo Fisher Scientific社製「Attune NxT Flow Cytometer」）を用いて、TRA-1-60の発現を分析した。具体的には、以下の手順で評価した。
　Ｐ３の７日目時点の細胞を、上述した「細胞の継代」の手順と同様にして、剥離剤（Thermo Fisher Scientific社製「TrypLE Select」）を用いてシングル細胞とした。得られたシングル細胞５×１０５ｃｅｌｌｓを１．５ｍＬチューブに採取し、この１．５ｍＬチューブを３００×ｇ及び５分間の条件で遠心した。遠心後、上清を除去して、１．５ｍＬチューブにBD社製のPharmingen Stain Buffer(FBS)を添加した。次いで、再度、上記の条件で、遠心及び上清の除去を行った。次いで、BD社製のPharmingen Stain Buffer(FBS)でブロッキングを実施した。次いで、１．５ｍＬチューブに、上述した抗体１０μＬをBD社製のPharmingen Stain Buffer(FBS)１００μＬで希釈した溶液を添加し、暗所及び室温で１時間インキュベーションした。次いで、１．５ｍＬチューブを３００×ｇ及び５分間の条件で遠心した後、上清を除去し、Pharmingen Stain Buffer(FBS)で２回洗浄した。次いで、１．５ｍＬチューブにPharmingen Stain Buffer(FBS)を０．４ｍＬ加えて混和し、フローサイトメトリーにて測定した。ＦＩＴＣ蛍光色素の蛍光強度のヒストグラムプロットを図１３に示す。
　図１３中、横軸はＦＩＴＣ蛍光色素の蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示す。また、図１３中の左側のヒストグラムプロット（着色無し）は、細胞を上記抗体と反応させなかった場合のヒストグラムプロットであり、図１３中の右側のヒストグラムプロット（着色あり）は、細胞を上記抗体と反応させた場合のヒストグラムプロットである。また、図１３中の左側のヒストグラムプロット（着色無し）の蛍光強度の最大値を、右側のヒストグラムプロット（着色あり）における陰性領域及び陽性領域の境界値として設定した。図１３中、右側のヒストグラムプロット（着色あり）における陰性領域及び陽性領域に含まれる細胞数の割合（％）をそれぞれ「FITC-A-」及び「FITC-A+」に示す。
　（２）未分化性（遺伝子発現マーカー）
　Ｐ６の７日目時点の細胞を用いて、各細胞に発現する未分化マーカー遺伝子の相対的定量を実施した。相対的定量はＰＣＲ装置（Thermo Fisher Scientific社製「QuatnStudio3リアルタイムPCRシステム」）を用いて行った。具体的には、以下の手順で評価した。継代時に、培養容器から細胞集団を剥離してシングル化し、２×１０５ｃｅｌｌｓの細胞を１．５ｍＬチューブに採取した。次いで、Thermo Fisher Scientific社製「TaqMan Fast Advanced Cells-to-Ct Kit」を用いて、細胞の溶解、ｃＤＮＡの合成、及び定量ＰＣＲを実施した。ターゲットの遺伝子発現マーカーは、NANOG、OCT3/4、及びSOX2とし、それぞれのプライマー及び検出用試薬として、Thermo Fisher Scientific社製「TaqMan Gene Expression Assay」を用いた。各遺伝子発現マーカーの発現量は、ハウスキーピング遺伝子１８Ｓを用いてΔΔＣＴ法により標準化した。なお、相対定量値は、京都大学で樹立されたヒト線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）における発現量を１として算出した。結果を図１４に示す。
　（３）分化能
　ｉＰＳ細胞の三胚葉分化誘導：
　培地としてStemcell Technologies社製「Trilineage Differentiation Kit」の各胚葉分化培地（Ectoderm Medium, Mesoderm Medium, Endoderm Medium）を用意した。培養容器（Ｓ３）の各ウェルに上記培地を添加した。なお、細胞の播種時に使用する培地には、あらかじめＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）を最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。Ｐ７の７日目時点の細胞を、上述した「細胞の継代」の手順と同様にして、剥離剤（Thermo Fisher Scientific社製「TrypLE Select」）を用いてシングル細胞とした。内胚葉分化誘導及び外胚葉分化誘導は８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で、中胚葉分化誘導は２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で播種し、３００×ｇ及び５分間の条件で遠心した後、インキュベーターで、３７℃及びＣＯ２濃度５％の条件下で接着培養した。なお、１日１回培地交換を行った。比較として、ｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）を用いて同様の方法で三胚葉分化誘導を行った。
　（３－１）免疫染色
　以下の溶液及び抗体を用意した。
　［溶液］
　固定液：４％パラホルムアルデヒド
　ブロッキング液：0.1％ TritonX100、10% FBS含有PBS
　Wash buffer：0.025% ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート含有ＰＢＳ
　［抗体］
　１次抗体（外胚葉）：Anti-PAX6抗体(Rabbit IgG)
　１次抗体（中胚葉）：Anti-Brachyury/Bry抗体(Rabbit IgG H&L)
　１次抗体（内胚葉）：Anti-SOX17抗体(Rabbit IgG)
　２次抗体（Rabbit）：Goat pAb to Rb IgG- Alexa Fluor488
　内胚葉分化誘導及び中胚葉分化誘導の免疫染色は各分化培地での培養開始から５日目に、外胚葉分化誘導の免疫染色は分化培地での培養開始から７日目に行った。まず、培養容器（Ｓ３）から培地を除去した後、０．７５ｍＬのＰＢＳを添加した。次に、ＰＢＳを除去して０．５ｍＬの固定液を加え、１５分間静置した。固定液を除去し、０．５ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。その後、５００μＬのブロッキング液を添加し、１５分間静置した。ブロッキング液を取り除き、Wash bufferを添加し５分間静置した後、溶液を除去した。再度Wash bufferを添加し５分間静置した後、溶液を除去した。その後、１次抗体含有溶液を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、２時間静置した。各１次抗体含有溶液はブロッキング液にて希釈して調製した。１次抗体含有溶液を取り除き、Wash bufferを２ｍＬ／ｗｅｌｌ添加し、５分間静置した後、除去した。再度Wash bufferを添加し、５分間静置して溶液を除去した。その後、２次抗体含有溶液を添加し、冷蔵庫内で一晩インキュベーションを行った。翌日、Wash bufferで１０００倍希釈したDAPIで３分間染色を行った。２ｍＬ／ｗｅｌｌのWash bufferで２回洗浄を行った。次いで、蛍光顕微鏡（キーエンス社製「BZ-X800」）を用いて、蛍光視野でウェルを観察し、撮影した。分化誘導前のｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）をネガティブコントロールとした。結果を図１５に示す。
　（３－２）遺伝子発現（ｑＰＣＲ）
　上記「（３－１）免疫染色」を実施した日に、上述した「細胞の継代」の手順と同様にして、剥離剤（Thermo Fisher Scientific社製「TrypLE Select」）を用いてシングル細胞を回収した。次いで、Thermo Fisher Scientific社製「TaqMan Fast Advanced Cells-to-Ct Kit」を用いて、細胞の溶解、ｃＤＮＡの合成、及び定量ＰＣＲを実施した。ターゲットの遺伝子発現マーカーは、内胚葉マーカーとして、FOXA2、SOX17を設定し、中胚葉マーカーとして、Tを設定し、外胚葉マーカーとして、PAX6を設定した。また、それぞれのプライマー及び検出用試薬には、Thermo Fisher Scientific社製「TaqMan Gene Expression Assay」を用いた。各遺伝子発現マーカーの発現量は、ハウスキーピング遺伝子１８Ｓを用いてΔΔＣＴ法により標準化した。分化誘導前のｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）及びＰ７の７日目時点の細胞をネガティブコントロールとした。なお、相対定量値は、各遺伝子発現とも、ｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１）のネガティブコントロールにおける発現量を１として算出した。
　ｑＰＣＲにより、上述した各マーカーの遺伝子発現を評価した結果を図１６に示す。図１６中、「２５３Ｇ１」及び「実施例５」はネガティブコントロールの結果を示し、「２５３Ｇ１（内）」及び「実施例５（内）」は内胚葉分化誘導後の結果を示し、「２５３Ｇ１（中）」及び「実施例５（中）」は中胚葉分化誘導後の結果を示し、「２５３Ｇ１（外）」及び「実施例５（外）」は外胚葉分化誘導後の結果を示す。

Claims (5)

  1. 　体細胞に初期化因子を導入する工程と、
    　前記初期化因子が導入された体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養する工程とを備える、人工多能性幹細胞の製造方法。
  2. 　前記体細胞に初期化因子を導入する工程よりも前に、
    　体細胞を、ペプチド含有ポリビニルアセタール樹脂を含む細胞足場材の存在下で培養する工程を備える、請求項１に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
  3. 　前記体細胞に初期化因子を導入する工程において、センダイウイルスベクターを用いて前記体細胞に初期化因子を導入する、請求項１又は２に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
  4. 　前記初期化因子が、ｍＲＮＡである、請求項１又は２に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
  5. 　前記ｍＲＮＡをプラズマ遺伝子導入法により前記体細胞に導入する、請求項４に記載の人工多能性幹細胞の製造方法。
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WO2020230885A1 (ja) * 2019-05-15 2020-11-19 積水化学工業株式会社 細胞培養用足場材料及び細胞培養用容器

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