KR20230087589A - 분비체-함유 조성물의 분석을 위한 방법 및 어세이 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획을 세포, 예컨대 전구체 세포로부터 생성 및/또는 정제하기 위한 방법; 및 이러한 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획의 활성, 및 기능성 및 역가를 분석하기 위한 방법을 제공한다. 본 개시는 또한 이러한 방법을 사용하여 분석된, 분비체, 세포외 소포, 및/또는 이의 분획의 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

분비체-함유 조성물의 분석을 위한 방법 및 어세이
본 개시는 일반적으로 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물의 활성, 기능성, 특징, 및/또는 역가를 분석하기 위한 방법 및 어세이에 관한 것이다.
시험관내 또는 생체외 배양에서의 것을 포함한, 세포는 매우 다양한 분자 및 생물학적 인자 (집합적으로 분비체로서 알려짐)를 세포외 공간으로 분비한다 (참조: Vlassov et al. (Biochim Biophys Acta, 2012; 940-948). 분비체의 일부로서, 다양한 생체활성 분자는 막-결합된 세포외 소포, 예컨대 엑소솜 내에서 세포로부터 분비된다. 세포외 소포는 신호전달을 통해서, 또는 그들 카고 (예를 들어, 단백질, 지질, 및 핵산 포함)의 전달을 통해서, 다른 세포의 생물학을 변경시킬 수 있다. 세포외 소포의 카고는 특히 막의 특별한 마커를 통해서 (예를 들어, 표적 세포에 대한) 특이적 표적화를 허용하는 막으로 둘러싸이고; 예컨대 혈류를 통해서 또는 혈액-뇌-장벽 (BBB)을 가로질러서, 생물학적 유체로 수송 동안 안정성이 증가된다.
엑소솜은 예를 들어, 상이한 세포 유형 간에 정보를 전달하는 분자 메신저로서 작용하여서, 광범위한 배열의 중요한 생리학적 기능들을 발휘한다. 예를 들어, 엑소솜은 그들 공급원에 의존하여, 아폽토시스, 전이, 혈관생성, 종양 진행, 혈전증, 면역 활성화쪽으로 T 세포를 유도하는 면역력, 면역 억제, 성장, 분열, 생존, 분화, 스트레스 반응, 아폽토시스 등에 영향을 미칠 수 있는 신호전달 경로에 참여하는 단백질, 지질, 및 RNA 및 마이크로RNA를 포함한, 가용성 인자를 전달한다 (참조: Vlassov et al. (Biochim Biophys Acta, 2012; 940-948)). 세포외 소포는 특정한 생물학적 효과를 발휘하도록 함께 작용할 수 있는 분자의 조합을 함유할 수 있다. 엑소솜은 부모 세포의 성질을 반영하는 광범위 시토졸 및 막 성분을 통합한다. 그러므로, 원래 세포에 적용되는 용어는 일부 예에서 분비된 엑소솜에 대한 단순 참조로서 사용될 수 있다.
전구체 세포는 증식 능력을 가지고, 성숙한 세포로 분화될 수 있어서, 전구체 세포를 치료적 적용 예컨대 예를 들어, 심근 경색 및 울혈성 심부전의 치료에서, 재생 의학을 위해 매력적이게 만든다. 줄기 세포-유래 심혈관 전구체 세포에 의해 분비되는 세포외 소포는 만성 심부전의 마우스 모델에서 그들 분비 세포에 대해 유사한 치료적 효과를 생성시킨다고 보고되었고 (참조: Kervadec et al. (J. Heart Lung Transplant, 2016; 35:795-807)), 이식된 전구체 세포의 중요한 작용 기전은 이식 후에 생물학적 인자의 방출에 있다는 것을 시사한다 (예를 들어, 내생성 재생 또는 복구 경로를 자극함). 이것은 효과적인, 세포-무함유 요법 (예컨대 개선된 편의성, 안정성, 및 작업자 취급성 등과 같은 이득을 가짐)의 가능성을 상승시킨다 (참조: El Harane et al. (Eur. Heart J., 2018; 39:1835-1847)). 그러나, 현재 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 또는 역가를 결정하기 위한 보다 정확하고 신뢰할만한 방법에 대한 요구가 존재한다.
조건화 배지, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 경우에, 혈청-고갈이 관여되는 기지의 세포 생존능 어세이는 이의 기능성 또는 역가를 결정하는데 사용될 수 있다. 특히, 충분히 공지된 심근세포 생존능 어세이는 혈청-고갈된 래트 H9c2 심근모세포를 사용하고, 혈청-고갈된 세포의 생존능에 대한 조건화 배지, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다 (참조: 예를 들어, El Harane et al. (Eur. Heart J., 2018, 39(20): 1835-1847)).
그러나, 이러한 어세이에서 도처에서 사용되는, H9c2 심근모세포는 반복 계대 이후에 세포 매개변수의 변동을 나타내는 것으로 보고되었다. 예를 들어, Witek 등 (Cytotechnology, 2016, 68(6): 2407-2415)은 세포 매개변수 (예컨대, 세포 형태, 유전자 발현 프로파일, 산화 스트레스 반응, 및 세포 스트레스제에 대한 민감성)는 세포 배양의 시기에 따라서 다양하였다고 보고하였다 (예를 들어, 세포 생존능의 촉진 또는 감소에 대한 그들 효과에 대해 작용제를 시험할 때, 신뢰할 수 없는 결과를 초래할 수 있음). 추가로, 그들 치료적 잠재성에 대해 (예를 들어, 상이한 세포 유형 및/또는 상이한 세포 배양 조건으로부터) 분비체의 스크리닝을 위한 몇가지 옵션이 존재한다.
따라서, 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가를 결정하기 위한 개선되고 보다 신뢰할만한 어세이에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 개시는 조건화 배지, 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획의 활성, 기능성, 및/또는 역가를 신뢰할만하게 결정하기 위한 방법 및 어세이를 제공하여, 당분야의 상기 기술된 한계를 해결한다. 본 개시는 조건화 배지, 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획을 비교하기 위한 신뢰할만한 분석 방법 및 어세이를 더 제공하여서, 고속 대량 분석을 허용하고, 시험관내 일관적인 결과를 생성시킬 수 있다.
본 개시의 비제한적인 구현예는 하기를 포함한다:
[1] 분비체의 활성을 분석하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 (a) 표적 세포의 배양물을 전처리 배지와 접촉시키고, 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계; (b) 분비체를 세포 배양물에 투여하고, 분비체의 존재 하에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 배양 동안 배양된 세포의 적어도 하나의 성질을 1회 이상 측정하는 단계를 포함한다.
[2] [1]의 방법에 있어서, 상기 방법은 단계 (b) 이전에 배양된 세포로부터 전처리 배지를 제거하는 것을 더 포함한다.
[3] [2]의 방법에 있어서, 표적 세포는 세포 배양물에 분비체의 투여 이전에 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양되고, 단계 (b)에서 표적 세포의 배양은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 부재 하에서 수행된다.
[4] 분비체의 활성을 분석하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 (a) 표적 세포의 배양물을 전처리 배지와 접촉시키고, 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계; (b) 분비체를 세포 배양물에 투여하고, 임의로 분비체의 존재 하에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계; (c) 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 표적 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 단계 (c)의 배양 동안 배양된 세포의 적어도 하나의 성질을 1회 이상 측정하는 단계를 포함한다.
[5] [4]의 방법에 있어서, 상기 표적 세포는 단계 (c)의 배양 이전에 분비체의 존재 하에서 배양된다.
[6] [5]의 방법에 있어서, 상기 방법은 단계 (c) 이전에 배양된 세포로부터 분비체를 제거하는 것을 더 포함한다.
[7] [4]의 방법에 있어서, 스트레스-유도 조건은 세포 스트레스제의 존재 하 배양이고, 세포 스트레스제는 분비체와 공동-투여되고, 상기 표적 세포는 분비체 및 세포 스트레스제의 존재 하에서 배양된다.
[8] [1]-[6] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 적어도 하나의 스트레스-유도 배양 조건은 세포 스트레스제의 존재 하 배양이다.
[9] [7] 또는 [8]의 방법에 있어서, 상기 세포 스트레스제는 화학요법제 및/또는 아폽토시스-유도제이다.
[10] [9]의 방법에 있어서, 상기 아폽토시스-유도제는 인돌로카르바졸이다.
[11] [9]의 방법에 있어서, 상기 아폽토시스-유도제는 인돌로(2,3-a)피롤(3,4-c)카르바졸 또는 이의 유도체이다.
[12] [9]의 방법에 있어서, 상기 아폽토시스-유도제는 스타우로스포린, 또는 이의 유도체이다.
[13] [9]의 방법에 있어서, 상기 아폽토시스-유도제는 독소루비신, 또는 이의 유도체이다.
[14] [1]-[13] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 측정되는 적어도 하나의 성질은 세포 생존능, 비대, 세포 건강, 세포 부착, 세포 생리학, ATP 함량, 세포수, 및 세포 형태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[15] [14]의 방법에 있어서, 상기 방법은 단계 (a)의 배양 동안 배양된 세포의 적어도 하나의 성질을 1회 이상 측정하는 것을 더 포함한다.
[16] [1]-[3] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 적어도 하나의 성질은 단계 (b)의 배양 동안 다수 회 측정된다.
[17] [4]-[7] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 적어도 하나의 성질은 단계 (c)의 배양 동안 다수 회 측정된다.
[18] [16] 또는 [17]의 방법에 있어서, 다수 측정은 서로 5분 내지 10시간 간격으로 수행된다.
[19] [18]의 방법에 있어서, 다수 측정은 서로 10분 내지 4시간 간격으로 수행된다.
[20] [19]의 방법에 있어서, 다수 측정은 서로 30분 내지 2시간 간격으로 수행된다.
[21] [1]-[20] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 적어도 하나의 성질은 세포 생존능, 세포 부착, 세포수, 세포 형태, 세포 성장, 및/또는 ATP 함량으로부터 선택된다.
[22] [21]의 방법에 있어서, 적어도 하나의 성질은 배양된 세포의 생존능이고, 생존능은 형광 DNA-표지 염료 또는 형광 핵-염색 염료를 사용하여 측정된다.
[23] [21]의 방법에 있어서, 적어도 하나의 성질은 배양된 세포의 부착, 세포수, 성장, 및/또는 형태이고, 배양된 세포의 부착, 세포수, 성장, 및/또는 형태는 배양물에서 배양 용기 표면에 걸쳐서 전기 임피던스를 측정하여 결정된다.
[24] [1]-[23] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 (a)의 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포의 배양은 30분 내지 10시간 동안이다.
[25] [24]의 방법에 있어서, 단계 (a)의 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포의 배양은 1시간 내지 5시간 동안이다.
[26] [25]의 방법에 있어서, 단계 (a)의 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포의 배양은 약 4시간 동안이다.
[27] [1]-[3] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 (b)의 상기 표적 세포의 배양은 적어도 2시간 동안이다.
[28] [4]-[7] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 (c)의 상기 표적 세포의 배양은 적어도 2시간 동안이다.
[29] [27] 또는 [28]의 방법에 있어서, 배양은 적어도 5시간 동안이다.
[30] [29]의 방법에 있어서, 배양은 적어도 12시간 동안이다.
[31] [30]의 방법에 있어서, 배양은 적어도 24시간 동안이다.
[32] [22]의 방법에 있어서, 배양된 세포의 생존능은 DNA-표지 염료 또는 핵-염색 염료를 이미지화하여 측정된다.
[33] [1]-[20] 및 [24]-[31] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 적어도 하나의 성질은 배양된 세포의 생존능이고, 생존능은 생 세포 이미지화에 의해 측정된다.
[34] [1]-[33] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 표적 세포는 특화 세포이다.
[35] [1]-[33] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 표적 세포는 심근세포, 심혈관 전구체, 심장 전구체, 및/또는 혈관 세포를 포함한다.
[36] [34]의 방법에 있어서, 상기 특화 세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 수득된다.
[37] [1]-[33] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 표적 세포는 이전에 냉동된 것이다.
[38] [1]-[37] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 분비체는 전능 전구체 세포, 다능 전구체 세포, 및 말기 분화 세포로부터 선택되는 하나 이상의 세포의 배양물로부터 단리된다.
[39] [38]의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 전구체 세포는 심근세포 전구체 세포, 심장 전구체 세포, 심혈관 전구체 세포, 및 중간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 전구체 세포를 포함한다.
[40] [1]-[39] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 분비체는 세포 배양물로부터 단리된 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)을 포함한다.
[41] [40]의 방법에 있어서, 상기 sEV 는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다: (a) CD63+, CD81+ 및/또는 CD9+ 임; (b) 50-200 nm 직경의 세포외 소포를 포함함; (c) CD49e, ROR1 (Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1), SSEA-4 (Stage-specific embryonic antigen 4), MSCP (Mesenchymal stem cell-like protein), CD146, CD41b, CD24, CD44, CD236, CD133/1, CD29 및 CD142 중 하나 이상에 대해 양성임; 및/또는 (d) CD19, CD4, CD209, HLA-ABC (human leukocyte antigen-ABC), CD62P, CD42a 및 CD69 중 하나 이상에 대해 음성이다.
[42] [40]의 방법에 있어서, 상기 sEV 는 엑소솜, 미세입자, 세포외 소포 및 분비된 단백질 중 하나 이상을 포함한다.
[43] [1]-[42] 중 하나 이상의 방법에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 이전 1-21일 동안 표적 세포를 배양하는 것을 더 포함한다.
[44] [43]의 방법에 있어서, 표적 세포는 단계 (a) 이전 5-14일 동안 배양된 것이다.
[45] [43]의 방법에 있어서, 표적 세포는 단계 (a) 이전 12-36시간에 신선한 배양 배지가 공급된다.
[46] [1]-[45] 중 하나의 방법에 있어서, 표적 세포는 2차원 세포 배양으로 배양된다.
[47] [46]의 방법에 있어서, 상기 2차원 세포 배양은 배양 용기 표면 상에서 표적 세포를 배양하는 것을 포함한다.
[48] [47]의 방법에 있어서, 상기 배양 용기 표면은 세포 부착을 촉진하는 물질로 코팅된다.
[49] [48]의 방법에 있어서, 세포 부착을 촉진하는 상기 물질은 피브로넥틴이다.
[50] [1]-[49] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 동시에 양성 대조군 세포를 배양하는 것을 더 포함하고, 상기 양성 대조군 세포는 분비체가 투여되지 않고, 스트레스-유도 조건을 겪지 않는다.
[51] [1]-[50] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 음성 대조군 세포를 배양하는 것을 더 포함하고, 상기 음성 대조군 세포는 분비체가 투여되지 않는다.
[52] [51]의 방법에 있어서, 상기 음성 대조군 세포는 분비체가 투여되지 않는 것을 제외하고, 표적 세포와 동일한 단계가 수행된 음성 대조군 세포를 포함한다.
[53] [51] 또는 [52]의 방법에 있어서, 상기 음성 대조군 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 전처리 배지에서 배양된 음성 대조군 세포를 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 전처리 배지를 배양하는 동안 또는 이후에 음성 대조군 세포의 적어도 하나의 성질을 측정하는 것을 포함한다.
[54] [51]의 방법에 있어서, 상기 음성 대조군 세포는 모의 분비체 조성물이 첨가되는 음성 대조군 세포를 포함하고, 상기 모의 분비체 조성물은 분비체를 생산하는 과정으로부터 세포를 제외시켜서 생산된다.
[55] [1]-[54] 중 하나의 방법에 있어서, 상기 표적 세포에 첨가된 분비체의 양은 분비체를 생산한 분비 세포의 양; 상기 분비체의 단백질 함량; 상기 분비체의 RNA 함량; 상기 분비체의 엑소솜 양; 및 상기 분비체의 입자 수 중 하나 이상을 기반으로 결정된다.
[56] [50]의 방법에 있어서, 상기 표적 세포 및 상기 양성 대조군 세포는 반복물 (replicate) 로 배양된다.
[57] [56]의 방법에 있어서, 반복 배양 (replicate culture) 에서 양성 대조군 세포의 수는 평균 내어져 평균 최대 세포수를 생성하고, 각 반복 배양에서 표적 세포의 수는 평균 최대 세포수에 대해 정규화된다.
[58] [51]-[54] 중 하나의 방법에 있어서, 적어도 하나의 성질은 배양된 세포의 생존능이고, 상기 분비체는 표적 세포의 생존능이 음성 대조군 세포의 생존능보다 더 높을 때 역가를 갖고/갖거나 치료적 효과를 나타내는 것으로 결정된다.
[59] [40]의 방법에 있어서, 상기 sEV 는 하기 중 적어도 하나이다: 약 50- 200 nm 또는 50-200 nm의 직경을 갖고, 바람직하게 약 50-150 nm 또는 50-150 nm의 직경을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된 sEV; 전체 세포가 실질적으로 없거나 또는 없는 sEV; 및/또는 하나 이상의 배양 배지 성분이 실질적으로 없는 sEV.
[60] 소형 분자 또는 화학요법제의 활성을 분석하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 (a) 표적 세포의 배양물을 전처리 배지와 접촉시키고, 소형 분자 또는 화학요법제의 존재 하에 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계; (b) 분비체를 세포 배양물에 투여하고, 분비체의 존재 하에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 배양 동안 배양된 세포의 적어도 하나의 성질을 1회 이상 측정하는 단계를 포함한다.
참조 편입
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도 1 은 스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이에서 스타우로스포린 존재 및 부재에서 인큐베이션된 세포에 대한 대표적인 이미지를 도시한다. 건강한 세포에서 핵은 둥글고 중간 적색 강도를 나타내지만 (패널 1에서 확인), 죽은 핵 및 죽어가는 핵은 쪼글쪼글하고 강렬한 적색을 나타낸다 (패널 3에서 확인). Incucyte 이미지 분석 소프트웨어는 생존 핵을 확인하고 (패널 2 및 4에서 파란색 "마스킹") 각 이미지에서 그들을 계측한다.
도 2 는 스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이에서 세포 생존능을 측정하는 시간 과정을 도시한다. 스타우로스포린 전처리 후에, 세포 생존능은 인간 심혈관 전구체 세포 (CPC)로부터 수득된 소형 세포외 소포 농후화 분획 (sEV) 분비체; 모의 sEV 조제물 (처녀 배지 대조군); 또는 sEV 없는 완전 배지의 투여 후 매 시간 측정되었다. 완전 배지 대조군 (양성 대조군)은 스타우로스포린 전처리가 수행되지 않았다.
도 3 은 스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이 시간 과정의 24시간 시점에서 결과를 보여주는 히스토그램을 도시한다. 이러한 히스토그램에 대한 값은 동일한 웰에 대해서 0-시간에 생존 세포 계수에 대해서 24-시간에 생존 세포 계수를 정규화하여 먼저 계산된다. 다음으로, 정규화된 기준점 결과 (음성 대조군 웰에서 결정됨)를 각 결과로부터 차감한다. 마지막으로, 각 조건의 결과는 양성 대조군 웰의 평균의 백분율로서 표시된다. 각 조건의 평균 및 표준 편차가 도시된다.
도 4 는 CPC로부터 생산된 sEV를 사용하는 실시예 2에 기술된 바와 같은 스타우로스포린 어세이에 대해, 세포 생존능 데이터 (13시간 시점에 Incucyte를 사용해 측정된, 생체적합성 염료를 사용해 수득)를 비롯하여, ATP 정량 데이터 (CellTiter-Glo® Luminescent 세포 생존능 어세이 (Promega)를 사용해 수득, CLARIOStar® (BMG Labtech) 및 Tecan for Life Science® 플레이트 판독기로 측정 (24시간 시점에, 즉 Incucyte 시간 과정 종료 후))를 나타내는 히스토그램을 도시한다.
도 5 는 MSC로부터 생산된 sEV를 사용하는 실시예 2에 기술된 바와 같은 스타우로스포린 어세이에 대해, 세포 생존능 데이터 (생체적합성 염료를 사용해 수득, 12시간 시점에 Incucyte를 사용해 측정)를 비롯하여, ATP 정량 데이터 (CellTiter-Glo® Luminescent 세포 생존능 어세이 (Promega)를 사용해 수득, CLARIOStar® (BMG Labtech) 및 Tecan for Life Science® 플레이트 판독기로 측정 (23시간 시점에, 즉 Incucyte 시간 과정 종료 후))를 나타내는 히스토그램을 도시한다.
도 6 은 MSC로부터 생산된 sEV 를 사용하는 실시예 2에 기술된 바와 같은 스타우로스포린 어세이에 대해, ATP 정량 데이터 (CellTiter-Glo® Luminescent 세포 생존능 어세이 (Promega)를 사용해 수득, Tecan for Life Science® 플레이트 판독기로 측정 (23시점에))를 나타내는 히스토그램을 도시한다. sEV 처리는 도시된 바와 같이, 혈청 함유 배지 ("iCell 심근세포 유지 배지 M1003"), 또는 혈청 무함유 배지 ("iCell 심근세포 혈청-무함유 배지 M1038")에서 수행되었다.
도 7 은 혈관생성에 대한 sEV 조제물의 효과를 결정하는, 스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이 및 HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이의 결과 간 비교를 도시한다. 효능에서 유사한 경향이 이들 2개 어세이에서 동시에 시험된 샘플에서 확인되었으며, 이는 심혈관 전구체 세포-sEV 경우에, 시험관내에서 심장 및 혈관 표적 세포 둘 모두에 대한 효과가 존재한다는 것을 나타낸다.
도 8 은 3명의 상이한 공여자 (62, 64, 82)로부터의 MSC에서 단리된 sEV 가 입자 수를 기반으로 투여될 때 상처 치유에 대해 매우 상이한 효과를 갖는 것으로 나타난다는 것을 보여주는, 스크래치 상처 치유 어세이의 결과를 도시한다 (좌측 그래프). 그러나, 분비 세포수를 기반으로 투여될 때 (우측 그래프), 상이한 MSC 공여자로부터의 sEV는 이러한 어세이에서 훨씬 더 유사한 효과를 나타낸다.
도 9 는 스타우로스포린 심근세포 세포 부착/수/성장 어세이에서, 전기 임피던스를 측정하는 시간 과정을 도시한다. 전처리 (스타우로스포린 존재 또는 부재) 이후에, 세포 부착/수/성장은 인간 심혈관 전구체 세포로부터 수득된 sEV ("sEV", 조건 3-5); 모의 sEV 조제물 (처녀 배지 대조군 ("MV"; 조건 1 및 7)); 또는 sEV 부재의 배지/배양 대조군 (조건 2, 6 및 8)의 투여 이전 및 이후에 (전기 임피던스를 측정하여) 계속 분석되었다.
도 10 은 처리 ("Tx") 시점에 대해 정규화된, 도 9에 도시된 시간 과정 실험의 결과를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 전문 용어는 오직 특정 구현예를 설명하려는 목적이고 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수형 "한", "하나" 및 "그"는 달리 문맥에서 명확하게 명시하지 않으면 복수 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포를 포함한다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 기술된 것과 유사하거나, 또는 동등한 다른 방법 및 재료가 본 발명에서 유용할 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법은 본 명세서에 기술된다.
본 명세서에서 사용되는, "대상체", "개체", 또는 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 제한없이, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 붉은털 원숭이, 침팬지, 및 다른 원숭이 및 유인원종을 포함한, 다른 영장류; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소, 및 말; 가축 포유동물, 예컨대 개 및 고양이; 토끼, 마우스, 래트, 및 기니 피그를 포함한, 실험실 동물; 가축, 야생, 및 사냥감 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 및 다른 순계류 조류, 오리, 및 거위를 포함한, 조류 등을 포함하여, 척삭동물문의 임의 구성원을 의미한다. 이 용어는 특정 연령 또는 성별을 의미하지 않는다. 따라서, 이 용어는 성인, 청소년, 및 신생 개체를 비롯하여 남성 및 여성을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 (예를 들어, 만능 줄기 세포, 전구체 세포, 또는 조직-특이적 세포를 포함한, 줄기 세포)는 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 대상체는 비-인간 대상체이다.
본 명세서에서 사용되는, "분화"는 미분화된 세포 (예컨대 만능 줄기 세포, 또는 다른 줄기 세포), 또는 다능 또는 협능 세포가 예를 들어, 보다 성숙하거나, 또는 완전하게 성숙한 세포의 특징적인 특화된 구조적 및/또는 기능적 특성을 획득하는 과정을 의미한다. "전환분화"는 하나의 분화된 세포 유형이 다른 분화된 세포 유형으로 전환되는 과정이다.
본 명세서에서 사용되는, "배아체"는 만능 줄기 세포의 3차원 응집체를 의미한다. 이들 세포는 3개의 배엽, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 세포로 분화를 겪을 수 있다. 배아체 미세환경 내에서 복잡한 세포 부착 및 측분비 신호전달의 확립을 포함한, 3차원 구조는 분화 및 형태발생을 가능하게 한다.
본 명세서에서 사용되는, "줄기 세포"는 자가-재생 능력, 즉 그들의 비말단 분화 상태를 유지하면서 다수의 세포 분열 주기를 거치는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 줄기 세포는 전능, 만능, 다능, 협능, 또는 단분화능일 수 있다. 줄기 세포는 예를 들어, 배아, 태아, 양막, 성체, 또는 유도 만능 줄기 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "만능 줄기 세포" (PSC)는 스스로 무한하게 번식되고, 성체 유기체의 임의의 다른 세포 유형으로 분화되는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 일반적으로, 만능 줄기 세포는 면역결핍 (SCID) 마우스에 이식했을 때 기형종을 유도할 수 있고; 모든 3개 배엽의 세포 유형으로 분화할 수 있고 (예를 들어, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포 유형으로 분화할 수 있고); PSC를 특징으로 하는 하나 이상의 마커를 발현할 수 있는 줄기 세포이다. PSC, 예컨대 배아 줄기 세포 (ESC) 및 iPSC에 의해 발현되는 이러한 마커의 예는 Oct 4, 알칼리 포스파타제, SSEA-3 표면 항원, SSEA-4 표면 항원, nanog, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2, 및 REX1을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, "유도 만능 줄기 세포" (iPSC)는 비-만능 세포, 전형적으로 체세포로부터 인공적으로 유도되는 유형의 만능 줄기 세포를 의미한다. 일부 구현예에서, 체세포는 인간 체세포이다. 체세포의 예는 피부 섬유아세포, 골수-유래된 중간엽 세포, 심장 근육 세포, 케라티노사이트, 간 세포, 위 세포, 신경 줄기 세포, 폐 세포, 신장 세포, 비장 세포, 및 췌장 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 체세포의 추가 예는 B-세포, 수지상 세포, 과립구, 선천성 림프구 세포, 거핵구, 단핵구/마크로파지, 골수-유래 억제 세포, 자연 살해 (NK) 세포, T 세포, 흉선세포, 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 면역계의 세포를 포함한다.
iPSC 는 체세포에서 인자들 (본 명세서에서 재프로그래밍 인자라고함) 중 하나 또는 조합을 발현시키거나 또는 그 발현을 유도하여, 체세포를 재프로그래밍하여서 생성될 수 있다. iPSC 는 태아, 생후, 신생, 청소년 또는 성인 체세포를 사용해 생성될 수 있다. 일부 예에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자들은 예를 들어, OCT4 (OCT3/4), SOX2, c-MYC, 및 KLF4, NANOG, 및 LIN28을 포함한다. 일부 예에서, 체세포는 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위해서, 적어도 2종의 재프로그래밍 인자, 적어도 3종의 재프로그래밍 인자, 또는 적어도 4종의 재프로그래밍 인자를 발현시켜서, 재프로그래밍될 수 있다. 세포는 예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 센다이 바이러스 벡터를 포함한, 벡터를 사용하여 재프로그래밍 인자를 도입시켜서 재프로그래밍될 수 있다. 대안적으로, 재프로그래밍 인자를 도입시키기 위한 비-바이러스 기술은 예를 들어, mRNA 형질감염, miRNA 감염/형질감염, PiggyBac, 미니써클 벡터, 및 에피솜 플라스미드를 포함한다. iPSC 는 또한 재프로그래밍 인자를 도입시키거나, 또는 내생성 프로그래밍 유전자를 활성화시키기 위해서, 예를 들어, CRISPR-Cas9-기반 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "배아 줄기 세포"는 배 조직, 바람직하게 임의로 세포주로서 연속 계대된 배반포 또는 상실배의 내부 세포괴로부터 유래되는 배아 세포이다. 이 용어는 바람직하게 배아의 나머지를 파괴하지 않고, 배아의 하나 이상의 할구로부터 단리된 세포를 포함한다. 이 용어는 또한 체세포 핵 전달에 의해 생산된 세포를 포함한다. ESC 는 예를 들어 정자 및 난자 세포의 융합, 핵 전달, 또는 처녀생식에 의해서 생성되는 접합자, 할구, 또는 배반포-단계 포유동물 배아로부터 생성 또는 유래될 수 있다. 인간 ESC 는 제한없이, MAO1, MAO9, ACT-4, No. 3, H1, H7, H9, H14 및 ACT30 배아 줄기 세포를 포함한다. 예시적인 만능 줄기 세포는 배반포 단계 배아의 내부 세포괴 (ICM)로부터 유래되는 배아 줄기 세포를 비롯하여, 분열 단계 또는 상실배 단계 배아의 하나 이상의 할구로부터 유래되는 배아 줄기 세포를 포함한다. 이들 배아 줄기 세포는 체세포 핵 전달 (SCNT), 처녀생식, 및 동정생식을 포함한, 무성 수단을 통해서 또는 수정을 통해서 생성되는 배아 물질로부터 생성될 수 있다. PSC 단독으로는 그들이 모든 배아외 조직에 기여할 가능성이 없기 때문에 자궁에 이식했을 때 태아 또는 성체 동물로 발달될 수 없다 (예를 들어, 생체내 태반 또는 시험관내 영양막).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "전구체 세포"는 하나 이상의 종류의 특화 세포로 더 분화될 수 있지만, 무한하게 분열 및 번식될 수 없는 줄기 세포의 후손을 의미한다. 즉, (무제한적인 자기-재생 능력을 보유하는) 줄기 세포와 달리, 전구체 세포는 오직 제한된 자기-재생 능력을 보유한다. 전구체 세포는 다능, 협능, 또는 단분화능일 수 있고, 전형적으로 그들이 분화될 수 있는 유형의 특화 세포에 따라서 분류된다. 예를 들어, "심근세포 전구체 세포"는 심근 세포로 분화되는 능력을 갖는 줄기 세포로부터 유래되는 전구체 세포이다. 유사하게, "심장 전구체 세포"는 예를 들어, 심근세포, 평활근 세포, 및 내피 세포를 포함한, 심장 조직을 구성하는 다수의 특화 세포로 분화될 수 있다. 추가로, "심혈관 전구체 세포"는 예를 들어, 심장 및 혈관 계통의 세포로 분화되는 능력을 갖는다. 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 전구체 세포의 다른 유형이다.
본 명세서에서 사용되는, "확장하다" 또는 "증식하다"는 세포 배양에서의 세포수가 세포 분열로 인해 증가되는 과정을 의미할 수 있다.
"다능"은 세포가 이의 자손을 통해서 성체 동물에서 발견되는 몇몇 상이한 세포 유형을 생기게 할 수 있다는 것을 의미한다.
"만능"은 세포가 이의 자손을 통해서 생식 세포를 포함하여, 성체 동물을 포함하는 모든 세포 유형을 생기게 할 수 있다는 것을 의미한다. 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 및 배아 생식 세포는 이러한 정의 하에서 만능 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "자기 유래 세포"는 수용자와 유전적으로 동일한 공여자 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "동종이계 세포"는 상이하고, 유전적으로 동일하지 않은, 동일 종의 개체로부터 유래되는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전능"은 살아있는 태어나는 동물을 생기게 하는 세포를 의미할 수 있다. 용어 "전능"은 또한 특정 동물에서 모든 세포를 생기게 하는 세포를 의미할 수 있다. 전능 세포는 하나 이상의 핵 전달 단계로부터 배아를 발생시키기 위한 절차에서 이용될 때 동물의 모든 세포를 생성시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "세포외 소포"는 집합적으로 세포로부터 유래되는 생물학적 나노입자를 의미하고, 이의 예에는 엑소솜, 엑토솜, 외포, 미세입자, 미세소포, 나노소포, 기포 소포, 발아 소포, 엑소솜-유사 소포, 매트릭스 소포, 막 소포, 탈피성 소포, 막 입자, 탈피성 미세소포, 온코솜, 엑소머, 및 아폽토시스 소체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
세포외 소포는 예를 들어, 크기에 따라서 분류될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는, 용어 "소형 세포외 소포"는 약 50-200 nm의 직경을 갖는 세포외 소포를 의미한다. 대조적으로, 약 200 nm 초과이지만, 400 nm 미만의 직경을 갖는 세포외 소포는 "중형 세포외 소포"라고 할 수 있고, 약 400 nm 초과의 직경을 갖는 세포외 소포는 "대형 세포외 소포"라고 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "소형 세포외 소포 분획" ("sEV")은 약 50-200 nm의 직경을 갖는 소형 세포외 소포에 대해 농축 및/또는 농후화된, 분비체 또는 조건화 배지의 일부, 추출물, 또는 분획을 의미한다. 이러한 농축 및/또는 농후화는 본 명세서에 개시된 정제, 단리, 농축, 및/또는 농후화 기술 중 하나 이상을 사용하여 수득될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "엑소솜"은 원형질막과 다중소포체 (MVB) (중간 세포내이입 구획)의 융합 시 세포로부터 방출되는 세포외 소포를 의미한다.
엑소솜과 공통 기원을 갖는, "엑소솜-유사 소포"는 전형적으로 엑소솜과 구별되는 크기 및 침강 성질을 갖는 것으로 설명되며, 특히 지질 뗏목 마이크로도메인이 결여된 것으로 설명된다. 본 명세서에서 사용되는 "엑토솜"은 전형적으로 호중구- 또는 단핵구-유래된 미세소포이다.
본 명세서에서 사용되는 "미세입자"는 전형적으로 약 100-1000 nm의 직경이고, 원형질막으로부터 기원한다. "세포외 막 구조"는 또한 예를 들어, 괴사성 사멸로부터의 선형 또는 폴딩된 막 단편을 비롯하여, 분비되는 리소솜 및 나노튜브를 포함하여, 다른 세포 공급원으로부터의 막 구조를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, "아폽토시스 체 또는 소체"는 전형적으로 약 1 내지 5 μm의 직경이고, 아폽토시스를 겪은 세포, 즉 질환이 있는, 원치않는 및/또는 이상 세포의 소기포로서 방출된다.
세포외 소포의 부류 내에서, 중요한 성분은 "엑소솜" 그 자체로서, 약 40 내지 50 nm에서 약 200 nm의 직경일 수 있고, 세포외 융합, 또는 다중소포체 (MVB)의 "세포외유출"의 결과인 세포내 기원의 막 소포, 즉 인지질 이중층으로 둘러싸인 소포이다. 일부 경우에, 엑소솜은 약 40 내지 50 nm에서 최대 약 200 nm의 직경일 수 있고, 예컨대 60 nm 내지 180 nm이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "분비체" 및 "분비체 조성물"은 세포외 공간 (예컨대, 배양 배지)로 세포에 의해 분비되는 하나 이상의 분자 및/또는 생물학적 인자를 상호교환적으로 의미한다. 분비체 또는 분비체 조성물은 제한없이, 세포외 소포 (예를 들어, 엑소솜, 미세입자 등), 단백질, 핵산, 사이토카인, 및/또는 세포외 공간 (예컨대, 배양 배지)로 세포에 의해 분비되는 다른 분자를 포함할 수 있다. 분비체 또는 분비체 조성물은 정제되지 않은 채로 남겨질 수 있거나 또는 추가로 처리될 수 있다 (예를 들어, 분비체 또는 분비체 조성물의 성분은 배양 배지, 예컨대 조건화 배지 내에 존재할 수 있거나, 또는 대안적으로, 분비체 또는 분비체 조성물의 성분은 배양 배지 또는 이의 추출물, 일부, 또는 분획으로부터 정제, 단리, 및/또는 농후화될 수 있음). 분비체 또는 분비체 조성물은 세포로부터 분비되지 않은 하나 이상의 물질 (예를 들어, 배양 배지, 첨가제, 영양분 등)을 더 포함할 수 있다. 대안적으로, 분비체 또는 분비체 조성물은 세포로부터 분비되지 않은 하나 이상의 물질 (예를 들어, 배양 배지, 첨가제, 영양분 등)을 포함하지 않는다 (또는 오직 이의 미량만을 포함한다).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "조건화 배지"는 하나 이상의 관심 세포가 배양된 배양 배지 (또는 이의 추출물, 일부, 또는 분획)를 의미한다. 바람직하게, 조건화 배지는 사용 및/또는 추가 처리 전에 배양된 세포로부터 분리된다. 배양 배지에서 세포의 배양은 그 결과로 하나 이상의 분자 및/또는 생물학적 인자 (제한없이, 세포외 소포 (예를 들어, 엑소솜, 미세입자 등), 단백질, 핵산, 사이토카인, 및/또는 세포외 공간으로 세포에 의해 분비되는 다른 분자를 포함할 수 있음)의 분비 및/또는 축적을 일으킬 수 있고; 하나 이상의 분자 및/또는 생물학적 인자를 함유하는 배지는 조건화 배지이다. 조건화 배지를 제조하는 방법의 예는 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 편입되는, 미국 특허 제6,372,494호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "세포 배양물"은 세포의 천연 환경 밖에서 제어된 조건(들) 하에서 성장된 세포를 의미한다. 일부 예에서, 세포는 그들 천연 환경의 완전히 밖 (시험관내)에서 번식될 수 있거나, 또는 그들 천연 환경 및 배양에서 제거될 수 있다 (생체외). 세포 배양 동안, 세포는 예를 들어, 특정 배양 배지, 배양 조건, 및 세포의 유형에 의존하여, 비-복제 상태로 생존할 수 있거나, 또는 복제되어서 수가 성장될 수 있다. 시험관내 환경은 시험관내에서 세포를 유지시키기에 적합한 당분야에 공지된 임의 배지, 예컨대 예를 들어, 적합한 액체 배지 또는 한천일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포주"는 종료없이 적어도 1회 계대될 수 있는 배양된 세포를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "현탁"은 세포가 고형 지지체에 부착되지 않은 세포 배양 조건을 의미할 수 있다. 현탁 증식되는 세포는 당업자에게 충분히 공지된 장비를 사용하여 증식하면서 교반될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단층"은 적합한 배양 조건에서 증식하면서 고형 지지체에 부착된 세포를 의미할 수 있다. 적합한 성장 조건 하에서 단층으로 증식되는 세포의 작은 부분은 고형 지지체가 아닌 단층 세포에 부착될 수 있다.
세포를 참조하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "도말된" 또는 "도말"은 시험관내에서 세포 배양의 확립을 의미할 수 있다. 예를 들어, 세포는 세포 배양 배지에 희석된 다음에 세포 배양 플레이트, 디쉬, 또는 플라스크에 첨가될 수 있다. 세포 배양 플레이트는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 세포는 다양한 농도 및/또는 세포 밀도로 도말될 수 있다.
용어 "세포 도말"은 또한 용어 "세포 계대"로 확장될 수 있다. 세포는 당업자에게 충분히 공지된 세포 배양 기술을 사용하여 계대될 수 있다. 용어 "세포 계대"는 (1) 고형 지지체 또는 기재로부터 세포를 방출하고 이들 세포를 해리시키는 단계, 및 (2) 추가 세포 증식에 적합한 배지에 세포를 희석하는 단계를 포함하는 기술을 의미할 수 있다. 세포 계대는 또한 배양된 세포를 함유하는 액체 배지의 일부를 제거하고 액체 배지를 본래 배양 용기에 첨가하여 세포를 희석하고 추가 세포 증식을 허용하는 것을 의미할 수 있다. 또한, 세포는 추가 세포 증식에 적합한 배지가 보충된 새로운 배양 용기에 또한 첨가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "배양 배지", "성장 배지" 또는 "배지"는 상호교환적으로 사용되고, 유기체의 성장 및 생존을 지원하고자 의도되는 조성물을 의미한다. 배양 배지가 종종 액체 형태이지만, 다른 물리적 형태, 예컨대, 예를 들어, 고체, 반고체, 겔, 현탁액 등이 사용될 수 있다.
배양 배지 또는 성장 배지의 상황에서, 본 명세서에서 사용되는, 용어 "혈청-무함유"는 혈청이 부재하는 배양 또는 성장 배지를 의미한다. 혈청은 전형적으로 응고 인자 (예를 들어, 피브리노겐 및 프로트롬빈)가 응괴 형성에 의해 제거된 이후, 응고된 혈액의 액체 성분을 의미한다. 혈청, 예컨대, 태아 소 혈청은 이의 다양한 단백질 및 성장 인자가 세포의 생존, 성장, 및 분열에 특히 유용하므로, 세포 배양 배지의 성분으로서 당분야에서 통상적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "기초 배지"는 완충제, 하나 이상의 탄소원, 아미노산, 및 염을 함유할 수 있는 비보충된 합성 배지를 의미한다. 적용에 따라서, 기초 배지는, 일부 예에서, 특정 세포 유형의 성장을 촉진하거나, 또는 분화 상태를 유지 또는 변화시키는데 유용한, 추가적인 완충제, 아미노산, 항생제, 단백질, 및 성장 인자 (예를 들어, 섬유아세포 성장 인자-염기성; bFGF)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 성장 인자 및 보충제가 보충될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "야생형", "천연 발생" 및 "비변형"은 자연계에 존재하는 전형적인 (또는 가장 일반적인) 형태, 외관, 표현형, 또는 균주, 예를 들어, 그들이 자연에서 발생되고, 자연 공급원으로부터 단리될 수 있는 대로의 세포, 유기체, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 거대분자 복합체, 유전자, RNA, DNA, 또는 게놈의 전형적인 형태를 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 야생형 형태, 외관, 표현형, 또는 균주는 의도적인 변형 이전 본래 부모로서 역할을 한다. 따라서, 돌연변이체, 변이체, 조작, 재조합, 및 변형 형태는 야생형 형태가 아니다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "단리된"은 이의 본래 환경으로부터 제거된 물질을 의미하고, 따라서, 이의 천연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변경된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "농후화"는 하나 이상의 다른 성분과 관련하여, 조성물 중 하나 이상의 성분의 양을 선택적으로 농축시키거나 또는 증가시키는 것을 의미한다. 일부 예에서, 농후화는 원치않는 물질의 양을 감소 또는 저하 (예를 들어, 제거 또는 근절)시키는 것을 포함할 수 있고/있거나, 조성물로부터 원하는 물질을 특이적으로 선택 또는 단리하는 것을 포함할 수 있다.
용어 "조작된", "유전자 조작된", "유전자 변형된", "재조합", "변형된", "비천연 발생" 및 "비-천연"은 유기체 또는 세포의 게놈의 의도적인 인간 조작을 의미한다. 이 용어는 본 명세서에 정의된 바와 같은, 게놈 편집을 포함한 게놈 변형 방법을 비롯하여, 유전자 발현 또는 불활성화를 변경시키는 기술, 효소 조작, 유도 진화, 지식-기반 디자인, 무작위 돌연변이유발 방법, 유전자 셔플링, 코돈 최적화 등을 포괄한다. 유전자 조작을 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 및 "올리고뉴클레오티드"는 모두 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 선형 형태일 때, 하나의 5' 말단 및 하나의 3' 말단을 갖고, 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있는 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA), 리보뉴클레오티드 (RNA), 이의 유사체, 또는 이의 조합일 수 있고, 임의 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 기능을 수행할 수 있고, 다양한 2차 및 3차 구조를 가질 수 있다. 이 용어는 천연 뉴클레오티드의 기지 유사체 및 염기, 당, 및/또는 포스페이트 모이어티가 변형된 뉴클레오티드를 포괄한다. 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍형성 특이성 (예를 들어, A의 유사체는 T와 염기쌍형성함)을 갖는다. 폴리뉴클레오티드는 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 예는 플루오르화된 뉴클레오티드, 메틸화된 뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 뉴클레오티드 구조는 중합체가 조립되기 이전 또는 이후에 변형될 수 있다. 중합 이후에, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 표지화 성분 또는 표적 결합 성분과 접합을 통해서 추가로 변형될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 성분을 혼입할 수 있다. 이 용어는 또한 합성, 천연 발생, 및/또는 비-천연 발생이고, 기준 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA)와 유사한 결합 성질을 갖는, 변형된 골격 잔기 또는 연결을 포함하는 핵산을 포괄한다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA™) (Exiqon, Inc., Woburn, MA) 뉴클레오시드, 글리콜 핵산, 가교 핵산, 및 모르폴리노 구조를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 펩티드-핵산 (PNA)은 폴리뉴클레오티드 포스페이트-당 골격이 가요성 슈도-펩티드 중합체로 대체된, 핵산의 합성 상동체이다. 핵염기는 중합체에 연결된다. PNA는 RNA 및 DNA의 상보성 서열과 높은 친화성 및 특이성으로 혼성화하는 능력을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 달리 표시하지 않으면 통상적인 5'에서 3' 배향으로 본 명세서에서 표시된다.
본 명세서에서 사용되는, "서열 동일성"은 일반적으로 다양한 가중 매개변수를 갖는 알고리즘을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 제2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 비교하는 뉴클레오티드 염기 또는 아미노신의 백분율 동일성을 의미한다. 2개 폴리뉴클레오티드 또는 2개 폴리펩티드 간 서열 동일성은 GENBANK (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 및 EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk.)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 월드와이드 웹 사이트를 통해 이용가능한 다양한 방법 및 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, Exonerate, BLAST, CS-BLAST, FASTA, HMMER, L-ALIGN 등)에 의한 서열 정렬을 사용해 결정될 수 있다. 2개 폴리뉴클레오티드 또는 2개 폴리펩티드 서열 간 서열 동일성은 일반적으로 다양한 방법 또는 컴퓨터 프로그램의 표준 디폴트 매개변수를 사용하여 계산된다. 2개 폴리뉴클레오티드 또는 2개 폴리펩티드 간 서열 동일성의 높은 정도는 종종 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서, 약 90% 동일성 내지 100% 동일성, 예를 들어, 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서, 약 90% 동일성 이상, 약 91% 동일성 이상, 약 92% 동일성 이상, 약 93% 동일성 이상, 약 94% 동일성 이상, 약 95% 동일성 이상, 약 96% 동일성 이상, 약 97% 동일성 이상, 약 98% 동일성 이상, 또는 약 99% 동일성 이상이다. 서열 동일성은 또한 2개 서열의 오직 일부만을 정렬하는 2개 서열의 중첩 영역에 대해 계산될 수 있다.
2개 폴리뉴클레오티드 또는 2개 폴리펩티드 간 서열 동일성의 중간 정도는 종종 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서 약 80% 동일성 내지 약 90% 동일성, 예를 들어, 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서, 약 80% 동일성 이상, 약 81% 동일성 이상, 약 82% 동일성 이상, 약 83% 동일성 이상, 약 84% 동일성 이상, 약 85% 동일성 이상, 약 86% 동일성 이상, 약 87% 동일성 이상, 약 88% 동일성 이상, 또는 약 89% 동일성 이상이지만, 90% 미만이다.
2개 폴리뉴클레오티드 또는 2개 폴리펩티드 간 서열 동일성의 낮은 정도는 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서, 종종 약 50% 동일성 내지 75% 동일성, 예를 들어, 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서, 약 50% 동일성 이상, 약 60% 동일성 이상, 약 70% 동일성 이상이지만, 75% 동일성 미만이다.
본 명세서에서 사용되는, "결합"은 거대분자 간 (예를 들어, 단백질 및 폴리뉴클레오티드 간, 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 간, 또는 단백질 및 단백질 간 등)에 비-공유 상호작용을 의미한다. 이러한 비-공유 상호작용은 또한 "회합" 또는 "상호작용"이라고 한다 (예를 들어, 제1 거대분자가 제2 거대분자와 상호작용하면, 제1 거대분자는 비-공유 방식으로 제2 거대분자에 결합한다). 결합 상호작용의 일부 부분은 서열-특이적일 수 있다 (용어 "서열-특이적 결합", "서열-특이적으로 결합하다", "부위-특이적 결합", 및 "부위 특이적으로 결합하다"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다). 결합 상호작용은 해리 상수 (Kd)를 특징으로 할 수 있다. "결합 친화성"은 결합 상호작용의 강도를 의미한다. 증가된 결합 친화성은 낮은 Kd와 상관있다.
본 명세서에서 사용되는 "유전자"는 엑손 및 관련 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 유전자는 인트론 및/또는 비번역 영역 (UTR)을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "발현"은 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA) 또는 다른 RNA 전사물 (예를 들어, 비-코딩, 예컨대 구조적 또는 스캐폴드 RNA)을 생성시키게 되는, DNA 주형으로부터 폴리뉴클레오티드의 전사를 의미한다. 이 용어는 또한 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 전사물 및 코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 생산물"이라고 할 수 있다. 발현은 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우에, 진핵생물 세포에서 mRNA를 스플라이싱하는 것을 포함할 수 있다.
"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "코딩하는" 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치될 때 시험관내 또는 생체내에서 전사 (DNA 경우)되어 폴리펩티드로 번역 (mRNA 경우)되는 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' 말단에 출발 코돈 및 3' 말단에 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 예를 들어, 특징 또는 성질의 "상이한" 또는 "변경된" 수준은 측정가능하게 상이하고, 바람직하게, 통계적으로 유의한 (예를 들어, 어세이의 표준 오차에 기인하지 않음) 편차이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 대조 또는 기준 샘플과 비교하여 편차는 예를 들어, 10% 초과 편차, 20% 초과 편차, 30% 초과 편차, 40% 초과 편차, 50% 초과 편차, 60% 초과 편차, 70% 초과 편차, 80% 초과 편차, 90% 초과 편차, 2-배 초과 편차; 5-배 초과 편차; 10-배 초과 편차; 20-배 초과 편차; 50-배 초과 편차; 75-배 초과 편차; 100-배 초과 편차; 250-배 초과 편차; 500-배 초과 편차; 750-배 초과 편차; 또는 1,000-배 초과 편차일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "내지"는 소정 범위의 말단 값을 포함한다 (예를 들어, 약 1 내지 약 50 뉴클레오티드 길이는 1개 뉴클레오티드 및 50개 뉴클레오티드를 포함함).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "아미노산"은 아미노산 유사체, 변형 아미노산, 펩티드모방체, 글리신, 및 D 또는 L 광학 이성질체를 포함하여, 천연 및 합성 (비천연) 아미노산을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적이고, 아미노산의 중합체를 의미한다. 폴리펩티드는 임의 길이일 수 있다. 이것은 분지형 또는 선형일 수 있고, 비-아미노산이 개재될 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 예를 들어, 아세틸화, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, PEG화, 바이오틴화, 가교, 및/또는 접합 (예를 들어, 표지화 성분 또는 리간드와의) 을 통해서 변형된 아미노산 중합체를 의미한다. 폴리펩티드 서열은 달리 표시하지 않으면, 통상적인 N-말단에서 C-말단 배향으로 본 명세서에서 표시된다. 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분자 생물학 분야에서 통상의 기술을 사용해 만들어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "모이어티"는 분자의 부분을 의미한다. 모이어티는 작용기일 수 있거나 또는 (예를 들어, 공통 구조적 측면을 공유하는) 다수의 작용기를 갖는 분자의 부분으로 설명할 수 있다. 용어 "모이어티" 및 "작용기"는 전형적으로 상호교환적으로 사용되지만, "작용기"는 보다 더 특별하게 일부 일반적인 화학적 거동을 포함하는 분자의 부분을 의미할 수 있다. "모이어티"는 구조적 설명으로서 종종 사용된다.
조성물 또는 작용제, 예컨대 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 치료 조성물의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 용어는 원하는 반응을 제공하는 조성물 또는 작용제의 충분한 양을 의미한다. 이러한 반응은 문제의 특정 질환에 의존적일 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "형질전환"은 삽입에 사용되는 방법과 무관하게, 숙주 세포로 외생성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 의미한다. 예를 들어, 형질전환은 직접 흡수, 형질감염, 감염 등에 의한 것일 수 있다. 외생성 폴리뉴클레오티드는 비-통합 벡터로서, 예를 들어, 에피솜으로서 유지될 수 있거나, 또는 대안적으로 숙주 게놈에 통합될 수 있다.
전구체 세포의 수득
본 개시는 부분적으로 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가를 분석하기 위한 방법 및 어세이에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 조건화 배지, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물은 배양되는 하나 이상의 세포, 예컨대 배양되는 전구체 세포로부터 수득될 수 있다. 그러나, 다른 유형의 세포, 예를 들어, 말기 분화 세포, 만능 줄기 세포 등을 포함한 것이 사용될 수도 있다.
조건화 배지, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물을 생산하는데 적합한 전구체 세포는 예를 들어, 대상체 또는 조직으로부터 단리될 수 있거나; 또는 만능 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 활성, 기능성, 및/또는 역가는 iPSC 세포로부터 분화된 전구체 세포로부터 생산된, 조건화 배지, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물에 대해 평가될 수 있다.
iPSC 세포의 생성
iPSC 세포는 예를 들어, 인간 체세포를 포함한, 체세포로부터 수득될 수 있다. 체세포는 비-인간 영장류, 예컨대 붉은털 원숭이, 침팬지, 및 다른 원숭이 및 유인원 종을 포함한, 인간 및 다른 영장류를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소, 및 말; 가축 포유동물, 예컨대 개 및 고양이; 토끼, 마우스, 래트 및 기니 피그를 포함한, 실험실 동물; 가축, 야생, 및 사냥감 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 및 다른 순계류 조류, 오리 및 거위를 포함한, 조류 등으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 체세포는 각질화 상피 세포, 점막 상피 세포, 외분비샘 상피 세포, 내분비 세포, 간 세포, 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 혈액 및 면역계의 세포, 신경 세포 및 교질 세포를 포함한, 신경계의 세포, 색소 세포, 및 조혈 줄기 세포를 포함한, 전구체 세포로부터 선택된다. 체세포는 완전 분화 (특화)될 수 있거나, 또는 덜 완전히 분화될 수 있다. 일부 예에서, 체세포 줄기 세포를 포함한, PSC가 아닌 미분화 전구체 세포, 및 최종적으로 분화된 성숙한 세포가 사용될 수 있다. 체세포는 성체 및 태아 세포를 포함하여, 임의 연령의 동물로부터 유래될 수 있다.
체세포는 포유동물 기원일 수 있다. 예를 들어, 이의 전구체 세포로부터의 분비체 (또는 세포외 소포)가 생체내 투여에 사용되는 경우에, 동종이계 또는 자기유래 줄기 세포가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, iPSC 는 대상체와 MHC-/HLA-일치하지 않는다. 일부 구현예에서, iPSC 는 대상체와 MHC-/HLA-일치한다. 구현예에서, 예를 들어, (대상체에서 치료적 용도를 위해, 분비체, 또는 세포외 소포를 수득하기 위해) iPSC 를 PSC-유래된 전구체 세포를 생성시키는데 사용하려는 경우, 체세포는 치료하려는 대상체, 또는 대상체의 것과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 HLA 유형을 갖는 다른 대상체로부터 수득될 수 있다. 체세포는 핵 재프로그래밍 이전에 배양될 수 있거나, 또는 예를 들어, 단리 이후에 배양없이 재프로그래밍될 수 있다.
체세포에 재프로그래밍 인자를 도입시키기 위해서, 예를 들어, 바이러스 벡터, 예를 들어, 바이러스 예컨대 SV40, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, HSV 및 EBV를 포함한 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 알파바이러스, 인간 헤르페스바이러스 벡터 (HHV) 예컨대 HHV-6 및 HHV-7, 및 레트로바이러스 유래의 벡터를 포함한 것이 사용될 수 있다. 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 1형 (HIV-1), 인간 면역결핍 바이러스 2형 (HIV-2), 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 말 전염성 빈혈 바이러스 (EIAV), 소 면역결핍 바이러스 (BIV), 양의 비스나 바이러스 (VISNA) 및 염소 관절염-뇌염 바이러스 (CAEV)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고 생체내 및 시험관내 유전자 전달 및 핵산 서열의 발현에 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 바이러스 단백질, 예컨대 외피 단백질을 결합제, 예컨대 항체, 또는 특정 리간드에 연결시켜서 특정 세포 유형을 표적화할 수 있다 (일부 예에서, 특정 세포 유형 상에 또는 그 안의 단백질 또는 수용체를 표적화하기 위함).
일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터는 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 이렇게 전달된 유전 물질은 이후 숙주 세포 내에서 전사되고 가능하게 단백질로 번역된다. 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않는 것이 사용된다.
바이러스 유전자 전달 시스템은 RNA-기반 또는 DNA-기반 바이러스 벡터일 수 있다. 에피솜 유전자 전달 시스템은 예를 들어, 플라스미드, 엡스테인-바 바이러스 (EBV)-기반 에피솜 벡터, 효모-기반 벡터, 아데노바이러스-기반 벡터, 원숭이 바이러스 40 (SV40)-기반 에피솜 벡터, 소 파필로마 바이러스 (BPV)-기반 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
체세포는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 생산하도록 재프로그래밍될 수 있다. 당업자는 유도 만능 줄기 세포를 쉽게 생산할 수 있는데, 예를 들어, 하기 문헌들을 참조하며, 이들 모두는 참조로 본 명세서에 편입된다: 공개된 미국 특허 출원 번호 제2009/0246875호, 공개된 미국 특허 출원 번호 제2010/0210014호; 공개된 미국 특허 출원 번호 제2012/0276636호; 미국 특허 제8,058,065호; 제8,129,187호; 및 미국 특허 제8,268,620호.
일반적으로, 단독으로, 조합하여, 또는 트랜스활성화 도메인과 융합으로서, 유도 만능 줄기 세포를 생성시키는데 사용될 수 있는 재프로그래밍 인자는 하기 유전자 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: Oct4 (Oct3/4, Pou5f1), Sox (예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3, Sox18, 또는 Sox15), Klf (예를 들어, Klf4, Klf1, Klf3, Klf2 또는 Klf5), Myc (예를 들어, c-myc, N-myc 또는 L-myc), nanog, 또는 LIN28. 이들 유전자 및 단백질에 대한 서열의 예로서, 하기 등록 번호가 제공된다: Mouse MyoD: M84918, NM_010866; Mouse Oct4 (POU5F1): NM_013633; Mouse Sox2: NM_011443; Mouse Klf4: NM_010637; Mouse c-Myc: NM_001177352, NM_001177353, NM_001177354 Mouse Nanog: NM_028016; Mouse Lin28: NM_145833: Human MyoD: NM_002478; Human Oct4 (POU5F1): NM_002701, NM_203289, NM_001173531; Human Sox2: NM_003106; Human Klf4: NM_004235; Human c-Myc: NM_002467; Human Nanog: NM_024865; 및/또는 Human Lin28: NM_024674. 또한, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 것들을 포함하여, 이와 유사한 서열도 고려한다. 일부 구현예에서, Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28 중 적어도 3개, 또는 적어도 4개가 이용된다. 다른 구현예에서, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4가 이용된다.
iPSC의 생산을 위한 예시적인 재프로그래밍 인자는 (1) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc (Sox2는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18로 대체될 수 있고; Klf4는 Klf1, Klf2 또는 Klf5로 대체가능함); (2) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, SV40 대형 T 항원 (SV40LT); (3) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, 인간 파필로마 바이러스 (HPV)16 E6; (4) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E7 (5) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (6) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, Bmi1; (7) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28; (8) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, SV40LT; (9) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, TERT, SV40LT; (10) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, SV40LT; (11) Oct3/4, Esrrb, Sox2, L-Myc (Esrrb는 Esrrg로 대체가능함); (12) Oct3/4, Klf4, Sox2; (13) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT; (14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6; (15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7; (16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmi1; (18) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28; (19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT; (20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT; (21) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT; 또는 (22) Oct3/4, Esrrb, Sox2 (Esrrb는 Esrrg로 대체가능함)를 포함한다.
iPSC는 전형적으로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 특징적인 형태를 나타내고, 만능성 인자, NANOG를 발현한다. 배아 줄기 세포 특이적 표면 항원 (SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81)이 또한 완전하게 재프로그래밍된 인간 세포를 확인하는데 사용될 수 있다. 추가로, 기능적 수준에서, PSC, 예컨대 ESC 및 iPSC 는 또한 모든 3개 배아 배엽으로부터의 계층으로 분화되고, 생체내 (예를 들어, SCID 마우스)에서 기형종을 형성하는 능력을 입증한다.
전구체 세포를 생성시키기 위한 PSC 분화
본 개시는 또한 ESC 및 iPSC를 포함한, PSC의 전구체 세포로의 분화를 고려한다. 이러한 전구체 세포는 본 개시의 분비체 (및 세포외 소포)를 생산하는데 사용될 수 있다.
본 개시의 전구체 세포는 예를 들어, 조혈 전구체 세포, 골수 전구체 세포, 신경 전구체 세포; 췌장 전구체 세포, 심장 전구체 세포, 심근세포 전구체 세포, 심혈관 전구체 세포, 신장 전구체 세포, 골격근모세포, 위성 세포, 뇌실하대에 형성된 중간 전구체 세포, 방사형 교질 세포, 골수 기질 세포, 골막 세포, 내피 전구체 세포, 아세포, 경계 캡 세포, 및 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 만능 줄기 세포를 전구체 세포로 분화시키고, 전구체 세포를 배양 및 유지하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예컨대, 그 전문이 본 명세서에 참조로 편입되는, 발명의 명칭 "Methods for the Production of Committed Cardiac Progenitor Cells"의 미국 가출원 번호 제63/243,606호에 기술된 것이 있다.
다음으로 수득된 전구체 세포를 배양할 수 있고, 이어서 그 결과로 생긴 배양 배지를 회수 (일부 예에서, 추가 처리)하여서, 조건화 배지, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물을 제공할 수 있다. 본 개시는 또한 조작된 세포외 소포를 고려한다. 예를 들어, 조건화 배지, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물은 조작된 세포로부터 회수될 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 세포외 소포는 그 자체로 그들 회수 이전, 그 동안, 및/또는 이후에 조작될 수 잇다.
예를 들어, 회수된 배양 배지는 농축, 정제, 냉장, 냉동, 저온보존, 동결건조, 멸균 등이 될 수 있다. 일부 구현예에서, 회수된 조건화 배지는 일정 크기 초과의 미립자를 제거하기 위해 사전-정화될 수 있다. 예를 들어, 회수된, 조건화 배지는 하나 이상의 원심분리 및/또는 여과 기술을 통해서 사전-정화될 수 있다.
일부 구현예에서, 회수된, 조건화 배지는 회수된, 조건화 배지의 특정 추출물 또는 분획을 수득하기 위해서 추가로 처리된다. 예를 들어, 회수된, 조건화 배지는 그로부터 소형 세포외 소포-농후화 분획 (sEV)을 분리하기 위해서 추가로 처리될 수 있다. sEV 분획은 예를 들어, 하나 이상의 기술 예컨대 원심분리, 초원심분리, 여과, 한외여과, 중력, 초음파 처리, 밀도-구배 초원심분리, 접선 유동 여과, 크기-배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 친화성 포획, 중합체-기반 침전, 또는 유기 용매 침전에 의해, 회수된, 조건화 배지 (또는 이전에 처리된 이의 추출물 또는 분획)로부터 분리될 수 있다.
임의의 상기 기술된 처리 기술은 예를 들어, 신선하거나, 또는 이전에 냉동 및/또는 냉장된 것인 회수된, 조건화 배지 (또는 이전에 처리된 이의 추출물 또는 분획)에 대해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 방법 및 어세이로 분석하려는 sEV 분획은 CD63+, CD81+, 및/또는 CD9+ 이다. sEV 분획은 하나 이상의 세포외 소포 유형, 예컨대, 예를 들어, 엑소솜, 미세입자, 및 세포외 소포 중 하나 이상을 함유할 수 있다. sEV 분획은 또한 분비된 단백질 (외피형 및/또는 비외피형)을 함유할 수 있다. 본 개시의 조건화 배지 또는 sEV 분획 내 세포외 소포는 예를 들어, 테트라스파닌 (예를 들어, CD9, CD63 및 CD81), 세라미드, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 인테그린, 부착 분자, 포스파티딜세린, 스핑고미엘린, 콜레스테롤, 세포골격 단백질 (예를 들어, 액틴, 겔솔린, 미오신, 튜불린), 효소 (예를 들어, 카탈라제, GAPDH, 산화질소 신타제, LT 신타제), 핵산 (예를 들어, RNA, miRNA), 열충격 단백질 (예를 들어, HSP70 및 HSP90), 엑소솜 생합성 단백질 (ALIX, Tsg101), LT, 프로스타글란딘, 및 S100 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 분획 중 원하는 세포외 소포 유형의 존재는 예를 들어, 전자현미경에 의해서; 나노입자 추적 분석 (분획 중 입자의 크기를 결정하기 위함)에 의해서; 및/또는 원하는 세포외 소포 유형(들)과 회합된 하나 이상의 마커의 존재를 확인함에 의해서, 결정될 수 있다. 예를 들어, 회수된, 조건화 배지의 분획은 분획 중 하나 이상의 마커, 예컨대, 예를 들어, CD9, CD63 및/또는 CD81의 존재를 검출하여서 원하는 세포외 소포 유형(들)의 존재에 대해 분석될 수 있다.
일부 구현예에서, sEV 제제 또는 조성물은 CD9, CD63 및 CD81 (정규 EV 마커)에 대해 양성이고, 심장-관련 마커 CD49e, ROR1, SSEA-4, MSCP, CD146, CD41b, CD24, CD44, CD236, CD133/1, CD29 및 CD142에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, sEV 제제 또는 조성물은 sEV 제제 또는 조성물 중 CD9, CD63 및/또는 CD81의 양과 비교하여, 더 적은 양으로, CD3, CD4, CD8, HLA-DRDPDQ, CD56, CD105, CD2, CD1c, CD25, CD40, CD11c, CD86, CD31, CD20, CD19, CD209, HLA-ABC, CD62P, CD42a 및 CD69로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 함유한다. 일부 구현예에서, sEV 제제 또는 조성물은 CD19, CD209, HLA-ABC, CD62P, CD42a 및 CD69로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 검출불가한 양 (예를 들어, MACSPlex 어세이, 면역어세이 등에 의함)으로 함유하거나, 또는 그에 대해 음성이다.
일부 구현예에서, sEV 제제 또는 조성물은 하기 중 적어도 하나이다: 약 50-200 nm 또는 50-200 nm의 직경을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된 sEV 제제 또는 조성물; 약 50-150 nm 또는 50-150 nm의 직경을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된 sEV 제제 또는 조성물; 전체 세포가 실질적으로 없거나 또는 없는 sEV 제제 또는 조성물; 및 하나 이상의 배양 배지 성분 (예를 들어, 페놀-레드)이 실질적으로 없는 sEV 제제 또는 조성물.
분비체 및 세포외 소포 활성, 기능성, 및/또는 역가를 결정하기 위한 어세이
본 개시는 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 특징, 및/또는 역가를 분석하기 위한 방법을 포괄한다. 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 특징, 및/또는 역가는 예를 들어, 조건화 배지 또는 조성물을 생산하는데 사용되는 세포(들)의 유형; 및 조건화 배지 또는 조성물의 원하는 용도에 의존하여, 다양한 기술을 통해 평가될 수 있다.
예를 들어, 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 특징, 및/또는 역가는 조건화 배지, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서, 표적 세포에 투여하여 평가될 수 있다. 이후 표적 세포의 하나 이상의 성질, 예컨대, 예를 들어, 세포 생존능, 비대, 세포 건강, 세포 부착, 세포 생리학, ATP 함량, 세포수, 세포 성장, 및 세포 형태가 분석될 수 있다 (조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 특징, 및/또는 역가를 결정하기 위함).
본 개시의 방법 및 어세이에서, 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 특징, 및/또는 역가는 조건화 배지, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을, 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양되는 표적 세포에 투여하는 단계, 및 세포의 적어도 하나의 성질을 분석하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 평가될 수 있다. 분석할 수 있는 표적 세포의 하나 이상의 성질은 예를 들어, 세포 이동, 세포 생존, 세포 생존능, 비대, 세포 건강, 세포 부착, 세포 생리학, ATP 함량, 세포수, 세포 성장, 및 세포 형태로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포의 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10가지 성질이 측정된다.
이의 제1 방법에서, 표적 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 전처리 배지에서 배양되고 나서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을, 세포 배양물에 투여한다. 다음으로 표적 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양되고, 배양된 세포의 적어도 하나의 성질이 배양 동안 1회 이상 측정된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 성질은 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양 동안 다수 회 측정된다 (예컨대, 예를 들어, 서로 5분 내지 10시간 간격; 서로 10분 내지 4시간 간격; 또는 서로 30분 내지 2시간 간격). 일부 구현예에서, 적어도 하나의 성질은 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양 동안 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 50, 적어도 100, 또는 적어도 500회 측정된다.
이러한 제1 방법의 일부 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하 배양은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 존재 하에서 발생된다. 이러한 제1 방법의 다른 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하 배양은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 부재 하에서 발생된다.
이러한 제1 방법의 일부 구현예에서, 전처리 배지는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양 이전에 세포로부터 제거된다. 따라서, 적어도 하나의 스트레스-유도 조건이 전처리 배지 (예를 들어, 전처리 배지에 존재하는 스트레스-유도제)에 의해 제공되는 제1 방법의 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하 배양은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 부재 하에서 발생된다.
이러한 제1 방법의 다른 구현예에서, 전처리 배지는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양 이전에 세포로부터 제거되지 않는다. 따라서, 적어도 하나의 스트레스-유도 조건이 전처리 배지 (예를 들어, 전처리 배지에 존재하는 스트레스-유도제)에 의해 제공되는 제1 방법의 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하 배양은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 존재 하에서 발생된다.
제2 방법에서, 표적 세포는 전처리 배지에서 배양되고, 이어서 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 투여 (및 임의로 이후로, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 표적 세포를 배양)한다. 이후에, 표적 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양되고, 배양된 세포의 적어도 하나의 성질은 (일부 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 발생될 수 있는) 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양 동안 1회 이상 측정된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 성질은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양 동안, 다수회, 예컨대, 예를 들어, 서로 5분 내지 10시간 간격; 서로 10분 내지 4시간 간격; 또는 서로 30분 내지 2시간 간격으로 측정된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 성질은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양 동안 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 50, 적어도 100, 또는 적어도 500회 측정된다.
이러한 제2 방법의 일부 구현예에서, 표적 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양되기 전에, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양된다. 이러한 제2 방법의 다른 구현예에서, 표적 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양되기 전에, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양되지 않는다. 이러한 제2 방법의 일부 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 존재 하에서 표적 세포를 배양하기 전에 표적 세포로부터 제거된다.
상기 제1 및 제2 방법의 일부 구현예에서, 스트레스-유도 조건은 세포 스트레스제의 존재 하 배양이다. 제2 방법의 일부 구현예에서, 세포 스트레스제는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물과 표적 세포에 공동-투여된다.
상기 제1 및 제2 방법의 일부 구현예에서, 세포 스트레스제는 하나 이상의 화학요법제, 및/또는 하나 이상의 아폽토시스-유도제이다.
화학요법제는 예를 들어, 항대사제, 알킬화제, 토포이소머라제 억제제, 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 키나제 억제제 (단백질 키나제 억제제 포함), 안트라사이클린, 백금, 식물 알칼로이드, 니트로소우레아, 세포골격 파괴제, 에포틸론, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 뉴클레오티드 유사체 및 전구체 유사체, 펩티드 항생제, 및 레티노이드로부터 선택될 수 있다.
하나 이상의 아폽토시스-유도제는 예를 들어, 독소루비신, 스타우로스포린, 에토포시드, 캄프토테신, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 감보그산, 다우노루비신, 티르포스틴, 탑시가르긴, 오카다산, 미페프리스톤, 콜키신, 이오노마이신, 24(S)-히드록시콜레스테롤, 사이토칼라신 D, 브레펠딘 A, 랍티날, 카르보플라틴, C2 세라미드, 악티노마이신 D, 로시글리타존, 캠페롤, 베르베린 클로라이드, 비오이미피, 베툴린산, 타목시펜, 엠벨린, 파이토스핀고신, 미토마이신 C, 비리나판트, 아니소마이신, 제니스테인, 사이클로헥시미드 등, 및 이의 유도체 및 조합으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 아폽토시스-유도제는 인돌로카르바졸이다. 일부 구현예에서, 아폽토시스-유도제는 인돌로(2,3-a)피롤(3,4-c)카르바졸이다. 일부 구현예에서, 아폽토시스-유도제는 스타우로스포린, 또는 이의 유도체이다. 다른 구현예에서, 아폽토시스-유도제는 독소루비신, 또는 이의 유도체이다.
제1 및 제2 방법의 일부 구현예에서, 측정되는 적어도 하나의 성질은 배양된 세포의 생존능이다. 생존능은 예를 들어, DNA-표지 염료 또는 핵-염색 염료를 사용하여 측정될 수 있다. 이의 일부 구현예에서, DNA-표지 염료 또는 핵-염색 염료는 형광 염료, 예컨대 원적외선 형광 염료이다.
제1 및 제2 방법의 일부 구현예에서, 측정되는 적어도 하나의 성질은 세포 부착, 세포수, 세포 성장, 및/또는 세포 형태이고, 세포 부착, 세포수, 세포 성장, 및/또는 세포 형태는 배양물에서 배양 용기 표면에 걸쳐서 전기 임피던스를 측정하여 결정된다.
제1 및 제2 방법의 구현예에서, 표적 세포는 상이한 시간 길이 동안 전처리 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 전처리 배지에서, 30분 내지 10시간, 1시간 내지 5시간, 또는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 또는 5시간 동안, 그의 초과, 또는 그 미만 동안 배양될 수 있다.
제1 및 제2 방법의 구현예에서, 표적 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물과 함께, 적어도 30분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 12시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 또는 적어도 48시간 동안 배양된다.
제1 및 제2 방법의 일부 구현예에서, 표적 세포는 전처리 배지에서 배양 이전에 시험관내에서 배양된다. 예를 들어, 표적 세포는 전처리 배지에서 배양 이전에, 1일 내지 21일, 3일 내지 17일, 5일 내지 14일, 또는 20일 미만, 18일 미만, 16일 미만, 14일 미만, 12일 미만, 10일 미만, 8일 미만, 6일 미만, 4일 미만, 또는 2일 미만 동안 시험관내에서 배양될 수 있다. 표적 세포가 전처리 배지에서 배양 이전에 시험관내에서 배양되는 일정 구현예에서, 표적 세포는 전처리 배지에서 배양 이전에 신선한 배양 배지가 공급된다. 예를 들어, 표적 세포는 전처리 배지에서 배양 이전에, 6-72시간, 8-60시간, 10-48시간, 또는 12-36시간에 신선한 배양 배지가 공급될 수 있다.
제1 및 제2 방법의 구현예에서, 표적 세포의 배양은 2차원 또는 3차원 세포 배양일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 배양에 사용되는 배양 용기는 예를 들어, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 하이퍼플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티-웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CellSTACK® 챔버, 배양 백, 롤러 병, 생물반응기, 교반식 배양 용기, 스피너 플라스크, 또는 수직 휠 생물반응기일 수 있다.
배양이 예컨대 배양 용기의 표면 상에서 2차원 세포 배양을 포함하는 구현예에서, (세포를 부착시키고자 의도되는) 배양 표면은 세포 부착을 촉진하는 하나 이상의 물질로 코팅될 수 있다. 고형 지지체에 대한 부착을 강화시키는데 유용한 이러한 물질은 예를 들어, I형, II형, 및 IV형 콜라겐, 콘카나발린 A, 콘드로이틴 술페이트, 피브로넥틴, 피브로넥틴-유사 중합체, 젤라틴, 라미닌, 폴리-D 및 폴리-L-리신, 마트리겔, 트롬보스폰딘, 및/또는 비트로넥틴을 포함한다.
제1 및 제2 방법의 구현예에서, 적어도 하나의 성질은 또한 하나 이상의 대조군 샘플을 참조하여 분석될 수 있다.
예를 들어, 제1 및 제2 방법은 양성 대조군 세포를 (예를 들어, 동시에) 배양하는 단계를 더 포함할 수 있고, 양성 대조군 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물이 투여되지 않고, 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양되지 않는다. 따라서, 스트레스 유도 조건이 아폽토시스-유도제의 존재인 구현예에서, 양성 대조군 세포는 아폽토시스-유도제가 투여되지 않는다.
제1 및 제2 방법은 음성 대조군 세포를 (예를 들어, 동시에) 배양하는 단계를 포함할 수 있고, 음성 대조군 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물이 투여되지 않는다. 일부 구현예에서, 음성 대조군 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물이 투여되지 않는 것을 제외하고, 표적 세포와 동일한 단계가 수행된 음성 대조군 세포를 포함한다.
일정 구현예에서, 음성 대조군 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 전처리 배지에서 배양된 음성 대조군 세포를 포함한다. 표적 세포에서 측정되는 적어도 하나의 성질은 또한 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 전처리 배지에서 배양되는 동안 및/또는 이후에, 음성 대조군 세포에서도 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 음성 대조군 세포는 모의 조건화 배지 또는 모의 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물이 첨가되는 음성 대조군 세포를 포함한다. 이의 특정 구현예에서, 모의 조건화 배지 또는 모의 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 제조하는 과정에서 세포를 제외시켜서 생산된다.
이러한 음성 대조군(들)의 사용은 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가를 평가하도록 허용한다.
예를 들어, 측정되는 적어도 하나의 성질이 배양된 세포의 생존능인 경우에, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 표적 세포의 생존능이 적어도 하나의 스트레스-유도 조건을 또한 겪은 음성 대조군 세포의 생존능보다 더 높을 때, 활성, 기능성, 역가를 갖는다 (및/또는 치료적 효과를 나타낸다)고 결정될 수 있다.
대안적으로, 예를 들어, 측정된 적어도 하나의 성질이 세포 부착, 세포 성장, 및/또는 세포수이고, 세포 부착, 세포 성장, 및/또는 세포수는 배양물에서 배양 용기 표면에 걸쳐서 전기 임피던스를 측정하여 결정되는 경우에, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 배양물에서 배양 용기 표면에 걸친 전기 임피던스가 적어도 하나의 스트레스-유도 조건을 역시 겪은 음성 대조군 세포의 배양물에서 배양 용기 표면에 걸친 전기 임피던스보다 더 높을 때, 활성, 기능성, 역가를 갖는다 (및/또는 치료적 효과를 나타낸다)고 결정될 수 있다.
임의의 하나 이상의 샘플, 및/또는 임의의 하나 이상의 양성 및/또는 음성 대조군은 반복물로, 예컨대, 예를 들어, 이중, 삼중 등으로 수행될 수 있다. 세포 생존능이 측정되는 이의 일부 구현예에서, 반복 배양이 수행되는 경우에, 반복 배양에서 양성 대조군 세포의 수는 최대 세포수를 생성하도록 평균낼 수 있다 (그리고 각각의 반복 시험 배양의 표적 세포수는 세포 생존능을 계산하기 위해 평균 최대 세포수에 대해 정규화될 수 있음).
일부 구현예에서, 당분야에 공지된 어세이는 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가를 추가로 결정, 검증, 및/또는 확인하기 위해서, 본 개시의 방법 및 어세이와 함께 사용될 수 있다.
예를 들어, 심근세포 전구체 세포로부터 수득되는, 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 경우에, 이의 활성, 기능성, 및/또는 역가는 예컨대 [El Harane et al. (Eur . Heart J., 2018, 39(20): 1835-1847)]에 기술된 바와 같은, 공지된 심근세포 생존능 어세이를 사용해 추가로 측정될 수 있다.
특히, 혈청-고갈된 심장 근모세포 (예를 들어, H9c2 세포)는 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물과 접촉될 수 있고, 이후 세포의 생존능이 측정될 수 있다. 이러한 어세이의 일부 구현예에서, 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 투여하기 이전에 혈청이 고갈된다. 이러한 어세이의 다른 구현예에서, 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 투여한 이후에 혈청이 고갈된다. 이러한 어세이의 일부 구현예에서, 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 투여하기 이전 및 이후에 혈청이 고갈된다.
본 개시의 방법 및 어세이와 함께 사용될 수 있는 당분야에 공지된 다른 어세이는 HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이이다. HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이에서, HUVEC 세포는 배양 표면 상에서 배양되고, 이후 배양된 세포층(들)을 스크래치내고; 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 혈관생성 활성은 혈청-무함유 조건 하에서 상처의 봉합을 일으키는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 능력에 의해 결정될 수 있다.
상이한 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물 간에, 활성, 기능성, 특징, 및/또는 역가를 보다 더 정확하게 비교하기 위해서, 표적 세포에 첨가된 (또는 첨가하려는) 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 양을 결정하는 것이 유리할 수 있다. 이것은 예를 들어, 분비체를 생산한 분비 세포의 양; 분비체의 단백질 함량; 분비체의 RNA 함량; 분비체의 엑소솜 양; 및 분비체의 입자수 중 하나 이상을 기반으로 결정될 수 있다.
치료 조성물 및 적용
조건화 배지, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물은 배지 또는 조성물이 원하는 활성, 기능성, 및/또는 역가를 함유하는지 여부를 확인하기 위해 본 개시의 방법 및 어세이를 통해 분석될 수 있다. 배지 또는 조성물이 본 개시의 방법 및/또는 어세이를 사용하여 원하는 활성, 기능성, 및/또는 역가를 나타내는 경우에, 이러한 배지 또는 조성물은 치료적 용도를 위해 제제화될 수 있거나 또는 개조될 수 있다.
예를 들어, 시험된 배지 또는 조성물은 조건화 배지의 더 큰 배치, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물의 더 큰 배치로부터의 샘플일 수 있다. 이러한 경우에, 배치로부터의 나머지 배지 또는 조성물의 전부 또는 일부가 치료적 용도를 위해 제제화될 수 있거나 또는 개조될 수 있다.
대안적으로, 시험된 배지 또는 조성물은 조건화 배지의 다른 배치, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물의 다른 배치를 대표할 수 있다 (예를 들어, 그들이 유사하거나, 또는 동일한 조건 하에서 동시에 생산되었기 때문임). 이러한 예에서, 시험된 배지 또는 조성물에 대한 분석 결과는 조건화 배지의 다른 배치, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물의 다른 배치가 치료적 용도를 위해 제제화 또는 개조되는데 적합하다는 지시자로서 역할할 수 있다.
본 개시의 방법 및 어세이는 또한 조건화 배지의 생산, 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)-함유 조성물의 생산을 위한 특정 과정(들)이 원하는 활성, 기능성, 또는 역가를 갖는 배지 또는 조성물을 산출하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시의 방법 및 어세이의 분석 결과를 기반으로, 분비체-, 세포외 소포-, 및 sEV-함유 조성물은 치료제로서 사용을 위해 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게 이의 유효량을 투여하기 위해), 확인, 선택, 및/또는 제제화될 수 있다.
확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 제한없이, 심장 조직, 뇌 또는 다른 신경 조직, 골격근 조직, 폐 조직, 동맥 조직, 모세관 조직, 신장 조직, 간 조직, 위장관 조직, 상피 조직, 결합 조직, 요로 조직 등을 포함한, 다양한 조직을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료하려는 조직은 예를 들어, 상처, 나이-관련 퇴화, 급성 또는 만성 질환, 암, 또는 감염으로 인해서 손상될 수 있거나 또는 완전히 또는 부분적으로 비-기능성일 수 있다. 이러한 조직은 예를 들어, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 정맥내 투여를 통해서 치료될 수 있다. 대안적으로, 확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 예측되거나 또는 예상되는 조직 손상 이전에 환자를 사전 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 예를 들어, 심장 손상을 예방하도록 보조하기 위해, 화학요법 이전에 투여될 수 있다.
확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 예를 들어, 심근 경색, 뇌졸중, 심부전, 및 중증 하지 허혈 등과 같은 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 심부전을 치료하는데 사용될 수 있다: 급성, 만성, 허혈성, 비-허혈성이거나, 심실 확장이 동반되거나 또는 심실 확장을 동반하지 않음. 일부 구현예에서, 본 개시의 조성물은 허혈성 심장 질환, 심근병증, 심근염, 비대성 심근병증, 확장기 비대성 심근병증, 확장성 심근병증, 및 화학요법-후 유도된 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 심부전을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 조성물은 예컨대 울혈성 심부전, 심장 질환, 허혈성 심장 질환, 판막 심장 질환, 결합 조직 질환, 바이러스 또는 박테리아 감염, 심근병증, 근병증, 심근염, 비대성 심근병증, 확장기 비대성 심근병증, 디스트로핀병증, 간 질환, 신장 질환, 겸상 세포 질환, 당뇨병, 및 신경학적 질환과 같은 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 적합한 전구체 세포 유형(들)이 치료하려는 질환, 또는 표적으로 하려는 조직에 의존하여 선택될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 예컨대 급성 심근 경색 또는 심부전 같은 심장 질환을 갖는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 예를 들어, 심근세포 전구체 세포, 심장 전구체 세포, 중간엽 줄기 세포, 및/또는 심혈관 전구체 세포로부터 생산될 수 있다.
확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 또한 조직의 기능 또는 성능을 개선시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈관생성의 개선, 또는 심장 성능의 개선은 심근세포 전구체 세포, 심장 전구체 세포, 및/또는 심혈관 전구체 세포로부터 생산된 확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하여 실시될 수 있다.
투여는 표적 조직과 동일한 조직 또는 장기 부위에 투여를 포함할 수 있다. 투여는 추가로 또는 대안적으로, 표적 조직과 상이한 조직 또는 장기 부위에 투여를 포함할 수 있다. 이러한 투여는 예를 들어, 정맥내 투여를 포함할 수 있다.
확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 부형제와 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 일부 구현예에서, 염, 완충제, 보존제, 또는 다른 치료제 중 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 농도를 함유할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당류, 예컨대 락토스, 포도당 및 수크로스; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 완충제, 예컨대 마그네슘 히드록시드 및 알루미늄 히드록시드; 무발열원 물; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜; 포스페이트 완충 용액; 및 약학 제제에 적용되는 다른 무독성 상용성 물질을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 생물질, 예컨대 주사용 생물질과 함께 제제화될 수 있다. 예시적인 주사용 생물질은 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 편입되는, WO 2018/046870에 기술된다.
확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 목적에 따라서, 유효량, 예컨대 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 유효량은 투여에 선택된 물질, 투여가 단일 또는 다수 용량인지 여부, 및 연령, 신체 상태, 체격, 체중, 및 질환 병기를 포함한 개별 환자 매개변수를 포함한, 다양한 인자에 의존할 것이다. 이들 인자는 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
임의의 적절한 투여 경로가 적용될 수 있고, 예를 들어, 투여는 비경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 종양내, 근육내, 두개내, 안와내, 안구, 심실내, 간내, 피막내, 척수강내, 수조내, 복강내, 비강내, 심근내, 관상동맥내, 에어로졸, 좌제, 심외막 패치, 경구 투여, 관류에 의할 수 있다. 예를 들어, 비경구 투여를 위한 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있고; 경구 투여의 경우, 제제는 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있고; 비내 제제의 경우, 분말, 점비액, 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 심장 질환, 예컨대 급성 심근 경색 또는 심부전을 갖는 대상체는 심근세포 전구체 세포, 심장 전구체 세포, 및/또는 심혈관 전구체 세포로부터 생산된, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물로 치료될 수 있고, 조성물은 정맥내로 투여된다.
확인, 선택, 및/또는 제제화된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 단일 용량으로서 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 1일, 1주, 또는 1개월 당 하나 이상의 용량에 걸쳐서, 다수 용량이 대상체에게 투여될 수 있다. 2회, 3회, 4회, 5회 이상의 투여를 포함한, 단일 또는 반복 투여가 수행될 수 있다. 조성물은 또한 연속적으로 투여될 수 있다. 반복 또는 연속 투여는 치료되는 병태의 속성 및/또는 중증도에 의존하여, 수 시간 (예를 들어, 1-2시간, 1-3시간, 1-6시간, 1-12시간, 1-18시간, 또는 1-24시간), 수 일 (예를 들어, 1-2일, 1-3일, 1-4일, 1-5일, 1-6일, 또는 1-7일) 또는 수 주 (예를 들어, 1-2주, 1-3주, 또는 1-4주)의 기간에 걸쳐 일어날 수 있다. 투여가 연속적이 아니라 반복적이면, 투여 사이의 시간은 시간 (예를 들어, 4시간, 6시간, 또는 12시간), 일 (예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 6일), 또는 주 (예를 들어, 1주, 2주, 3주, 또는 4주)일 수 있다. 투여 간 시간은 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 예로서, 증상이 악화되거나, 또는 개선되지 않으면, 조성물은 더 빈번하게 투여될 수 있다. 반대로, 증상이 안정화되거나 또는 감소되면, 조성물은 덜 빈번하게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV -함유 조성물은 정맥내 투여를 통해서, 3회 용량으로, 2주 또는 약 2주 간격으로 투여된다. 이의 일부 구현예에서, 조성물은 담체, 희석제, 또는 적합한 물질 (예를 들어, 염수)로 희석되고/되거나, 그와 함께 제제화, 및/또는 투여될 수 있다.
실험
본 발명의 비제한적인 구현예는 하기 실시예에서 예시된다. 사용된 수치 (예를 들어, 양, 농도, 변화율 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만, 일부 실험 오차 및 편차를 고려해야 한다. 이들 실시예는 단지 예시로 제공되고, 본 발명자가 본 발명의 다양한 구현예로서 간주하는 것의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 각각의 실시예에 기재된 모든 하기 단계가 필요한 것은 아니고, 각 실시예에서 단계의 순서가 표시된 대로일 필요는 없다.
실시예 1
H9c2 생존능 어세이의 재현성
H9c2 생존능 어세이의 재현성을 시험하기 위해서, 어세이는 본질적으로 El Harane 등 (Eur. Heart J., 2018; 39:1835-1847)이 기술한 대로 수행되었다. 이러한 어세이에서, H9c2 심근세포는 배양 배지에 혈청이 풍부 (예를 들어, H9c2 완전 배지에서 배양)할 때, 증식되지만, 혈청이 고갈 (예를 들어, H9c2 불완전 배지에서 배양)될 때 증식을 멈추고 생존능을 잃는다. 그러므로 H9c2 심근세포 생존능을 촉진하는, sEV를 포함하는 세포외 소포 (EV) 조제물의 능력은 EV를 H9c2 불완전 배지에 보충하여 결정할 수 있다.
간략하게, H9c2 세포를 해동하였고, 4250 생존 세포를 96-웰 플레이트의 웰에 웰 당 파종하였다. 완전 성장 배지에서 24시간 인큐베이션 이후에, 세포를 다시 공급하였다. 추가 24시간 인큐베이션 후에, 배양 배지를 제거하였고, 혈청-함유 배지 (H9c2 완전 배지; 양성 대조군), 또는 혈청-무함유 배지 (H9c2 불완전 배지; 시험 샘플 및 음성 대조군)를 적절한 웰에 (세포 생존능의 정량을 허용하도록 핵-염색 염료와 함께) 첨가하였다. sEV 조제물 (또는 모의 sEV 조제물)을 이어서 적절한 웰에 첨가하여서, H9c2 생존능에 대한 sEV의 효과를 결정하였다. 다음으로, H9c2 세포를 배양하였고, 배양 동안 수회의 시점에, Incucyte (Essen BioSciences)를 사용하여 이미지를 찍었다.
이러한 어세이를 사용하여, 동일한 sEV 조제물 및 배양 조건을 사용하는 경우에도, 혈청-고갈을 겪은 상이한 뱅크의 H9c2 세포가 상이한 세포 생존능 결과를 생성시켰다고 결정되었다. 일부 sEV 조제물은 일정 (고-계대) 뱅크의 H9c2 세포의 세포 생존능에 대해 긍정적인 효과를 갖는 것으로 확인되었지만, 상이한 (저-계대) 뱅크의 H9c2 세포에 대해서는 그렇지 않은 것으로 확인되었다. 이러한 현상은 생존 세포의 수동 세포-계측 (세포를 수확 후 혈구계를 사용해 수동으로 계측함), 및 ViCell XR 세포 생존능 분석기 (Beckman Coulter)를 사용하여 확인되었다. 상이한 뱅크의 H9c2 세포의 분석은 상이한 뱅크의 H9c2 세포가 계대 수에 의존하여, 상이한 형태를 나타냈다는 것을 밝혀주었다. 결과는 이러한 어세이가 분비체 또는 sEV 역가를 평가하는 표준화된 방식이 되기에는 이러한 H9c2 세포 생존능 어세이에서 너무 많은 H9c2 로트별, 및 계대별 가변성이 존재한다는 것을 시사한다. 더 나아가서, 이들 래트 세포는 인간 치료제 개발에 의도되는 인간 sEV 생산물의 개발 및 시험에 대해서 제한된 적용가능성을 가질 수 있다.
실시예 2
스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이
실시예 1의 H9c2 세포 생존능 어세이의 결과를 고려하여, 대안적인 세포 생존능 어세이를 개발하였다.
특히, 인간 iCell Cardiomyocytes2 (Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: CMC-100-012-001)를 iCell 심근세포 도말 배지 (Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: M1001)에서 피브로넥틴-코팅된 (5 ㎍/mL) 96-웰 플레이트에 50,000 세포/웰로 도말하였고, 37℃ (대기 산소, 5% CO2)에서 4시간 동안 배양하였다. 이러한 4-시간 인큐베이션 이후에, 배지를 (웰 당) 100 ㎕의 iCell 심근세포 유지 배지 (iCMM, Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: M1003)로 교환하였고, 세포를 2-3일마다 배지를 완전히 교환하면서, 최대 12일까지 배양하였다.
최소 4일 이후에, 세포를 NucSpot Live 650 염료 (Biotium, ref: 40082; 0.125% 최종 농도) 존재의 iCMM (이것은 생존 세포 (양성) 대조군으로서 제공됨); 또는 NucSpot Live 650 염료 (0.125% 최종 농도), 및 2 μM의 최종 웰 내 농도의 스타우로스포린 (Abcam, ref: ab146588) 존재의 iCMM (이것은 또한 아폽토시스 세포 (음성) 대조군으로서 제공됨)에 노출시켰다. 염료, PBS 및 DMSO (0.325%) 농도, 최종 웰 부피 (120 ㎕)는 모든 웰에서 동등하였다. 다음으로 세포는 37℃ (대기 산소, 5% CO2)에서 4시간 동안 배양되었다.
이러한 4-시간 인큐베이션 이후에, 플레이트는 Incucyte (Essen BioSciences)를 사용하여 이미지화하였고, 사전-인큐베이션 배지를 제거하였고, 웰을 100 ㎕ iCMM으로 세정하였다. 스타우로스포린 존재 및 부재의 세포에 대한 대표적인 이미지는 도 1에 도시된다. 다음으로 세포는 NucSpot Live 650 염료 (0.125% 최종 농도), DMSO (0.325% 최종 농도), 및 15 ㎕ DPBS (120 ㎕의 최종 부피)를 함유하는 iCMM의 혼합물의 (웰 당) 120 ㎕; 또는 NucSpot Live 650 염료 (0.125% 최종 농도), DMSO (0.325% 최종 농도), 및 DPBS로 15 ㎕로 조정된 sEV 또는 모의 sEV의 증가 농도를 함유하는 iCMM의 혼합물의 (웰 당) 120 ㎕가 공급되었다. 이후 배양은 37℃ (대기 산소, 5% CO2)에서 유지되었다. 웰은 24시간 동안 매시간 마다 Incucyte에서 이미지화되었고, 핵 계측수를 결정하였다. 시간 과정 결과는 0시간 (T0)에 대해 정규화된 NucSpot Live 650 양성%를 비교하여 수득되었다. 도 2 는 이러한 시간 과정을 도시하는데, 모의 sEV 조제물이 아닌, sEV 조제물이 심근세포 생존을 개선시키는 것을 보여주며, 이는 sEV 조제물의 기능성을 나타낸다.
웰 당 세포의 절대수가 어세이 간에 가변적일 수 있으므로, 데이터는 하기와 같이, 비슷한 값을 수득하도록 처리되었다. 첫째로, 정규화는 각 조건에 대해서, 0시간에 평균 세포수에 대해 명시된 시점에 평균 세포수를 비교하여 수행되었다. 다음으로, 정규화된 음성 대조군 값을 각 조건으로부터 차감하였고, 최종 값은 양성 및 음성 대조군 간 차이와 비교하였다. 도 3 은 스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이 시간 과정의 24시간 시점에서 결과를 보여주는 히스토그램을 도시한다.
sEV의 투여의 경우, 단백질 농도, RNA 농도, 및 sEV 입자 수는 배지, 배양 조건, 세포 유형, sEV 단리/농후화 기술, 및 공여자에 의존하여 상당히 가변적일 수 있다고 결정되었다. 따라서, 정확한 투여 및 상이한 sEV 샘플 간에 정확한 비교를 보장하기 위해서, 용량은 얼마나 많은 분비 세포가 분비체를 생성했는가를 기반으로 계산되었다. 이것은 활성 성분이 알려지지 않을 수 있고; 비-활성, 공-단리 성분이 상당히 다양할 수 있는 경우에 신뢰할만한 측정인 것으로 확인되었다 (실시예 4 참조).
추가로, 세포 생존능의 확인 척도로서, 상기 시간 과정 (Incucyte 및 생체적합성 염료)이 먼저 수행된 96-웰 플레이트의 세포 배양물은 이후에 ATP 함량에 대해 분석되었다 (즉, Incucyte 및 생체적합성 염료를 사용하는 시간 과정의 종료 시).
특히, 각 웰의 세포를 용해시켰고, 그 안의 ATP 함량은 제조사 지시에 따라서, CellTiter-Glo® Luminescent 세포 생존능 어세이 (Promega)를 사용하여 정량되었다. 생성 신호는 CLARIOStar® (BMG Labtech) 및 Tecan for Life Science® 플레이트 판독기를 사용해 분석되었다. 결과는 도 4에 도시된다. 도 4 는 13시간 시점에 Incucyte를 사용해 수득된 세포 생존능 데이터를 비롯하여, CellTiter-Glo® Luminescent 세포 생존능 어세이 (Promega)와 CLARIOStar® (BMG Labtech) 및 Tecan for Life Science® 플레이트 판독기 (24시간 시점, 즉 Incucyte 시간 과정 종료 이후)를 사용하여 수득된 ATP 정량 데이터를 도시한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 3개 데이터세트에 대한 결과는 서로 놀랍도록 유사하여서, 다양한 검출 방법 및 판독과 스타우로스포린 어세이의 사용을 확인하였다.
도 5 는 본질적으로 상기 기술된 바와 같이 세포 생존능 데이터 (Incucyte 사용, 데이터는 12시간 시점부터 표시)가 수득될 뿐만 아니라, CellTiter-Glo® Luminescent 세포 생존능 어세이 (Promega)와 CLARIOStar® (BMG Labtech) 및 Tecan for Life Science® 플레이트 판독기 (데이터는 23시간 시점부터 표시됨, 즉, Incucyte 시간 과정 종료 이후)를 사용하여 ATP 정량 데이터가 수득된 추가의 실험 세트의 결과를 도시한다. 도 5 는 양성 대조군 (스타우로스포린 없음 ("스트레스-없음")), sEV가 존재하지 않는 음성 대조군 ("스타우로스포린"), 및 중간엽 줄기 세포로부터 생산된 sEV (1×용량으로 사용 ("MSC-sEV, 1×"))에 대한 이들 실험의 결과를 도시한다. 확인할 수 있듯이, 결과는 도 4에 도시된 결과와 일관적이다. 추가 실험 세트에서, 인간 iCell Cardiomyocytes2 는 본질적으로 상기 기술된 바와 같이, 도말, 배양하였고, 스타우로스포린으로 전처리되었다 (혈청 함유 iCMM 배지에서). 그러나, 스타우로스포린 전처리 이후에, 세포는 iCMM 또는 iCell 심근세포 혈청-무함유 배지 (iCSFM, Fujifilm Cellular Dynamics, Ref: M1038)로 세척되었다. 다음으로, 세포는 세포를 세척한 것과 동일한 유형의 배지 (즉, iCMM 또는 iCSFM) 중에 PBS (비히클), sEV, 또는 MV 로 처리되었고, 37℃ (대기 산소, 5% CO2)에서 인큐베이션되었다. 23시간 시점 (즉, 스타우로스포린 전처리 개시 후 23시간)에, 각 웰의 세포를 용해시켰고, 그 안의 ATP 함량은 제조사 지시에 따라서, CellTiter-Glo® Luminescent 세포 생존능 어세이 (Promega)를 사용해 정량하였다. 생성 신호는 Tecan for Life Science® 플레이트 판독기를 사용해 분석하였다. 결과는 도 6에 도시되어 있고, EV 처리 단계가, 적어도, 비슷한 결과를 제공하면서, 혈청의 부재 하에서 수행될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 3
스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이와 HUVEC 스크래치 어세이의 비교
실시예 2에 기술된 스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이의 타당성을 확인하기 위해서, HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이 (Incucyte의 경우, Essen BioSciences가 개발)를 동일한 sEV 및 모의 sEV 조제물에 대해 수행하였다. 간략하게, HUVEC 세포는 HUVEC 완전 배지: 내피 세포 성장 배지 보충제 팩 (PromoCell, Ref: C-39210)이 보충된 내피 세포 기초 배지 (PromoCell, Ref: C-22210)를 사용하여 확장시켰다. 확장 후에, 세포는 CS10 (Cryostore, ref: 210102) 중에 분취액 당 1-2 Х 106 세포 (96-웰 플레이트의 절반 내지 전체에 충분)로 저온보존하였다. 어세이 전 2일에, HUVEC 분취액을 해동시켰고, ImageLock 96-웰 플레이트 (EssenBio, Ref: 4379)에 10,000 세포/웰로 도말하고, HUVEC 완전 배지에서 2일 동안 성장시켰다. 이어서, 유지 및 어세이 과정 전반에서 배양은 37℃ (대기 산소, 5% CO2)에서 유지시켰다. 웰은 제조사 지시에 따라서 Wound Maker (EssenBio, Ref: 4493)를 사용해 스크래치내었고, 세포를 내피 세포 기초 배지로 세정하고 밤새 배양하였다 (양성 대조군으로서, HUVEC 완전 배지 단독; 음성 대조군으로서, 내피 세포 기초 배지 단독; 또는 sEV 또는 모의 sEV 조제물이 보충된 내피 세포 기초 배지). 스크래치 상처 치유 모듈과 Incucyte를 사용하여, 플레이트를 총 18시간 동안 3시간 마다 이미지화하였다. 제조사 소프트웨어를 사용하여 상처 봉합을 결정하였고, 값은 기준점 (음성 대조군)을 차감하고, 양성 대조군에 대해 정규화되었다. 도 7 은 스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이 및 HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이의 결과 간 비교를 제공하고, 스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이가 HUVEC 스크래치 어세이와 비슷한 일관된 결과를 제공하지만, 여기서 심장 질환과 잠재적으로 더 관련된 세포 유형, 즉 심근세포에 있다는 것을 보여준다.
실시예 4
세포수와 비교하여 입자수에 따른 sEV 투여
실시예 2에서 논의된 바와 같이, 상이한 sEV 샘플 간 정확한 비교를 보장하기 위한 투여 전략이 필요하였다. 초기에, sEV 용량은 sEV 샘플 당 입자 수를 기반으로 계산되었는데, "1x" 투여 부피는 NanoSight에서 확인되는 10억개 입자 목표와 동등하다. 모의 sEV 투여 전략은 투여 부피를 sEV 샘플 "1x" 투여 부피와 일치시키는 것이었다. 1개 초과의 sEV 샘플이 존재하는 경우에, 모의 sEV 는 "1x" sEV 샘플 부피가 가장 큰 것에 일치시켰다.
sEV 샘플 기능성 간 가변성은 상이한 MSC 공여자 로트로부터의 10억개 입자를 HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이에서 서로 비교했을 때 확인되었다. 이들 MSC 공여자를 배양, 수확하였고, 유사한 조건 하에서 제조된 sEV 샘플을 가졌다. 이들 로트 간 기능성 차이를 조사하기 위해서, 대체 투여 전략을 고려하였다. 이러한 새로운 전략에서, 용량은 얼마나 많은 분비 세포가 sEV 분비체를 생성시켰는가를 기반으로 계산하였다. HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이에서 평가했을 때, 1.85x105 세포의 분비체 분비와 동등한 "1x" 부피에서 각 MSC 로트로부터의 sEV 샘플 투여는, 입자수에 의한 투여와 비교하여 보다 더 유사한 기능성을 야기하였다 (도 8 참조).
실시예 5
모의 sEV를 sEV 조제물과 일치시킬 때 고려 사항
실시예 4에서 언급한 바와 같이, sEV 샘플 투여는 본래 입자 계수를 기반으로 하였고, 모의 sEV 투여는 sEV 샘플과 "1x" 용량 부피 대 부피 일치 전략에 의존하였다. 그러나, 얼마나 많은 분비 세포가 sEV 분비체를 생성시켰는가를 기반으로 하는 용량의 새로운 sEV 샘플 투여 전략이 채택되었을 때, 새로운 모의 sEV 투여 전략도 필요하였다. 이러한 전략을 위해서, 모의 sEV의 부피는 다음과 같이 sEV 샘플에 일치된다:
일치된 sEV 샘플의 경우에, 단리/농후화 절차에 투입되는 조건화 배지에 대한 최종 sEV 조제물 부피의 비율을 계산한다 ("㎕ sEV/mL MC"). 유사하게, 모의 sEV 샘플의 경우, 최종 조제물의 부피는 단리/농후화 방법이 수행되는 처녀 배지의 부피로 나눈다 ("㎕ MV/mL MV"). sEV 샘플이 스타우로스포린 어세이 또는 다른 시험관내 또는 생체내 어세이에서 사용되는 경우에, 용량의 "MC 배지 당량"이 계산된다 ("MC 배지 당량" = 어세이에서 sEV 용량의 부피 / "㎕ sEV/mL MC"). 어세이에서 대조군으로서 필요한 MV의 부피는 MC 배지 당량을 일치시키기 위해 계산될 수 있고, 따라서 배지 자체로부터의 오염 성분에서 발생될 수 있는 임의 효과를 제어할 수 있다 (대조군으로서 사용을 위한 MV 부피 = "㎕ MV/mL MV" * "MC 배지 당량").
실시예 6
스타우로스포린 심근세포 부착/성장/수 어세이 (전기 임피던스)
실시예 2에 기술된 스타우로스포린 심근세포 생존능 어세이 실험에서, 세포 생존능이 결정되었다 (Incucyte 및 생체적합성 염료를 사용한 생 세포 이미지화; 및 ATP 함량 측정에 의함). 실시예 2에 기술된 스타우로스포린 어세이가 sEV 조제물의 기능성을 결정하기 위해 대체 검출 방법 또는 판독과 함께 사용될 수 있다는 것을 입증하기 위해서, 실시예 2에 기술된 스타우로스포린 어세이를 sEV 조제물의 기능성의 척도로서 세포 성장/부착/수를 사용해 수행하였다.
특히, 인간 iCell Cardiomyocytes2 (Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: CMC-100-012-001)를 먼저 iCell 심근세포 유지 배지 (iCMM, Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: M1003) 에서 37℃ (대기 산소, 5% CO2)에서, 전극 (CytoView Z-Plate, Axion Biosystems®)이 장착된 배양 플레이트의 피브로넥틴-코팅된 웰에 파종하였고 부착시켜 단층을 형성하도록 하였다("0 시간").
126시간 후, 이 시점에 파종된 세포는 부착되어서 합류성 단층을 형성하였고 (0시간에 0로부터 증가 후, 임피던스 값의 안정기에 의해 결정됨), 세포를 세척한 다음에 iCMM의 사전-인큐베이션 배지 (이것은 생존 세포 (양성) 대조군으로서 역할함); 또는 2 μM의 최종 웰내 농도의 스타우로스포린 (Abcam, ref: ab146588)을 함유하는 iCMM (이것은 또한 아폽토시스 세포 (음성) 대조군으로서 역할함)에 노출시켰다. 다음으로 세포를 37℃ (대기 산소, 5% CO2)에서 4시간 동안 배양하였다. 임피던스는 Axion BioSystems® Maestro Z 장치를 사용하여 인큐베이션 동안 계속 측정되었다.
이러한 4-시간 인큐베이션 이후에, 사전-인큐베이션 배지를 제거하였고 (스타우로스포린이 후속 인큐베이션 동안 존재한 대조군 샘플 제외, 도 9의 조건 8 참조), 웰을 iCMM로 세정하였다. 다음으로 세포의 상이한 웰에 iCMM (도 9의 조건 2 및 8 참조), 또는 다양한 농도의 sEV가 공급된 iCMM (도 9의 조건 3-5 참조); 모의 sEV 조제물 (처녀 배지 대조군, 도 9의 조건 1 및 7 참조); 또는 PBS (도 9의 조건 6 참조)를 공급하였다. 배양은 이어서 37℃ (대기 산소, 5% CO2)에서 72시간 동안 유지시켰고, 임피던스를 다시 연속하여 측정하였다. 도 9 는 이러한 시간 과정을 도시하는데, sEV 조제물 (도 9의 조건 3-5 참조)이 음성 (스타우로스포린-처리) 대조군 (도 9의 조건 6 및 8 참조)과 비교하여, 스타우로스포린 처리 이후 심근세포 부착을 개선시켰지만, 모의 sEV 조제물 (도 9의 조건 7 참조)은 그렇지 않다는 것을 보여준다. 양성 대조군은 도 9에서 조건 1 및 2로 표시된다. 실시예 2에 기술된 심근세포 생존능 어세이 실험의 결과와 유사하게, 이들 결과는 sEV 조제물의 기능성을 나타낸다. 도 10 은 처리 ("Tx") 시점에 대해 정규화된 실험의 결과를 보여준다.

Claims (60)

  1. 분비체의 활성을 분석하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 표적 세포의 배양물을 전처리 배지와 접촉시키고, 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계;
    (b) 분비체를 세포 배양물에 투여하고, 분비체의 존재 하에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 배양 동안 배양된 세포의 적어도 하나의 성질을 1회 이상 측정하는 단계
    를 포함하는 것인 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b) 이전에 배양된 세포로부터 전처리 배지를 제거하는 것을 더 포함하는 것인 분석 방법.
  3. 제2항에 있어서, 표적 세포는 세포 배양물에 분비체의 투여 이전에 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양되고, 단계 (b)에서 표적 세포의 배양은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 부재 하에서 수행되는 것인 분석 방법.
  4. 분비체의 활성을 분석하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 표적 세포의 배양물을 전처리 배지와 접촉시키고, 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계;
    (b) 분비체를 세포 배양물에 투여하고, 임의로 분비체의 존재 하에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계;
    (c) 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 표적 세포를 배양하는 단계; 및
    (d) 단계 (c)의 배양 동안 배양된 세포의 적어도 하나의 성질을 1회 이상 측정하는 단계
    를 포함하는 것인 분석 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 표적 세포는 단계 (c)의 배양 이전에 분비체의 존재 하에서 배양되는 것인 분석 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c) 이전에 배양된 세포로부터 분비체를 제거하는 것을 더 포함하는 것인 분석 방법.
  7. 제4항에 있어서, 스트레스-유도 조건은 세포 스트레스제의 존재 하 배양이고, 세포 스트레스제는 분비체와 공동-투여되고, 상기 표적 세포는 분비체 및 세포 스트레스제의 존재 하에서 배양되는 것인 분석 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 스트레스-유도 배양 조건은 세포 스트레스제의 존재 하 배양인 분석 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 세포 스트레스제는 화학요법제 및/또는 아폽토시스-유도제인 분석 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 아폽토시스-유도제는 인돌로카르바졸인 분석 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 아폽토시스-유도제는 인돌로(2,3-a)피롤(3,4-c)카르바졸 또는 이의 유도체인 분석 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 아폽토시스-유도제는 스타우로스포린, 또는 이의 유도체인 분석 방법.
  13. 제9항에 있어서, 상기 아폽토시스-유도제는 독소루비신, 또는 이의 유도체인 분석 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 측정되는 적어도 하나의 성질은 세포 생존능, 비대, 세포 건강, 세포 부착, 세포 생리학, ATP 함량, 세포수, 및 세포 형태로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 분석 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a)의 배양 동안 배양된 세포의 적어도 하나의 성질을 1회 이상 측정하는 것을 더 포함하는 것인 분석 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 성질은 단계 (b)의 배양 동안 다수 회 측정되는 것인 분석 방법.
  17. 제4항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 성질은 단계 (c)의 배양 동안 다수 회 측정되는 것인 분석 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 다수 측정은 서로 5분 내지 10시간 간격으로 수행되는 것인 분석 방법.
  19. 제18항에 있어서, 다수 측정은 서로 10분 내지 4시간 간격으로 수행되는 것인 분석 방법.
  20. 제19항에 있어서, 다수 측정은 서로 30분 내지 2시간 간격으로 수행되는 것인 분석 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 성질은 세포 생존능, 세포 부착, 세포수, 세포 형태, 세포 성장, 및/또는 ATP 함량으로부터 선택되는 것인 분석 방법.
  22. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 성질은 배양된 세포의 생존능이고, 생존능은 형광 DNA-표지 염료 또는 형광 핵-염색 염료를 사용하여 측정되는 것인 분석 방법.
  23. 제21항에 있어서, 적어도 하나의 성질은 배양된 세포의 부착, 세포수, 성장, 및/또는 세포 형태이고, 배양된 세포의 부착, 세포수, 성장, 및/또는 형태는 배양물에서 배양 용기 표면에 걸쳐서 전기 임피던스를 측정하여 결정되는 것인 분석 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (a)에서 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포의 배양은 30분 내지 10시간 동안인 분석 방법.
  25. 제24항에 있어서, 단계 (a)에서 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포의 배양은 1시간 내지 5시간 동안인 분석 방법.
  26. 제25항에 있어서, 단계 (a)에서 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포의 배양은 약 4시간 동안인 분석 방법.
  27. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 표적 세포의 배양은 적어도 2시간 동안인 분석 방법.
  28. 제4항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 표적 세포의 배양은 적어도 2시간 동안인 분석 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 배양은 적어도 5시간 동안인 분석 방법.
  30. 제29항에 있어서, 배양은 적어도 12시간 동안인 분석 방법.
  31. 제30항에 있어서, 배양은 적어도 24시간 동안인 분석 방법.
  32. 제22항에 있어서, 배양된 세포의 생존능은 DNA-표지 염료 또는 핵-염색 염료를 이미지화하여 측정되는 것인 분석 방법.
  33. 제1항 내지 제20항, 및 제24항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 성질은 배양된 세포의 생존능이고, 생존능은 생 세포 이미지화에 의해 측정되는 것인 분석 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적 세포는 특화 세포인 분석 방법.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적 세포는 심근세포, 심혈관 전구체, 심장 전구체, 및/또는 혈관 세포를 포함하는 것인 분석 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 특화 세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 수득되는 것인 분석 방법.
  37. 제1항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적 세포는 이전에 냉동된 것인 분석 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 분비체는 전능 전구체 세포, 다능 전구체 세포, 및 말기 분화 세포로부터 선택되는 하나 이상의 세포의 배양물로부터 단리되는 것인 분석 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 하나 이상의 전구체 세포는 심근세포 전구체 세포, 심장 전구체 세포, 심혈관 전구체 세포, 및 중간엽 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 전구체 세포를 포함하는 것인 분석 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 분비체는 세포 배양물로부터 단리된 소형 세포외 소포-농후화된 분획 (sEV)을 포함하는 것인 분석 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 sEV 는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 것인 분석 방법: (a) CD63+, CD81+ 및/또는 CD9+ 임; (b) 50-200 nm 직경의 세포외 소포를 포함함; (c) CD49e, ROR1 (Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1), SSEA-4 (Stage-specific embryonic antigen 4), MSCP (Mesenchymal stem cell-like protein), CD146, CD41b, CD24, CD44, CD236, CD133/1, CD29 및 CD142 중 하나 이상에 대해 양성임; 및/또는 (d) CD19, CD4, CD209, HLA-ABC (human leukocyte antigen-ABC), CD62P, CD42a 및 CD69 중 하나 이상에 대해 음성이고, 50-150 nm 직경의 세포외 소포를 포함하고/하거나, CD49e, ROR1, SSEA-4, MSCP, CD146, CD41b, CD24, CD44, CD236, CD133/1, CD29 및 CD142 중 하나 이상에 대해 양성임.
  42. 제40항에 있어서, 상기 sEV 는 엑소솜, 미세입자, 세포외 소포 및 분비된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것인 분석 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (a) 이전 1-21일 동안 표적 세포를 배양하는 것을 더 포함하는 것인 분석 방법.
  44. 제43항에 있어서, 표적 세포는 단계 (a) 이전 5-14일 동안 배양된 것인 분석 방법.
  45. 제43항에 있어서, 표적 세포는 단계 (a) 이전 12-36시간에 신선한 배양 배지가 공급되는 것인 분석 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 세포는 2차원 세포 배양으로 배양되는 것인 분석 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 2차원 세포 배양은 배양 용기 표면 상에서 표적 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인 분석 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 배양 용기 표면은 세포 부착을 촉진하는 물질로 코팅되는 것인 분석 방법.
  49. 제48항에 있어서, 세포 부착을 촉진하는 상기 물질은 피브로넥틴인 분석 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 동시에 양성 대조군 세포를 배양하는 것을 더 포함하고, 상기 양성 대조군 세포는 분비체가 투여되지 않고, 스트레스-유도 조건을 겪지 않는 것인 분석 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 음성 대조군 세포를 배양하는 것을 더 포함하고, 상기 음성 대조군 세포는 분비체가 투여되지 않는 것인 분석 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 음성 대조군 세포는 분비체가 투여되지 않는 것을 제외하고, 표적 세포와 동일한 단계가 수행된 음성 대조군 세포를 포함하는 것인 분석 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 음성 대조군 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 전처리 배지에서 배양된 음성 대조군 세포를 포함하고, 상기 방법은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 전처리 배지에서 배양 동안 또는 이후에 음성 대조군 세포의 적어도 하나의 성질을 측정하는 것을 포함하는 것인 분석 방법.
  54. 제51항에 있어서, 상기 음성 대조군 세포는 모의 분비체 조성물이 첨가되는 음성 대조군 세포를 포함하고, 상기 모의 분비체 조성물은 분비체를 생산하는 과정에서 세포를 제외시켜서 생산되는 것인 분석 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 표적 세포에 첨가된 분비체의 양은 분비체를 생산한 분비 세포의 양; 상기 분비체의 단백질 함량; 상기 분비체의 RNA 함량; 상기 분비체의 엑소솜 양; 및 상기 분비체의 입자수 중 하나 이상을 기반으로 결정되는 것인 분석 방법.
  56. 제50항에 있어서, 상기 표적 세포 및 상기 양성 대조군 세포는 반복물 (replicate) 로 배양되는 것인 분석 방법.
  57. 제56항에 있어서, 반복 배양 (replicate culture) 에서 양성 대조군 세포의 수는 평균 내어져 평균 최대 세포수를 생성하고, 각 반복 배양에서의 표적 세포의 수는 평균 최대 세포수에 대해 정규화되는 것인 분석 방법.
  58. 제51항 내지 제54항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 성질은 배양된 세포의 생존능이고, 상기 분비체는 표적 세포의 생존능이 음성 대조군 세포의 생존능보다 더 높을 때 역가를 갖고/갖거나 치료적 효과를 나타내는 것으로 결정되는 것인 분석 방법.
  59. 제40항에 있어서, 상기 sEV 는 하기 중 적어도 하나인 분석 방법: 약 50-200 nm 또는 50-200 nm의 직경을 갖고, 바람직하게 약 50-150 nm 또는 50-150 nm의 직경을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된 sEV; 전체 세포가 실질적으로 없거나 또는 없는 sEV; 및/또는 하나 이상의 배양 배지 성분이 실질적으로 없는 sEV.
  60. 소형 분자 치료제의 활성을 분석하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 표적 세포의 배양물을 전처리 배지와 접촉시키고, 소형 분자 또는 화학요법제의 존재 하에 상기 전처리 배지에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계;
    (b) 분비체를 세포 배양물에 투여하고, 분비체의 존재 하에서 상기 표적 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 배양 동안 배양된 세포의 적어도 하나의 성질을 1회 이상 측정하는 단계
    를 포함하는 것인 분석 방법.
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