JP6996972B2 - 幹細胞培養用容器 - Google Patents
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Description
本発明は、適度な親水性と強度を備え、幹細胞の播種後の定着性が高い幹細胞培養用足場材料を樹脂膜として備える、幹細胞培養用容器を提供することを目的とする。
(1)幹細胞培養用容器であって、
幹細胞培養用容器は、幹細胞の培養領域の少なくとも一部に樹脂膜を備え、
樹脂膜は、合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料である幹細胞培養用容器。
(2)幹細胞培養用容器であって、
幹細胞培養用容器は、幹細胞の培養領域の少なくとも一部に樹脂膜を備え、
樹脂膜は、合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料であり、
樹脂膜の表面粗さRaが1μm以下である幹細胞培養用容器。
(3)樹脂膜の表面電位が-50~50mVである(1)または(2)記載の幹細胞培養用容器。
(4)樹脂膜の貯蔵弾性率が1.0×105~1.0×1010Paである(1)~(3)のいずれか1項に記載の幹細胞培養用容器。
(5)樹脂膜のヤング率が100~3000MPaである(1)~(4)のいずれか1項に記載の幹細胞培養用容器。
(6)合成樹脂がポリビニルアセタール樹脂である(1)~(5)のいずれか1項に記載の幹細胞培養用容器。
(7)幹細胞が多能性幹細胞である(1)~(6)のいずれか1項記載の幹細胞培養用容器。
発明は、幹細胞の培養領域の少なくとも一部に樹脂膜を備える幹細胞培養用容器に関する。樹脂膜は、合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料であることが好ましい。
樹脂膜は、少なくとも以下のいずれか1つの条件
ヤング率が100~3000MPaである、
貯蔵弾性率が1.0×105~1.0×1010Paである、
厚みが1nm~500,000nmである、
表面粗さRaが1000nm以下である、
表面電位が-50~50mVである、を満たすことが好ましい。
樹脂膜の貯蔵弾性率下限は、1.0×105Paが好ましく、1.0×106Paがより好ましく、1.0×107がさらに好ましい。上限は、1.0×1010Paが好ましく、1.0×109がより好ましく、1.0×108Paがさらに好ましい。
樹脂膜の厚みの下限は、1nmが好ましく、10nmがよりに好ましく、100nmがさらに好ましい。上限は、1000,000nmが好ましく、10,000nmがより好ましく、1,000nmがさらに好ましい。
表面粗さRaは、1,000nm以下が好ましく、100nm以下がより好ましく、10nm以下がさらに好ましい。
表面電位の下限は、50mVが好ましく、30mVがよりに好ましく、10mVがさらに好ましい。上限は、-50mVが好ましく、-10mVがより好ましく、0mVがさらに好ましい。
本発明者らは鋭意検討した結果、所定のアセタール化度を備えるポリビニルアルコールから誘導される合成樹脂を用いることで、上述の課題を解決できることを知見し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料であって、合成樹脂がポリビニルアセタール樹脂を含み、ポリビニルアセタール樹脂のアセタール化度が60モル%よりも高い幹細胞培養用足場材料に関する。なお、本発明の幹細胞培養用足場材料には、合成樹脂のみからなる態様が含まれることは無論である。
この幹細胞培養用足場材料は、適度な親水性と強度を備えるため、幹細胞の播種後の定着性が向上する。特にフィーダー細胞や接着タンパク質を含まない無血清培地培養において、幹細胞播種後の初期定着率が向上する。
ポリビニルアセタール樹脂は、例えば、ポリビニルアルコール(PVA)とアルデヒド(R-CHO)を脱水縮合させる方法(アセタール化反応)により製造することができる。なお、アセタール化反応において、適宜、酸触媒を用いることができる。
上記範囲であると、ポリビニルアセタール樹脂が培養培地の水分によって膨潤し難く、細胞の定着が良好な結果となる。
ここで、樹脂全体基準のアセタール基のモル比(mol%)が、「アセタール化度」に相当する。
なお、本発明において、「(メタ)アクリル酸類」とは、(メタ)アクリル酸エステル及び(メタ)アクリル酸からなる群より選択される少なくとも1種をいう。
上記(メタ)アクリル酸環状アルキルエステルとしては、例えば、シクロヘキシル(メタ)アクリレート、イソボルニル(メタ)アクリレートなどが挙げられる。
上記(メタ)アクリル酸アリールエステルとしては、例えば、フェニル(メタ)アクリレート、ベンジル(メタ)アクリレートなどが挙げられる。
上記アクリルアミド類としては、例えば、(メタ)アクリルアミド、N-イソプロピル(メタ)アクリルアミド、N-tert-ブチル(メタ)アクリルアミド、N,N’-ジメチル(メタ)アクリルアミド、(3-(メタ)アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、4-(メタ)アクリロイルモルホリン、3-(メタ)アクリロイル-2-オキサゾリジノン、 N-[3-(ジメチルアミノ)プロピル](メタ)アクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)(メタ)アクリルアミド、N-メチロール(メタ)アクリルアミド、6-(メタ)アクリルアミドヘキサン酸などが挙げられる。
上記(メタ)アクリル酸ポリエチレングリコール類としては、例えば、メトキシ-ポリエチレングリコール(メタ)アクリレート、エトキシ-ポリエチレングリコール(メタ)アクリレート、ヒドロキシ-ポリエチレングリコール(メタ)アクリレート、メトキシ-ジエチレングリコール(メタ)アクリレート、エトキシ-ジエチレングリコール(メタ)アクリレート、ヒドロキシ-ジエチレングリコール(メタ)アクリレート、メトキシ-トリエチレングルコール(メタ)アクリレート、エトキシ-トリエチレングルコール(メタ)アクリレート、ヒドロキシ-トリエチレングルコール(メタ)アクリレートなどが挙げられる。
上記(メタ)アクリル酸ホスホリルコリンとしては、例えば、2-(メタ)アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが挙げられる。
上記(メタ)アクリル酸類は単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。なお、本明細書において、上記(メタ)アクリル酸とは、アクリル酸及びメタクリル酸を総称するものであり、上記(メタ)アクリレートとは、アクリレート及びメタクリレートを総称するものとする。
上記アミン類としては、例えば、アミノ基、イミノ基、アミド基、イミド基が挙げられる。
上記ポリビニルアセタール樹脂を上記アレニウス塩基性基により変性する方法としては特に限定されないが、上記アリルアミンやマレイミド、(メタ)アクリルアミド類との共重合によって得られる。
上記カルボン酸としては、特に限定されないが、カルボキシル基が挙げられる。
上記含フッ素アルコールとしては、特に限定されないが、
上記スルホン酸としては、特に限定されないが、スルホ基が挙げられる。
上記ポリビニルアセタール樹脂を上記アレニウス酸性基により変性する方法としては特に限定されないが、上記イタコン酸や(メタ)アクリル酸との共重合によって得られる。
エチレン基変性の場合、0.1~40モル%が好ましく、1~40モル%がより好ましく、1~10モル%がより好ましい。
アミノ基変性の場合、0.1~30モル%が好ましく、0.1~10モル%がより好ましい。
カルボキシル変性の場合、0.1~30モル%が好ましく、0.1~10モル%がより好ましい。
「幹細胞」とは、自己複製能と分化能を有する細胞をいう。
幹細胞のうち、自己複製能を有し、かつ、1つの細胞から、内胚葉、中胚葉、外胚葉の全ての細胞へ分化できるものを「多能性幹細胞」という。多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell、以下「iPS細胞」という。)、胚性幹細胞(embryonic stem cells、以下「ES細胞」という。)、Muse細胞(multilinege differentiating stress enduring cells)等が挙げられる。
幹細胞のうち、自己複製能を有し、かつ、2胚葉になるもの又は1胚葉の中の複数の細胞になるものを「多分化能細胞」という。多分化能細胞としては、例えば、成熟脂肪細胞に由来する脱分化脂肪細胞(dedifferentiated fat cell、以下「DFAT」という) 等が挙げられる。
本発明は幹細胞の培養に用いることができるが、中でも、多能性幹細胞、特にiPS細胞の培養に用いられることが好ましい。フィーダー細胞や接着タンパク質を含まない無血清培地培養において、幹細胞播種後の初期定着率が向上し、幹細胞の培養がし易くなるからである。
「足場材料(スキャフォールド;scaffold)」とは、細胞の接着、増殖、分化を制御するための細胞培養基材をいう。
上述の幹細胞培養用足場材料を備える容器によれば、様々な幹細胞を培養することができるが、その特性を考慮すると、幹細胞の中でも多能性幹細胞の培養に用いることが好ましい。一般的に、多能性幹細胞は播種後の培養の定着率が低いとされているが、上述の幹細胞培養用足場材料は、培養培地の水分によって膨潤し難く、適度な親水性と強度を維持できるので、多能性幹細胞の播種後の定着率が向上するからである。
細胞培養用足場材料は、適度な親水性と強度を備えることから、三次元培養方法に用いられることが好ましい。細胞培養用足場材料をバイオリアクター等に用いることにより、効率良く幹細胞を増殖させることができるからである。
1つまたは複数のウェル(穴)を備える細胞培養用テストプレートや、細胞培養用フラスコの材質は特に限定されないが、高分子樹脂や金属、無機材料が挙げられる。上記高分子樹脂としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリイソプレン、シクロオレフィンポリマー、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミドイミド、(メタ)アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン等が挙げられる。金属としては、ステンレス、銅、鉄、ニッケル、アルミ、チタン、金、銀、白金等が挙げられる。無機材料としては、酸化ケイ素(ガラス)、酸化アルミ、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化鉄、窒化ケイ素等が挙げられる。
本発明は、上述の幹細胞培養用足場材料を備える容器の他にも、さらに以下の態様の発明が提供される。例えば、上述の幹細胞培養用足場材料に、さらに多糖類等を添加した幹細胞培養用担体(媒体)を備える容器が提供される。
ポリアルコールとしては特に限定されないが、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタンジオール、オクタンジオール、ノナンジオール、デカンジオール、ドデカンジオール、ウンデカンジオール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ポリエチレングリコール、カテコール、ピロガロール、ジボロン酸、メチレンジボロン酸、エチレンジボロン酸、プロピレンジボロン酸、フェニレンジボロン酸、ビフェニルジボロン酸、ビスフェノール誘導体等が挙げられる。
ポリカルボン酸としては特に限定されないが、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、ポリ(メタ)アクリル酸等が挙げられる。
ヒドロキシカルボン酸としては特に限定されないが、グリコール酸、乳酸、タルトロン酸、グリセリン酸、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸、酒石酸、シトマル酸、クエン酸、イソクエン酸、ロイシン酸、メバロン酸、パントイン酸、リシノール酸、リシネライジン酸、セレブロン酸、キナ酸、シキミ酸、ヒドロキシ安息香酸、サリチル酸、クレオソート酸、バニリン酸、シリング酸、ピロカテク酸、レソルシル酸、プロトカテク酸、ゲンチジン酸、オルセリン酸、没食子酸、マンデル酸、ベンジル酸、アトロラクチン酸、メリロト酸、フロレト酸、クマル酸、ウンベル酸、コーヒー酸、フェルラ酸、シナピン酸、ヒドロキシステアリン酸等が挙げられる。
金属石鹸としては特に限定されないが、ステアリン酸、ラウリン酸、リシノール酸、オクチル酸などの脂肪酸と、リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、アルミニウムなどの金属の塩が挙げられる。
多糖類としては特に限定されないが、ペクチン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、カラギーナン、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、キチン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、ヒアルロン酸、キシログルカン、グルコマンナン酸等が挙げられる。
(ポリビニルブチラールの調製)
攪拌装置を備えた反応機に、イオン交換水2700mL、平均重合度250、鹸化度97mol%のポリビニルアルコールを300g投入し、攪拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。次に、この溶液に触媒として35重量%塩酸を、塩酸濃度が0.2重量%となるように添加し、温度を15℃に調整した後、攪拌しながらn-ブチルアルデヒド(n-BA)22gを添加した。その後、n-ブチルアルデヒド(n-BA)148gを添加したところ、白色粒子状のポリビニルブチラール樹脂が析出した。析出してから15分後に、35重量%塩酸を、塩酸濃度が1.8重量%になるように添加し、50℃に加熱し、50℃で2時間熟成させた。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラール樹脂を水洗し、乾燥させることにより、ポリビニルブチラールを得た。
得られたポリビニルブチラールは、平均重合度250、水酸基量28mol%、アセチル基量3mol%、ブチラール化度71mol%であった。
得られたポリビニルブチラール1gをブタノール19gに溶解させることで、ポリビニルブチラール溶液を得た。得られたポリビニルブチラール溶液150μLをφ22mmのカバーガラス上に吐出し、スピンコーターを用いて2000rpm、20秒回転させて平滑な樹脂膜を得た。得られた上記樹脂膜をカバーガラスごとφ22mmのポリスチレンディッシュに投入することで細胞培養用容器を得た。
得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水1mLを加えて37℃のインキュベーター内で1時間静置した。ディッシュ内のリン酸緩衝生理食塩水を除いた後、h-iPS細胞252G1を1.5×104を播種し、培地TeSR E8(STEM CELL社製)1mLおよび、ROCK-Inhibitor(Y27632)10μM存在下、37℃、CO2濃度5%のインキュベーター内で培養を行った。24時間毎に培地を750μL除き、新たなTeSR E8 250μLを加え、ROCK-Inhibitor(Y27632)10μMに調整することで培地交換を行った。
(1)膜厚
得られた上記樹脂膜の一部をステンレス製ピンセットで剥がし、ガラス面を露出させた。上記樹脂膜とガラス面の高さの差をレーザー顕微鏡(オリンパス社製、OLS-4100)を用いて計測することで膜厚とした。
(2)貯蔵弾性率
得られた上記樹脂を熱プレスにより厚み0.5mm以上に成膜した。得られた膜を直径8mmの円形に切り抜き、粘弾性測定装置(レオメトリックス社製「ARES」)を用いて、せん断法にて、ひずみ量1.0%及び周波数1Hzの条件で、昇温速度5℃/分で動的粘弾性の温度分散測定を行った。得られた温度分散測定値の100℃の値を貯蔵弾性率とした。
(3)ヤング率
得られた上記樹脂をテトラヒドロフランに溶解させ、PET上に塗布および乾燥することで100μmキャスト膜を作製した。得られたキャスト膜を10×40mm のサイズに切断し、引張り試験装置(島津社製、AG-IS)を用いて、引張速度200mm/min、掴み具間距離15mm、25℃の条件にて引張り試験を行った。
(4)表面電位
得られた上記樹脂膜をゼータ電位測定装置(大塚電子社製、ELSZ-2000Z)を用いて測定した。
(1)細胞接着密度
細胞播種後24時間経過時の細胞接着密度(個/mm2)を、10×10倍の位相差顕微鏡(オリンパス社製、IX73)を用いてカウントすることで算出した。
(2)細胞増殖数
培養試験開始から5日経過後の細胞塊を、1mLのTrypLE Express(1X)Phenol Red(ThermoFisher社製)を用いて細胞塊を剥離し、単一細胞にした後、細胞数をセルカウンター(NanoEntek社製、EVE)を用いてカウントを行った。
(3)未分化性
アルカリフォスファターゼ(ALP)染色試験キット(Vector社製、SK-5300)を使用して未分化性の確認を行った。
平均重合度850、鹸化度97mol%のポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例1同様にして試験を行った。
平均重合度1700、鹸化度97mol%のポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例1同様にして試験を行った。
平均重合度2400、鹸化度97mol%のポリビニルアルコールを使用したこと、および、n-ブチルアルデヒド(n-BA)の代わりに、アセトアルデヒドを使用すること以外は、実施例1同様にして試験を行った。
平均重合度850、鹸化度98mol%、エチレン変性度4mol%のポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例1同様にして試験を行った。
平均重合度250、鹸化度97mol%、アミン変性度2mol%のポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例1同様にして試験を行った。
平均重合度1600、鹸化度97mol%、アミン変性度2mol%のポリビニルアルコールを使用したこと以外は、実施例1同様にして試験を行った。
足場材樹脂を用いず、ポリスチレンディッシュのみで実施例1同様にて試験を行った。
N-イソプロピルアクリルアミド100重量部、酢酸エチル75重量部、アゾビスイソブチロニトリル0.5重量部を混合し、窒素雰囲気下、65℃で8時間重合を行うことでポリアクリルアミド樹脂を得た。得られた樹脂について、カラムとしてWaters社製「2690 Separations Model」を用いて、GPC法によってポリスチレン換算による重量平均分子量を測定したところ、約9万(重合度約800)であった。その他の操作は実施例1同様にして試験を行った。
シリコーン接着剤SILPOT 184(東レダウコーニング社製)100μLをφ22mmのカバーガラス上に吐出し、スピンコーターを用いて2000rpm、30秒回転させて平滑な樹脂膜を得た。得られた上記樹脂膜をカバーガラスごとφ22mmのポリスチレンディッシュに投入することで細胞培養用容器を得た。その他の操作は実施例1同様にして試験を行った。
Claims (3)
- 幹細胞培養用容器であって、
前記幹細胞培養用容器は、幹細胞の培養領域の少なくとも一部に樹脂膜を備え、
前記樹脂膜のヤング率が400MPa~800MPaであり、
前記樹脂膜の表面電位が-15~15mVであり、
前記樹脂膜の貯蔵弾性率が1.0×10 6 ~1.0×10 8 Paであり、
前記樹脂膜は、合成樹脂を含有する幹細胞培養用足場材料である幹細胞培養用容器。 - 前記合成樹脂がポリビニルアセタール樹脂である請求項1に記載の幹細胞培養用容器。
- 前記幹細胞が多能性幹細胞である請求項1又は2に記載の幹細胞培養用容器。
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