DE3226320A1

DE3226320A1 - Plasminogenaktivator und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE3226320A1
Application number: DE19823226320
Authority: DE
Inventors: Zvi Rehovot Bohak; Avinoam Petach Tikvah Kadouri
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1981-07-15
Filing date: 1982-07-14
Publication date: 1983-02-10
Also published as: JPH0137115B2; FR2510604A1; JPS5865219A; FR2510604B1; IL63317A; IT1195939B; IT8222392A0; GB2104081B; GB2104081A; IL63317A0; DE3226320C2

Description

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung von Plasminogenaktivator (p.a.) durch ein spezielles Verfahren der Züchtung bestimmter Zellen. Durch die Erfindung werden ein neuartiges Züchtungsverfahren sowie gewisse Zellinien bereitgestellt, welche sich durch eine hohe Produktion von p.a. auszeichnen, und zwar ohne vorausgehende Transformation mit Viren oder Behandlung mit Chemikalien (Induktoren), welche karzinogen sind oder Cokarzinogene darstellen. Am Ende des Produktionszyklus haben die Zellen keine Veränderungen durchgemacht, weder im Hinblick auf die Anzahl ihrer Chromosomen noch in ihren Wachstumseigenschaften. Sie proliferieren unter Standardbedingungen, welche für jede Zellinie benutzt werden und können daher wieder verwendet werden.

Urokinase ist ein proteolytisches Enzym, welches in der Medi- ^O zin für die Behandlung von Patienten verwendet wird, welche an Thromben leiden. Seine Wirksamkeit ist bewiesen worden und sein Gebrauch ist erlaubt nach den Bestimmungen der F.D.A. (USA), ebenso in Europa und Japan. Es scheint, daß die Enzyme, welche als Urokinase und als Plasminogenaktivator bezeichnet werden, im wesentlichen identisch sind. Urokinase wird heutzutage hauptsächlich aus Urin gewonnen, in welchem es in sehr kleinen Mengen vorliegt (in der Größenordnung von 8 Einheiten/ml). Die Gesamtherstellungskosten sind sehr hoch und die verfügbaren Mengen klein. Daher dauern die Bemühungen an, p.a. in kommerziellen Mengen durch andere Methoden herzustellen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Plasminogenaktivator, im folgenden p.a. genannt, bereitzustellen, der nach einem neuen Verfahren hergestellt wurde. Eine weitere Aufgabe ist die Schaffung eines Verfahrens für die Herstellung von p.a.

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Diese Aufgaben werden durch den überraschenden Befund gelöst, daß besagtes Enzym p.a. in kommerziell interessanten Mengen von normalen diploiden Zellen hergestellt werden kann. Es wurden Zellen isoliert, welche p.a. produzieren, und solche Zellinien wurden in entsprechender Weise vorbereitet, wie im folgenden im Detail beschrieben, um gesteigerte Mengen von p.a. herzustellen.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Gewisse Zellinien von etablierten menschlichen diploiden Zellen, wie z.B. IMR-90, WI-38 oder HEL-299 erwerben die Fähigkeit, p.a. zu produzieren, wenn diese anfangs für einen gewissen Zeitraum von etwa 5 bis 15 Tagen auf einem Medium mit Serum wachsen, welches kein fötales Kalbsserum darstellt, vorzugsweise Pferdeserum oder durch Wachstum derselben auf Petrischalen, welche mit einer Matrix beschichtet sind, wie z.B. Poly-D-lysin. Zellen, wel-

ehe auf diese Weise vorbehandelt sind, produzieren an-

schließend p.a. und scheiden es kontinuierlich für einen Zeitraum von mindestens 15 Tagen in ein serumfreies Medium aus, welches Lactalbuminhydrolysat oder ein anderes geeignetes Nährsubstrat enthält. Nach Anreicherung von p.a. im 25

Medium und wenn eine gewisse Konzentration erreicht ist, nimmt die Produktion von p.a. ab und hört eventuell sogar ganz auf. Die maximale Konzentration war für viele normale Zellinien etwa 1 Einheit/ml; 3 bis 5 Einheiten/ml für

transformierte Zellen, 30 bis 50 Einheiten/ml für Schweine-30

blasenzellen und 100 bis 300 Einheiten/ml für IMR-90. Fortgesetztes Entfernen von p.a. aus dem Nährmedium verhindert das Erreichen der Maximalkonzentration, und daher erzeugen die Zellen p.a. für einen beachtlich verlängerten Zeitraum.

Für IMR-90 beträgt diese Rate etwa 50 Einheiten/Tag/1O⁵ ZeI-35

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len. Der p.a. kann auch aus dem Medium absorbiert und dieses kann wiederverwendet werden. Der erzeugte p.a. wurde analysiert und sein Molekulargewicht mit etwa 55 KD festgestellt, er kreuzreagiert immunologisch mit Urin-Urokinase. Es scheint daher, daß der erzeugte p.a. mit der 54 KD-Spezies der Urin-Urokinase (H-UK) homolog ist, welche die Spezies mit dem höchsten therapeutischen Effekt zu sein scheint.

IMR-90 ist eine Zellinie ähnlich WI-38, welche eine bewährte Quelle für die Herstellung von lebender Polio- und Rötelvaccine ist. Die Züchtung dieser Zellinien ist im Detail in der Literatur beschrieben und die optimalen Bedingungen sind bekannt.

Die Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die Zellinie IMR-90 erläutert.

In ähnlicher Weise können jedoch auch andere etablierte oder neuartige Zellinien mit ähnlichen Charakteristiken für den gleichen Zweck verwendet werden. Auch solche Verfahren sind Gegenstand der Erfindung.

Die bevorzugt verwendete Zellinie ist IMR-90, ein menschlicher diploider Fibroblastenstamm, welcher durch W.W. Nichols

(1977) aus der Lunge eines 16 Wochen alten weiblichen Fötus erhalten wurde. Die Zellen wurden erhalten von der ATCC (CCL 198, Passage 7). Weder von IMR-90 noch von WI-38 noch HEL-299 war berichtet worden, daß sie in nennenswerter Menge p.a. herstellen. In der gegenwärtigen Forschung wurden sie anfangs als Nichtproduzenten betrachtet. Man fand heraus, daß es möglich ist, solche Zellen zu Herstellern von nennenswerten

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Quantitäten von p.a. zu machen, indem man sie auf einem Medium kultiviert, welches Pferdeserum enthält, und durch anschließende Züchtung auf anderen Nährmedien. Die von der ATCC erhaltenen IMR-90 Zellen wurden aufgetaut und in einem Medium plattiert, welches 10 % FCS enthielt, entsprechend der Empfehlung von ATCC. Nach einer Passage wurden die Zellen in das LH-Medium übertragen und der Enzymgehalt gemessen. Eine langsame Bildung von p.a. wurde festgestellt (weniger als 5 Einheiten/ml nach 4 Tagen).

Nach zwei Passagen in FCS wurden die IMR-90-Zelien in einem Medium von 10 % HS subkultiviert. Nach 4 Passsagen (etwa 12 Verdoppelungen) in diesem Medium wurden die Zellen in LH übertragen. Die Ergebnisse (Figur 1) zeigten, daß die Zellen zu sehr erfolgreichen Produzenten von p.a. wurden.

Das Enzym wurde rasch hergestellt und seine Konzentration in der Lösung erreichte etwa 100 Einheiten/ml.

Die gleichen Zellen wurden dann kontinuierlich in HS subkultiviert und die p.a.-Produktion von Zeit zu Zeit immer wieder getestet. Die Ergebnisse (Tabelle I) zeigten an, daß die Fähigkeit zur Herstellung von p.a. solange beibehalten wurde, bis die Zellen anfingen, Zeichen von Alterung zu zeigen, d.h., langsame Teilung und "Ausflachung". 25

Dies wurde nach 22 bis 24 Passagen beobachtet, was schätzungsweise 65 bis 70 Verdoppelungen entspricht.

Um die Möglichkeit auszuschalten, daß die p.a.-Herstellung das Ergebnis eines einmaligen und nicht reproduzierbaren Mutationsereignisses war, wurde das Experiment wiederholt indem mit Zellen begonnen wurde, welche nach der 9. Passage eingefroren worden waren. Die Ergebnisse zeigten, daß die Fähigkeit zur p.a.-Herstellung reproduzierbar ausgeprägt war.

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Unter bestimmten Bedingungen können die oben erwähnten Fibroblastenzellinien dazu gebracht werden, p.a. herzustellen, indem- sie auf gewissen Substraten in Gegenwart von Seren gezüchtet werden. Die Zellen wurden auf einer Vielfalt von Seren gezüchtet, wobei Kulturgefäße benutzt wurden, welche mit verschiedenen Verbindungen (siehe unten) vorher beschichtet waren und das Auftreten der Fähigkeit zur p.a.-Herstellung wurde verfolgt. Es zeigte sich, daß die Menge von p.a. im Medium in Abhängigkeit sowohl vom Serum als auch von <ä_er Matrix schwankte. Die Ergebnisse, welche mit Gefäßen erzielt wurden, die mit Poly-D-Lysin beschichtet waren, zeigen (Tabelle IV), daß an dieser Matrix die Zellen dazu gebracht werden können, p.a. in Medien (wie z.B. FCS) herzustellen, welche sonst nicht die Enzymherstellung fördern.

Wenn diese Zellen einmal angepaßt waren, fuhren sie fort, das Enzym in einem serumfreien Medium herzustellen, wie oben beschrieben. Die konditionierten Zellen werden in dem Herstellungsverfahren benutzt.

^ Im Anschluß an die oben beschriebenen Beobachtungen wurde die Herstellung mehr im Detail charakterisiert. In diesen Experimenten wurden die Zellen in einem Medium mit HS kultiviert,dann in ein Medium mit LH übertragen und die Menge

an p.a. im Medium festgestellt.
25

Die in Figur 2 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß mit Zellen von frühen Passagen die Enzymkonzentration im Medium eine obere Grenze von etwa 100 Einheiten/ml erreicht. Diese obere Grenze steigt, wenn Zellen von späteren Passagen benutzt werden. Bei sehr alten Zellen hörte die Enzymproduktion auch dann nicht auf, wenn die Konzentration im Medium 300 Einheiten/ml erreichte.

Diese Ergebnisse legen die Vermutung sehr nahe, daß die p.a.-Konzentration, die im Medium beobachtet wurde, einerseits durch seine Bildung selbst bestimmt wird und andererseits durch irgendeinen "negativen" Prozeß. Letzterer könnte eine

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reprimierende Rückkopplung auf die Synthese (oder Exkretion) des Enzyms sein oder die Bildung eines anderen Zellproduktes, welches entweder das Enzym hemmt oder seinen Zerfall katalysiert. Wiederholte Übertragung der Zellen in ein HS-haltiges Medium scheint diese negative Kontrolle abzuschwächen, wobei die Bildung höherer nachweisbarer Enzymaktivität in dem Medium ermöglicht wird.

Es sollte erwähnt werden, daß eine Aktivität von 100 Einhelten/ml einer Enzymkonzentration von etwa 1 mg/Liter entspricht, so daß die Produktmengen in den oben erwähnten Experimenten im Bereich von 1 bis 3 mg/Liter liegen.

Ernte und Reinigung:
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Der p.a., welcher von den Zellen hergestellt wurde, kann geerntet werden durch Adsorption aus dem Kulturmedium mittels Adsorbentien, welche bekanntermaßen Urokinase adsorbieren, durch Konzentration mittels Membranen oder durch Kombinationen beider Möglichkeiten. Zwei Beispiele werden lediglich zur Erläuterung gegeben.

1. Adsorption

Das p.a.-haltige LH-Medium wurde mit fein zerteiltem Silikat behandelt, in dem 1 bis 2 mg des Feststoffs zu jedem ml Lösung gegeben und für 1 Stunde gemischt wurden. Die Feststoffe wurden dann durch Zentrifugetion abgetrennt. Es zeigte sich, daß der überstand weniger als 5 % des ursprünglich vorhandenen p.a. enthielt und wurde wie unten beschrieben, weiter verwendet.

Die Analyse des Feststoffs zeigte, daß p.a. durch Behandlung mit einer Base, insbesondere Ammoniak, organischem Amin und polymeren Aminen quantitativ vom Silikat abgetrennt werden konnte, wobei eine Lösung von p.a. entstand, welche

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weiter gereinigt werden konnte durch eine Vielzahl von Methoden, welche in diesem Gebiet Anwendung finden.

2. Konzentrierung durch Dialyse
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Das p.a.haltige LH-Medium wurde in einen Dialyseschlauch gefüllt und wasserabsorbierendes Material über die Außenseite gestreut. Dadurch wurde das Enzym 10- bis 20-fach konzentriert, wobei die Gesamtausbeute mehr als 75 % betrug. 10

Wirkung von Medienwechseln auf die p.a.-Herstellung

Die Ähnlichkeit des zeitlichen Verlaufs der p.a.-Herstellung durch IMR-90 und der früher mit anderen Zellen beobachteten

'^ Synthese veranlaßte uns, die Wirkung mehrfachen Medienwechsels zu prüfen. Wie in den früheren Fällen zeigte sich (Figur 2), daß die Verlangsamung des Auftretens von Enzym in den Kulturen von IMR-90 bei hoher Enzymkonzentration weitgehend durch Perfusion (Durchspülung) verlorengeht. Offenbar interferiert die Durchspülung in irgendeiner Weise mit dem oben diskutierten negativen "Rückkoppelungs"-Kontrollmechanismus.

Die in Figur 3 dargestellten Ergebnisse scheinen anzudeuten, daß Medienwechsel das Auftreten von p.a. dann beeinflußt, wenn bereits eine nennenswerte Enzymmenge im Medium akkumulierte, daß er jedoch keine Wirkung auf die Anfangsrate der p.a.-Synthese hat. Ein Befund, der dies bestätigt, wurde von einem Experiment erhalten, bei dem in FCS gezüchtete Zellen in LH-Medium überführt wurden (Figur 4). Diese Zellen stellten p.a. sehr langsam her, so daß die Konzentration im Medium gering war: die Rate der p.a.-Bildung wurde durch Medienwechsel nicht beeinflußt. ^J

Da anzunehmen ist, daß die Kosten für Nährmedien einen wesentlichen wirtschaftlichen Faktor darstellen, wurde ein Experi-

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ment durchgeführt mit dem Ziel, die Möglichkeit der Wiederverwendung von Nährmedium zu prüfen. Das bereits benutzte Medium wurde mit Silikat behandelt, um p.a. daraus zu entfernen und nach 1 : 1 -Verdünnung mit frischem Medium zurückgeführt in die Kultur. Es zeigte sich, daß die Silikatbehandlung 90 % oder mehr von dem p.a. aus dem Medium entfernte. Die Ergebnisse (Figur 5) deuten an, daß die Wiederverwendung von Medium möglich ist. Die beobachtete p.a.-Synthese war in der Tat höher mit wiederverwendetem Medium als wenn eine Durchspülung mit frischem Medium vorgenommen wurde.

Den allgemeinen Verfahren zur Untersuchung von p.a. folgend enthielt das Medium, welches in den oben erwähnten Experimenten für die Herstellung von p.a. verwendet wurde, Lactalbuminhydrolysat (Milcheiweißhydrolysat). Es stellte sich jedoch heraus, daß die ρ.a.-Produktion mit einer Vielzahl von Peptonen erreicht werden kann, welche als Substrat für das Wachstum von Mikroorganisen verwendet werden und Hydrolyseprodukte tierischer oder pflanzlicher Proteine darstellen. Ein Beispiel der Ergebnisse ist in Tabelle V dargestellt.

Züchtung von IMR-90 Zellen:

1. Standardverfahren

Zellen wurden routinemäßig in 90 mm-Kunststoffschalen von Palcon in einem Medium gezüchtet, das aus einer Mischung (1/1 v/v) von DMEM und F-12 bestand und dem entweder fötales Kälberserum oder Pferdeserum (von Gibco USA) in einer Endkonzentration von 10 % zugefügt wurde. Jede Schale wurde mit 5x10 Zellen und 7 ml Medium beimpft. Konfluente Bedeckung wurde nach 3 bis 5 Tagen mit etwa 8x10 Zellen/ Platte erreicht. Um die Zellen zu passagieren, wurden sie mit 0,25 % Trypsinlösung (Biolab, Jerusalem) behandelt.

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Die TrypsinlÖsung (2 bis 3 ml) wurde in die Platte pipettiert und nach 1 Stunde bei Raumtemperatur die Hauptmenge der TrypsinlÖsung abgesaugt. Die Zellen blieben mit einem dünnen Flüssigkeitsfilm zurück. Nach 15 bis 20 Minuten wurde eine kleine Menge frischen Mediums zugefügt, mit den Zellen vermischt und mehrmals in eine Pipette aufgezogen, um eine Suspension von einzelnen Zellen zu erhalten. Es wurden zu jeder Platte 5 ml frisches Medium gegeben und Proben für die Zellzählung und für erneute Plattierung entnommen.

Zellen wurden auch in Schalen von anderer Größe und in anderen Gefäßen für die Zellkultur gezüchtet, wobei das gleiche Verhältnis von Zellen zur Fläche wie oben eingehalten und das gleiche allgemeine Verfahren befolgt wurde.

2. Wirkungen des Substrats auf die Anheftung und Proliferation von IMR-90

Es wurden Untersuchungen zur Züchtung von IMR-90 auf unterschiedlichen Substraten und Beschichtungen durchgeführt. Die Zellen wurden plattiert und auf verschiedenen Substraten 4 Tage lang wachsen gelassen, um einen kombinierten Effekt auf Plattierungseffizienz und Proliferation zu erzielen.

Die Ergebnisse (Tabelle II und III) zeigen, daß die Züchtung durch eine Vorbeschichtung der Platten verbessert werden kann. Die einfachste Vorbeschichtung, die Wirkung zeigt, ist Gelatine. Darüberhinaus ermöglicht eine Gelatineschicht auch das Wachstum auf anderen Oberflächen, wie z.B.

Gelbond.

Einheiten:

Die Enzymaktivität wird in CTA-Einheiten angegeben. Enzymtests wurden mit der Fibrinplattenmethode durchgeführt, wobei die Kalibrierung mit Standard-Urokinase durchgeführt wurde, welche vom NIH (USA) erhalten wurde.

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Charakterisierung der Zellen nach ihrer Verwendung zur p.a.-Herstellung

Von IMR-90-zellen, welche wie oben beschrieben, zur p.a.-Herstellung angeregt worden waren, wurden Karyotypien durchgeführt. Es wurde eine normale Chromosomenausstattung (2N=46) vorgefunden, wobei die Verteilung der experimentellen Befunde ähnlich der war, wie sie für die originale Zellinie mitgeteilt wird.

Zellen, welche zur p.a.-Herstellung 12 Tage lang in LH-Medium benutzt worden waren, wurden in Kulturmedium mit 10 % FCS übertragen und unter den vorher beschriebenen Standardbedingungen gezüchtet. Die Zellen wurden 1 Monat lang überwacht und es zeigte sich, daß die Wachstumsrate der Zellen, ihre Dichte bei konfluenter Bedeckung sowie ihr morphologisches Aussehen mit den jeweiligen Eigenschaften der originalen IMR-90 Zellen identisch waren. Auch die p.a.-Synthese ging auf das Maß normaler Zellen zurück.

Ähnliche Ergebnisse können mit Zellen der Linie WI-38, HEL-299 oder ähnlichen erzielt werden und die Erfindung soll auch die Verwendung solcher Zellinien für die p.a.-Her stellung mit erfassen.

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- 14 Tabelle I

Herstellung von p.a. durch IMR-90-Zellen, die im Medium mit Pferdeserum gezüchtet wurden:

Beisp.	Passagenzahl *	p.a. Menge Einheiten/ml
1	12	98
	15	110
	20	208
	22	45**
	24	15,6
2.	14	160
	17	43**
	24	272

* Passagen von 8 an gezählt
** nur 0,5 χ 1O⁵ Zellen

Die Zellen wurden mit der Standardmethode fortlaufend subkultiviert in HS-Medium. Um die p.a.-Produktion zu bestimmen, wurden die Zellen nach Trypsinbehandlung in HS-Medium plattiert (2 χ 10 -Zellen, 30 mm-Schalen, 1,5 ml Medium) und nach 24 Stunden wurde das Medium durch LH ersetzt. Die Aktivität einer Probe des Mediums wurde 96 Stunden nach der Überfüh-

rung in LH bestimmt. Leerproben, die mit plasminogenfreien Platten durchgeführt wurden, waren negativ.

IMR-90-Zellen, welche nach der 7. Passage eingefroren worden waren, wurden aufgetaut und zweimal in DMEM/FCS weiter

transferiert (Passagen 8 und 9). Das erste Experiment wurde mit Zellen durchgeführt, welche nach der Passage 9 eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufgehoben worden waren. Die Zellen wurden aufgetaut, zweimal in DMEM/FCS und dann

in DMEM/HS weiter transferiert.
35

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- 15 1 Tabelle II

Die Verwendung von Gelbond* Filmen und Gelatinebeschichtung bei der Züchtung von IMK-*90 5

Substrat Zellzahl ( χ 10**⁵>

ünbehandelte Schale 1,3

Gelatine-behandelte Schale 3,2

Gelbond 1 ,0

₁₀ (dünne Blätter aus Polyester mit

einer hydrophilen Seite, die benutzt wurde)

Gelatine-behandeltes Gelbond 1,7

Die Experimente wurden in 30 mm-Schalen durchgeführt. Dabei ¹⁵ wurden 1 χ 10 Zellen und 1,5 ml HS-Medium eingesetzt. Für die Experimente mit Gelbond wurde ein Kreis aus der Folie ausgeschnitten und der Boden der Schale damit bedeckt. Gelatine wurde als 0,03prozentige wäßrige Lösung zugegeben und 20 Minuten in der Schale stehengelassen. Dann wurde die 20 Lösung abgesaugt.

Nach 96 Stunden Wachstum wurden die Zellen durch Trypsinbehandlung losgelöst und gezählt.

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Tabelle III

Die Verwendung unterschiedlicher Beschichtungen für die Schalen

Substrat

Unbehandelte Schale

behandelt mit Protaminsulfat

behandelt mit poly-D-Lysin

Zellmatrix

Die experimentellen Details sind die gleichen wie in Tabelle II, außer daß eine andere Zellprobe eingesetzt und 2,5 χ 10 Zellen in 30 mm-Schalen plattiert wurden. Die Schalen wurden mit Protaminsulfat oder poly-D-Lysin (o,1 rag/ml) behandelt.

Zellzahl (x10 )	N/No.	,3
4,5	1	,8
3,0		/8
6,5	1	,1
7,5	2

Nach 5 Minuten Inkubation wurden die Schalen zweimal mit sterilen H»O und einmal m;
den die Zellen plattiert.

sterilen H»O und einmal mit Medium gewaschen und dann wur-

Die Zellmatrix wurde durch Wachsen einer Monolayer-Kultur

von CCL- Zellen (menschliches Darmepithel) und Behandlung ο

mit 0,5 % Triton X-100 in H₃O hergestellt. Nach 10 Minuten Inkubation wurden die Schalen zweimal mit PBS und einmal mit Medium gewaschen. Dann waren die Platten bereit für die Plattierung der Zellen.

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- 17 Tabelle IV

Produktion von p.a. durch IMR-90 Zellen, welche in verschiedenen Seren vermehrt wurden

Serum Poly D-Lysin p.a. im Medium/ Beschichtung E/ml

Fötales Kälberserum + 23

Pferdeserum + 57

28 Schweineserum + 3

- 1 Menschliches Rückenmarkserum + 6

" - 11

Serum von neugeborenen + 40

Kälbern

10 Hundeserum + 12

Ziegenserum + 8

- 3

Hühnerserum + 3

IMR-90 Zellen wurden in einem Medium mit 10 % Serum auf Kunststoffpetrischalen mit 0,1 % PoIy-D-Lysin-Vorbeschichtung vermehrt. Die p.a.-Aktivität des Mediums wurde bestimmt.

- 18 -

Tabelle V

Wirkung verschiedener Peptone auf die p.a. Herstellung

Peptone

p.a. im Medium E/ml

Milcheinweiß-Hydrolysat	36
Casein-Hydrolysat	72
D.M.Pepton	27
Tryptosephosphat-Brühe	10
Prematon-K	11

Die Zellen (10 Zellen/30 mm-Schale) wurde in einem Medium ¹⁵ mit 10 % HS plattiert und 48 Stunden später wurde das Medium durch frisches Medium mit dem angegebenen Pepton ersetzt. Der p.a. im Medium wurde nach 24 Stunden gemessen.

Milcheiweiß-Hydrolysat Casein-Hydrolysat D.M.Pepton

Tryptosephosphat-Brühe Prematon-K

0,5 % von Bio-lab Israel 2 % von Gibco USA

0,5 % von Scientific Protein Labor. Inc.

0,5 % von Difco

0,5 % von Humko Sheffield Chemicals

Claims

VOSSIUS VOSSIUS TÄ-ÜrCHNeR :"h EUNEMANN -RAUH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE A ■ 800O MÜNCHEN 86 · PHONE: (O8Ö) 47 4O7B CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX Β-2Θ4Β3 VOPAT O WiZ.: R 979 (Ra/kä) 14. Juli 1982 Case: T/469 YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO., LTD. Rehovot/ Israel 10 " Plasminogenaktivator und Verfahren zu seiner Herstellung " Patentansprüche 15

1. Plasminogenaktivator, hergestellt durch Züchtung eines diploiden Fibroplastenstammes für eine Anzahl von Passagen in einem serumhaltigen Kulturmedium auf beschichteten oder unbeschichteten Oberflächen, Züchtung der konditionierten Zellen zur Plasminogenaktivator-Erzeugung in einem Kulturmedium und Gewinnen des Plasminogenaktivator s aus dem Medium.

2. Verfahren zur Herstellung von Plasminogenaktivator,

dadurch gekennzeichnet, daß man einen diploiden Pibroblastenstamm für eine Anzahl von Passagen in einem serumhaltigen Kulturmedium auf beschichteten oder unbeschichteten Oberflächen züchtet, dann die konditionierten Zellen zur Plasminogenaktivator-Erzeugung in einem Kulturmedium züchtet und den Plasminogenaktivator aus dem Medium gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die diploiden Fibroblastenzellen von den Zellinien IMR-90, WI-38, oder HEL-299 stammen.

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4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen auf unbeschichtetei Oberflächen von Schalen, Folien, Körnern oder anderen Oberflächenformen gezüchtet werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen durch Züchtung auf Oberflächen, welche mit Poly-D-Lysin, Protaminsulfat, Gelatine oder mit einer Zellmatrix beschichtet sind, konditioniert und anschließend auf einer unbeschichteten oder beschichteten Oberfläche gezüchtet werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen durch Züchtung in einem Pferdeserum-haltigen Medium (HS) für 3 bis 12 Tage konditioniert und anschließend in einem Medium, welches Milcheiweiß-Hydrolysat enthält (LH) ,. gezüchtet werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen durch Züchtung in einem Medium mit fötalem Kälberserum, Schweineserum, menschlichem Rückenmarkserum, Serum neugeborener Kälber, Hundeserum, Ziegen- oder Hühnerserum konditioniert und anschließend in einem Medium, welches ein geeignetes Hydrolysat enthält, kultiviert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen in einem Medium züchtet, welches Caseinhydrolysat, D.M. Peptontryptosephosphat-Brühe, Prematon-K oder ein entsprechendes anderes technisches Pepton enthält.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man den erzeugten Plasminogenaktivator kontinuierlich durch Perfusion aus dem Medium gewinnt.

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10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den Plasminogenaktivator an Kieselsäure adsorbiert, durch Kontakt mit einer Base wieder freisetzt und mit üblichen Methoden reinigt.

11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium nach Abtrennung des Plasminogenaktivators wiederverwendet wird.

¹⁰ 12. Verwendung eines diploiden Fibroblastenstammes zur Herstellung von Plasminogenaktivator.

13. Ausführungsform nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fibroblastenstamm eine der Zellinien 15 IMR-90, WI-38 oder HEL-299 einsetzt.

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