JPS5865219A - プラスミノ−ゲン賦活体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は、一定の細胞を培養する特殊な方法による。シ
ラスはノーダン賦活体（、ｐ’、ａ、）の製造法化合物
（誘発物質）の処理をｌＡ：：　Ｔことなく高いｐ、ａ
、生産性を示す一定の細胞株が提供される。

該細胞は生産循環の終期に染色体および生育上の特色に
変化がなく、各細胞株に用いた標準条件で増殖し再循環
できる。

本発明の背景 ウロキナーゼは血栓に対する治療薬の成分として用いら
れる蛋白分解酵素である。その効力は既に証明され、米
国Ｆ、Ｄ、Ａ、の規制に従って使用が許可されており、
ヨーロッパおよび日本でも同様である。ウロキナーゼお
よびプラスεノーダン賦活体とよばれる二つの酵素は本
質的には同一のものと考えられる。ウロキナーゼは現在
主に尿から生産されるが、尿中には極少量、８単位／　
ｍｌの割でしか存在しない。最終製品の調製費が非常に
高り、シかも少量しか入手できない。そのため、商業的
規模でｐ、ａ、を生産する方法を開発すべく努力が重ね
られている。

本発明の要約 本発明はゾラスミノーデン賦活体（以下ｐ、ａ。

という）の製法ならびに、生産された酵素に関する。本
発明は該酵素ｐ、ａ、が普通の二倍体細胞から商業的規
模で生産できるとの予期せざる知見に基いている。以下
詳細に説明するとと＜、ｐ、ａ。

生産性を有する細胞を分離し、多量のｐ、ａ、を生産す
るように調整した。

定着したヒトの二倍体細胞の一定細胞株、たとえばｘＭ
Ｒ−９０，ＷＩ−３８またはＨＦ！Ｌ　−２９９は、ま
ず胎生子牛血清以外の、好ザしくは馬血清のよ５な血清
を含む培地で約５−１５日間培養するか、あるいはポリ
ーＤ−リジンσ）ようなマトリックスで被覆した皿上で
培養するとｐ−ａ＃生産能を獲得することを見出した。

か（して調整した細胞は、それ以後はラクトアルブミン
加水分解物を含む無血清培地あるいは他の適当な栄養培
地で培養すると少な（とも１５日間連続してｐ、ａ、を
生産・分泌する。培地中にｐ、ａ、が蓄積し、一定の濃
度に達すると、　ｐ、ａ、の生産は減少し、最後には停
止する・最扁譲度は多くの通常の細胞株で約１単位／　
ｍｌ、形質転換した細胞で３−５単位／　ｍ！！　。

豚の膀胱細胞で３Ｏ−５０ｔ４Ｌ位／ｍｅ、　ＩＭＲ−
９０で１００−３００単位／　ｍｌで；し］る。栄誉培
地からｐ、ａ、を連続的に取除くと最高濃度到達を避け
ることができ、細胞はかなり長期間に亘ってｐ、ａ。

を生産する。ＩＭＲ−９０では約５０単位／日／１０５
細胞の割でｐ、ａ、が生産される。ｐ、ａ、はまた培地
から回収され再循環される。生産されたｐ、ａ。

は分析の結果分子量約５５キロダルトン（ＫＤ　）で尿
のウロキナーゼ（ＵＫ　）と免疫的交叉反応をすること
が見出された。従って、生産されたｐ、ａ。

は最高の医療効果を持っていると思われる５４ＫＤの尿
ウロキナーゼ（Ｈ−ＵＫ　）と同一であると考えられる
。

ＩＭＲ−９０はポリオおよび風疹用の生ワクチンの生産
源として認可されているＷＩ　−３８と同様なａ胞株で
ある。これら細胞株の培養については文献に詳細な記載
があり、最適条件はよく知られている。本発明による方
法をＩＭＲ−９Ｑ細胞株を例にとって説明する。これは
単なる一例示であり。

同様に定着したまたは類似の性質を有する新規な細胞株
も同様に使用することかでさるものと理解すべきである
。また以下の記載も単なる例示と理解すべきである。

本発明は特定東注下で一足の二倍体細胞を培養し、培養
物から目的物を回＋１７することからなるシラスミノ−
ｒン賦活体（ｐ、ａ、）の製造に関する。

用いられる好適な細胞株はＩＭＲ−９０で、これはｗ、
ｗ、　＝コルス（Ｎ１ｃｈｏｌｓ　）（１９７７）によ
って１６週令女性胎児の肺から得られたヒト二倍体線維
芽細胞株で、６る。該細胞はＡＴＣＣ（ＩＴ！Ｌ１８６
、第７継代培養）から入手した。ＩＭＲ−９０。

ＷＩ　−３８−ＨＥＬ　−２９９のいずれについてもｐ
、ａ。

を著量生産するという報告はない。本研究では。

それらは最初卵生ｐｃ株と考えられていたが、馬血清を
含む培地で培養し１次いで他の栄養培地で培養すること
によりそれらの細１１ｂ！をｐ、ａ、の著量生産株に変
えることができることを見出した。

ＡＴＣＣから入手したＩＭＲ−９０を解かし、ＡＴ（１
’ｃが勧める１０％ＦＣＢ含有培地にＪｉｆｆえた。−
継代培養後細胞をＬＨ培地に移し、酵累含１正を６１１
］定した。

その結果ｐ、ａ、の生成が僅かに（４目抜５単位／罰以
下）認められた。

Ｆｅ２で二継代培養後、ＩＭＲ−９３細胞を１０係ＨＥ
含有培地で二次培養した。この培地で四継代培養（約１
２分裂）後、細胞をＬＨに移した。その第１図の結果は
、細胞が非常に高いｐ、ａ　、生産株になったことを示
している。該酵素は急速に生産され、溶液中の濃度は約
１００単位／ゼに達した。

次いで同じ細胞をＨ８で連続的に二次培養し。

ｐ、ａ、／３１意を時おり調べた。、第１表の結果はｐ
、ａ。

生産能力が、細胞に老令のきざし、つまり緩慢な分裂と
増殖停止（ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ　）が見えはじめるま
で保持されγこことを示している。

こｎ、は６５−７０分裂に相当するとみられる２２−２
４継代後も観察された。

１　　　　　　　　　　　１２　　　　　　　　　　　
９８１５　　　　　　　　　　１１０ ２０　　　　　　　　　　　２０Ｂ ２２　　　　　　　　　４５” ２４　　　　　　　　　　　１５．６ ２　　　　　　　　　　　１４　　　　　　　　　　１
６０１７　　　　　　　　　４５” ２４　　　　　　　　　　２７２ 細胞なＨ８培地で標準操作によって連続的に二仄培書し
た。ｐ、ａ、生産量を′６＋！Ｉるために、細胞をトリ
プシン消化後Ｈｅ培地にプレート移植しく２×１０５細
胞、６０朋プレート、１．５ｍＡ培地）、２４時間後に
培地をＬＨに変えた。ＬＨ移植してから９６時間後に培
地の一部で活性なｉｌｌ！Ｉ定した。プラスミノ−ｒン
なしのプレートで行なった仝試験は隘性であった。

第７継代後凍結したＩＭＲ−９０を解かしＤＭ　ＥＭ／
ＦＣ８で２継代（第８および第９継代）培養した。

最初の実験は第９継代後に凍結し液体窒素中に保存した
細胞で行なった。細胞を解かし、　ＤＭＥＭ／ＦＣＢで
２継代１次いでＤＭＫＭ　／　Ｈａで継代培養しち＊　
　第８継代かうつけた継代番号。

＊＊　　　０．５Ｘ１０５細胞 特殊な非再生産性変異によるｐ、ａ、生理の可能性を除
くために、第９継代後凍結した細胞から実験を繰返した
。その結果、　ｐ、ａ、生産能力は再現されることがわ
かった。

ある一定の条件下では、上記線維芽細胞株は血−清の存
在下一定基質で培養することによりｐ、ａ。

を生産するように調整することができる。下記の種々化
会物で前もって被覆した培養容器を用い種種の血清で細
胞を増殖させ、　ｐ、ａ、生産能力の発現を追跡した。

培地中のｐ、ａ、ｉｔは、血清とマトリックスの両者に
よって変化することが見出された。ボＩＪ　＋　ｐ　−
ＩＪジンで被覆した容器で得られた結果（第４表）は、
細胞が通常は酵素生産に貢献しないようなＦｅ２のよう
な培地中でもこのマトリツクス上ではｐ、ａ、化生産す
るように適応できることを示している。

一度適応すると、これら細胞は上記のごとく無血清培地
中で酵素生産を続けた。その調整細胞は生産手段に使わ
れる。

上記観察に従って、生産をある程度詳細に特定した。こ
れらの実験では、細胞なＨａ含有培地に増殖させ、　Ｌ
Ｈ含有培地に移し、培地中のｐ、ａ。

量を追跡した。

第２図に要約した結果は、初期継代の細胞では。

培地中の酵素濃度の上限は約１００単位／　ｍｌに達し
たことを示している。この上限は後期継代細胞では増加
する。非常に古い細胞では、培地中の酵素濃度が６００
単位／継に達しても酵素生産は止まらなかった。

これらの結果は、培地中のｐ、ａ、量がｐ、ａ、形成と
なんらかの負要因によって決められていることを強（示
唆している。負要因としては、酵素合成あるいは分泌に
及ぼす抑制型フィードバックまたは、酵素を阻害するか
その崩壊を触媒する他の細胞産物の生成があげられる。

Ｈ８含有培地での細胞の繰返し継代培養はこの負抑制を
減じ、その績果培地中に高酵素活性の増強をもたらすと
考えられる。

１００単位／ａの活性は約１叩／ｌの酵素濃度に相当す
るので、上記実験での生産量は１−６ｒＲｙ／ｌの割で
ある。

細胞により生産されたｐ、ａ、はウロキナーゼを吸着す
ることが知られている吸着剤を用いる培養物からの吸着
、膜を用いる濃縮、または両者の併用により採取できる
。以下に２つの方法を例示する。

１、　吸着 ｐ、ａ、を含むＩ、Ｈ培地を細砕シリカで処理した。

即ち、溶液１ｍｌ当り１−２呼の固体を加え、１時間混
合した。ついで固体を遠心分離で回収した。

上清は最初に存在したｐ、ａ、の５％以下を含んでおり
、下記のとおり再使用した。

固体の分析の結果１１　ｐ、ａ、は塩基、とくにアンモ
ニア、有機アミンおよび重合アミンの処理でシリカから
定量的に遊離し、得られたｐ、ａ、の溶液はこの分野で
用いられる槙々の方法によって更に精製することができ
た。

ｐ、ａ、を含むＬＨ培地を透析袋に移し、吸水性物質を
外側に置いた。酵素は１０−２０倍に濃縮され、７５チ
以上の総回収率であった。

ＩＭＲ−９０によるｐ、ａ、生−ａｔｔの経時変化と他
の細胞で以前に観察された経時変化の類似点を考慮して
、培地の繰返し置換による効果を調べた。先に見られた
ように、第２図のＴＪｌｌ＜、　ＩＭＲ−９０の培養時
に酵素濃度が旨くなると酵素生成速度が減するが、この
減速は潅水により大巾に解消される。油水は明らかに上
述した負のフィードバック調節機構を妨げる。

第６図の結果は、培地に著量の酵素が蓄積しているとき
は培地置換がｐ、ａ、　ｇＥ成に影響を及はすが４１　
ｐ、ａ、の初期ｇ：、産には影響しないことを示してい
る。この事はＦＣ８培地で増加した細胞ＹＬＨに移して
行なった実験（第４図）により証明された。これらの細
胞はｐ、ａ、を非常に緩慢に生産するので培地中の濃度
は低く、ｐ、ａ、生成は培地置換によって影響されなか
った。

培地の経費は重要な経済的要因であると思われるので、
培地循環の可能性を調べる実験を行なった。使用した培
地なシリカで処理してｐ、ａ、　ｆ除き、新鮮培地と１
：１に希釈して戻した。シリカの処理で９０％以上のｐ
、ａ、が培地から除かれることがわかった。第５図の結
果は培地の反復使用が可能であることを示している。事
実、循環した培地を用いた場合の方が、新鮮培地ヲ油水
した場合よりも、多量のｐ、ａ、が生産されることが観
察された。

上記笑、験のｐ、ａ、ｒＥｆｉに用いられた培地は。

ｐ、ａ、に関する実験で通常用いられるものと同様。

ラクトアルブミン加水分解物を含んでいる。しかし動植
物由来蛋白質の加水分解物で、微生物増殖の基質として
用いられるＨ１ｉｆ々のペゾトンを用いてもｐ、ａ、が
生産されることがわかった。結果の一例を＠５表に示す
。

第５表：　ｐ、ａ、生産における抽々ペプトンの影畳 ラクトアルブミン加水分解物　　　　　　　　　６６力
ゼイン加水分解物　　　　　　　　　　　　　７２Ｄ、
Ｍ、ペゾト〜　　　　　　　　　　　　２７トリゾトー
ス燐酸プロス　　　　　　　　　１０プレマトン−Ｋ　
　　　　　　　　　　　　　　１１細胞を１０％Ｈ８を
加えた培地に１０５細胞／６０朋皿の割でプレート移植
し、４８時間後に培地を表示したペプトンを含む新館培
地に替えた。

培地中のｐ、ａ、　Ｙ’２４時間後に分析した。

ラクトアルブミン加水分解物　　０．５％バイオ・ラブ
、イスラエル（Ｂｌｏ−１ａｂ、　ｌ５ｒａｅｌ）カゼ
イン加水分解物　　　　　　２係ヤプコ、米国（ｏｉｂ
ｃｏ　、ＬＪＢＡ） （８ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ＰｒｏｔｅｉｎＴ、ａｂｏｒ
　＋Ｉｎｃ　、　） トリゾトース燐酸ブロス　　　　０．５％ディフコ（Ｄ
ｉｆｃｏ）プレマトン−Ｋ　　　　　　　　　Ｏ，５％
ラフコ・シェフイールド・ケミカルス （Ｈｕｍｋｏ　８ｈｅｆｆｉｅｌｄ ＣｈｅｍｉｃａｌＳ　） ＩＭＲ−９０細胞の培養 １、　標準操作 細胞を常法どおり、ファルコｙ　（Ｆａｌｃｏｎ）　９
０ｗ１ｔシラスチツクプレートを用いＤＭＫＭとＦ−１
２との１対１（容積比）混合培地で培養し、米国イデコ
（Ｇｉｂｃｏ　ＵＳＡ　）製の胎児子牛血清または馬血
清を１０係の濃度になるように加えた。各プレートは５
　Ｘ　１０５細胞と７ｍｂの培地で種培養した。

プレート当り約８　Ｘ　１０６細胞になった３−５口重
に集＠状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ　）達した。細胞な
継代培養するために０．２５％５％トリジシン（バイオ
ラフ、エルサレム）でトリノシン消化した。トリジシン
溶液（２−３ｄ）をプレートに加え、１分後に室温でト
リノクン溶液の大部分乞吸い出すと。

細胞は溶液の薄膜で覆われた状態で残った。１５−２０
分後に、少量の新鮮培地を加え、細胞と混合しピペット
を用いて数回にわたり細胞の懸濁液を得た。次いで各プ
レートに新鮮培地（５ｒｎｅ　）を加え、一部を細胞数
計測および１ｇ移植のため（（をり出した。

また、他の大きさのプレー）、−１：たは他の細胞培養
用容器を用い、上記の表面積対細胞の割合で。

同じ一般的手法に従って補＋■１ｌ−１′　　、細胞の
培養を行った。

効果 種々の基質および被覆物上でのＩＭＲ−９０の培養の検
討を行なった。移植効率および増殖に関する併合効果を
得るために、細胞をプレート移植し。

種々の基質上に４日間増殖させた。

第２．６表の結果は、プレートの被覆により培養が改善
できることを示している。最も単純で効果的な被覆物は
ゼラチンである。さらに、ゼラチン被覆はまたゲルボン
ド（Ｇｏｌｈｏｎｄ　）のような他の表面での増殖をも
可能にする。

未処理プレート　　　　　　　　　　　　　１・６ゼラ
チン処理プレート　　　　　　　　　　６．２ゲルボン
ド　　　　　′１．０ ゼラチン処理ゲルボンド　　　　　　　　１．７笑験は
３０ｍｍプレート上で、　１，５　ｒｎｌ　Ｈ８培地を
用いＩ　Ｘ　１０５細胞から行なった。ゲルボンドを用
いる実験では１円形フィルムを作りプレートの底を覆っ
た。ゼラチンは０．０３　％水性溶液として使用し、２
０分間プレートに存在させて、吸引で除いた。

９６時間増殖の後、細胞をトリゾシン消化で分離し、細
胞数を数えた。

＊　ゲルボンド（Ｇｅ１ｂｏｎｄ　’）はポリエステル
薄膜の商品名（マリン−バイオカロイズ、　Ｍａｒｉｎ
Ｂｉｏｃａｌｏｌｓ　）である。膜の片側は親水性にな
っており、実験にはそちら側を用いた。どのような方法
で親水性にしたかは明らかでないが、アルカリを用いた
ものと思われ、る。

未処理プレート　　　　　　　４．５　　　　　　　１
．３ゾロタミン硫酸処理　　　　　３．０　　　　　　
０，８ポリ−Ｄ−リジン処理　　　　６．５　　　　　
　　　１．８細胞マトリツクス　　　　　　７．５　　
　　　　　２．１異なる細胞群を使い、２．６Ｘ１０４
細胞を６０關のプレートに植える以外は、実験の詳細は
第２表と同様である。プレートはプロタミン硫酸または
ポリ−ローリジン（０，１９／ｍｅ）で処理した。

５分間インキュベートした後、プレートを殺菌水で２度
、培地で１度洗い、細胞をプレート移植した。

細胞マ）　ＩＪソックスｃｃＬ６細胞（ヒト腸、上皮）
を単層増殖させ、０，５％トリトンＸ−１００−水で処
理して調製した。１０分間インキュペー）した後プレー
トをＰＢ８で２度、培地で１度洗った。

この段階でプレートは細胞をプレート移植できる状態に
なる。

単位 酵素活性はＣＴＡ単位で表わされる。

酵素分析はＮＩＨ（米国）から入手した標準ウロキナー
ゼで検定した線維素プレート法（ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔ
ｅ　ｍｅｔ、ｈｏｄ　）によって行なった。

ｐ、ａ、生産に使用後の細胞の特徴 上記のごと＜　ｐ、ａ、生産に適応させたＩＭＲ−９０
型 の核分析を行なった。朱色体の通常の補体（２Ｎ＝４６
）は親の細胞株で報告されているのと同じ実験結果を示
した。１２日間ＬＨ培地でｐ、ａ、の生産に使われた細
胞を１０　％　ＦＣＢ含有生育培地に移し。

上記標準条件で増殖させた。細胞を１ケ月追跡したとこ
ろ、生育速度、集密（ｃｏｎｆｌｕｄｎｃｅ　）時の細
胞濃度および細胞の形態的外観は親のＩＭＲ−９０と同
じであった。ｐ、ａ、生産もまた通常細胞の程度に下っ
ていた。

ｗニー３８．ＨＢＬ−２９９などの細胞株の細胞でも同
様の結果が得られるので１本発明は、またそれら細胞株
によるｐ、ａ、の生産にも拡げられる。

【図面の簡単な説明】

粛１図は、Ｈａ培地で増殖したＩＭＲ−９０細胞による
ｐ、ａ、の生産を示す。細胞は馬血清（Ｈ８）含有培地
で継代第８番以後４継代増殖させた。 第２図は、　ＤＭＫＭ　／　Ｈａで種々の時間培養した
ＩＭＲ−９Ｑによるｐ、ａ、生産の経時変化を示す。 継代番号１２（セラ）−１）、継代番号１５（セット−
１）、継代番号２０（セット−１）、継代番号１４（セ
ラ）−２）、継代番号２０（セット−２）。 第３図は、　Ｈ８培地で増殖（、りＩＭＲ−９０＋ｍ胞
によるｐ、ａ、生産における培地置換の効果を示す。 １５継代（Ｈｅ　中６継代）ｇノＩＭＲ−９０ＭＩＩ胞
を２．５−のＨ８培地を含む６ｏ龍ペトリ皿に１×１０
５の割でプレート移植した。２４時間後に培地を」に変
えた。矢印で示した時間に、培地の半量または全量を各
プレートから採取し、新鮮ＬＨ培地と置換した。対照の
プレートで１００μｌの培地をｐ、ａ、分析の為に採取
し、新鮮ＬＨ培地と置換した。 ○は全培地置換、△は半培地置換、・は無培地置換を示
す。 第４図は、　ＦＣ，８培地で増殖したＩＭＲ−９３細胞
によるｐ、ａ、生産における培地量・換の効果乞示す。 ＦＣ８で９継代後のＩＭＲ−９細胞Ｑｐｃｓ含有培地２
酩を含む１６，４ｍｔｎのウェルにプレート移植した（
　５　Ｘ　１０４　）。２４時間後に培地をＬＨを含む
ものに替えて実験を続行した◎ ○は全培地置換、△は半培地置換、・は無培地置換を示
す。 第５図は、ｒｕＲ−９Ｑ細胞によるｐ、ａ、　＋７）連
続生産を示す。２３継代（Ｈ８培地で１３継代）後のＩ
ＭＲ−９０細胞２　Ｘ　１０５をＨ８含有培地２．５ｍ
ｌ　ｆ含む６０關ペトリ皿にプレート移植した。２４時
間後培地ｉＬＨに替え、その後矢印で示した時　　　間
に替えた。グループ１では各プレートの培地半分を採取
し、新鮮ＬＨ培地で置換した。グループ２では全培地を
採取した。１．２！Ｍの新鮮ＬＨ培地を細胞に加えた。 採取した培地はｐ、ａ、を吸着する為にシリカで処理し
、この培地１．２５７１１／ヲグループ２の各プレート
に返した。ｐ、ａ、活性を各時点一部の培地で測定した
。 ・はグループ１．○はグループ２を示″ｆ″。 代理人浅村　皓 外４名 手続補正書（方式） 昭和も２年〃　月〆身　日 特許庁長官殿 １、事件の表示 ３６補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 ５、補正命令の日付 昭和よ７年７０月２Δ　日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 図面の浄書　（内容に変更なし） ８、補正の内容　　別紙のとおり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）被覆を施すかまたは施していない表面に結分した
   二倍体線維芽細胞株を、血清含有培地中で多継代培養を
   行ない、そのようにして調整した細胞を培地中で培養し
   て、プラスミノ−ｒン賦活体（ｐ、ａ、　）を生産しつ
   いで培地からｐ　、ａ、を採取することを特徴とする。 ｐ、ａ、の製造法。 １２）二倍体線維芽細胞がｘＭＲ−９３，ｗＩ−３８ま
   たはＨｇＬ−２９９細ｆ＠株である。特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 （３）細胞を平板、薄板、ビーズその他の形状を有する
   被覆を施していない表面上で培養する１時計請求の範囲
   第１項または第２項記載の方法。 （４）　　ポリーＤ−リジン、プロタミン硫酸、ゼラチ
   ンまたは細胞マトリックスで被覆を施した表面上で培養
   して細胞を調整し、ついで被覆を施すかまたは施してい
   ない表面上で培養する。特許請求の範囲第１項から第３
   項のいずれか１項に記載の方法。 （５）馬血清（Ｈ８）含有培地で６〜１２日間培養して
   細胞を調整し１次いでラクトアルブミン加水分解物（Ｌ
   Ｈ）含有培地で培養をし、目的とするｐ、ａ、を得る。 特許請求の範囲第１項から第４項のいずれか１項に記載
   の方法。 （６）胎生子牛血清、豚血清、ヒト素状組織血清。 新生子牛血清、犬血清、山羊血清または鶏のひなの血清
   を含む培地で培養してｐ、ａ、を生産するように細胞を
   調整し１次いで適当な加水分解物を含む培地で培養して
   、目的のｐ、ａ、を得る。特許請求の範囲第１項から第
   ５項のいずれか１項に記載の方法。 （７）　　カゼイン加水分解物、　Ｄ、Ｍ、ペプトン・
   トリプトース・リン酸塩プロス、プレマトン−に′ｆ、
   たは他の市販同等物から選ばれるペプトンを含有する培
   地で培養してｈ　ｐ−ａ−生産を行なう、特許請求の範
   囲第６項記載の方法。 （８）　　生産されたｐ、ａ、を潅流によって培養物か
   ら連続的に取り除（、を臣肝請求の範囲第１項から第６
   項のいずれか１項に記載の方法。 ｆ９１　’ｐ、ａ、をシリカ上に吸桁させ、塩基と接触
   させて脱離させ１次いで常法により和製する特許請求の
   範囲第１項から第８項のいずれか１項に記載の方法。 口ω　培地をｐ、ａ、除去後再循環させる。ｌ臣許請求
   の範囲第１項に記載の方法。 αυ　実質的に前記したごとぎ、シラスずノーデン賦活
   体の製造法。 （Ｉり　特許請求の範囲第１〜１１項のいずれかの方法
   によって得られたシラスミノ−ｒン賦活体。