CN109295199A - Rap1b基因的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Rap1b基因的用途，即将Rap1b基因作为药物靶标应用在筛选抗Ⅰ型超敏反应药物中；本发明通过构建致敏剂C48/80诱导的P815肥大细胞体外过敏模型，发现Rap1b的敲除具有促进肥大细胞活化的作用，即Rap1b本身具有缓解肥大细胞在致敏状态下发生的脱颗粒反应，抑制类胰蛋白酶及β‑氨基己糖苷酶的释放，并阻遏炎症因子的合成及分泌，在mRNA水平上抑制炎症基因的表达；敲除Rap1b能够激活MAPK信号通路，促进AKT的磷酸化水平，即证实Rap1b在细胞内信号通路中具有抑制MAPK和AKT信号通路，为临床治疗Ⅰ型超敏反应提供理论依据和筛选新的药物靶点的应用。

Description

Rap1b基因的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及由肥大细胞活化而引起的Ⅰ型超敏反应靶向治疗抑制剂的筛选，即利用Rap1b基因作为药物靶标在筛选抗Ⅰ型超敏反应药物中的应用。
背景技术
过敏性疾病(变态反应性疾病)包括过敏性鼻炎、哮喘、结膜炎、湿疹、食物过敏等，是临床上的常见病、多发病，已被世界卫生组织(WHO)列为二十一世界重点防治的三大疾病之一，是当前世界性的重大卫生学问题。
据世界变态反应组织(WAO)统计，近30年间，过敏性疾病的发生率至少增加了4-5倍，且正以每年大于1％的速度增加。目前全球总患病率已达22％，预计在20年后，工业化国家50％的人口将患上过敏性疾病。2002年世界卫生组织估计全球大约有3亿过敏性哮喘患者，其中的50％患者生活在发展中国家，还有4亿多的过敏性鼻炎患者，并指出这类呼吸系统过敏性疾病是儿童最常见的慢性病。以哮喘为例，季节性过敏如不经治疗，25％-38％将发展为哮喘，最终成为慢性哮喘、肺气肿、肺心病，每年有超过18万人死于哮喘，于2005年更有约25万人因哮喘病而导致死亡。
肥大细胞是炎症反应中的主要效应细胞，在特异性抗原的刺激下，肥大细胞活化，并发生脱颗粒反应，其胞浆颗粒内含有多种生物活性物质，如组胺、肿瘤坏死因子、白三烯、前列腺素、血小板活化因子等，肥大细胞通过释放这些生物活性物质发挥其功能，促进炎症的发生发展。
目前，在治疗方面的耗费极高，全球仅抗变态反应(过敏)药物这一项的支出估计超过80亿美元；在欧洲每年用于治疗过敏性疾病的费用高达近40亿美元，其经济花费远远超过治疗结核病和艾滋病的总和；而我国过敏性疾病的发病率超过20％，治疗费用也占所有疾病系列的前列。
过敏性疾病已对人类的正常生活及生存造成了严重的威胁，对全世界的健康发展带来了巨大的阻碍。目前，临床上对过敏性疾病的治疗主要采取对症治疗法，如使用抗组胺药物和激素等以及过敏原特异性免疫疗法(Allergen-specific immunotherapy)，前者只能暂时缓解症状，而后者疗程较长，费用高，效果有时也不甚明显；因为，寻找一种高效低价、且能靶向治疗Ⅰ型超敏反应的抑制剂就显得尤为迫切。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种Rap1b基因的新用途，即利用Rap1b作为药物靶标在筛选抗Ⅰ型超敏反应药物，所述抗Ⅰ型超敏反应药物能够增加Rap1b基因的表达，从而能够有效抑制肥大细胞的脱颗粒程度，进而缓解由肥大细胞活化而引起的Ⅰ型超敏反应。
本发明通过分子生物学的方法，使用CRISP/Cas9技术成功在小鼠肥大细胞P815细胞株中敲除Rap1b蛋白基因；本发明利用CCK-8检测细胞增殖率和对致敏剂C48/80的敏感性，甲苯胺蓝染色检测肥大细胞脱颗粒程度，ELISA检测类胰蛋白酶的释放，显色法检测β-氨基己糖苷酶释放量，ELISA检测相关细胞因子的分泌，实时荧光定量PCR检测相关细胞因子在mRNA水平的表达情况，激光共聚焦及ELISA检测双信使系统的激活情况，Western Blot检测胞内相关信号通路关键蛋白的表达情况。通过上述实验研究Rap1b基因对P815细胞在Ⅰ型超敏反应过程中的生物学功能的影响，结果表明Rap1b的敲除具有促进肥大细胞活化的作用，即Rap1b可作为一种抗过敏蛋白，其表达具有有效抑制肥大细胞在致敏状态下的脱颗粒程度，缓解类胰蛋白酶及β-氨基己糖苷酶的释放，阻遏炎症因子TNF-a和IL-12的合成及分泌，在mRNA水平上，能够抑制炎症基因IL-5、TNF-α的表达，且在胞内信号通路中能够显著抑制MAPK信号通路，及抑制AKT的磷酸化水平，在细胞水平证实Rap1b蛋白具有一定的抗过敏作用，为临床治疗Ⅰ型超敏反应提供理论依据和筛选新的药物靶点的应用。
目前对于Rap1b在Ⅰ型超敏发生发展的作用研究还未见系统性的报道；本发明提供的应用，在Ⅰ型超敏反应发病机制中的作用进行了初步探究，为临床治疗过敏提供理论依据和筛选新的药物靶点的应用。
附图说明
图1-3是肥大细胞P815细胞敲除Rap1b的结果验证图；
图1-A为Rap1b敲除后蛋白水平的验证结果图，1-B为敲除Rap1b后肥大细胞的形态图；
图2为Rap1b敲除基因水平结果图；
图3显示基因测序为单峰；
图4是Rap1b对P815细胞增殖的影响(A图)以及致敏剂C48/80抑制P815细胞增殖的影响图(B图)，即表现为Rap1b KO细胞具有更强的细胞增殖能力，且对C48/80具有更高的敏感性及信号接收能力；
图5-6是Rap1b对P815细胞脱颗粒的影响图；
图5为P815WT和Rap1b KO在致敏剂C48/80处理0小时及2小时后用甲苯胺蓝染色检测细胞脱颗粒程度照片(A图)(此处每组细胞仅取一张视野图做图)以及图B细胞脱颗粒程度的统计柱状图(此处每组取四张视野图做统计学分析)；
图6为P815WT和Rap1b KO在致敏剂C48/80刺激后用ELISA法检测的类胰蛋白酶释放图(A图)，及显色法检测的β-氨基己糖苷酶释放图(B图)；
图7是Rap1b对肥大细胞在活化后相关细胞炎症因子分泌的影响图，显示为敲除Rap1b能促进促炎因子TNF-a(A图)、IL-12(B图)的分泌；
图8是Rap1b对肥大细胞在活化后相关抗炎因子分泌的影像图，显示为敲除Rap1b能抑制抗炎因子IL-13(A图)和IL-4(B图)的分泌；
图9是Rap1b对肥大细胞在活化后相关细胞炎症因子在mRNA水平上表达的影响图，显示为敲除Rap1b能促进炎症基因TNF-a(A图)及IL-5(B图)的表达；
图10是Rap1b对肥大细胞在活化后相关抗炎症因子在mRNA水平上表达的影响图，显示为敲除Rap1b能抑制炎症基因IL-13(A图)及IL-4(B图)的表达；
图11-12是Rap1b对C48/80刺激肥大细胞激活双信使系统的影响图；
图11显示为敲除Rap1b能促进胞内IP3(A图)和DAG水平(B图)；
图12显示为敲除Rap1b能促进胞内钙离子水平(A图)，并激活PKC的表达(B图)；
图13是Rap1b对P815黏附能力的影响图，A图为敲除Rap1b细胞的黏附能力结果，B图为钙粘附蛋白E表达量结果；
图14是Rap1b对肥大细胞活化通路中相关蛋白表达的影响图；图A显示为敲除Rap1b能显著促进MAPK信号通路，并提高AKT的磷酸化水平。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，实施例中所使用的试剂均为市场常规购得，所使用的代码或缩写均为本领域技术人员公知的，如C48/80、CCK-8、Trizol、SDS-PAGE、TBST等。
本发明中，Rap1b基因作为肥大细胞活化抑制基因，在筛选Ⅰ型超敏反应靶向治疗抑制剂中的应用，所述抗过敏抑制剂优选为促进Rap1b编码基因表达的激动剂。
本发明中，为了验证所述药物靶标的作用，构建基因敲除细胞模型(记为细胞Rap1b-KO模型)。所述基因敲除细胞模型的方法，包括以下步骤：
A.设计Rap1b编码基因抑制剂gRNA的DNA寡核苷酸片段的正反向序列；
B.将设计得到的正反向序列进行磷酸化，得到双链片段；
C.将所述双链片段连接至质粒载体中，得到连接产物；
D.将所述连接产物进行纯化；
E.将纯化后的连接产物转染至肥大细胞P815细胞中，检测基因和蛋白的表达结果。
本发明中，所述设计抑制剂的DNA寡核苷酸片段的正反向序列用软件没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的设计软件即可。本发明实施例中，采用麻省理工学院的CRISPR Design进行设计。所述CRISPR Design网址：http://crispr.mit.edu/。
本发明中，抑制剂的DNA寡核苷酸片段的正反向序列的长度优选为18～22bp。所述正反向序列优选在5’端添加上粘性末端序列，所述粘性末端序列优选为CACC或AAAC。在正反向序列的5’端添加上粘性末端序列有利于后期与质粒易于连接。
本发明中，将设计得到的DNA正反向序列进行磷酸化使人工合成的DNA正反向序列形成双链结构。所述磷酸化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的磷酸化方法即可。
本发明对所述连接的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的连接方案即可。
本发明中，所述纯化是将所述连接产物中存在的未连接在载体上的DNA寡核苷酸片段的正反向序列进行线性化。本发明对所述线性化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的线性化的方法即可。
本发明中，转染的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的转染方案即可。本发明实施例中，转染采用vefactor进行转染。所述肥大细胞优选传代10代以内的细胞。所述肥大细胞在平时培养时，密度优选低于超过80％，当转染时，细胞的密度优选为70％～80％。
本发明中，转染后优选培养48小时后筛选阳性细胞克隆；所述培养优选在细胞培养基中添加0.8μg/mL的嘌呤霉素；所述阳性克隆的筛选方法依次包括单克隆形成、多克隆细胞淘汰、Western Blot法、PCR法及基因测序法检测这些细胞克隆的基因敲除情况。本发明中，所述多克隆细胞淘汰和Western Blot实验没有特殊限制，采用本领域所熟知的方案即可。
本发明中，所述PCR法的扩增引物为F:AGCTGGTATCTTGTACCTCCCA和R:CATCATCAGTGTCTTTAACCCG。
所述扩增程序为：
4℃保存
当细胞中不能准确扩增所述Rap1b编码基因片段，同时野生型对照组细胞扩增得到目的Rap1b编码基因片段时，说明构建成功基因敲除细胞模型。
下面将结合实施例对本发明提供的Ⅰ型超敏反应靶向治疗的抑制剂及Rap1b作为药物靶标在筛选抗过敏的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：构建能发挥对靶基因进行编辑的质粒转染至细胞，使在细胞中发挥作用，进而筛选出Rap1b敲除的细胞系，用于后续实验；
(1)质粒构建
A、设计和合成gRNA
设计一对20bp左右的gDNA，我们可以通过以下在线工具设计：麻省理工学院的CRISPRDesign：http：//crispr.mit.edu/；设计靶向Rap1b编码基因的gRNA序列，具体如下表所示：
表1：gRNA-Rap1b核酸序列
注：小写部分是与质粒相连接的核酸序列；
B、将sgRNA克隆至pSpCas9(BB)质粒
①将每条gRNA溶解至终浓度100μM，按照以下配方对sgRNA进行磷酸化和退火；
成分 用量(μL)
sgRNA正向序列(100μM) 1
sgRNA反向序列(100μM) 1
T4连接缓冲液10× 1
T4PNK 1
水 6
共计 10
②将上述混合物放置PCR仪中，利用以下程序对sgRNA进行磷酸化和退火：37℃30分钟，95℃5分钟，然后以5℃/分钟降至25℃；
③将上述已经磷酸化和退火的产物按1∶200进行稀释，即取1μL加199μL的PCR水；
④按照以下配方将上述稀释的产物与载体进行连接
成分 用量(μL)
pSpCas(BB)质粒 100ng
上一步稀释产物(200倍稀释) 2
Tango缓冲液，10× 2
DTT，10mM 0.5
ATP，10mM 0.4
BbsI 0.5
T7连接酶 0.5
水 13.28
共计 20
⑤将上述混合物放在PCR仪中，按照以下程序进行连接反应
循环数 条件
6 37℃5分钟，21℃5分钟
⑥利用PlasmidSafe核酸酶来处理连接产物，将一些线性化的DNA水解掉；具体反应体系如下：
成分 用量(μL)
上一步连接产物 11
PlasmideSafe缓冲液，10X 1.5
ATP，10mM 1.5
PlasmideSafe核酸酶 1
共计 15
⑦将PlasmidSafe反应体系放在PCR仪中：先37℃30分钟，再70℃30分钟，然后取上述2μL产物来转染大肠杆菌(DH5α)，挑单克隆，抽提质粒，测序等，测序所用的引物为U6启动子通用序列。
(2)肥大细胞系P815细胞的培养及传代
A、P815细胞的培养：P815培养于高糖DMEM培养基，含10％胎牛血清(FBS)，1％青链霉素，培养于37℃、5％CO2环境中；
B、P815细胞的传代：待步骤A中细胞密度达到80％时，需进行传代，收集培养瓶中的细胞培养液于离心管中，预热的磷酸缓冲盐溶液漂洗三次，加入适量胰蛋白酶，待细胞完全消化后，加入细胞培养液中和胰蛋白酶，并吹打均匀，800rpm离心3分钟，去掉上清液，加入新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞，按照1:4的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5％CO2环境中继续培养。
(3)用脂质体转染法将构建成功的质粒转染至P815细胞并筛选单克隆细胞
A、铺板：取步骤(1)中状态较好的P815细胞，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜高糖DMEM培养基(不加抗生素)吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔2mL的量均匀铺于6孔板，37℃、5％CO2培养24小时；
B、细胞转染：转染时细胞密度最好能达到70-80％，可用vefactor来转染测序正确的1000ngpSpCas9(sgRNA)，同时另外转染未连接sgRNA的pSpCas9作为阴性对照，转染后6小时更换为正常培养基；
C、加嘌呤霉素筛选细胞：转染24h后，将6孔板中的细胞消化下来转移至150mm大皿中，继续培养24小时后加入嘌呤霉素(终浓度为0.8μg/mL的)进行阳性细胞克隆的筛选，每4天更换一次含嘌呤霉素的培养基，直至大皿中长出单克隆；
D、挑单克隆并扩培：待单克隆长好之后，取出大皿，吸除大量培养基，用10μL的枪头吸取少量胰酶，在单克隆上轻轻吹打使单克隆细胞消化下来，转移至24孔板，37℃、5％CO2继续培养，等24孔板中的细胞长到60％左右，消化下来转移至6孔板，继续培养。
(3)单克隆细胞的验证
A、用Western Bolt法检测上述细胞克隆的基因敲除情况
①用洗涤精把玻璃板洗干净，再用去离子水冲洗，然后将玻璃板置于烘箱中至烘干；
②配胶：配分离胶和浓缩胶，先配分离胶，配完分离胶后要加95％的分析纯乙醇液封，大约500μL；等分离胶充分凝固后，再配浓缩胶，根据样品数，选择合适孔的梳子插入收缩胶中；
③上样：将凝胶板放到电泳槽中，倒入适量的1×电泳Buffer，然后小心缓慢地拔去梳子，将准备好的蛋白样品以及蛋白Marker加入SDS-PAGE凝胶的各泳道中；
④电泳：打开电源，电泳条件为U＝80V，电泳大约30分钟；然后将电压调至120V，电泳约1.5小时；
⑤转膜：预先配好1×转膜液，放入4℃预冷。转膜用的装置需提前洗干净。胶板从电泳槽中取出后，先切去浓缩胶。转膜前将聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)浸泡于甲醇中，待其浸透无白点时，才可放入转膜液中进行转膜。打开转膜用具，黑板朝下，放上一块棉垫，加三张滤纸(6×8厘米)，每一步都需赶走气泡，将凝胶放在滤纸上，对整齐，加PVDF膜，赶气泡，再加三张滤纸，最后再放另一块棉垫，然后整齐的拿出三明治，放到电泳槽中，转膜条件为根据具体显影的蛋白决定；
⑥封闭：用5％的脱脂牛奶(1×TBST配用)封闭，转膜结束后，将PVDF膜放入封闭盒中，加入适量的5％脱脂牛奶，室温摇床上2小时；
⑦孵育一抗：5％的脱脂牛奶(1×TBST配用)作为配置液，按比例加入Rap1b的一抗，将封闭完成的膜剪成条状，用镊子将膜放入孵育盒中，加入配制好的一抗，置于摇床上，4℃过夜孵育；
⑧孵育二抗：取出PVDF膜，一抗回收保存在-20℃，将膜放在盒中置于摇床上，用1×TBST漂洗3次，每次5分钟；将PVDF膜放入装有对应二抗(羊)盒子中，保证抗体与膜充分接触，放在摇床上，室温孵育60分钟；
⑨化学发光仪显影：二抗孵育完成后，取出PVDF膜，用1×TBST漂洗3次，每次5分钟；漂洗后将PVDF膜浸泡于配制好的发光底物中，放入化学发光仪，调好曝光时间进行显影，观察目的蛋白(Rap1b)是否被敲除干净；
B、挑出Western Blot验证成功的细胞株进行基因测序，在基因水平验证Rap1b编码基因的敲除情况
①设计验证引物：引物F：AGCTGGTATCTTGTACCTCCCA，引物R：CATCATCAGTGTCTTTAACCCG，所扩增的片段涵盖了gRNA打靶的位点。
②PCR反应混合液组分如下：
名称 体积(μL)
GXL酶 0.8
Rap1b引物F(10μM) 0.4
Rap1b引物R(10μM) 0.4
cDNA 0.4
dNTPs 1.6
水 9.9
5×缓冲液 4.0
40％甘油 2.5
共计 20.0
③扩增Rap1bPCR反应条件如下：
④将获得的产物送测序并将敲除组的序列与野生型P815-WT细胞序列比对，将成功基因敲除的细胞记为Rap1bKO；
实验结果：利用Crispr Cas9技术敲除肥大细胞P815细胞中的Rap1b，并通过Western Blot的方法和基因测序的方法验证Rap1b的敲除情况；图1-A为利用Western Blot技术检测的敲除Rap1b在蛋白水平上的结果图，1-B是在倒置显微镜中拍摄的细胞形态图，发现P815WT细胞为不规则形态，而Rap1b KO细胞呈现圆形，形态规则；图2为敲除Rap1b在基因水平上的结果图；图3为基因测序的峰图，显示为单峰；结果表明，Rap1b蛋白已经敲除干净，在P815细胞中不再表达。CRISPR Cas9系统通过gRNA序列的引导结合于指定的基因组序列上，并由Cas9酶造成该序列附近的基因组DNA双链切口，细胞便启动非同源重组修复方式，伴随对基因组DNA的随机增删，造成基因组DNA片段缺失17个碱基(上：P815WT；下：Rap1bKO)，并产生移码突变，且为单峰，最终导致Rap1b蛋白的缺失，即KO细胞系构建成功，可以利用该细胞系继续开展功能性试验。
实施例2
肥大细胞的增值速率对细胞整体的脱颗粒水平有着一定的影响，且肥大细胞致敏剂C48/80能诱导肥大细胞活化脱颗粒，脱颗粒程度与肥大细胞接受C48/80致敏信号的能力具有一定的相关性。为验证Rap1b对肥大细胞增殖及接受C48/80信号具有何种影响，我们采用CCK-8实验检测P815WT和Rap1b KO细胞的增值率及在C48/80(10μg/mL)诱导下的细胞增殖抑制率，具体步骤如下：
(1)肥大细胞系P815WT和Rap1b KO细胞的培养及传代
A、P815WT和Rap1b KO细胞的培养：P815培养于高糖DMEM培养基，含10％胎牛血清(FBS)，1％青链霉素，培养于37℃、5％CO2环境中；
B、P815WT和Rap1b KO细胞的传代：待步骤A中细胞密度达到80％时，需进行传代，收集培养瓶中的细胞培养液于离心管中，预热的磷酸缓冲盐溶液漂洗三次，加入适量胰蛋白酶，待细胞完全消化后，加入细胞培养液中和胰蛋白酶，并吹打均匀，800rpm离心3分钟，去掉上清液，加入新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞，按照1:4的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5％CO2环境中继续培养。
(2)CCK-8检测Rap1b对肥大细胞增殖率的影响
A、细胞铺板：步骤(1)P815细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，用细胞计数的方法调整细胞密度至1×105个/mL，以每孔100μL的量均匀铺于96孔板，P815WT和Rap1b KO细胞均铺4个实验组，分别为对照组和加C48/80刺激后1天、2天、3天，每组3个复孔，37℃、5％CO2培养24小时；
B、加入CCK-8溶液：在对应的时间点加入CCK-8溶液，每孔加入10μL，37℃、5％CO2孵育2小时；
D、吸光度(OD值)的测定：使用酶标仪在630nm和490nm测量各孔的吸光度，分析数据并作图。
(2)CCK-8检测C48/80对肥大细胞P815WT和Rap1b KO的细胞增殖抑制率
A、细胞铺板：步骤(1)P815细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，用细胞计数的方法调整细胞密度至1×105个/mL，以每孔100μL的量均匀铺于96孔板，P815WT和Rap1b KO细胞均铺4个实验组，分别为对照组和加C48/80刺激后1天、2天、3天，每组3个复孔，37℃、5％CO2培养24小时；
B、C48/80处理细胞：配制含10μg/mL的C48/80的培养基，吸走原有培养基，加入新配的含C48/80培养基，对照组更换为不含C48/80的培养基，37℃、5％CO2孵育24小时；
C、加入CCK-8溶液：更换对应培养基后，对照组每孔加入孔加入CCK-8溶液10μL，37℃、5％CO2孵育2小时；其他孔根据实验设置，在对应的时间加入CCK-8溶液进行吸光度测定；
D、吸光度(OD值)的测定：使用酶标仪在630nm和490nm测量各孔的吸光度，分析数据并作图。
实验结果：如图4所示，敲除Rap1b显著促进了肥大细胞的增殖速率。C48/80对肥大细胞的增殖具有一定抑制作用，CCK-8检测结果表明C48/80对肥大细胞的抑制作用在两天后达到最大值，将肥大细胞中的Rap1b蛋白成功敲除后，C48/80对细胞的增殖抑制率在两天后明显增加，说明Rap1b KO细胞对C48/80的敏感性增强，认为其接受C48/80信号的能力显著提升。因此，Rap1b的敲除可能对肥大细胞的活化具有一定的促进能力。
实施例3
肥大细胞的脱颗粒程度直接反应了机体发生过敏反应的状况，细胞中预先合成的颗粒介质中包含类胰蛋白酶、β-氨基己糖苷酶等物质，这些物质均可作为肥大细胞脱颗粒标志物。为了验证Rap1b对肥大细胞活化脱颗粒的影响，本实验使用甲苯胺蓝染色法、ELISA法以及显色法进行检测，具体步骤如下：
(1)肥大细胞系P815WT和Rap1b KO细胞的培养及传代
A、P815WT和Rap1b KO细胞的培养：P815培养于高糖DMEM培养基，含10％胎牛血清(FBS)，1％青链霉素，培养于37℃、5％CO2环境中；
B、P815WT和Rap1b KO细胞的传代：待步骤A中细胞密度达到80％时，需进行传代，收集培养瓶中的细胞培养液于离心管中，预热的磷酸缓冲盐溶液漂洗三次，加入适量胰蛋白酶，待细胞完全消化后，加入细胞培养液中和胰蛋白酶，并吹打均匀，800rpm离心3分钟，去掉上清液，加入新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞，按照1:4的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5％CO2环境中继续培养。
(2)甲苯胺蓝染色法检测Rap1b对肥大细胞活化脱颗粒程度的影响
A、细胞铺板：P815WT和Rap1b KO细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔500μL的量均匀铺于24孔板，37℃、5％CO2培养24小时；
B、C48/80处理细胞：实验组加入C48/80母液，使其终浓度为10μg/mL，阴对照孔不做处理，37℃、5％CO2孵育1.5小时；
C、甲苯胺蓝染色法测定肥大细胞活化脱颗粒程度：将各孔的细胞及细胞悬液小心收集于EP管中，离心后将各组细胞上清转移至新的EP管中，上清液-80℃保存，用于之后的ELISA检测类胰蛋白酶释放量；留于管底的细胞沉淀用1×PBS润洗后离心，吸除上清，加入200μL 4％的多聚甲醛进行固定，30分钟后离心，小心吸除全部的多聚甲醛溶液，用枪头吸取15μL 1×PBS混匀细胞沉淀，将细胞悬液均匀涂于干净的玻片上，待完全晾干后加入5％的甲苯胺蓝溶液对细胞进行染色15分钟；染色完成后将细胞置于显微镜下观察，每组细胞分别选取4个视野进行拍照，并计算细胞脱颗粒程度；染色不均、胞膜边界不清，胞膜外有颗粒物质存在的细胞认为是发生脱颗粒的细胞。
(3)ELISA法检测Rap1b对肥大细胞活化脱颗粒释放类胰蛋白酶的影响
A、细胞铺板：P815WT和Rap1b KO细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔500μL的量均匀铺于24孔板，37℃、5％CO2培养24小时；
B、C48/80处理细胞：实验组加入C48/80母液，使其终浓度为10μg/mL，阴对照孔不做处理，37℃、5％CO2孵育2小时；
C、样品的收集：将各孔的细胞及细胞悬液小心收集于EP管中，4℃环境下，3000g离心15分钟，将各组细胞上清转移至新的EP管中；
D、ELISA法测定细胞上清中的类胰蛋白酶含量：实验前先将试剂盒从冷藏环境中取出，在室温平衡20分钟后再进行使用；
①标准孔的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
②加样：分别设置空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
③加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外；
④温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟；
⑤配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用；
⑥洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
⑦显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
⑧终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
⑨测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定在加终止液后15分钟以内进行。
(4)显色法检测Rap1b对肥大细胞活化脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶的影响
A、细胞铺板：P815WT和Rap1b KO细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔500μL的量均匀铺于24孔板，37℃、5％CO2培养24小时；
B、C48/80处理细胞：实验组加入C48/80母液，使其终浓度为10μg/mL，阴对照孔不做处理，37℃、5％CO2孵育1.5小时；
C、显色法测定β-氨基己糖苷酶：将各孔的细胞及细胞悬液小心收集于EP管中，离心后将各组细胞上清转移至新的EP管中，吸取50μL于96孔板，设置3个复孔，每孔加入50μL的1×对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(PNP-NAG)，37℃孵育1小时，1小时后，每孔加入100μL碳酸钠缓冲液终止反应，使用酶标仪在405nm处测定各孔的吸光度，分析数据并作图；
实验结果：Rap1b的敲除能促进肥大细胞的脱颗粒程度；其中，如图5所示，用C48/80(10μg/mL)刺激肥大细胞，诱导其发生脱颗粒反应，A图为细胞脱颗粒的照片，每组分别从4个视野图中选择一个作图，对应标记如图所示；B图是对脱颗粒细胞进行计数并统计后作出的图。结果表明，Rap1b的敲除能加重肥大细胞的脱颗粒程度，与野生型肥大细胞具有显著性差异。图6表示为Rap1b的敲除能促进肥大细胞脱颗粒后类胰蛋白酶和β-氨基己糖苷酶的释放，即Rap1b基因本身具有抑制肥大细胞活化的作用。
实施例4
C48/80诱导肥大细胞活化产生多种细胞因子并分泌于细胞外，如促炎症因子TNF-a、IL-12等，以及作为抗炎因子的IL-13和IL-4，从而影响过敏反应的发生；本实验通过ELISA的方法来检测Rap1b对P815细胞活化后相关细胞因子TNF-a、IL-12、IL-13及IL-4分泌的影响，具体步骤如下：
(1)肥大细胞P815WT和Rap1b KO细胞的培养及传代
A、P815WT和Rap1b KO细胞的培养：细胞培养于高糖DMEM培养基，含10％胎牛血清，1％青链霉素，培养于37℃、5％CO2环境中；
B、P815WT和Rap1b KO细胞的传代：待步骤A中细胞密度达到80％时，需进行传代，收集培养瓶中的细胞培养液于离心管中，预热的磷酸缓冲盐溶液漂洗一次，加入适量胰蛋白酶，待细胞完全消化后，加入细胞培养液中和胰蛋白酶，并吹打均匀，800rpm离心3分钟，去掉上清液，加入新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞，按照1:4的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5％CO2环境中继续培养。
(2)ELISA法检测Rap1b对P815细胞活化后相关细胞因子L-1β、IL-12分泌的影响
A、细胞铺板：P815WT和Rap1b KO细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔2mL的量均匀铺于6孔板，设置阴对照组及实验组，37℃、5％CO2培养24小时；
B、C48/80刺激细胞：除阴对照孔以外，其余各孔加入C48/80母液，使其终浓度为10μg/mL，刺激24小时；
C、样品的收集：将各孔的细胞及细胞悬液小心收集于EP管中，4℃环境下，3000g离心15分钟，将各组细胞上清转移至新的EP管中；
D、ELISA法测定细胞因子TNF-a、IL-12、IL-13及IL-4，实验前先将试剂盒从冷藏环境中取出，在室温平衡20分钟后再进行使用；
①标准孔的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
②加样：分别设置空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作相同)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释为5倍)，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
③温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
④洗涤：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
⑤加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外；
⑥温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
⑦洗涤：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用，小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
⑧显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
⑨终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)；
⑩测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定在加终止液后15分钟以内进行；
实验结果：如图7所示，Rap1b的敲除能具有促进肥大细胞合成并分泌促炎症因子TNF-a及IL-12，图8所示，Rap1b的敲除在一定程度上能抑制肥大细胞合成并分泌抗炎因子IL-13及IL-4，进一步发挥胞内的促过敏反应，即Rap1b能在胞内发挥抗过敏作用。
实施例5
肥大细胞在C48/80的作用下能在mRNA水平上激活多种细胞因子，如TNF-α、IL-5、IL-13及IL-4等的表达，进而影响过敏反应的发生，；本实验通过实时荧光定量PCR的方法来检测Rap1b对P815细胞活化后相关细胞因子TNF-α、IL-5、IL-13及IL-4在mRNA水平表达的影响，具体步骤如下：
(1)肥大细胞P815WT和Rap1b KO细胞的培养及传代
A、P815WT和Rap1b KO细胞的培养：细胞培养于高糖DMEM培养基，含10％胎牛血清，1％青链霉素，培养于37℃、5％CO2环境中；
B、P815WT和Rap1b KO细胞的传代：待步骤A中细胞密度达到80％时，需进行传代，收集培养瓶中的细胞培养液于离心管中，预热的磷酸缓冲盐溶液漂洗一次，加入适量胰蛋白酶，待细胞完全消化后，加入细胞培养液中和胰蛋白酶，并吹打均匀，800rpm离心3分钟，去掉上清液，加入新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞，按照1:4的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5％CO2环境中继续培养。
(2)实时荧光定量PCR技术检测Rap1b对P815细胞活化后相关细胞因子TNF-α、IL-5、IL-13及IL-4在mRNA水平表达的影响
A、细胞铺板：P815WT和Rap1b KO细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔2mL的量均匀铺于6孔板，设置阴对照组及实验组，37℃、5％CO2培养24小时；
B、C48/80刺激细胞：除阴对照孔以外，其与各孔加入C48/80母液，使其终浓度为10μg/mL，刺激16小时；
C、RNA抽提：轻缓吹打细胞使贴壁部分的细胞悬浮，收集全部细胞悬液于2.0mL EP管中，离心去上清，每孔加入1mL Trizol，颠倒混匀10下，室温静置5分钟后，每1mL Trizol中加入0.2mL氯仿(Trizol：氯仿＝5:1)，盖紧样品管盖，上下颠倒10下使其充分混匀，再室温静置5分钟，于4℃环境下，12000rpm离心15分钟，管内液体出现分层，将上层水相转入新的1.5mL EP管中(约400μL)，加入等量(400μL)异丙醇，颠倒混匀后室温静置10分钟，于4℃环境下，12000rpm离心10分钟，小心倒去掉上清，留取沉淀，每管加入1mL现配的75％的乙醇(预冷)振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rpm低温离心5分钟，小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干(约30分钟)，再在管中加20μL的DEPC水溶解沉淀；
D、反转录：
①在PCR小管中配制下列体系(冰上操作)：
②反应条件：65℃×5分钟，立即置于冰水上，至少1分钟；
③取出PCR小管，配制下一步体系(冰上操作)：
④反应条件：25℃×5分钟，42℃×60分钟，70℃×5分钟；
E、实时荧光PCR反应：
①引物：
TNF-a-F(5’-3’) AAACTGCAGCAAGACCGTGA
TNF-a-R(5’-3’) CCACCGGGATACTGACAGAC
IL-5-F(5’-3’) CTCTGTTGACAAGCAATGAGACG
IL-5-R(5’-3’) TCTTCAGTATGTCTAGCCCCTG
IL-13-F(5’-3’) AAACTGCAGCAAGACCGTGA
IL-13-R(5’-3’) CCACCGGGATACTGACAGAC
IL-4-F(5’-3’) TCACTGACGGCACAGAGCTA
IL-4-R(5’-3’) CCTTCTCCTGTGACCTCGTT
actin-F(5’-3’) GCTACAGCTTCACCACCACAG
actin-R(5’-3’) GGTCTTTACGGATGTCAACGTC
②反应体系：
③反应条件：预变性95℃×10分钟，其循环条件为95℃×10秒，60℃×10秒，72℃×15秒，共40个循环。
实验结果：用C48/80(10μg/mL)刺激P815WT及Rap1b KO细胞16小时，促使细胞中相关因子TNF-α、IL-5、IL-13及IL-4的转录，通过实时荧光定量PCR技术检测上述mRNA的表达量；如图9、10所示，敲除肥大细胞中Rap1b能促进炎症基因TNF-a、IL-5在mRNA水平表达的作用，并减少抗炎因子IL-13和IL-4的表达，从而引起一系列炎症反应，对该细胞的活化发生超敏反应有一定的促进作用，即Rap1b基因具有一定的抗过敏作用，与对照组差异显著。
实施例6
现有研究表明肥大细胞脱颗粒的过程包括囊泡的转运、定向、锚定、融合等环节，该过程的早期阶段是细胞内信号的传递，钙离子水平的升高等阶段。细胞内钙离子浓度的改变是肥大细胞激活的重要第二信使途径，通过其浓度的时空变化，把胞外信号传递到胞内，控制肥大细胞的活化过程。研究报道该过程中有双信使信号系统的参与，引发IP3/Ca2+和DAG/PKC两条信号转导途径。IP3是胞内钙库钙释放的诱发信号，IP3合成受抑制就会影响胞内钙库的钙释放，从而影响钙信号的形成。DAG信号调控着胞内PKC信号，从而影响细胞内下游信号的传递；本实验通过ELISA法检测肥大细胞接受胞外信号使PIP2转化成的IP3和DA的含量，以及采用激光共聚焦法检测胞内钙离子水平、Western Blot检测PKC在细胞中的表达水平来研究Rap1b对肥大细胞双信使系统激活的影响。具体步骤如下：
(1)肥大细胞P815WT和Rap1b KO细胞的培养及传代
A、P815WT和Rap1b KO细胞的培养：细胞培养于高糖DMEM培养基，含10％胎牛血清，1％青链霉素，培养于37℃、5％CO2环境中；
B、P815WT和Rap1b KO细胞的传代：待步骤A中细胞密度达到80％时，需进行传代，收集培养瓶中的细胞培养液于离心管中，预热的磷酸缓冲盐溶液漂洗三次，加入适量胰蛋酶，待细胞完全消化后，加入细胞培养液中和胰蛋白酶，并吹打均匀，800rpm离心3分钟，去掉上清液，加入新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞，按照1:4的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5％CO2环境中继续培养。
(2)ELISA法检测Rap1b对肥大细胞接受胞外信号使PIP2转化成的IP3和DAG能力的影响
A、细胞铺板：P815WT和Rap1b KO细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去除上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔2mL的量均匀铺于6孔板，设置阴对照组及实验组，37℃、5％CO2培养24小时。24小时后，每孔加入1.5mL不含胎牛血清的高糖DMEM培养基对细胞做饥饿处理，处理时间为12小时；
B、C48/80刺激细胞：将各孔细胞及细胞悬液收集于1.5mL EP管中，实验组加入C48/80母液，使其终浓度为10μg/mL，37℃孵育2分钟；
C、裂解细胞获取胞内IP3和DAG：C48/80孵育细胞2分钟后，迅速将EP管置于4℃离心机中高速离心。离心后置于冰上，吸尽全部培养基，每管加入100μL RIPA裂解液(含PMSF)，冰上裂解15分钟，期间高速涡旋震荡5次，裂解完成后，4℃高速离心收集上清液，用于ELISA测定；
D、ELISA法测定胞内IP3和DAG含量：实验前先取出试剂盒于室温平衡20分钟；具体方法与ELISA检测类胰蛋白酶一致。
(3)激光共聚焦检测Rap1b对肥大细胞接受刺激后胞内钙离子水平的影响
A、细胞铺板：P815WT和Rap1b KO细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去除上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔2mL的量均匀铺于激光共聚焦专用的玻底小皿中，37℃、5％CO2培养24小时；
B、利用激光共聚焦进行胞内钙离子水平变化的检测：取镜下状态良好的细胞，用1XPBS清洗3次，换掉培养基，以荧光染料Fluo-3AM(激发波长和发射波长分别为488nm和526nm)负载，该染料具有荧光选择性强、自身无荧光，只有进入细胞内与游离钙结合后才发出荧光。将细胞置于37℃条件下孵育30分钟；负载结束后，用1XPBS洗去细胞外多余染液，加入一定量的1×PBS，将培养皿置于共聚焦显微镜载物台上，选择镜下细胞分布均匀、染色良好的视野，设定基础荧光强度值，观察基线一段时间后，加入C48/80，继续观察60秒，获得连续[Ca2+]i的动态变化；
(4)Western BlotJ检测细胞内PKC的表达情况
A、细胞铺板：P815WT和Rap1b KO细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去除上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔2mL的量均匀铺于6孔板中，37℃、5％CO2培养24小时；
B、用肥大细胞生长因子(SCF，10ng/mL)处理6孔板中实验组细胞24小时；
C、细胞处理24小时后，采用Western Blot的方法检测细胞中的PKC表达情况。Western Blot的实验方法同实施例1中的操作步骤一致。
实验结果：如图11-A、B所示，通过ELISA法检测胞内IP3和DGA含量，显示Rap1b的敲除能促进PIP2分解产生的两个胞内第二信使IP3和DAG的含量，即激活了胞内的双信号途径。在检测胞内钙离子方面，如图12-A所示，我们使用的激光共聚焦可以实时获每个时间点的静态图片、整个实验中细胞内荧光强度的连续动态记录，在处理后可以得到每一时间点的灰度值，将其转为Excel数据；结果显示，相对于野生型细胞而言，敲除细胞中Rap1b能促进肥大细胞内质网释放Ca2+，显著提高胞内钙离子水平；如图12-B所示，敲除Rap1b促进胞内的PKC表达水平，认为更大程度地激活PKC信号，从而促进肥大细胞的颗粒囊泡移向胞浆膜并释放炎症介质类胰蛋白酶、β-氨基己糖苷酶等，即Rap1b基因对肥大细胞的活化发生超敏反应有一定的缓解作用。
实施例7
P815肥大细胞属于半悬浮细胞，本实验利用CCK-8法检测肥大细胞黏附与平板的能力，并用Western Blot检测钙粘附蛋白E的表达情况，来确定Rap1b对肥大细胞黏附能力及迁移能力的影响，
(1)肥大细胞系P815WT和Rap1b KO细胞的培养及传代
A、P815WT和Rap1b KO细胞的培养：P815培养于高糖DMEM培养基，含10％胎牛血清(FBS)，1％青链霉素，培养于37℃、5％CO2环境中；
B、P815WT和Rap1b KO细胞的传代：待步骤A中细胞密度达到80％时，需进行传代，收集培养瓶中的细胞培养液于离心管中，预热的磷酸缓冲盐溶液漂洗三次，加入适量胰蛋白酶，待细胞完全消化后，加入细胞培养液中和胰蛋白酶，并吹打均匀，800rpm离心3分钟，去掉上清液，加入新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞，按照1∶4的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5％CO2环境中继续培养。
(2)CCK-8检测Rap1b对肥大细胞帖壁能力的影响，即检测其黏附能力
A、细胞铺板：步骤(1)P815细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，用细胞计数的方法调整细胞密度，使P815WT和Rap1b KO细胞数量保持一致，以每孔500μL的量均匀铺于24孔板，37℃、5％CO2培养24小时；
B、贴壁细胞转移至96孔板细胞培养24小时后，取出细胞板，小心吸除细胞上清，即带走全部的悬浮细胞，PBS清洗细胞2遍。将帖壁细胞用少量胰酶进行消化，并用培养基重悬，均匀铺于96孔板，每孔100μL，37℃、5％CO2培养2小时待细胞状态稳定。
C、加入CCK-8溶液：每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃、5％CO2孵育2小时；
D、吸光度(OD值)的测定：使用酶标仪在630nm和490nm测量各孔的吸光度，分析数据并作图。
(3)Western Blot检测P815WT和Rap1b KO细胞表达钙粘附蛋白E的情况
A、细胞铺板：P815WT和Rap1b KO细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去除上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔2mL的量均匀铺于6孔板中，37℃、5％CO2培养24小时；
B、用肥大细胞生长因子(SCF，10ng/mL)处理6孔板中细胞0、12、24小时；
C、细胞处理完成后，采用Western Blot的方法检测细胞中的钙粘附蛋白E 表达情况。Western Blot的实验方法同实施例1中的操作步骤一致。
实验结果：如图13所示，敲除Rap1b细胞的贴壁能力明显减弱，大部分变成悬浮细胞(A图)，且细胞内的钙粘附蛋白E表达量显著降低(B图)，认为其具有更强的迁移能力。
实施例8
检测Rap1b对引起肥大细胞活化的MAPK信号通路及AKT信号通路的影响，具体步骤如下：
(1)肥大细胞P815WT和Rap1b KO细胞的培养及传代
A、P815WT和Rap1b KO细胞的培养：细胞培养于高糖DMEM培养基，含10％胎牛血清，1％青链霉素，培养于37℃、5％CO2环境中；
B、P815WT和Rap1b KO细胞的传代：待步骤A中细胞密度达到80％时，需进行传代，收集培养瓶中的细胞培养液于离心管中，预热的磷酸缓冲盐溶液漂洗三次，加入适量胰蛋白酶，待细胞完全消化后，加入细胞培养液中和胰蛋白酶，并吹打均匀，800rpm离心3分钟，去掉上清液，加入新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞，按照1:4的比例传代至新的培养瓶中，轻轻摇晃使细胞分布均匀，37℃、5％CO2环境中继续培养。
(2)蛋白质印迹法(Western Blot)检测Rap1b对P815活化后胞内信号通路MAPK及AKT信号通路的影响
A、细胞铺板：P815WT和Rap1b KO细胞培养至对数生长期，将细胞消化下来离心后，去上清，用新鲜高糖DMEM培养基吹打混匀细胞沉淀，制成单细胞悬液，以每孔2mL的量均匀铺于6孔板，37℃、5％CO2培养24小时，24小时后，每孔加入1.5mL不含胎牛血清的高糖DMEM培养基对细胞做饥饿处理，处理时间为12小时；
B、C48/80刺激细胞并收集蛋白样品：除阴对照组以外，其余实验组各孔加入C48/80母液，使其终浓度为10μg/mL，37℃条件下刺激5分钟，5分钟后立即置于冰水上，吹打各孔细胞制成细胞悬液，收集于1.5mL离心管，低温(4℃)离心后去上清，加入1mL预冷的磷酸缓冲盐溶液漂洗细胞，低温离心，去上清，每管加入100μLRipa裂解液(含PMSF)，冰上裂解30分钟，期间涡旋振荡3-5次，裂解完成后，12500rpm低温离心15分钟并吸除核酸；
D、蛋白样品定量：利用BCA蛋白定量试剂盒对收集的蛋白样品进行定量，并配置成30μg的蛋白样品，用Ripa裂解液补齐至16μL，每管加入上样缓冲液4μL，98℃加热7分钟，-20℃保存样品；
E、Western Blot实验:该实验操作方法同实施例1。
实验结果：如图14所示，用C48/80分别刺激饥饿处理12小时后的细胞：0、5、10分钟，激活与肥大细胞活化密切相关的MAPK信号通路和AKT信号通路，收集蛋白样品，蛋白质印迹法检测ERK、P38、AKT的磷酸化水平；结果表明，敲除细胞中的Rap1b对ERK、P38及AKT的磷酸化有显著的促进作用，认为Rap1b基因对P815细胞活化的抑制作用可能是通过抑制了MAPK信号转导通路和AKT信号转到通路实现的。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> Rap1b基因的用途
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
gaacggacaa ggcttcgctc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
agctggtatc ttgtacctcc ca 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
catcatcagt gtctttaacc cg 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
aaactgcagc aagaccgtga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
ccaccgggat actgacagac 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
ctctgttgac aagcaatgag acg 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
tcttcagtat gtctagcccc tg 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
aaactgcagc aagaccgtga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
ccaccgggat actgacagac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
tcactgacgg cacagagcta 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
ccttctcctg tgacctcgtt 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
gctacagctt caccaccaca g 21
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
ggtctttacg gatgtcaacg tc 22

Claims (1)

1.Rap1b基因作为药物靶标在筛选抗Ⅰ型超敏反应药物中的应用。
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