CN103432112A - 白杨素在制备治疗肥胖相关代谢炎症药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药应用技术领域，具体涉及白杨素在制备治疗肥胖相关代谢炎症药中的应用。本发明所述白杨素促进了IL-4激活的鼠巨噬细胞替代活化：促进抑炎细胞因子IL-10的释放，促进巨噬细胞替代活化典型标志分子精氨酸酶活的上升，表面分子MGL1/2的上调，经典分子CD206，Ym1，Fizz的上调。特别是在高脂饲喂诱发的肥胖小鼠C57/B6中，白杨素可以抑制血清中促炎细胞因子TNF-α、血清中AST和ALT的释放，提高抑炎细胞因子IL-10的释放，并改善了肝脏和脂肪组织的病变，抑制腹腔巨噬细胞的吞噬功能，抗原递呈能力以及NO的释放能力并且下调了巨噬细胞典型活化表面分子CCR7，CD80的表达。本发明为治疗肥胖相关代谢炎症疾病开发了一种新的治疗药物。
Description
一、技术领域
本发明属于中药应用技术领域，具体涉及白杨素在制备治疗肥胖相关代谢炎症药中的应用。
二、背景技术
白杨素（Chrysin），化学名5,7-二羟基黄铜，是从紫葳科植物木蝴蝶中提取的一种具有广泛药理作用的天然黄酮类化合物，广泛存在于多种植物、蜂胶和蜂蜜中，是蜂胶的主要成分。由于其抗氧化、抗肿瘤，抗病毒、抗焦虑、抗过敏和抑制芳香酶活性等广泛的药理活性而备受人们关注。
白杨素发挥其抑炎作用主要包括：通过阻断组胺的释放和促炎因子的基因表达抑制肥大细胞介导的过敏炎症反应；抑制多种细胞因子、NO和前列腺素E的释放而缓解结肠炎的症状，改善结肠结构的破坏情况；通过抑制TNF-α诱导的NF-λB和caspase-1的活性，降低促炎因子的释放等。但是关于白杨素在促使巨噬细胞替代活化从而抑制炎症的研究还未见报道。
巨噬细胞在炎症和机体抵抗外来微生物入侵时起一个中枢的作用，且具有很高的可塑性。在不同的环境中，巨噬细胞接受不同的刺激能够表现出不同的激活方式：典型活化和替代活化。巨噬细胞的典型活化在维持机体免疫功能正常运行中具有重要的生理功能。细菌感染如脂多糖（LPS）和IFN-γ等刺激可以使巨噬细胞发生经典激活，使巨噬细胞发生炎症反应并具有较强的吞噬和杀菌能力。其紊乱及失调会导致各种免疫性疾病，如包括获得性免疫功能缺失综合症（AIDS）、迟发性超敏反应在内的免疫缺陷综合症，类风湿性关节炎等。而在一些寄生虫感染如血吸虫卵抗原时，IL-4和IL-13可以使巨噬细胞发生替代活化，从而促进抗寄生虫感染并参与组织修复和重塑。发生替代活化的巨噬细胞，相对于典型活化的巨噬细胞在表型及功能方面均有较大差异。典型活化的巨噬细胞发挥促炎功能，可以迅速摧毁入侵的细菌，诱导氧自由基（ROS）和一氧化氮（NO）的产生，并分泌促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-12，进而增强细胞介导的免疫反应，表现出强大的内吞作用，清除胞内异源性物质，杀伤体内微环境中的微生物病原体和肿瘤细胞，同时也会造成组织损伤。与典型活化不同，替代活化巨噬细胞低表达IL-12、IL-23和TNF-α，高表达IL-10，同时还高表达一些表面受体如I型诱导型精氨酸酶、甘露糖受体、清除剂受体等，以及选择素CCL12和CCL17和一些分泌产物如Ym1（Chi3l3）和Fizz1（Retnla），在体内发挥组织修复、促肿瘤生长、促血管新生和免疫抑制功能。
在炎症反应中，巨噬细胞有三项功能：抗原呈递、吞噬作用以及通过分泌各种细胞因子和生长因子发挥免疫调节功能。巨噬细胞分泌的一些活性分子会参与有益的炎症反应，也会参与有害的炎症反应。所以对巨噬细胞及其分泌产物进行干预治疗，可为控制炎症性疾病开启新的途径。
代谢性炎症是由营养物和代谢过剩触发炎症的过程，其分子及信号通道相似传统（低度）的炎症反应。代谢系统和免疫系统是人类生存最基本的要素系统。很多代谢反应途径和免疫反应途径以及营养素和病原体的感知系统，在物种进化的过程中呈高度保守（conserved）。因此，免疫反应和代谢调节是高度整合的，任何一方的正常作用都依赖于另一方。这个相互作用的交界面被认为是稳态机制的核心（a central homeostatic mechanism）；其功能失常可以导致一些慢性代谢性疾病，特别是肥胖、2型糖尿病及心血管病的发生和聚集。所有这些疾患极大地威胁全球人类的健康和安宁。
1948年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）将肥胖定义为一种疾病，即肥胖症。越来越多研究发现肥胖症本身存在内分泌及代谢功能的紊乱外，同时还伴随有炎症的发生，且肥胖相关性炎症反应参与了肥胖并发症的发病机制，并有可能影响应激情况下全身炎症反应的强度。
目前治疗肥胖相关代谢炎症的策略，从代谢和炎症二者的交界面来寻找其治疗靶点，可从肽类（peptides）和脂质介导的两类通道着手；前者有细胞因子，趋化因子及其受体。己知抗TNF或抗CCR2（抗趋化因子受体）的效果有限；因而认为处理更为中心的位点可能更为有益。有报道针对JNK_IKK通道，用高剂量水杨酸抑制IKK在肥胖小鼠和糖尿病患者可以改善葡萄糖代谢。针对JNK靶点在用抑制肽类，合成小分子抑制剂或RNA干扰技术（RNAi），在不同小鼠模型显示有改善胰岛素作用。在脂质相关的信号通道方面，用噻唑烷二酮（thiazolidinediones TZDs）取得效果，如PPARγ配体作为胰岛素增敏剂，可以调节脂质代谢和抗炎效应。因此控制肥胖相关炎症的持续，或者说消退肥胖相关炎症对于控制代谢性疾病具有重要的意义。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是白杨素在制备治疗肥胖相关代谢炎症药中的应用。
本发明所述白杨素购买于南京泽朗医药科技有限公司，白杨素可以促进巨噬细胞向替代活化方向转化，抑制其向典型活化方向转化；并且在动物水平上白杨素明显改善了肝脏组织和脂肪组织的脂变性，极显著抑制了小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力、NO、TNF-α的释放量，抑制了在典型活化巨噬细胞中高表达的表面分子CCR7，MHCII，CD80的表达；另外，在动物血清水平上也显著抑制了炎症相关分子的表达。
本发明的有益效果是：
目前关于白杨素在调控巨噬细胞替代活化方面的研究还属空白，在细胞和动物水平上研究这一调控作用，对巨噬细胞及其分泌产物进行干预治疗，可为控制炎症性疾病开启新的途径。本发明首次公开了白杨素在促进巨噬细胞替代活化方面的应用，本发明为治疗肥胖相关代谢炎症疾病开发了一种新的治疗药物。
四、附图说明
图1.白杨素在巨噬细胞中ANA-1中的活性检测
图2.白杨素抑制了LPS激活的小鼠典型活化巨噬细胞表面Marker CD80，CCR7的表达；抑制了炎性细胞因子IL-1β，TNF-α的释放。
图3.白杨素促进了IL-4激活的替代活化巨噬细胞表面MarkerMGL1/2的表达；促进了小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子IL-10的释放；增强了精氨酸酶活性以及巨噬细胞替代活化相关基因CD206，YM1，Fizz1的表达水平。
图4.白杨素对肥胖诱导的小鼠C57/B6的肝脏组织中肝细胞小泡型脂变具有改善作用，并且对脂肪组织中脂肪细胞面积增大、间质结缔组织以及单核巨噬细胞的浸软具有明显的改善作用。
图5.白杨素极显著的抑制了高脂诱导的肥胖小鼠C57/B6的炎性细胞因子的释放能力以及谷丙转氨酶，谷草转氨酶的释放，并且对血脂以及葡萄糖的含量也有所降低。
图6.白杨素极显著抑制了高脂诱导的肥胖小鼠C57/B6的腹腔巨噬细胞的吞噬功能，培养上清中NO和细胞因子TNF-α的释放能力，同时在基因水平也检测白杨素抑制了巨噬细胞的典型活化及抗原递呈能力。
五、具体实施方式：
1.白杨素在巨噬细胞中的活性检测
选取对数生长期的巨噬细胞株ANA-1，离心后用DMEM培养基稀释成5*104/mL，接种于96孔板中。37℃培养过夜后加入不同浓度（10μM，20μM，50μM，100μM）白杨素，并设对照组，37℃，5%CO2培养箱孵育24h，加入10μL MTT溶液，37℃孵育4h，酶标仪测定在570nm吸光度。结果如图1，发现，白杨素在ANA-1巨噬细胞中的活性存在剂量和时间依赖性。药物浓度在10μM，12小时，与正常组即存在明显差异，随着浓度或时间的增加，细胞的增殖率明显下降。
2．白杨素抑制了巨噬细胞的典型活化
2.1流式细胞仪检测白杨素对M1型巨噬细胞表面Marker CD80和CCR7表达的影响
在6孔板中接种5*105/ml巨噬细胞，5μM或者10μM白杨素孵育2小时后，加入500ng/mlLPS，作用24h后，收集细胞于1.5mL Eppendorf(EP)管中，300g离心5min，4℃；用含2%BSA的PBS洗涤细胞沉淀一次，加入100μL抗体工作液（含2%BSA的PBS+荧光抗体）重悬细胞；阴性对照样品中加入相应的同型IgG荧光抗体；4℃避光孵育PE-CD80或PE-CCR730min，期间不停的摇动EP管以防止细胞沉积。用预冷的PBS洗涤3遍，300g离心5min，加500μL PBS重悬细胞，流式细胞仪FL2通道检测其表达量。结果如图2A显示：LPS可以使巨噬细胞中CD80和CCR7的表达升高，而10μM白杨素明显抑制了其表达，CD80从57.95%降到47.75%，CCR7从21.47%到9.47%。
2.2ELISA检测白杨素对细胞因子，IL-1β，TNF-α表达的影响
本实验采用ebioscience的试剂盒，具体操作如下:
1)预包被Corning Costar901896孔ELISA板，每孔加入100μL含有捕获抗体的包被缓冲液，Parafilem封住包被孔，4℃放置过夜。
2)吸干每孔的包被液，每孔加入250μL0.1%PBST洗涤包被孔，微量振荡器上振荡1min，倒扣洗涤液，吸水纸吸去残余液体。反复操作，洗5次。
3)每孔加入200μL1×Assay Buffer,室温封闭1h。
4)同2）洗涤每孔。
5)每孔加入100μL细胞培养基，同时用试剂盒中的标准品，作标准曲线。Parafilem封住包被孔，室温反应2h。
6)同2）洗涤每孔。
7)每孔加入100μL检测抗体（用1×Assay Buffer稀释），Parafilem封住包被孔，室温反应1h。
8)同2）洗涤每孔。
9)每孔加入100μL亲和素偶联辣根过氧化酶（Avidin-HRP，用1×Assay Buffer稀释），Parafilem封住包被孔，室温反应30min。
10)同2），洗涤14次。
11)每孔加入100μL底物反应液，室温反应15min。
12)每孔加入50μL终止液（1M H2SO4）
13)测定450nm吸光度，并扣除570nm吸光度。
14)将测定的吸光值与标准曲线比较即可知样品中细胞因子的浓度。结果如图2B显示白杨素抑制了巨噬细胞促炎因子IL-1β，TNF-α的释放。
3白杨素对IL-4诱导的替代活化型巨噬细胞的促进作用
3.1流式细胞仪检测白杨素对替代活化型巨噬细胞表面Marker MGL1/2表达的影响
检测方法同2.1，PE-MGL1/2抗体使用比例皆为1:100，利用FL2通道。结果如图3A显示白杨素促进了巨噬细胞替代活化型表面Marker MGL1/2的表达，从41.58%升高到59.35%。
3.2精氨酸酶活性检测
精氨酸酶活性增加作为巨噬细胞替代活化的经典标志，我们检测了白杨素对巨噬细胞精氨酸酶活性的影响。按照以下步骤进行实验：
1)细胞因子或共培养处理结束的细胞全部吹散下来收集于离心管里，离心机预冷至4℃，300g离心5min，弃上清，保留细胞沉淀。
2)用1mL预冷的PBS缓冲液吹洗沉淀一次，300g离心5min。弃上清，保留细胞沉淀。
3)每孔加入100μL含0.1%TritonX-100的PBS，在振荡器上振荡30min，裂解细胞。
4)将上一步裂解的细胞，于4℃，1,000g离心5min，小心收集上清，丢弃沉淀。
5)取上一步收集到的上清裂解液25μL，加入20μL25mM Tris·HCl（pH7.5）,5μL10mMMnCl2,混合均匀，于56℃反应2min激活精氨酸酶。
6)在上一步溶液中加入25μL0.5M L-arginine,37℃水浴90min。
7)加入200μL终止液（H2SO4/H3PO4/H2O）终止反应
8)加入25μL2-异硝基苯丙酮，Parafilm膜封住EP管口，95℃加热10min。异硝基苯丙酮不溶于水，加入时会立即变浑浊，加热后可溶解，冷却后又会变浑浊。
9)在上步溶液中加200μL95%乙醇，溶液立即变澄清，混匀。吸取200μL于酶标板中，每个样品3个复孔。540nm测定吸光度。
10)配制1M尿素溶液，按照上述步骤，分别测定0.1M，0.2M，0.3M，0.4M，0.5M尿素对应的OD540，制作尿素浓度标准曲线。
11)将9）中获得结果与尿素标准曲线对比即可知最终尿素生成量。BCA法测定蛋白浓度，得到每毫克蛋白中精氨酸酶的相对活性。
结果发现白杨素极显著增强了巨噬细胞精氨酸的活性（图3B）。
3.3ELISA检测白杨素对IL-10表达的影响
实验方法同2.2，结果发现白杨素极显著增强了小鼠腹腔巨噬细胞对抑炎细胞因子IL-10的表达（图3C）。
3.4Q-PCR检测白杨素对巨噬细胞替代活化基因m RNA水平的影响
3.4.1mRNA的提取
1)吸去六孔板中每孔中细胞培养液；每孔中分两次（0.6ml+0.4ml）共加入1ml Tripue，反复吹打以消化细胞，收集细胞悬液于1.5ml Eppendorf管中；
2)RT静置5min（冷冻离心机提前预冷）；加入CHCl30.2ml(相对于Tripue，0.2mlCHCl3/mlTripure)，剧烈振荡，静置5min；
3)4℃放置，12000g离心15min；取400ul上清移至新的1.5ml eppendof管，加异丙醇0.5ml（相对于Tripue，0.5ml异丙醇/mlTripue），反复颠倒摇匀，静置5-10min；
4)4℃下12000g离心10min（如果细胞量较大，可以看见淡黄色少量沉淀）；弃去上清，加入75％乙醇1ml（无水乙醇：DEPC＝3：1现配）；4℃下7500g离心5min；
5)弃掉上清，清洁处晾干；加入DEPC水（10-20μl）溶解mRNA；-70℃保存待用。
3.4.2RT-PCR
1)按如下体系配制第一反应液：
2)PCR仪上65℃反应5min，然后立即冰上冷却。
3)在第一反应液基础上配制如下第二反应液：
4)轻轻混匀，然后42℃反应1h。
5)接着95℃反应5min使逆转录酶灭火。
6)冰上冷却，用于后续PCR实验或-20℃保存。
(逆转录过程中的枪头和离心管都必须经过除酶处理)。
3.4.3Q-PCR
反应体系：将上述cDNA稀释3倍做一下实验
反应程序为：95℃ 30s；(95℃ 5s，56℃ 5s，)40cycles。
所使用的引物序列为：
CD206上游引物F:GCA GGT GGT TTA TGG G AT GT；
CD206下游引物R:GGG TTC AGG AGT TGT TGT GG。
Ym1上游引物F:AGA AGG GAG TTT CAA ACC TGG T；
Ym1下游引物R:GTCTTGCTCATGTGTGTAAGTGA.
Fizz1上游引物F:CCA ATC CAG CTA ACT ATC CCT CC；
Fizz1下游引物R:ACC CAG TAG CAG TCA TCC CA。
β上游引物actin:GCT CTG GCT CCT AGC ACC；
β下游引物actin:CCA CTA TCC ACA CAG AGT AC T TG。
Q-PCR结果显示白杨素极显著增强了小鼠腹腔巨噬细胞替代活化经典分子甘露糖受体CD206，Fizz1，Ym1的表达（图3D）。
4.白杨素抑制了肥胖相关炎症
清洁型C57/B6小鼠，4周龄，16-18g，购自南京大学动物模式研究所，在21-24℃、相对湿度40-60%、自由取食、自由饮水和12h昼夜交替的环境下饲养。肥胖模型组喂食含60%高脂的饲料，其它喂养条件与正常喂食的小鼠相同。高脂饲料购自美国Research Diets公司。
高脂喂食17周后，将小鼠分4组做实验：ND组，正常饲养的小鼠，不加处理；HFD组，肥胖小鼠，不加处理；HFD-DMSO组，肥胖小鼠，腹腔注射溶剂对照DMSO；HFD-白杨素组，肥胖小鼠，腹腔注射。按小鼠体重35mg/kg的剂量，腹腔注射，不间断给药15天。给药结束后，眼球取血；取腹腔巨噬细胞检测其吞噬能力以及NO的释放量，还有表面分子MHCII，CCR7，CD80的表达量。
具体操作如下：
4.1白杨素对肥胖诱发的肝脏剂脂肪的脂变性具有明显的改善作用
取肝脏组织和脂肪组织于10%福尔马林中浸泡过夜，送往东南大学药检所进行HE染色检验并评分。根据病变轻重程度，依次半定量为轻度（±,0.5）轻度+1中度+2重度+3无病变组织为阴性（0）。结果发现如图4：白杨素对肥胖诱导的小鼠C57/B6的肝脏组织中肝细胞小泡型脂变具有改善作用（图4A,B），并且对脂肪组织中脂肪细胞面积增大、间质结缔组织以及单核巨噬细胞的浸软具有明显的改善作用(图4C.D)。
4.2白杨素改善了肥胖小鼠血清中炎性细胞因子的释放
细胞因子的ELISA检测同2.2，血清中总胆固醇的测定参见北京北化康泰临床试剂有限公司编号006301试剂盒，血清中葡萄糖的测定参见上海荣盛生物医药有限公司（CAT361500）试剂盒，血清中甘油三脂的测定参见北京北化康泰临床试剂有限公司试剂盒（编号006304），血清中谷丙转氨酶ALT，谷草转氨酶AST测定参见南京市建成生物工程研究所(C009-2，C010-2)。试验结果显示：白杨素显著抑制了促炎细胞因子TNF-α的释放，显著促进了抑炎细胞因子IL-10的释放（图5A）；同时也显著抑制了谷草转氨酶和谷丙转氨酶的释放（图5C,D）；而且对血糖，血脂也有所改善（图B,E,F）
4.3白杨素抑制了肥胖小鼠腹腔巨噬细胞典型活化主要表面分子的表达
流式检测腹腔巨噬细胞中典型活化表面分子CD80，CCR7，MHCII的影响，操作方法同2.1。试验结果如图6A显示，白杨素抑制了典型活化表面分子CD80，CCR7的表达，降低了肥胖小鼠腹腔巨噬细胞抗原递呈能力。
4.4中性红吞噬试验
1）铺96孔板，100μl/孔（细胞密度106/ml），培养2h后弃去未贴壁的细胞，用PBS洗两次。
2）弃去旧培养基，加入100μl0.1%（0.75g/l）中性红，37℃作用1h，PBS洗3次。
3）加入100μl细胞裂解液（无水乙醇：0.1mol/l乙酸），4℃过夜。4）测490nm吸光值。
结果如图6B，白杨素极显著抑制了小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。
4.5小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中NO的测定
使用Gress试剂检测上清中的NO
1）工作液配制：将Gress试剂A液和B液等体积混合；
2）将细胞上清与工作液等体积混合，室温静置10min；
3）540nm测吸收峰。
结果显示，白杨素显著改善了肥胖小鼠腹腔巨噬细胞NO的释放能力（图6C）。
4.6白杨素对肥胖小鼠腹腔巨噬细胞中表型分子的影响
Q-PCR操作同3.4.3，结果如图6D显示，白杨素极显著的促进了替代活化巨噬细胞表面分子Arg1，CD206，Ym1的表达，极显著抑制了典型活化巨噬细胞表面分子CCL3，IL-12β的表达。
Claims (2)
1.白杨素在制备治疗肥胖相关代谢炎症药中的应用。
2. 根据权利要求1所述的白杨素在制备治疗肥胖相关代谢炎症药中的应用，其特征是在促进巨噬细胞替代活化，抑制巨噬细胞典型活化中的应用。
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