CN113116913A

CN113116913A - 连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞活性药物中的应用

Info

Publication number: CN113116913A
Application number: CN202110326995.0A
Authority: CN
Inventors: 童小慧; 吕燕萍; 方志正; 卢孟雅; 王桐生; 韩荣春
Original assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Current assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date: 2021-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2021-07-16

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞药物中的应用，通过采用连翘苷对棕榈酸诱导的代谢激活型巨噬细胞IL‑6、Igfbp3、Odc1、Ptpn14、Ehd2基因的表达产生抑制作用，进一步抑制代谢激活型巨噬细胞的活性，而巨噬细胞在炎症，肥胖，糖尿病和胰岛素抵抗等疾病的发生和发展过程中扮演着关键的角色，逐渐成为了新的治疗靶点；这种连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞活性药物中的应用，解决了现有技术针对代谢激活型巨噬细胞相关的疾病的药物治疗方法存在着副作用大、价格昂贵、服用周期长的问题。

Description

连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞活性药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞药物中的应用。

背景技术

连翘始载于《神农本草经》卷三，列为下品，曰：“连翘一名异翘，一名兰华，一名折根，一名轵，一名三廉。生山谷”。其味苦，性微寒。归肺、心、小肠经，主产于我国山西、河南、陕西、山东等地。2020年版《中华人民共和国药典》收载连翘为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实。秋季果实初熟尚带绿色时釆收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘”；果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称“老翘”。具有清热解毒，消肿散结，疏散风热的功效，临床上用于治疗痈疽，瘰疬，乳痈，丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋涩痛。

连翘中含多种化学成分，主要包括木脂素类、黄酮类、苯乙醇苷类、挥发油类及萜类、生物碱类、有机酸类等，其中木脂素类有效活性成分连翘苷(分子量为534.55)含量较高，是连翘的主要药理活性成分，也是中国药典所规定的连翘质量控制指标性成分，中国药典规定本品按干燥品计算，含连翘苷(C₂₇H₃₄O₁₁)不得少于0.15％。连翘苷是由两分子苯丙素侧链相互连接形成两个环氧结构的一类木脂素。其结构上连桥是多种天然产物单体发挥抗氧化，抗菌和抗炎作用中起着重要基团之一。

单核巨噬细胞来源于骨髓，包括血液中的单核细胞与组织中的巨噬细胞。在生理条件下，外周循环中的单核细胞逐渐成熟，然后迁移到外周淋巴和非淋巴组织，转化为巨噬细胞。巨噬细胞作为免疫系统的必要成员，其基本功能是吞噬病原体、清除凋亡和坏死的细胞等以维持组织的稳态和正常功能。在不同的组织中分布着具有相似功能的巨噬细胞，如肝脏中的枯否细胞、大脑中的小胶质细胞、脂肪组织中的巨噬细胞等。巨噬细胞在不同微环境中的极化及功能转换，在炎症，肥胖，糖尿病和胰岛素抵抗等疾病的发生和发展过程中扮演着关键的角色，逐渐成为了新的治疗靶点。

因为巨噬细胞具有吞噬病原体、清除凋亡和坏死的细胞的功能，会参与许多免疫系统的疾病，但是有些情况下会适得其反，例如肿瘤形成的过程、多种病症引起的炎症病变、心脑血管疾病等。当巨噬细胞与流行性感冒病毒展开“斗争”时，巨噬细胞会被输送至喉咙；但是在T细胞将感冒病毒识别出前，巨噬细胞的作用是弊大于利，它们不光会吞噬受感冒病毒感染的细胞，还会吞噬喉咙附近未被感染的其它细胞。又如当人体受到人体免疫缺损病毒(HIV)感染时，同T细胞一样，巨噬细胞也会受到感染，被变成在身体之中持续复制病毒的仓库。另外，巨噬细胞也被证明会帮助癌细胞增生，它们会被吸引到缺氧(低氧)的肿瘤细胞附近并促进慢性炎症，巨噬细胞会释出致炎物质如肿瘤坏死因子(TNF)从而活化NF-κB的基因。其后，NF-κB会进入肿瘤细胞核并启动多种可以停止细胞凋亡及促进细胞增生及发炎的蛋白质的产生。

连翘苷是中药连翘的主要的活性成分之一，现代药理研究表明连翘苷具有多种作用，包括抗氧化、抗炎、抑制肥胖、调节代谢等。连翘苷的一些药理作用已经被研究者证明：有研究表明连翘苷具有较好的抗氧化作用,可以抑制氧化产物丙二醇的积累，促进抗氧化酶POD和CAT的活性,提高了机体的抗氧化能力；有学者通过微量稀释法检测连翘苷对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)、结晶染色法分析铜绿假单胞菌生物被膜最小抑菌浓度，发现连翘苷对铜绿假单胞菌细胞的黏附性和生物被膜有较强的抑制作用；有文献研究以小鼠巨噬细胞(RAW264.7)为研究模型，探索了连翘苷对LPS(革兰阴性菌细胞壁的主要成分)引起的炎症反应的影响及其可能存在的机制，研究证明了连翘苷可抑制LPS引起的RAW264.7细胞多个促炎症因子和介质的释放；连翘为双黄连、银翘散等多种中药复方的重要成分，作为常用的清热解毒类中药，其中的有效成分连翘苷也是具有较强抗病毒作用；还有研究者以体外高糖诱导脂质蓄积的人体肝细胞为模型，研究发现连翘苷对肝细胞的脂质蓄积具有显著地抑制作用，其作用机理是通过激活LKB1/AMP活化蛋白激酶信号通路从而抑制肥胖。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术针对代谢激活型巨噬细胞相关的疾病的药物治疗方法存在着副作用大、价格昂贵、服用周期长的问题，提供了一种连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞活性药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明公开了一种连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞活性药物中的应用。

所述连翘苷的化学结构式为：

所述药物剂型包括注射剂、丸剂、片剂、颗粒剂。

所述连翘苷对棕榈酸诱导的代谢激活型巨噬细胞IL-6、Igfbp3、Odc1、Ptpn14、Ehd2基因的表达具有抑制作用。

与现有技术比较本发明的有益效果在于：本发明通过采用连翘苷对棕榈酸诱导的代谢激活型巨噬细胞IL-6、Igfbp3、Odc1、Ptpn14、Ehd2基因的表达产生抑制作用，进一步抑制代谢激活型巨噬细胞的活性，而巨噬细胞在炎症，肥胖，糖尿病和胰岛素抵抗等疾病的发生和发展过程中扮演着关键的角色，逐渐成为了新的治疗靶点。连翘苷在未来对于代谢性相关疾病新药开发有着重大意义。连翘是常用中药，种质资源丰富。连翘苷作为连翘的有效成分之一，其有效成分的提取方法成熟，因此，相比现有技术产品开发节省成本且作用显著。

附图说明

图1为油红O染色检测各组巨噬细胞脂滴的变化；

图2为RT-qPCR检测各组巨噬细胞IL-6基因表达统计学分析；

图3为RT-qPCR检测各组巨噬细胞Igfbp3基因表达统计学分析；

图4为RT-qPCR检测各组巨噬细胞Odc1基因表达统计学分析；

图5为RT-qPCR检测各组巨噬细胞Ptpn14基因表达统计学分析；

图6为RT-qPCR检测各组巨噬细胞Ehd2基因表达统计学分析；

图7为RT-qPCR检测各组巨噬细胞SCOS3基因表达统计学分析；

图8为RT-qPCR检测各组巨噬细胞STAT3基因表达统计学分析。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

一、连翘苷对巨噬细胞脂质代谢的影响

步骤1：细胞的复苏

(1)培养基的配制：配制DMEM培养基(4℃保存)+10％胎牛血清(-20℃保存)。配制完成后，4℃保存。

(2)细胞复苏：从-80℃冰箱中取出冻存管，37℃水浴使快速升温，取出细胞液于10mL离心管中，1500r/min，离心5min，弃去上清，用配制好的完全培养基混悬细胞，移入培养瓶。

步骤2：细胞培养

将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中，拧松瓶盖放置。细胞贴壁后，2-3日更换一次培养基。

步骤3：细胞传代

细胞传代培养2-3日后，贴满培养瓶壁，从培养箱中取出培养瓶，弃上清，用PBS清洗一遍，加0.2％的胰酶1mL覆盖培养瓶底部。37℃放置3-5min后，瓶底透明时，消化完全。加入2mL培养基终止消化。并用吹打管将瓶壁上的细胞完全吹打下来，将悬液移入10mL离心管内，1000r/min离心5min，弃去上清液，加入新的DMEM吹打混匀后平均分装至新的培养瓶中，一般一瓶可传两至三瓶细胞，次日细胞贴壁后换液一次。

步骤4：细胞冻存

取出已完全覆盖瓶底的细胞，将细胞悬液移入离心管内离心，弃去上清液，用1.5mL冻存液混悬细胞，移入冻存管内，4℃冰箱放置30min，-20℃冰箱放置2h，-80℃冰箱长期保存。

步骤5：细胞分组

正常组：培养基中加入10％胎牛血清；模型组：培养基中中加入0.4mmol/L棕榈酸；给药组：培养基中加入0.4mmol/L棕榈酸+100μmol/L连翘苷。

步骤6：巨噬细胞油红O染色

培养瓶中巨噬细胞细胞达到90％以上，种6孔板一块，待细胞贴壁后，分正常组、模型组给药组在CO₂培养箱中培养48h。按下述步骤操作：

(1)吸弃培养基，加固定液，室温，放置10min；

(2)回收固定液，PBS洗5min，2次；

(3)加油红O染料(饱和油红O：蒸馏水＝3:2)，室温，10min；

(4)回收染料，60％异丙醇分化；

(5)装片，镜下观察巨噬细胞脂滴变化。

通过油红O染色检测巨噬细胞脂滴的变化结果如图1所示，在PA诱导的模型中，巨噬细胞的脂滴明显较多，与正常组相比脂滴数量较多；而给药组相对于模型组，脂滴数量明显下降。以上结果表明，连翘苷可抑制代谢激活型巨噬细胞。

二、实时荧光定量PCR检测巨噬细胞相关炎症的表达

步骤1：巨噬细胞总RNA的提取

(1)移除6孔板中的培养基，用PBS缓冲液对6孔板内的细胞进行清洗，动作要轻柔，而后每孔加250μL TRIzol Reagent裂解细胞，轻轻吹打使细胞完全裂解。

(2)加500μL氯仿，室温放2-3min。

(3)离心12000r/min，15min 4℃。

(4)取上清至新的EP管。

(5)加100μL异丙醇，室温放10min。

(6)离心转速12000r/min，时间10min，温度4℃

(7)弃上清，加75％乙醇500μL洗一次，晾干，加20μL ddH₂O存放于冰上。

(8)测RNA浓度，存放于-80℃。

步骤2：逆转录反应

(1)RNA上样量1000ng，计算上样体积，加5×gDNA 2μL，ddH₂O补足10μL，条件为42℃3min；

(2)10×Fast RT Buffer 2μL，RT Enzyme Mix 1μL，FQ-RT Primer Mix 2μL，ddH₂O 5μL，加入(1)中42℃放置15min，95℃放置3min；

(3)得到cDNA 20μL，存放于-20℃。

步骤3：RT-qPCR(实时荧光定量PCR)

运用SYBR Green嵌入荧光法定量检测il-6、Igfbp3、Odc1、Ptpn14、Ehd2等基因的表达水平。将逆转录合成的cDNA加80μL ddH₂O稀释，进行定量PCR反应。反应条件为：95℃下预变性10min，95℃下变性15s，60℃下退火/延伸1min，共45个循环20μL反应体系，300nm：Primer(4500nm)0.34μL，H₂O2.12μL，Master Mix5μL，cDNA2.5μL；100nm：Primer(4500nm)0.11μL，H₂O2.39μL，Master Mix5μL，cDNA2.5μL。

采用实时荧光定量PCR检测巨噬细胞中IL-6、Igfbp3、Odc1、Ptpn14、Ehd2的表达。如图2、图3、图4、图5、图6所示，在PA诱导的模型中，模型组相对于正常组，IL-6、Igfbp3、Odc1、Ptpn14、Ehd2的基因表达水平都显著升高；而给药组相对于模型组都显著下降。此结果表明，连翘苷对PA诱导的代谢激活型巨噬细胞IL-6、Igfbp3、Odc1、Ptpn14、Ehd2基因的表达具有显著的抑制作用。

三、实时荧光定量PCR检测SCOS3调节巨噬细胞中STAT3基因的表达

巨噬细胞总RNA的提取、逆转录反应、RT-qPCR(实时荧光定量PCR)方法步骤与实施例2中相同。

采用实时荧光定量PCR检测SCOS3调节巨噬细胞中STAT3基因的表达。如图7、图8所示，在PA诱导的模型中，模型组相对于正常组的SCOS3、STAT3基因表达水平都显著升高；而给药组相对于模型组都显著下降。此结果表明，连翘苷对PA诱导的代谢激活型巨噬细胞通过下调SCOS3基因的表达，从而抑制STAT3基因表达水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞药物中的应用。

2.如权利要求1所述的连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞药物中的应用，其特征在于，所述连翘苷的化学结构式为：

3.如权利要求1所述的连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞药物中的应用，其特征在于，所述药物剂型包括注射剂、丸剂、片剂、颗粒剂。

4.如权利要求1所述的连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞药物中的应用，其特征在于，所述连翘苷对棕榈酸诱导的代谢激活型巨噬细胞IL-6、Igfbp3、Odc1、Ptpn14、Ehd2基因的表达具有抑制作用。

5.如权利要求1所述的连翘苷在制备抑制代谢激活型巨噬细胞药物中的应用，其特征在于，连翘苷在制备抑制STAT3基因表达药物中的应用。