CN105663506A - 一种具有抗抑郁作用的中药提取物及其应用 - Google Patents

一种具有抗抑郁作用的中药提取物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有抗抑郁作用的中药提取物及其应用，本发明以人参300-600份、远志200-400份、石菖蒲200-400份、茯苓300-600份为原料药，加水提取，取提取液浓缩，得浓缩液；浓缩液通过大孔树脂柱纯化，先用水去杂，再采用优选体积的乙醇洗脱，得洗脱液，浓缩得到。经过小鼠悬尾与游泳抑郁模型与PC12细胞、C6细胞模型验证，本发明提供的中药提取物具有明显改善抑郁样情绪，抑制神经递质降解，促进神经营养因子表达的作用，疗效可靠，安全性好，不良反应低，可用于制备抗抑郁的药物。

Description

一种具有抗抑郁作用的中药提取物及其应用
技术领域
本发明涉及一种中药提取物，特别是涉及一种具有抗抑郁作用的中药提取物及其制备方法与应用。
背景技术
抑郁症，是一种以显著而持久的心境低落为主要临床特征的病症，同时伴有失眠，记忆缺失，饮食失调等症状，严重者可出现自杀念头和行为。据报道，人群中有16％的人在一生的某个时期会出现抑郁症状。若这些症状持续两周以上无明显改善，患者可确诊为抑郁症。据世界卫生组织统计，抑郁症已成为世界第4大疾患，并且预计到2020年，可能成为仅次于冠心病的第二大疾病。抑郁症患者不能适应社会，注意力下降，是自杀的高危人群。不仅如此，临床还发现，抑郁症与老年痴呆症常呈现共存状态，抑郁症患者更易发展成为老年痴呆症，从而带来沉重的经济负担与社会负担。
长期以来，单胺类神经递质调控紊乱假说被认为是抑郁症的主要发病机理。该假说认为，神经元突触间隙内神经递质五羟色胺(serotonin，5-HT)，去甲肾上腺素(norepinepherine，NE)，多巴胺(dopamine，DA)含量降低，神经传导异常，是导致抑郁症的主要原因，因此会出现记忆缺失与情绪低落等症状。因此，现有的治疗抑郁症的药物，包括：三环类抗抑郁药(TCAs)，如丙咪嗪(impiramine)等；五羟色胺重摄取抑制剂(SSRI)，如氟西汀(Fluoxetine)等；单胺氧化酶抑制剂(MAOI)，如苯乙肼等，均以提高神经元突触间隙神经递质的浓度，抑制神经递质的重摄取为治疗与药物开发靶点。
近年来研究发现，神经营养因子调控失常是抑郁症的另一个重要的致病机理。临床研究发现，抑郁症患者血清中神经营养因子，尤其是脑源性神经营养因子(BDNF)的含量下降。除了BDNF之外，神经生长因子(NGF)与胶质细胞源神经营养因子(GDNF)的水平在抑郁症病人血清中的含量也同样低下。动物研究证明，抑郁症动物脑中NGF、BDNF与GDNF的含量表达下降，尤其是在与抑郁症发病最密切相关的海马与前额皮质部位。离体细胞实验证明，这些部位神经营养因子的缺乏，将直接导致神经元损伤，死亡，影响正常的神经生长过程。因此，神经营养因子在抑郁症发病机理中意义重大，是抑郁症诊断的重要指标与药物开发的重要靶点。可是，目前尚无针对此靶点的有效药物，严重影响了抑郁症病人的治疗与康复。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种疗效可靠，安全性好，具有很好的抗抑郁作用的中药提取物。本发明的另一目的是提供上述提取物的制备方法和应用。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，该中药提取物由如下方法制成：
步骤1：选取如下原料药：人参300-600份、远志200-400份、石菖蒲200-400份、茯苓300-600份；
步骤2：取步骤1的原料药，加水提取，取提取液浓缩，得浓缩液；
步骤3：取步骤2的浓缩液，通过大孔树脂柱洗脱，得洗脱液，浓缩。
作为优选方案，以上所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，原料药的组成为：人参300份、远志200份、石菖蒲200份、茯苓300份。
作为优选方案，步骤2中，将原料药用加水回流提取2-4次，每次提取1-2小时。作为更加优选方案，步骤2所述的水提取条件为：首先加入中药原料药重量8倍体积量的提取溶剂水，100℃回流提取120min，过滤后加入药材重量10倍体积量的提取溶剂水，100℃回流提取120min。
作为优选方案，将步骤2所得的提取物进行浓缩，得浓度为1.0g/mL，以3000转/分钟的转速离心10min。
作为优选方案，步骤3所述的大孔树脂洗脱条件为：吸附流速为1.0-2.0mL/min，洗脱液依次用水和体积浓度为10-90％的乙醇，分别洗脱3-7倍树脂体积，洗脱流速为1.0-2.0mL/min，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。
作为更加优选的方案，步骤3所述的大孔树脂洗脱条件为：优选1.25L860021型大孔吸附树脂，吸附流速为2.0mL/min，大孔树脂柱径高比为1:10，上样液浓度为1.0g/mL，水洗脱2倍树脂体积进行除杂，除杂流速为1.0mL/min。以10％，30％，50％，70％，90％依次洗脱大孔树脂柱5倍柱体积，收集体积浓度90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。
本发明提供的中药提取物，动物模型实验结果表明，90％乙醇大孔树脂洗脱液可明显缓解动物抑郁样症状，细胞模型试验结果表明，可增加神经递质合成，抑制神经递质降解，增加神经营养因子的表达。并且本发明通过对比试验结果表明，90％乙醇洗脱液的抗抑郁功效明显高于其它体积浓度(10％，30％，50％，70％乙醇)的洗脱液。
并且本发明通过对比试验研究，结果表明，中药组合物先采用水提取后，再通过大孔树脂吸附纯化，并采用优选的90％乙醇洗脱液的中药提取物有效部位，其抗抑郁功效明显优于中药水提液。表明本发明采用大孔树脂吸附，优选比例乙醇洗脱后，可得到抗抑郁效果明显的中药提取物的精制部位。
本发明通过大量实验筛选得到的中药提取物有效部位，该部位在小鼠悬尾与游泳抑郁模型上显示出显著的抗抑郁活性，能显著提升脑内神经递质与神经营养因子的的表达。在PC12神经元细胞上能够促进神经递质合成酶的合成，抑制降解；在C6胶质瘤细胞模型上可促进神经营养因子合成。上述研究表明本发明提供的中药提取物对抑郁症有显著的改善作用，可用于制备具有改善抑郁症状的药品或保健品，适合抑郁症患者。
本发明所述的具有抗抑郁作用的中药提取物的制备与应用，将此中药提取物和药学上可接受的载体制成片剂、丸剂、散剂、汤剂、颗粒剂、煎膏剂或浸膏剂剂型的药物，临床服用方便，并且本发明提供的中药提取物，实验过程中未发现明显毒副作用，安全性好。
附图说明
图1为中药提取物对悬尾小鼠不动时间影响的柱状图。
图2为中药提取物对强迫游泳小鼠不动时间影响的柱状图。
图3为中药提取物对抑郁小鼠脑内神经递质影响的柱状图。
图4为中药提取物对抑郁小鼠脑内神经营养因子影响的柱状图。
图5为中药提取物对PC12细胞中神经递质合成酶表达测试结果的柱状图。
图6为中药提取物对PC12细胞中神经递质降解酶表达测试结果的的柱状图。
图7为中药提取物对C6细胞中神经营养因子表达影响的柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
一种具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，该中药提取物由如下方法制成：
步骤1：选取如下原料药：人参300份、远志200份、石菖蒲200份、茯苓300份；
步骤2：取步骤1的原料药，首先加入中药原料药重量8倍体积量的提取溶剂水，100℃回流提取120min，过滤后加入药材重量10倍体积量的提取溶剂水，100℃回流提取120min。取提取液浓缩，得浓度为1.0g/mL浓缩液；
步骤3：取步骤2的浓缩液，通过大孔树脂柱洗脱，大孔树脂洗脱条件为：选用1.25L860021型大孔吸附树脂，吸附流速为2.0mL/min，大孔树脂柱径高比为1:10，上样液浓度为1.0g/mL，水洗脱2倍树脂体积进行除杂，除杂流速为1.0mL/min。然后以体积浓度为10％，30％，50％，70％，90％乙醇依次洗脱大孔树脂柱，各5倍柱体积，收集体积浓度90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。
实施例2中药提取物抗抑郁实验研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
动物多重行为测试仪(上海吉量仪器有限公司)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。
2.药物
氟西汀购自TCI(上海)化成工业发展有限公司。
受试药物：本发明实施例1制备得到的中药提取物(低剂量、中剂量、高剂量分别为1、3、10ug/mL)。
3.实验动物
SPF级雄性ICR种小鼠，体重18～22g，购自南京中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(苏)2015-0001。
二、实验方法
1.小鼠悬尾实验
小鼠给以阳性药与中药组合提取物7天后，于末次灌胃给药30min后，用悬尾箱顶板中心绳连着的小夹子夹住小鼠尾尖，使小鼠成倒挂状态，其头部离箱底约5cm。小鼠悬挂2min后，立即开始观察，观察持续4min，累计此4min内小鼠的不动时间。
2.小鼠强迫游泳实验
小鼠给以阳性药与中药组合提取物7天后，于末次给药30min后，将小鼠放入高20cm，直径14cm的圆柱形玻璃缸中，每缸1只，缸中水深10cm，水温25℃。小鼠游泳2min后，立即开始观察，观察持续4min，累计此4min内的不动(小鼠在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动)时间。
3.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1.小鼠悬尾实验测试结果
给药7天后，进行小鼠悬尾实验测试。由图1可以看出，小鼠经灌胃中药提取物7天后，小鼠悬尾过程中的不动时间显著减少，与生理盐水组相比有显著性差异(P<0.05)，其趋势与阳性药氟西汀作用相当，显示出明显的抗抑郁作用。
2.小鼠强迫游泳实验测试结果
给药7天后，进行小鼠强迫游泳实验。由图2可以看出，小鼠经灌胃7天后，本发明提供的中药提取物可减少小鼠强迫游泳的不动时间，与生理盐水组相比有显著性差异(P<0.05)，其趋势与阳性药氟西汀作用相当，显示出明显的抗抑郁作用。
实施例3中药提取物对抑郁动物脑内神经递质影响实验研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
Agilent1290Series高效液相色谱仪；AgilentQQQ6410A三重四级杆质谱仪；分析色谱柱：ACEC18-AR,1.8μm,2.1x100mm；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；超纯水制备仪(南京易普易达公司)。
2.药物：标准品多巴胺，去甲肾上腺素，5-羟色胺均购自Sigma-Aldrich公司；受试药物：本发明实施例1制备得到的中药提取物(低剂量、中剂量、高剂量分别为1、3、10ug/mL)。
二、实验方法
1.样品处理
将完成行为学测试的小鼠处死后解剖取全脑组织，按5g/mL的浓度值加入一定体积的甲酸(0.5M)，高速分散制成匀浆液，13200转/分离心5分钟后取上清液。
2.液相色谱分离
条件如下：
②层析条件：流动相：0.1％甲酸(A)，乙腈+0.1％甲酸。流速：0.2ml/min。梯度条件：0.0min:99％A；2.0min:99％A；6.0min:90％A；10min:90％A。
3.质谱检测
干燥气温度(Dryinggastemperature)：325℃；干燥气流速(Dryinggasflow):10L/min；毛细管电压(Vcap):4000V；雾化电压(Nebulizer)：35psig；检测极性(Polarity):Positive；扫描模式(Scanmode)：多离子检测模式(MRM)；检测离子对(Ionpairsdetection)：154.1>137.1，154.1>91.1(多巴胺)；170.1>153.1，170.1>107.1(去甲肾上腺素)；170.1>153.1，170.1>107.1(去甲肾上腺素)；177.1>160.1，177.1>115.1(5-羟色胺)；
4.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
由图3可以看出，本发明提供的中药提取物中剂量与高剂量均可显著提升小鼠脑内与抑郁症发病密切相关的多巴胺，去甲肾上腺素与5-羟色胺的含量，与生理盐水组相比有显著性差异(P<0.05)。与之相比，阳性药氟西汀仅对5-羟色胺具有显著的上调作用，本发明提供的中药提取物的作用靶点则更为全面广泛。
实施例4中药提取物对抑郁动物脑内神经营养因子影响实验研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
Nanodrop(DS11spectrophotometer，DeNovix公司)，ABI7500荧光实时定量PCR仪(Invitrogen公司)，高速离心机(AllegraX-12RCentrifuge和Microfuge22RCentrifuge，Backman公司)，恒温水浴锅(Bluepard公司)。
2.试剂与药物
TRIzolRNA提取试剂盒(15596-026，Invitrogen)。RT-PCR反转录试剂盒(PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser,RR047A，TAKARA)；SYBR荧光定量PCR试剂(FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX),04913914001，Roche)。Bradford试剂盒(T9310A，TAKARA)。受试药物：本发明实施例1制备得到的中药提取物(低剂量、中剂量、高剂量分别为1、3、10ug/mL)。
二、实验方法
1.RNA提取
取-80℃保存的小鼠海马组织50mg，加入500μL的TRIzol，按TRIzolRNA提取试剂盒所列步骤进行操作。所提取RNA于-80℃保存。
2.cDNA制备：用Nanodrop测试RNA的浓度和纯度，根据TaKaRa逆转录试剂盒的说明，总计取用1μg的RNA来进行逆转录操作，制备cDNA。
3.实时定量荧光PCR仪测定神经营养因子转录水平表达
依照SYBR荧光实时定量试剂盒操作步骤，利用荧光实时定量PCR仪测定神经营养因子的基因转录水平表达。所用引物序列如下：
3.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
由图4可以看出，小鼠经灌胃7天后，本发明提供的中药提取物中剂量与高剂量均可显著提升脑组织内与抑郁症发病密切相关的NGF、BDNF与GDNF的含量，与生理盐水组相比有显著性差异(P<0.05)。与之相比，作用趋势与阳性药氟西汀相似。
实施例5中药提取物对神经递质合成酶与降解酶表达的实验研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
二氧化碳培养箱(FormaseriesⅡwaterjacketCO2incubator，Thermo公司)，1300seriesA2超净工作台(Thermo公司)，AutoVertA1倒置荧光显微镜(ZEISS公司)，恒温水浴锅(Bluepard公司)，多功能酶标仪(Enspire，PerkinElmer公司)，细胞培养器皿(CORNING公司)。
2.试剂与药物
TRIzolRNA提取试剂盒(15596-026，Invitrogen)。RT-PCR反转录试剂盒(PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser,RR047A，TAKARA)；SYBR荧光定量PCR试剂(FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX),04913914001，Roche)。Bradford试剂盒(T9310A，TAKARA)。NGF(Almonelab)。受试药物：本发明实施例1制备得到的中药提取物(低剂量、中剂量、高剂量分别为1、3、10ug/mL)。
3.细胞株
大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)细胞株，来源于自ATCC细胞库。
二、实验方法
1.细胞培养与给药
将PC12细胞按接种量2×105个/孔接种于6孔板中培养24h后，对照组每24h换一次新鲜培养液，共培养48h。样品组加实施例1中药提取物低剂量、中剂量、高剂量(1、3、10ug/mL)24h后，换液，重新加入上述中药提取物，培养24小时。阳性药组：NGF(100μM)，按上述加药方法培养48小时。
2.实时定量荧光PCR仪测定神经营养因子转录水平表达
RNA提取：吸去细胞培养液，加入2mL的PBS冲洗，每盘细胞中加入500μL的TRIzol，按TRIzolRNA提取试剂盒所列步骤进行操作。所提取RNA于-80℃保存。
cDNA的制备：用Nanodrop测试RNA的浓度和纯度，根据TaKaRa逆转录试剂盒的说明，总计取用1μg的RNA来进行逆转录的操作。
依照SYBR荧光实时定量试剂盒操作步骤，利用荧光实时定量PCR仪测定神经营养因子的基因转录水平表达。所用引物序列如下：
3.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
PC12细胞常用于神经递质表达研究。将体外培养的PC12细胞，加以本发明提供的中药提取物培养后，如图5所示，中药提取物可以上调神经递质合成酶Tyrosinehydroxylase、Aromaticaciddecarboxylase、Dopamine-b-hydroxylase，由图6所示，可下调神经递质降解酶MonoamineoxidaseA、MonoamineoxidaseB、Catechol-O-methyltransferase的表达。与阳性药NGF作用趋势一致，提示本发明提供的中药提取物具有促进神经递质合成，抑制神经递质降解的活性。
实施例6中药提取物对神经营养因子表达的体外实验研究
一、实验材料与药物
1.实验仪器
二氧化碳培养箱(FormaseriesⅡwaterjacketCO2incubator，Thermo公司)，1300seriesA2超净工作台(Thermo公司)，AutoVertA1倒置荧光显微镜(ZEISS公司)，恒温水浴锅(Bluepard公司)，多功能酶标仪(Enspire，PerkinElmer公司)，细胞培养器皿(CORNING公司)。
2.试剂与药物
TRIzolRNA提取试剂盒(15596-026，Invitrogen)。RT-PCR反转录试剂盒(PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser,RR047A，TAKARA)；SYBR荧光定量PCR试剂(FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX),04913914001，Roche)。Bradford试剂盒(T9310A，TAKARA)。NGF(Almonelab)；受试药物：本发明实施例1制备得到的中药提取物。
3.细胞株
大鼠胶质瘤(C6)细胞株，来源于ATCC细胞库。
二、实验方法
1.细胞培养与给药
将C6细胞按接种量2×105个/孔接种于6孔板中培养24h后，对照组每24h换一次新鲜培养液，共培养48h。样品组加实施例1中药提取物低剂量、中剂量、高剂量(1、3、10ug/mL)24h后，换液，重新加入上述中药提取物，培养24小时。阳性药组：cAMP(100μM)，按上述加药方法培养48小时。
2.实时定量荧光PCR仪测定神经营养因子转录水平表达
RNA提取：吸去细胞培养液，加入2mL的PBS冲洗，每盘细胞中加入500μL的TRIzol，按TRIzolRNA提取试剂盒所列步骤进行操作。所提取RNA于-80℃保存。
cDNA的制备：用Nanodrop测试RNA的浓度和纯度，根据TaKaRa逆转录试剂盒的说明，总计取用1μg的RNA来进行逆转录的操作。
依照SYBR荧光实时定量试剂盒操作步骤，利用荧光实时定量PCR仪测定神经营养因子的基因转录水平表达。所用引物序列如下：
3.统计学处理
所有实验数据均采用SPSS18.0统计处理软件进行统计学处理，结果以表示，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
C6细胞常用于神经递质表达研究。将体外培养的C6细胞，加以实施例1中的中药提取物培养后，如图7所示，本发明提供的中药提取物可以上调NGF、BDNF与GDNF的含量，与生理盐水组相比有显著性差异(P<0.05)。与之相比，作用趋势与阳性药cAMP相似。
以上实验结果表明，本发明提供的中药提取物具有显著的改善抑郁情绪、促进神经递质与神经营养因子表达等功能，具有很好的对抗抑郁症的作用。与现有的最常用的抗抑郁西药氟西汀相比，该组合物具有更多种类的神经递质调控作用靶点，还具有显著的促进多种神经营养因子表达的效用，尤为氟西汀所不及，具有较高的药物开发价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，它由下列方法制备得到：
步骤1：选取如下原料药：人参300-600份、远志200-400份、石菖蒲200-400份、茯苓300-600份；
步骤2：取步骤1的原料药，加水提取，取提取液浓缩，得浓缩液；
步骤3：取步骤2的浓缩液，通过大孔树脂柱洗脱，得洗脱液，浓缩。
2.如权利要求1所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，步骤1中原料药的组成为：
人参300份、远志200份、石菖蒲200份、茯苓300份。
3.如权利要求1或2所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，步骤2中，将原料药用加水回流提取2-4次，每次提取1-2小时。
4.如权利要求1或2所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，将步骤2所得提取物浓缩成浓度为0.5-1.0g/mL。
5.如权利要求1或2所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，步骤3所述的大孔树脂洗脱条件为：吸附流速为1.0-2.0mL/min，洗脱液依次用水和体积浓度为10-90％的乙醇，分别洗脱3-7倍树脂体积，洗脱流速为1.0-2.0mL/min，收集乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得。
6.如权利要求1或2所述的具有抗抑郁作用的中药提取物，其特征在于，步骤3中所述的大孔树脂洗脱条件为：860021型大孔吸附树脂，吸附流速为2.0mL/min，大孔树脂柱径高比为1:10，水洗脱2倍树脂体积进行除杂，除杂流速为1.0mL/min；然后以10％，30％，50％，70％，90％体积浓度乙醇依次洗脱大孔树脂柱5倍柱体积，收集体积浓度为90％乙醇洗脱液，减压干燥，即得。
7.权利要求1或2所述的具有抗抑郁作用的中药提取物在制备防治抑郁症药物中的应用。
8.根据权利要求6所述的具有抗抑郁作用的中药提取物在制备防治抑郁症药物中的应用，其特征在于，将中药提取物和药学上可接受的载体制成片剂、丸剂、散剂、汤剂、颗粒剂、煎膏剂或浸膏剂。
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