CN110551138A - 贯叶连翘提取物及其制法和制备抗阿尔兹海默病药的应用 - Google Patents

贯叶连翘提取物及其制法和制备抗阿尔兹海默病药的应用 Download PDF

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Abstract

本发明对药用植物贯叶连翘(Hypericum perforatum)的乙醇提取物进行分离纯化，得到5个新骨架化合物1‑5，综合运用多种波谱分析方法和其他手段，确定其为间苯三酚类衍生物，通过BACE1抑制活性和PP2A激活活性的评价，发现所得化合物对BACE1和PP2A双靶点均具有调节作用，在体外细胞模型中可明显抑制BACE1活性以减少Aβ及激活PP2A活性以降低tau蛋白磷酸化水平，在三重转基因AD小鼠模型中，化合物2和3还显示出良好的减轻认知功能障碍及记忆障碍的作用，本发明化合物可用于制备治疗阿尔兹海默病的药物。

Description

贯叶连翘提取物及其制法和制备抗阿尔兹海默病药的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及具有抗阿尔兹海默病活性的化合物及其分离制备方法和应用，具体涉及对药用植物贯叶连翘(Hypericum perforatum)的乙醇提取物进行分离纯化，结构确证及其对双靶点BACE1和PP2A的调节作用评价。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，又称老年性痴呆症，是一种起病隐匿、与年龄相关的以痴呆为特征的大脑退行性变性疾病，临床表现为短期记忆退化、理解表达能力下降、认知障碍及性格改变等。随着世界老年人口的急速增长，AD发病人数也逐年增多，时至今日，全球AD患者已经突破4000万人，随着全球人口老龄化加速，预计至2050年AD患者将超过1亿人。近年来的研究表明，AD患者脑部神经细胞胞外存在大量淀粉样蛋白斑沉积及胞内神经纤维高度缠结，其中，淀粉样蛋白斑的主要成分是β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)，而高度缠结的神经纤维的主要成分则是过度磷酸化的tau蛋白(一种微管相关蛋白)。Aβ是β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)先后经β、γ-分泌酶剪切的产物。处于上游的β-分泌酶(βamyloid cleaving enzyme1，BACE1)是治疗AD的关键靶点。因此抑制BACE1是防治AD的重要途径。另一方面，蛋白磷酸激酶与蛋白磷酸酯酶的调节失衡，直接导致了阿尔茨海默病样tau蛋白的过度磷酸化，蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)是最具活性的蛋白磷酸酯酶，能对过度磷酸化的tau蛋白脱磷酸化，从而可以通过激活PP2A的活性达到治疗AD的作用。由于AD的发病机制的复杂性，单一靶向的治疗药物效果有限，因此，多靶点治疗AD的策略亟待开发。
贯叶连翘(Hypericum perforatum)：又名圣约翰草(St.John’s wort)，系藤黄科金丝桃属多年生草本植物。贯叶连翘在民间已有二千四百余年的药用历史。传统中医药学认为，其性平，味辛苦涩，具有清心明目、舒经活血、止血生肌、解毒消炎、利湿之功效。目前，用贯叶连翘提取物制成的制剂已在欧美大量上市，主要用于治疗抑郁症、甲型和乙型肝炎及艾滋病等。近年来，随着阿尔兹海默病的患者不断的增加，AD已经成为继心脏病和癌症之后危害人类健康的主要疾病之一。但该疾病治疗药物少、疗效不佳，当前研发单一靶点抗AD新药屡屡受挫，亟待新的防治策略。天然产物、特别是有着复杂三维结构的天然产物是药物开发的重要来源。从药用植物中寻找结构新颖的治疗AD的先导化合物具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的任务是提供贯叶连翘提取物。
本发明的另一个任务是提供所述的贯叶连翘提取物的制备方法。
本发明的又一个任务是提供所述的贯叶连翘提取物的应用。
实现本发明的技术方案是：
本发明的提供的贯叶连翘提取物是具有以下式1-式5所示结构的化合物1至化合物5：
化合物1：金丝桃环酮A(Hyperforone A)
化合物2：金丝桃环酮B(Hyperforone B)
化合物3：金丝桃环酮C(Hyperforone C)
化合物4：金丝桃环酮D(Hyperforone D)
化合物5：金丝桃环酮E(Hyperforone E)
本发明提供的上述化合物1至化合物5的制备方法包括如下步骤：
(1)贯叶连翘的干燥茎叶粉碎后用乙醇提取，减压浓缩后得到总浸膏；
(2)将步骤(1)得到的总浸膏悬浮于水中，用二氯甲烷萃取，得到二氯甲烷部位；
(3)对步骤(2)得到的二氯甲烷部位进行硅胶柱层析，梯度洗脱，用TLC检测合并相似的部分，得到7个组分：Ⅰ-Ⅶ；
(4)将步骤(3)得到的组分Ⅲ经过MCI柱脱色后，除去色素，再经过反相C18柱层析，用TLC检测合并相似的部分，得到8个组分：Ⅲ1-Ⅲ8；
(5)将步骤(4)得到的组分Ⅲ5进行硅胶柱层析，梯度洗脱，用TLC检测合并相似的部分，得到11个组分：Ⅲ5a-Ⅲ5k；
(6)将步骤(5)得到的组分Ⅲ5d经过凝胶柱层析后，再使用反相柱层析，用TLC检测合并相似的部分得到5个组分：Ⅲ5d1-Ⅲ5d5；
(7)将步骤(6)得到的组分Ⅲ5d2经过反相高效液相色谱，得到结构如式2所示的化合物；
(8)将步骤(5)得到的组分Ⅲ5e通过凝胶柱层析以及反相高效液相色谱分离得到12个组分：Ⅲ5e1-Ⅲ5e12；
(9)将步骤(8)得到的组分Ⅲ5e9经过反相高效液相色谱纯化得到结构如式1所示的化合物；
(10)将步骤(8)得到的Ⅲ5e12经反相高效液相色谱得到了结构如式3所示的化合物；
(11)将步骤(4)得到的组分Ⅲ6通过硅胶柱层析，梯度洗脱，用TLC检测合并相似的部分，得到8个组分：Ⅲ6a-Ⅲ6h；
(12)将步骤(11)得到的组分Ⅲ6c经过反相柱层析以及正相高效液相色谱得到了结构如式4所示的化合物；
(13)将步骤(11)得到的组分Ⅲ6d经过凝胶柱层析和反相柱层析，用TLC检测合并相似的部分，得到9个组分：Ⅲ6d1-Ⅲ6d9；
(14)将步骤(13)得到的组分Ⅲ6d6通过反相高效液相色谱得到结构如式5所示的化合物5。
步骤(1)所述的步骤具体可以为：将贯叶连翘的干燥茎叶粉碎后用体积分数95％的乙醇提取3次，每次室温下浸泡4-5天，减压浓缩后得到总浸膏。
步骤(3)中所述的梯度洗脱具体为用石油醚:丙酮，体积比100:0-0:100，进行梯度洗脱；步骤(4)中所述的反相C18柱层析具体为以甲醇-水，体积比50:50-100:0，进行反相C18柱层析；步骤(5)中所述的梯度洗脱具体为以石油醚:丙酮，体积比30:1-0:1，进行梯度洗脱；步骤(6)中所述的反相柱层析具体为以甲醇-水，体积比50:50-100:0进行反相柱层析；步骤(7)中所述的反相高效液相色谱具体为以95％乙腈-水(乙腈和水体积比为95:5)进行反向高效液相色谱；步骤(8)所述的反向高效液相色谱具体为用80％乙腈-水(乙腈-水体积比80:20)进行反向高效液相色谱；步骤(9)所述的反相高效液相色谱具体为以95％乙腈-水(乙腈和水体积比为95:5)，进行反向高效液相色谱；步骤(10)所述的反相高效液相色谱具体为用95％乙腈-水(乙腈和水体积比为95:5)进行反向高效液相色谱；步骤(11)所述的梯度洗脱具体为用石油醚:乙酸乙酯，体积比30:1-0:1进行梯度洗脱；步骤(12)所述的反相柱层析具体为以甲醇-水，体积比60:40-90:10进行反相柱层析；步骤(12)所述的正相高效液相色谱具体为用98％正己烷-乙醇(正己烷-乙醇的体积比为98:2)进行正相高效液相色谱；步骤(13)所述的反相柱层析具体为以甲醇-水，体积比60:40-80:20进行反相柱层析；步骤(14)所述的反相高效液相色谱具体为用95％乙腈-水(乙腈和水体积比为95:5)，进行反相高效液相色谱。
为了得到更纯净的提取物，步骤(7)、步骤(9)、步骤(10)、步骤(12)、步骤(14)中得到化合物之前还可以包括纯化步骤。
结构如式1-式5所示的化合物(化合物1-5)中的任一种在制备BACE1抑制药物中的应用。
结构如式1-式5所示的化合物(化合物1-5)中的任一种在制备PP2A激活药物中的应用。
结构如式1-式5所示的化合物(化合物1-5)中的任一种在制备用于治疗阿尔兹海默病药物中的应用。
本专利申请发明人通过对药用植物贯叶连翘(Hypericum perforatum)的乙醇提取物进行分离纯化，得到5个新骨架化合物。综合运用多种波谱分析方法和其他手段，确定其为间苯三酚类衍生物，具体结构如上述式Ⅰ所示。通过对式Ⅰ所示化合物1-5的BACE1抑制活性和PP2A激活活性的评价，发现化合物1-5对两个AD相关的重要靶点均有调节作用，其中化合物3表现出良好的双靶点调节作用，并在三重转基因AD小鼠模型上显示出良好的减轻认知功能障碍的作用。本发明提供的化合物1-5中的任一种可用于制备具有BACE1抑制作用的药物或/和具有PP2A激活作用的药物。本发明提供的化合物1-5中的任一种可用于制备用于治疗阿尔兹海默病的药物。
附图说明
图1：化合物3晶体结构
图2：在细胞系，化合物2和3可通过调节PP2A活性和BACE1活性下调Tau磷酸化水平和毒性Aβ42的生成：免疫印迹(图A)及其统计结果(图B)显示，在HEK293-tau细胞中，2和3可下调tau蛋白Ser199，Thr231，Ser396，Ser404位点的磷酸化水平，用tau1显示的非磷酸化tau水平上调，并且tau5显示的tau蛋白总体水平没有变化。
图3：A和B活性检测结果显示，在HEK293-tau细胞中，2和3处理均可上调PP2A活性，但不影响GSK-3β活性。免疫印迹(图C)及其统计结果(图D)显示，在HEK293-tau细胞中，2和3处理可上调PP2A Lue309位点甲基化(PP2A激活形式)水平，下调Tyr30位点磷酸化(PP2A失活形式)水平，并且PP2A蛋白总体水平没有变化。
图4：图A.活性检测结果显示，在N2a-APP细胞中，2和3均可下调动物脑内BACE1活性水平，效果与阳性对照药LY2811376相当。图B.ELISA检测结果显示，在N2a-APP细胞中，2和3均可下调动物脑内毒性Aβ42的蛋白水平，效果与阳性对照药LY2811376相当。图C，D和E中的免疫印迹及其统计结果显示，在N2a-APP细胞中，2和3处理可减少APPβ剪切片段的生成，效果与阳性对照药LY2811376相当，并且不影响APP和BACE1蛋白总体水平。
图5：2和3的处理可在一定程度上拯救3×Tg小鼠的学习记忆损伤：图A和B对新事物识别检测结果显示，2和3与阳性对照药物在相似的程度上提高了动物对新事物识别的能力，即学习记忆能力。
图6：图A的水迷宫训练结果显示，从训练第一天到第六天，2和3与阳性对照药物在相似的程度上减少了动物找到平台的潜伏期，并且3效果最明显。图B，C，D，E和F中水迷宫第七天检测结果显示，2和3与阳性对照药物在相似的程度上减少了动物找到平台的潜伏期，增加了穿越平台的次数以及在有效区停留时间，并且运动功能没有改变。
图7：化合物2和3的处理的处理可在一定程度上上调3×Tg小鼠脑内突触相关蛋白表达，以及增加树突棘密度和树突分枝，从而改善小鼠学习记忆功能。图A和B中免疫印迹及其统计结果显示，2和3以及阳性对照药物的处理可上调突触前相关蛋白synapsin1和synaptophysin的蛋白水平，上调突触后相关蛋白PSD-93和PSD-95的蛋白水平。化合物3的效果尤为显著。图C，D和E中高尔基染色及其统计结果显示，2和3以及阳性对照药物的处理可增加树突棘密度和树突分枝，且3的效果尤为显著。
图8：本发明贯叶连翘提取物的提取分离过程流程图。
具体实施方式
实施例1
一、如式(1)所示化合物1-5的制备
1.植物信息
本植物的茎叶于2014年8月采摘自中华人民共和国湖北省神农架地区，由华中科技大学张长弓教授鉴定为贯叶连翘(Hypericum perforatum)。植物标本存放于华中科技大学同济医学院药学院天然药物化学与资源评价重点实验室标本室，标本号为HP20140826。
2.提取分离(见图8)
贯叶连翘的干燥茎叶(105kg)粉碎后用95％乙醇(乙醇:水＝95:5,v/v)提取3次，每次室温下浸泡4-5天，减压浓缩后得到总浸膏8.3kg。将总浸膏悬浮于水中，用二氯甲烷萃取，最终得到二氯甲烷部位3.8kg。二氯甲烷部位进行硅胶柱层析(青岛海洋化工产100-200目正相硅胶)，石油醚：丙酮梯度洗脱(1:0-0:1,v/v)，用TLC检测合并相似的部分，得到7个组分(Ⅰ-Ⅶ)。组分Ⅲ经过MCI柱脱色除去色素，再经过反相C18柱层析(甲醇-水＝50:50-100:0,v/v)，用TLC检测合并相似的部分，得到8个组分：组分Ⅲ1-Ⅲ8。
其中的组分Ⅲ5再次进行硅胶柱层析，石油醚：丙酮梯度洗脱(30:1-0:1,v/v)，用TLC检测合并相似的部分，最终得到11个组分：Ⅲ5a-Ⅲ5k。其中的Ⅲ5d经过凝胶柱层析后，再使用反相柱层析(甲醇-水＝50:50-100:0,v/v)，用TLC检测合并相似的部分后得到5个组分。其中的第二个组分(Ⅲ5d2)进一步经过反相高效液相色谱(HPLC，乙腈-水＝95％-5％,v/v)纯化得到了化合物2(22.8mg)。
同时，另外一个组分Ⅲ5e通过凝胶柱层析以及反相HPLC(乙腈-水＝80％-20％,v/v)分离得到12个组分：Ⅲ5e1-Ⅲ5e12。第9个组分Ⅲ5e9经过反相HPLC(乙腈-水＝95％-5％,v/v)纯化得到了化合物1(4.5mg)；第12个组分Ⅲ5e12经过反相HPLC(乙腈-水＝95％-5％,v/v)纯化得到了化合物3(9.4mg)。
而组分Ⅲ6则通过硅胶柱层析，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱(30:1-0:1,v/v)，用TLC检测合并相似的部分，得到8个组分：Ⅲ6a-Ⅲ6h。其中的组分Ⅲ6c经过反相柱层析(甲醇-水＝60:40-90:10,v/v)以及进一步的正相HPLC纯化(正己烷-乙醇＝98％-2％,v/v)得到了化合物4(5.6mg)。
另一个组分Ⅲ6d经过凝胶柱层析和反相柱层析(甲醇-水＝60:40-80:20,v/v)，用TLC检测合并相似的部分后得到9个组分：Ⅲ6d1-Ⅲ6d9。其中的第6个组分Ⅲ6d6进一步通过反相HPLC(乙腈-水＝95％-5％,v/v)纯化得到化合物5(15.3mg)。
二、如式(1)所示化合物1-5的结构鉴定
对化合物1-5的高分辨质谱，紫外光谱，红外光谱，旋光，核磁共振，圆二色谱和X射线单晶衍射等数据进行综合分析，从而确定化合物1-5的结构。化合物1：Colorless gum,IR vmax＝3438,1649,1605,1420,1136cm-1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.23)and 278(4.01)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)207(-17.08),270(-8.24),323(-1.13)nm；HRESIMS[M+H]+m/z429.2982(calcd for C27H41O4,429.3005)化合物1的核磁共振(NMR)数据如表(1)和表(2)所示。
化合物2：Colorless oil,IR vmax＝3450,2976,1734,1696,1462,1158cm-1；UV(MeOH)λmax(logε)＝204(4.22)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)207(-6.68),242(-2.16),289(+3.65)nm；HRESIMS[M+H]+m/z 447.3113(calcd for C27H43O5,447.3110)化合物2的核磁共振(NMR)数据如表(1)和表(2)所示。
化合物3：Colorless crystals,mp 155-157℃；IRvmax＝3436,1737,1703,1626,1452,1383cm-1；UV(MeOH)λmax(logε)＝202(4.19)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)217(-2.37),272(+1.49),304(-2.11)nm；HRESIMS[M+Na]+m/z 537.3182(calcd for C31H46O6Na,537.3192)化合物3的核磁共振(NMR)数据如表(1)和表(2)所示。晶体结构如图(1)所示。
化合物4：Colorless oil,IR vmax＝3449,2974,2927,1749,1698,1629,1451,1382cm-1；UV(MeOH)λmax(logε)＝202(4.11)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)237(+2.93),306(-2.51)nm；HRESIMS[M+Na]+m/z 537.3196(calcd for C31H46O6Na,537.3192)化合物4的核磁共振(NMR)数据如表(1)和表(3)所示。
化合物5：Colorless oil,IR vmax＝3439,2968,2927,1739,1706,1628,1453,1382cm-1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(3.96)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)217(-0.94),308(-2.02)nm；HRESIMS[M+H]+m/z 515.3375(calcd for C31H47O6,515.3373)化合物5的核磁共振(NMR)数据如表(1)和表(3)所示。
表(1).化合物1-5的13C NMR数据(J in Hz)
表(2).化合物1-3的1H NMR数据(J in Hz).
表(3).化合物3-5的1H NMR数据(J in Hz).
实施例2：化合物1-5对BACE1和PP2A的双靶点调节作用。
化合物1-5对BACE1的抑制活性在N2a/APP细胞中进行测试，对PP2A的激活活性则在HEK293/tau细胞中进行。初步的酶活性实验表明，化合物1-5均能在一定程度上抑制BACE1活性及激活PP2A活性，其中以化合物2和3的作用最为显著，其活性明显高于阳性对照，结果如表(4)所示。对化合物2和3进行体外细胞活性评价，结果表明2和3可明显减弱细胞中tau蛋白的磷酸化水平(图2)同时还可提高PP2A活性(图3)，此外，2和3还可以通过抑制BACE1活性从而降低Aβ的含量(图4)。进一步对化合物2和3进行AD小鼠模型体内活性评价，结果显示2和3可缓解AD小鼠对新事物的认知障碍(图5)、记忆障碍(图6)、提高小鼠脑部突触相关蛋白的水平及恢复AD小鼠海马区初级树突受损(图7)。综合体外体内活性评价实验，较化合物2来说，化合物3的活性更高，甚至强于阳性对照药。
表(4).化合物1-5对BACE1和PP2A的双靶点调节作用
实验结论：化合物1-5对BACE1和PP2A双靶点均具有调节作用。其中，化合物2和3表现出的活性尤为突出，在体外细胞模型中可明显抑制BACE1活性以减少Aβ及激活PP2A活性以降低tau蛋白磷酸化水平。此外，在三重转基因AD小鼠模型中，化合物2和3还显示出良好的减轻认知功能障碍及记忆障碍的作用，且化合物3作用更强。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.具有以下式1、式2或式5所示结构的化合物：
2.权利要求1中所述式1化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)贯叶连翘的干燥茎叶粉碎后用乙醇提取，减压浓缩后得到总浸膏；
(2)将步骤(1)得到的总浸膏悬浮于水中，用二氯甲烷萃取，得到二氯甲烷部位；
(3)对步骤(2)得到的二氯甲烷部位进行硅胶柱层析，用石油醚:丙酮，以体积比100:0-0:100，进行梯度洗脱，用TLC检测合并相似的部分，得到7个组分：Ⅰ-Ⅶ；
(4)将步骤(3)得到的组分Ⅲ经过MCI柱脱色除去色素，以甲醇-水，体积比50:50-100:0，进行反相C18柱层析，用TLC检测合并相似的部分，得到8个组分：Ⅲ1-Ⅲ8；
(5)将步骤(4)得到的组分Ⅲ5进行硅胶柱层析，石油醚:丙酮，体积比30:1-0:1，进行梯度洗脱，用TLC检测合并相似的部分，得到11个组分：Ⅲ5a-Ⅲ5k；
(6)将步骤(5)得到的组分Ⅲ5e通过凝胶柱层析，再用80％乙腈-水进行反向高效液相色谱，分离得到12个组分：Ⅲ5e1-Ⅲ5e12；
(7)将步骤(6)得到的组分Ⅲ5e9用95％乙腈-水进行反向高效液相色谱得到结构如式1所示的化合物。
3.权利要求1中所述式2化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)贯叶连翘的干燥茎叶粉碎后用乙醇提取，减压浓缩后得到总浸膏；
(2)将步骤(1)得到的总浸膏悬浮于水中，用二氯甲烷萃取，得到二氯甲烷部位；
(3)对步骤(2)得到的二氯甲烷部位进行硅胶柱层析，用石油醚:丙酮，以体积比100:0-0:100，进行梯度洗脱，用TLC检测合并相似的部分，得到7个组分：Ⅰ-Ⅶ；
(4)将步骤(3)得到的组分Ⅲ经过MCI柱脱色除去色素，以甲醇-水，体积比50:50-100:0，进行反相C18柱层析，用TLC检测合并相似的部分，得到8个组分：Ⅲ1-Ⅲ8；
(5)将步骤(4)得到的组分Ⅲ5进行硅胶柱层析，以石油醚:丙酮，体积比30:1-0:1，进行梯度洗脱，用TLC检测合并相似的部分，得到11个组分：Ⅲ5a-Ⅲ5k；
(6)将步骤(5)得到的组分Ⅲ5d经过凝胶柱层析后，再用甲醇-水，体积比50:50-100:0进行反相柱层析，用TLC检测合并相似的部分后，得到5个组分：Ⅲ5d1-Ⅲ5d5；
(7)将步骤(6)得到的组分Ⅲ5d2，用95％乙腈-水进行反向高效液相色谱，得到结构如式2所示的化合物。
4.权利要求1中所述式5化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)贯叶连翘的干燥茎叶粉碎后用乙醇提取，减压浓缩后得到总浸膏；
(2)将步骤(1)得到的总浸膏悬浮于水中，用二氯甲烷萃取，得到二氯甲烷部位；
(3)对步骤(2)得到的二氯甲烷部位进行硅胶柱层析，用石油醚:丙酮，以体积比100:0-0:100，进行梯度洗脱，用TLC检测合并相似的部分，得到7个组分：Ⅰ-Ⅶ；
(4)将步骤(3)得到的组分Ⅲ经过MCI柱脱色除去色素，以甲醇-水，体积比50:50-100:0，进行反相C18柱层析，用TLC检测合并相似的部分，得到8个组分：Ⅲ1-Ⅲ8；
(5)将步骤(4)得到的组分Ⅲ6通过硅胶柱层析，用TLC检测合并相似的部分，用石油醚:乙酸乙酯，体积比30:1-0:1，进行梯度洗脱得到8个组分：Ⅲ6a-Ⅲ6h；
(6)将步骤(5)得到的组分Ⅲ6d经过凝胶柱层析，再用甲醇-水，体积比60:40-80:20进行反相柱层析，用TLC检测合并相似的部分，得到9个组分：Ⅲ6d1-Ⅲ6d9；
(7)将步骤(6)得到的组分Ⅲ6d6，用95％乙腈-水进行反相高效液相色谱得到结构如式5所示的化合物5。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的步骤具体为：将贯叶连翘的干燥茎叶粉碎后用体积分数95％的乙醇提取3次，每次室温下浸泡4-5天，减压浓缩后得到总浸膏。
6.权利要求1所述化合物中的任一种在制备BACE1抑制药物中的应用。
7.权利要求1所述化合物中的任一种在制备PP2A激活药物中的应用。
8.权利要求1所述化合物中的任一种在制备用于治疗阿尔兹海默病药物中的应用。
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