CN114835724B - (+/-)-spiroganoapplanin A及其药物组合物与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供（+/‒）‑spiroganoapplanin A及其药物组合物与应用。属于药物技术领域。本发明试验结果显示，本发明的一对灵芝杂萜新化合物，（+）‑spiroganoapplanin A和（‒）‑spiroganoapplanin A具有抑制BACE1，CDK5和GSK3β表达，从而抑制Aβ的产生和tau蛋白磷酸化的作用，揭示其在治疗阿尔兹海默症中的价值。
Description
技术领域
本发明属于药物技术和食品领域，具体涉及化合物(+/-)-spiroganoapplanin A及其药物组合物和其制备方法与其在制药和食品中的应用。
背景技术
灵芝作为传统中药在我国已有2000多年的应用历史。灵芝的种类很丰富，除了药典品种赤芝和紫芝之外，其它的灵芝例如反柄紫芝、无柄灵芝、树舌灵芝等都是民间广泛应用的品种。尤其是树舌灵芝因其具有抗肿瘤、降低血糖、治疗乙型肝炎、神经衰弱等作用而被人们广泛应用，临床上也将其作为治疗肝病的重要药物。随着现代研究技术的发展，其活性成分多糖、三萜、杂萜等相继被报道，尤其是灵芝杂萜已经成为合成化学家和药理学家研究的热点。灵芝杂萜被发现具有慢性肾保护、抗肿瘤、抗炎和神经保护等方面的作用。本申请人前期的研究发现树舌灵芝中含有丰富的灵芝杂萜并具有抗神经炎症方面的活性，因此，本申请人继续对树舌灵芝的杂萜类成分进行系统挖掘，并从中分离得到一对结构新颖的灵芝杂萜化合物。目前本申请人对发现的杂萜进行了抑制BACE1，CDK5和GSK3β表达和抑制Aβ的产生和tau蛋白磷酸化的作用的研究，结果发现(±)-spiroganoapplanin A、(+)-spiroganoapplanin A和(-)-spiroganoapplanin A都能显著的抑制抑制BACE1，CDK5和GSK3β表达和抑制Aβ的产生和tau蛋白磷酸化的作用，提示该杂萜类化合物在治疗阿尔兹海默症方面具有一定的作用，而相关研究未见文献报道。
迄今为止，现有技术中未见有化合物(+/-)-spiroganoapplanin A及其制备方法以及在制药和食品中的应用的报道，也没有以其为活性成分的药物组合物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供化合物(+/-)-spiroganoapplanin A及其制备方法以及在制药和食品中的应用，该化合物具有抗阿尔兹海默症的作用。同时提供了以该化合物为有效成分的药物组合物，及其制备方法与在制药和食品中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
本发明首先公开了一种化合物，所述化合物名称为(+)-spiroganoapplanin A和(-)-spiroganoapplanin A。所述化合物具有下述结构式的灵芝杂萜类化合物，其晶体结构(晶体数据存于Cambridge Crystallographic Dta Centre(no.CCDC 2098350)。WWW.ccdc.cam.an.uk/conts/retrieving.html.)如下：
化合物(+/-)-spiroganoapplanin A的结构式
化合物(±)-spiroganoapplanin A的晶体结构
所述的化合物是通过从树舌灵芝中提取获得或通过人工合成获得。
本发明第二方面提供了一种新化合物的药物组合物，所述药物组合物包括(+)-spiroganoapplanin A和(-)-spiroganoapplanin A或其药学上可接受的衍生物及其盐类。
进一步地，所述的药物组合物为药物制剂，其是由(+)-spiroganoapplanin A和(-)-spiroganoapplanin A或其药学上可接受的衍生物及其盐类作为活性成分和药学上可接受的载体组成。
药学上可接受的载体包括：固体制剂包括：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；半固体制剂包括软膏剂、栓剂等；液体制剂包括：溶液剂、注射剂、喷雾剂等；眼用制剂包括：滴眼剂、眼用凝胶剂等。
本发明第三方面还公布了一种杂萜化合物或药物组合物的制备方法，方法包括：
取树舌灵芝39kg，粉碎，用20倍体积的95％乙醇回流提取，提取物减压回收乙醇，得到浸膏，浸膏混悬于水中，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯层浓缩后，用大孔吸附树脂(D-101)分离，甲醇/水洗脱，得到30％、50％、70％、90％和100％五个部分(FractionsA→E)。其中Fr.D部分用反相硅胶柱处理，甲醇/水(50％→80％)为洗脱剂，合并后得到10个部分(Fr.D1→Fr.D10)。第5个部分再用凝胶(Sephadex LH-20)柱层析分离，甲醇洗脱，合并得到3个部分(Fr.D5-1→Fr.D5-3)，Fr.D5-3部分用半制备HPLC(乙腈/水＝35：65+0.1％CF3COOH)纯化得到(±)-spiroganoapplanin A(12mg，tR＝16.8min)。该化合物是一对对映体，经过手性拆分(正己烷/乙醇＝77：23)得到(-)-spiroganoapplanin A(3.8mg,tR＝23.7min)和(+)-spiroganoapplanin A(3.5mg,tR＝33.1min)。其药物组合物的制备是进一步将化合物，加入药学上可接受的载体；或将化合物进一步制备为药学上可接受的衍生物及其盐类，再加入药学上可接受的载体所制得。
本发明第四方面提供了第一方面所述的新化合物在制备治疗阿尔兹海默症的药物和食品中的应用。
本发明第五方面提供了第二方面所述的新化合物的药物组合物在制备治疗阿尔兹海默症的药物和食品中的应用。
本发明提供的化合物(+/-)-spiroganoapplanin A，从树舌灵芝中提取分离或经人工合成制得，在治疗阿尔兹海默症方面有良好得疗效。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选0.5-90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
所述的药用载体是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射(静注、肌注)、口服、滴丸三种形式给药。
与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：
1.本发明提供了两个新的化合物(+/-)-spiroganoapplanin A；填补了现有技术的空白。
2.本发明提供了制备新的化合物(+/-)-spiroganoapplanin A的方法，该方法原料易得，易于操作，收率高，适于工业化生产。
3.本发明提供了新的化合物(+/-)-spiroganoapplanin A作为有效成分的药物组合物，为新的治疗阿尔兹海默症药物提供了具有较好药用作用的新的药物。
4.本发明的新的化合物(+/-)-spiroganoapplanin A能通过靶向BACE1、CDK5和GSK3β抑制Aβ42的产生和tau蛋白的磷酸化来发挥抗阿尔兹海默症的作用。
5.新的化合物(+/-)-spiroganoapplanin A可作为药物用于治疗阿尔兹海默症等相关的疾病。
附图说明
图1为本发明化合物的结构示意图；
图2为本发明化合物晶体结构示意图；
图3为本发明化合物对U251-APP细胞的细胞毒性和对BACE1表达及Aβ42产生的抑制活性；
图4为本发明化合物对CDK5，GSK3β及磷酸化tau蛋白表达的抑制作用。
具体实施方式
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明得实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明得实质对本发明进行得简单改进都属于本发明得范围。
实施例1：
化合物1的分离纯化。
取树舌灵芝39kg，粉碎，用20倍体积的95％乙醇回流提取，提取物减压回收乙醇，得到浸膏，浸膏混悬于水中，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯层浓缩后，用大孔吸附树脂(D-101)分离，甲醇/水洗脱，得到30％、50％、70％、90％和100％五个部分(FractionsA→E)。其中Fr.D部分用反相硅胶柱处理，甲醇/水(50％→80％)为洗脱剂，合并后得到10个部分(Fr.D1→Fr.D10)。第5个部分再用凝胶(Sephadex LH-20)柱层析分离，甲醇洗脱，合并得到3个部分(Fr.D5-1→Fr.D5-3)，Fr.D5-3部分用半制备HPLC(乙腈/水＝35：65+0.1％CF3COOH)纯化得到(±)-spiroganoapplanin A(12mg，tR＝16.8min)；该化合物是一对对映体，经过手性拆分(正己烷/乙醇＝77：23)得到(-)-spiroganoapplanin A(3.8mg,tR＝23.7min)和(+)-spiroganoapplanin A(3.5mg,tR＝33.1min)。
化合物结构鉴定如下：
化合物(±)-spiroganoapplanin A(1)，淡黄色固体，{(-)-1:[α]25 D-22.1(c0.10,MeOH)，CD(MeOH)Δε214-5.54，Δε253+3.90，Δε322-3.34，Δε369+1.88；(+)-1:[α]25 D+30.0(c 0.11,MeOH)，CD(MeOH)Δε213+11.0，Δε255-3.28，Δε320+4.91，Δε371-1.72}；UV(MeOH)λmax(logε):196(4.64)，258(4.14)，306(4.19)，和371(3.59)；IR(KBr)vmax 3450，2991，1750，1530，1417，1200cm-1；1H NMR和13CNMR data见表1；HRESIMS m/z 651.1463[M+Na]+(calcd for C34H28O12Na,651.1473)。
表1.化合物1的1H和13C数据
实施例2：
实施例1中化合物(+/-)-spiroganoapplanin A中的任一种或其组合，按常规法加注射用溶媒，精滤，灌封灭菌后可制成注射液。
实施例3：
实施例1中化合物(+/-)-spiroganoapplanin A中的任一种或其组合作为药物活性成分，使用几种赋型剂作为制备组合药物片剂的辅料成分，按照一定比例制成每片含有药物成分1-100mg的片剂样品。
实施例4：
实施例1中化合物(+/-)-spiroganoapplanin A中的任一种或其组合按常规法配以各种药用辅料可制成胶囊剂：
含有实施例1中化合物(+/-)-spiroganoapplanin A中的任一种或其组合作为有效成分的药物组合胶囊制剂的制备，使用实施例1中化合物(+/-)-spiroganoapplanin A中的任一种作为药物活性成分、使用几种赋形剂作为制备组合药物胶囊剂的辅料成分，按照一定比例制成每粒胶囊中含有化合物成分1-100mg的胶囊制剂。
实施例5：
取实施例1的方法制得的化合物(+/-)-spiroganoapplanin A中的任一种或其组合1份，10份植脂末，混匀，按照常规方法制成固体饮料。
实施例6：
化合物(+/-)-spiroganoapplanin A的活性评价。
细胞培养和处理。
U251-APP细胞和U251-MAPT P301S细胞是由中国科学院昆明动物所提供和培养的。细胞在Roswell RPMI-1640培养基中，37°的潮湿空气下培养(空气中含有5％的CO2，湿度为95％)，培养基中含有10％的胎牛血清(Gibco-BRL，10099-141)。将细胞接种在预热的6孔培养皿中，药物直接加入培养基，共孵育24个小时。
Western blot分析。
使用文献报道的方法对靶蛋白进行Western blotting分析。简言之，使用蛋白裂解缓冲液(Beyotime Institute of Biotechnology,P0013)制备培养U251-APP细胞裂解液。用BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime Institute of Biotechnology,P0012)检测蛋白浓度。共20μg蛋白质经12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad,L1620177Rev D)上。用5％(w:v)脱脂牛奶在室温下浸泡膜2小时。将膜与一抗共孵育，4℃下过夜，其中一抗包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(Proteintech,12990)]，β-分泌酶[BACE1(Cell SignalingTechnology,5606)]，早老素1[PSEN1(Cell Signaling Technology,5643]；早老素2[PSEN2(Cell Signaling Technology，9979)]，nicastrin蛋白[NICSTN(Cell SignalingTechnology,5665)]，早衰素增强子，分泌酶亚单位[PEN2(Cell Signaling Technology，8598)]，周期素依赖蛋白激酶[CDK5(Santa Cruz Biotechnology，sc-6247)]，磷酸化Tau蛋白(Ser396)(pTau396，PHF13)[Cell Signaling Technology,9632S]，磷酸化糖原合酶激酶3β(Ser9)(Pgsk3β)[Affinit，AF2016]，磷酸化Tau蛋白(Thr181)(pTau181)[CellSignaling Technology，12885S]，GSK-3β(D5C5Z)[Cell Signaling Technology，12456]，和磷酸化Tau蛋白(Thr217)[Abcam，ab192665]。用TBST(Tris-buffered saline，CellSignaling Technology，9997)和吐温20(0.1％，Sigma，P1379)冲洗膜3次，每次5分钟，随后与过氧化物酶偶联抗小鼠(474-1806)或抗兔(474-1516)IgG(1:500；KPL)在室温下反应1小时。使用ECL蛋白印迹检测试剂盒(Millipore，WBKLS0500)观察抗原表型。采用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，Bethesda，Maryland，USA)对密度测定进行评估。以GAPDH、β-微管蛋白或ACTB为加载对照，Western blot检测目标蛋白的密度。
Aβ的ELISA分析。
采用商品化ELISA试剂盒(Elabscience，E-EL-H0542c)检测U251-APP细胞上清中Aβ42/Aβ1-42的水平。根据试剂盒说明书检测Aβ42。
实验结果显示，在浓度为5和20μM下，(+/-)-spiroganoapplanin A对U251-APP细胞没有明显的毒性(图3中的A)。同时，能够显著抑制BACE1、NCSTN和PSEN1的表达，而对PSEN2和PEN2没有明显作用，如图3中的B-D所示。进一步，在20μM下，(+/-)-spiroganoapplanin A对Aβ42的累积有明显的降低作用(图3中的E)。这些结果说明(+/-)spiroganoapplanin A能通过抑制BACE1的表达来抑制Aβ42的产生。
在抗tau蛋白磷酸实验结果中，5和20μM的(+/-)-spiroganoapplanin A对CDK5和GSK3β蛋白的表达量有明显的降低(图4中的A-C)，同时，也能降低磷酸化的tau蛋白如Thr217、Thr181和ptau396的表达量(图4中的A-C)。这些结果说明(+/-)-spiroganoapplanin A通过抑制CDK5和GSK3β来抑制tau蛋白的磷酸化。
综上所述，(+/-)-spiroganoapplanin A能通过靶向BACE1、CDK5和GSK3β抑制Aβ42的产生和tau蛋白的磷酸化来发挥抗阿尔兹海默症的作用。
Claims (6)
1.如下结构式所示的化合物(+)-spiroganoapplanin A和(-)-spiroganoapplanin A，
2.权利要求1所述的化合物(+/-)-spiroganoapplanin A的制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：取树舌灵芝，粉碎，用20倍体积的95％乙醇回流提取，提取物减压回收乙醇，得到浸膏，浸膏混悬于水中，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯层浓缩后，用大孔吸附树脂D-101分离，甲醇/水洗脱，得到30％、50％、70％、90％和100％五个部分Fractions A→E；其中Fr.D部分用反相硅胶柱处理，甲醇/水50％→80％为洗脱剂，合并后得到10个部分Fr.D1→Fr.D10；第5个部分再用凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，甲醇洗脱，合并得到3个部分Fr.D5-1→Fr.D5-3，Fr.D5-3部分用半制备HPLC，乙腈/水＝35：65+0.1％CF3COOH纯化得到(±)-spiroganoapplanin A；该化合物是一对对映体，经过手性拆分，正己烷/乙醇＝77：23得到(-)-spiroganoapplanin A和(+)-spiroganoapplanin A。
3.权利要求1所述的化合物(+/-)-spiroganoapplanin A在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
4.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为药物制剂，由(+)-spiroganoapplaninA和/或(-)-spiroganoapplanin A或其药学上可接受的盐作为活性成分，和药学上可接受的载体所组成。
5.权利要求4所述的药物组合物在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
6.权利要求4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：取树舌灵芝，粉碎，用20倍体积的95％乙醇回流提取，提取物减压回收乙醇，得到浸膏，浸膏混悬于水中，用等体积的乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯层浓缩后，用大孔吸附树脂D-101分离，甲醇/水洗脱，得到30％、50％、70％、90％和100％五个部分Fractions A→E；其中Fr.D部分用反相硅胶柱处理，甲醇/水50％→80％为洗脱剂，合并后得到10个部分Fr.D1→Fr.D10；第5个部分再用凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，甲醇洗脱，合并得到3个部分Fr.D5-1→Fr.D5-3，Fr.D5-3部分用半制备HPLC，乙腈/水＝35：65+0.1％CF3COOH纯化得到(±)-spiroganoapplanin A；该化合物是一对对映体，经过手性拆分，正己烷/乙醇＝77：23得到(-)-spiroganoapplanin A和(+)-spiroganoapplanin A，然后加入药学上可接受的载体；或将化合物进一步制备为药学上可接受的盐，再加入药学上可接受的载体。
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