CN103857400A - 玫瑰红景天提取物和分离的化合物及其在治疗神经变性疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及玫瑰红景天的提取物、组分和分离的化合物，及其用于治疗神经病理性疾病和神经变性疾病的用途。本发明的提取物和化合物抑制α-突触核蛋白的聚集。在一个实施方案中，本发明的玫瑰红景天提取物和化合物可用于治疗突触核蛋白病，包括帕金森病、路易体痴呆、单纯性自主神经衰竭、多系统萎缩和阿尔茨海默病。

Description

玫瑰红景天提取物和分离的化合物及其在治疗神经变性疾病中的应用

相关申请的交叉引用本申请要求2011年8月8日提交的美国临时申请系列号为No.61/573,022的权益，将其全部内容通过引用并入本文。 

背景技术

帕金森病(PD)是一种致残性、渐进性神经变性病症。PD的临床表现包括休息性震颤、僵直、运动迟缓和姿势不稳定性与认知和情感障碍。PD的主要病理特征为黑质致密部中多巴胺能神经元的损失和被称为路易体的胞浆内包含体的存在。 

PD的病因学和发病机理尚未完全阐明。环境因素和遗传因素都可导致PD的形成(Broussolle&Thobois,2002)。大多数PD患者为散发行的，然而也鉴定了一些易感基因伴随着家族遗传的PD病人。基因组复制的三个错义点突变(A53T、A30P和E46K)或α-突触核蛋白(synuclein)基因的三倍复制已经报道为家族性PD的病因(Conway et al.,1998)。 

α-突触核蛋白蛋白质主要在神经元中表达，特别是在突触未端，并且在突触功能和神经可塑性方面起作用(Sidhu et al.,2004)。病理性α-突触核蛋白存在于路易体和路易轴突中，呈不溶性、细丝状聚集体存在，其包含异常硝酸化的、磷酸化的和泛素化的残基。已有报道表明α-突触核蛋白病是神经变性疾病的一个重要发病机制(Vekrellis et al.,2011)。 

α-突触核蛋白蛋白质具有形成各种构象的高倾向性，具有自我聚集成低聚物的强倾向性，所述低聚物进一步聚集成原纤维沉积为路易体和其它疾病。在体外和动物模型中，α-突触核蛋白的突变体更倾向于形成聚集体(Giasson et al.,2002;Lee et al.,2002)。在具有路易体的痴呆(DLB)(Spillantini et al.，1998)、阿尔茨海默病、多系统萎缩(MSA)及其它神 经变性病症中(Halliday et al.,2011)，α-突触核蛋白也被确定为路易体和路易轴突的主要成分。 

另外，α-突触核蛋白蛋白质水平随衰老在人黑质中增加。人类患者和动物模型中的神经变性表型显示α-突触核蛋白的高表达水平，并且该蛋白质的异常聚集在PD的发病机制中起作用。A53Tα-突触核蛋白转基因小鼠(在小鼠朊病毒-相关蛋白启动子的控制下)显示运动功能显著降低，随着年龄增长，最终导致致命性的运动麻痹(Giasson et al.,2002)。A53Tα-突触核蛋白转基因小鼠的运动神经元显示出接近原纤维α-突触核蛋白包含体(其类似于路易体结构的一部分)的轴突变性。. 

最新证据也表明聚集的不溶性α-突触核蛋白的低聚物(初原纤维)在PD的发病机制中起重要作用。已经证实α-突触核蛋白初原纤维形成椭圆形或圆形淀粉样孔，其可以刺穿细胞膜及导致细胞内含物释放和细胞死亡(Lashuel et al.,2002)。 

除了α-突触核蛋白低聚物的毒性之外，最新研究已经表明线粒体复合物I功能丧失和PD患者脑中发现的氧化应激的产生(Keeney et al.,2006)，这些可能参与PD中选择性黑质多巴胺能变性的发展。 

6-羟基多巴胺(6-OHDA)是一种广泛地用于在实验动物中诱导帕金森综合征的化学物质(Lane&Dunnett,2008)。6-OHDA经由多巴胺和去甲肾上腺素重吸收转运蛋白进入神经元。因此，6-OHDA通常与选择性去甲肾上腺素重吸收抑制剂(比如地昔帕明)一起使用以选择性地仅杀死多巴胺能神经元。在体外，多巴胺的氧化可导致6-OHDA的产生，所以6-OHDA被认为是内源性毒素(Jellinger et al.,1995)。确实的证据表明6-OHDA产生活性氧簇，并降低谷胱甘肽和过氧化物歧化酶的活性(Betarbet et al.,2002)。在脑内注射6-OHDA之后，纹状体神经元在24小时内开始变性，并且在2-3天后纹状体多巴胺耗尽(Asanuma et al.,1998)。 

MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)被认为是一种环境毒素，可在PD的发病机制中起作用。MPTP本身无毒，然而其在脑中产生的活性代谢物，一种带正电荷的化学毒素(MPP+)，干扰线粒体的氧化磷酸化，并引起ATP耗尽和随后引起细胞死亡。MPP+经多巴胺转运蛋白被多巴胺能神经元吸收。MPP+也抑制儿茶酚胺的合成，降低多巴胺和去 甲肾上腺素的水平，并使酪氨酸羟化酶失活。另外，已经发现MPP+上调SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白的表达和聚集(Kalivendi et al.,2004)。可以通过在啮齿类动物的侧脑室内注射MPP+诱导形成帕金森综合征(Cavalla et al.,1985)，用Rotorod试验和旷场实验(Open Field Test)评价这些PD小鼠的运动活性。 

目前，没有停止或逆转PD发展的治疗药物。市售可获得的药物仅缓解该疾病的症状，以改善PD患者的生活质量。因为PD患者存在大量症状和并发症，药物的选择在个体之间变化相当大，对于PD的最通常的处方药物是促进脑内多巴胺生成的治疗剂。左旋多巴，其由大脑酶改性产生多巴胺，是用于PD的最常用药物。这些年来，已经研究了许多多巴胺受体激动剂来治疗PD；然而，在治疗一段时期之后，治疗效果降低。而且这样用药，在一些患者中也有副作用，比如胃肠疾病和心理学认知问题(例如，意识模糊、幻觉、精神病、等)。因此，需要PD的改善的治疗剂。 

玫瑰红景天(Rhodiola rosea,RR)，也称为黄金根，是景天科植物中红景天属(Rhodiola)的一种。玫瑰红景天生长在海拔3000米以上的山脉和硬岩石中。红景天属的根具有低毒，理气养血、润肺补肾功能及其抗衰老作用，两千年前在《神农本草经》中被列为上品。 

自从18世纪以来，红景天在中国之外的许多欧洲国家的本草著作中也有记载，并且早在维京时代就已经使用。《现代实用本草》记载玫瑰红景天具有中枢抑制、抗疲劳、增强心脏作用、抗炎、降低血糖水平、抗-过氧化和抗-微波辐射活性。现代生物学研究证明RR提取物具有抗疲劳、抗氧化、增强认知、抗抑郁、抗应激、抗病毒、抗菌、抗肿瘤和抗炎活性(Panossian et al.,2010)。 

玫瑰红景天包含多种化学成分，包括苯丙素类(例如，络塞维(rosavin)、络缌(rosin)、络塞琳(rosarin))、苯乙醇类衍生物(例如，红景天苷、络醇)、黄酮类(例如，rodiolin)、单萜类(例如，rosiridol、rosiridin)、甾体苷(例如，胡萝卜苷)和酚酸类(例如，没食子酸)。报道表明红景天苷具有抗细胞凋亡、抗炎、抗氧化、抗抑郁和神经保护作用。特别地，红景天苷可以通过抑制NO途径而保护PC12细胞抗MPP(+)-诱导的细胞凋亡。Rosiridin已被报道为单胺氧化酶抑制剂，这也许是RR抗抑郁作用的原因。已知络塞 维对于细菌淋病奈瑟球菌的生长具有抑制作用，并具有活性氧簇清除活性(Panossian&Wagner,2005)。 

发明简述 

本发明提供用于预防和/或治疗神经病学和/或神经变性疾病和病症的新的和有益的物质和方法。在一个实施方案中，本发明提供玫瑰红景天提取物，和从玫瑰红景天中分离的化合物，用于预防、治疗或改善突触核蛋白病比如帕金森病。 

在一个特定实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式I的化合物： 

其中R₁-R₃独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；R₄-R₉独立地为氢、烷基或酰基。 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式II的化合物∶ 

其中R₁-R₄独立地为氢、烷基或酰基；R₅-R₇独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇。 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式III的化合物∶ 

其中R₁-R₃和R₇-R₉独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；R₄-R₆独立地为氢、烷基或酰基。 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式IV的化合物∶ 

其中R₁-R₆独立地为氢、烷基或酰基；R₇-R₉独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇。 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式V的化合物∶ 

其中R₁-R₄独立地为氢、烷基或酰基；R₅为羟基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、烷氧基、硫醇、氰基或-COOH。 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式VI的化合物∶ 

其中R₁-R₃独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；R₄-R₁₀独立地为氢、烷基或酰基(例如乙酰基)。 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式VII的化合物∶ 

其中R₁-R₄独立地为氢、或酰基(例如乙酰基)。 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式VIII的化合物∶ 

其中R₁-R₃和R₇-R₉独立地为氢、羟基、酰基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、烷基、羟基烷基、烷氧基、硫醇；R₄-R₆独立地为氢、烷基或酰基(例如乙酰基)。 

在一个特定实施方案中，本发明涉及络塞维(rosavin)、6-O-没食子酰基络缌(6-O-galloyl rosin)、络塞琳(rosarin)、淫羊藿次苷D2、mongrhoside、没食子酸、6-O-没食子酰基熊果苷或rhodiocyanoside A的治疗用途。 

在一个实施方案中，本发明提供治疗或药物组合物，其包括治疗有效量的本发明的玫瑰红景天提取物和任选的可药用载体。在另一个实施方案中，本发明提供药物或治疗组合物，包括分离的或基本上纯的选自式I(比如络塞维)至式VIII的化合物或其盐、和任选的可药用载体。 

在一个实施方案中，本发明提供用于预防、治疗或改善其中抑制α-突触核蛋白蛋白质的聚集是有益的疾病或病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向需要这样的治疗的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包括本发明的玫瑰红景天提取物、从玫瑰红景天分离的生物活性替代物(例如，络塞维)、和/或式I至式VIII的化合物。 

在某些实施方案中，本发明预防、治疗或改善神经变性疾病，包括，但不限于帕金森病、突触核蛋白病、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、具有路易体的痴呆(DLB)、单纯性自主神经衰竭(PAF)、多系统萎缩(MSA)和亨廷顿氏疾病。 

附图说明

图1显示玫瑰红景天提取物在体外抑制α-突触核蛋白的聚集。用α-突触核蛋白(0.07μg)重组蛋白质和玫瑰红景天的总提取物(RRTE,0.001-100μg/ml)共同孵育7天，以Filter trap assay方法测定。进行蛋白质印迹分析以检测α-突触核蛋白聚集体。在两个泳道进行测定，并重复至少2次，使用5μM的刚果红作为阳性对照，RR样品中DMSO的浓度为0.2%。 

图2显示玫瑰红景天的提取物和亚组分在体外抑制α-突触核蛋白的聚集。通过用α-突触核蛋白(0.07μg)重组蛋白质和RR的总提取物或亚组分(0.1至10μg/ml)共同孵育7天，以Filter trap assay方法测定。进行蛋白质印迹分析以检测α-突触核蛋白聚集体。一式两份进行测定，并重复至少2次。使用5μM的刚果红作为阳性对照。RR样品中DMSO的浓度为0.2%。. 

图3A显示从玫瑰红景天分离的化合物络塞维(RR-C36)在体外抑制α-突触核蛋白聚集。通过用α-突触核蛋白(0.07μg)重组蛋白质和化合物RR-C36或RR-C20(红景天苷)(0.2、2、20μM)孵育7天，以Filter trap assay方法测定。在孵育7天之后，α-突触核蛋白聚集体的含量增加，并且刚果红抑制该增加。来自RRWA的RR-C36呈剂量依赖性方式抑制α-突触核蛋白聚集。一式两份进行该测定，并重复至少2次。使用5μM的刚果红作为阳性对照，RR样品中DMSO的浓度为0.2%。图3B显示化合物RR-C36(络塞维)抑制α-突触核蛋白的聚集，并诱导预聚集的α-突触核蛋白的解聚。对于抑制测定，用RR-C36孵育在TBS中的重组α-突触核蛋白7天。对于解聚测定，在熟化(聚集)5天之后，将RR-C36加入到重组α-突触核蛋白中，接着孵育2天。样品进行Filter trap assay方法测定。RR-C36抑制α-突触核蛋白聚集，并以剂量依赖性方式诱导α-突触核蛋白的解聚。图3C显示在与重组α-突触核蛋白共处理7天之后，RR-C22(6-O-没食子酰基络缌)和 RR-C49(络塞琳)抑制α-突触核蛋白的聚集。一式两份进行该测定，并重复至少2次。使用5μM的刚果红作为阳性对照，RR样品中DMSO的浓度为0.2%。图3D显示在与重组α-突触核蛋白共处理7天之后，RR-C31(淫羊藿次苷D2)和RR-C47(mongrhoside)抑制α-突触核蛋白的聚集。一式两份进行该测定，并重复至少2次。使用5μM的刚果红作为阳性对照，RR样品中DMSO的浓度为0.2%。图3E显示在与重组α-突触核蛋白共处理7天之后，RR-C04(没食子酸)和RR-C34(6-O-没食子酰基熊果苷)抑制α-突触核蛋白的聚集。进行该测定一式两份，并重复至少2次。使用5μM的刚果红作为阳性对照，RR样品中DMSO的浓度为0.2%。 

图4A显示当通过原子力显微镜(AFM)测定时，玫瑰红景天丁醇组分(RRBU)、玫瑰红景天水组分(RRWA)、和络塞维(RR-C36)抑制α-突触核蛋白的聚集。在室温下，用RRBU、RRWA或RR-C36孵育在TBS中重组α-突触核蛋白7天和14天，采用0.3%DMSO作为对照。在用DMSO处理的样品中，观察到大尺寸低聚物和初原纤维。RRBU、RRWA和RR-C36抑制大尺寸低聚物和初原纤维的形成，如AFM图像的高度分析图所示。图4B显示在孵育7天之后，rhodiocyanoside A(RR-C41)抑制α-突触核蛋白的聚集，如原子力显微镜图像和高度分析所示。 

图5显示各种RR组分显现出对Aβ1-42肽的抗聚集活性。在37℃下，用重组人Aβ1-42孵育RR的总提取物、各种组分和络塞维(RR-C36)3天。在孵育之后，样品进行硫代黄素T(ThT)结合测定。RR组分(RRBU和RRWA)显示对Aβ1-42聚集的抗聚集活性。 

图6显示RRBU和RRWA防止SH-SY5Y细胞中MPP+诱导的半胱天冬酶-3裂解和抑制MPP+诱导的α-突触核蛋白聚集。用RRBU(50μg/ml)、RRWA(50μg/ml)或DMSO(0.1%)预处理SH-SY5Y细胞两小时。然后使用MPP+(1mM)处理细胞20小时，收集全细胞溶解产物进行针对裂解的半胱天冬酶-3和α-突触核蛋白的蛋白质印迹。GAPDH的探查充当负载对照。 

图7显示玫瑰红景天水组分(RRWA)援救注射6-OHDA的老鼠中TH损失。(A)试验设计。(B)通过蛋白质印迹分析测定酪氨酸羟化酶(TH)的蛋白质表达。简而言之，在立体定位注射6-OHDA之前5天和之后3天，每日用玫瑰红景天的水组分(RRWA)(i.p.，10 或100mg/kg)处理3月龄C57B/6小鼠。将6-OHDA(50μg)注射到小鼠的侧脑室中，在手术后3天，收集纹状体组织。(C)在注射6-OHDA之后，进行Rotorod试验以检查小鼠的运动缺失。 

图8显示RRBU、RRWA和RR-C36改善人A53Tα-突触核蛋白转基因的小鼠的运动功能。用RRBU、RRWA或RR-C36处理的A53T转基因小鼠显示改善运动活性，在旷场试验中，结果显示处理的小鼠行进距离增加。 

图9显示使用LCMS/MS分析测定的小鼠血浆和脑中RR-C36的含量。在腹膜注射15分钟之后，检测小鼠血浆和脑中的RR-C36。 

图10A-H显示来自玫瑰红景天的提取物和各组分的HPLC色谱图，以及RR-C20(红景天苷)、RR-C36(络塞维)、RR-C41(rhodiocyanoside A)、RR-C31(淫羊藿次苷D2)、RR-C34(6-O-没食子酰基熊果苷)和RR-C47(mongrhoside A)的HPLC色谱图。A-D的流动相从2%ACN开始，而E-H的流动相为10%CAN，检测波长设定为220nm。 

详细说明 

本发明提供用于预防和/或治疗神经病学和/或神经变性疾病和病症的新的和有益的物质和方法。在一个实施方案中，本发明涉及玫瑰红景天(RR)提取物、其组分、以及从玫瑰红景天(RR)分离的显示出抗帕金森病作用的化合物。有利地，本发明的玫瑰红景天(RR)提取物、组分和分离的化合物抑制α-突触核蛋白的聚集、减少6-OHDA诱导的PD动物模型中酪氨酸羟化酶损失、和援救来自在神经毒素的存在下细胞死亡的SH-SY5Y细胞；因此，本发明的玫瑰红景天(RR)提取物、组分和分离的化合物可用于治疗神经变性疾病，包括帕金森病和突触核蛋白病。 

特别地，本发明显示玫瑰红景天的总提取物(RRTE)、总提取物的正丁醇(BU)和水(WA)组分、以及从玫瑰红景天分离的化合物络塞维，可以抑制α-突触核蛋白的低聚和初原纤维形成。络塞维抑制α-突触核蛋白聚集。玫瑰红景天提取物的丁醇(RRBU)和水(RRWA)组分也抑制淀粉样-β肽的聚集、在MPP+的存在下抑制半胱天冬酶-3的活化、减 少高分子量α-突触核蛋白、以及增加SH-SY5Y细胞中单体表达。玫瑰红景天提取物的水(RRWA)组分也减少注射6-OHDA的小鼠的运动缺陷。 

化合物 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式I的化合物： 

其中R₁-R₃独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；R₄-R₉独立地为氢、烷基或酰基。 

在一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物络塞维((2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(E)-3-苯基丙-2-烯氧基]-6-([(2S,3R,4S,5S)-3,4,5-三羟基噁烷-2-基]氧基甲基)噁烷-3,4,5三醇)，具有下述结构∶ 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式II的化合物∶ 

其中R₁-R₄独立地为氢、烷基或酰基；R₅-R₇独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇。 

在一个实施方案中，本发明涉及式II的化合物-红景天苷(2-(4-羟基苯基)乙基β-D-吡喃葡萄糖苷)，具有下述结构∶ 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式III的化合物∶ 

其中R₁-R₃和R₇-R₉独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；R₄-R₆独立地为氢、烷基或酰基。 

在一个实施方案中，本发明涉及式III的化合物-6-O-没食子酰基络缌，具有下述结构∶ 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式IV的化合物∶ 

其中R₁-R₆独立地为氢、烷基或酰基；R₇-R₉独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇。 

在一个实施方案中，本发明涉及式IV的化合物络塞琳((E)-3-苯基2-丙烯基]6-O-α-L-阿拉伯糖呋喃糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷)，具有下述结构∶ 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式V的化合物∶ 

其中R₁-R₄独立地为氢、烷基或酰基；R₅为羟基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、烷氧基、硫醇、氰基或-COOH。 

在一个实施方案中，本发明涉及式V的化合物-淫羊藿次苷D2，具有下述结构∶ 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式VI的化合物∶ 

其中R₁-R₃独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；R₄-R₁₀独立地为氢、烷基或酰基(例如乙酰基)。 

在一个实施方案中，本发明涉及式VI的化合物mongrhoside，具有下述结构∶ 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式VII的化合物∶ 

其中R₁-R₄独立地为氢、烷基或酰基(例如乙酰基)。 

在一个实施方案中，本发明涉及式VII的化合物-rhodiocyanoside A，具有下述结构∶ 

在一个实施方案中，本发明涉及具有下述结构的式VIII的化合物∶ 

其中R₁-R₃和R₇-R₉独立地为氢、羟基、酰基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、烷基、羟基烷基、烷氧基、硫醇；R₄-R₆独立地为氢、烷基或酰基(例如乙酰基)。 

在一个实施方案中，本发明涉及式VIII的化合物-6-O-没食子酰基熊果苷，具有下述结构∶ 

在一个实施方案中，本发明涉及从玫瑰红景天分离的化合物的治疗用途。 

术语“烷基”指1至8个碳原子的直链饱和的一价基团或3至8个碳原子的支链饱和的一价基团。其可以包括1至4个或1至3个碳原子的烃基，其可以是直链的。实例包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。在某些实施方案中，烷基为直链或支链C₁至C₆烷基、C₁至C₅烷基、C₁至C₄烷基、C₁至C₃烷基、乙基或甲基。. 

术语“烃”或“烃基”指基本上只由元素碳和氢组成的有机化合物或基团。烃基包括烷基、链烯基和炔基部分。 

术语“酰基”指基团-C(O)R，其中R为氢、烷基或环烷基、或杂环烷基。在一个实施方案中，基团-C(O)R的R基团为C₁至C₄烷基。酰基的实例包括但不限于甲酰基、乙酰基和乙基羰基。 

术语“卤素”指氟、氯、溴、和碘。 

术语“羟基”指基团-OH。 

如本文使用的术语“取代的”指其中化合物或化学部分的至少一个氢原子被第二化学部分取代的实施方案。取代基的非限制性实例为在本文公开的示例性化合物和实施方案中存在的那些，以及卤素、烷基、链烯基、炔基、羟基、烷氧基、氨基、卤代烷基(例如三氟甲基)和-COOH。本文公开的所有化学基团都可以被取代，除非另有说明。例如，本文描述的“取代的”烷基、链烯基或炔基部分为被第二化学部分比如烃基部分、卤素、烷氧基 和-COOH取代的部分。取代的烷基包括，但不限于卤代烷基、羟基烷基、羧基烷基和氨基烷基。 

术语“卤代烷基”指被一个或多个相同或不同的卤素原子取代的烷基。卤代烷基的代表性实例包括，但不限于-CH₂Cl、-CH₂Br、-CF₃、-CH₂CH₂Cl和-CH₂CCl₃。 

如本文使用的术语“氨基”指-NH₂。 

术语“烷基氨基”指基团-NHR或–NR₂，其中每个R独立地为烷基。在某些实施方案中，烷基氨基的烷基为C₁至C₄烷基。烷基氨基的代表性实例包括，但不限于甲基氨基、(1-甲基乙基)氨基、二甲基氨基、甲基乙基氨基、和二(1-甲基乙基)氨基。 

术语“羟基烷基”指被一个或多个(优选一个、两个或三个)羟基取代的如本文定义的烷基。在某些实施方案中，羟基烷基为被一个或多个羟基取代的C1至C6烷基，优选C1至C4烷基。羟基烷基的代表性实例包括，但不限于羟基甲基、2-羟基乙基、2-羟基丙基、3-羟基丙基、1-(羟基甲基)-2-甲基丙基、2-羟基丁基、3-羟基丁基、4-羟基丁基、2,3-二羟基丙基、2-羟基-1-羟基甲基乙基、2,3-二羟基丁基、3,4-二羟基丁基和2-(羟基甲基)-3-羟基丙基，优选2-羟基乙基、2,3-二羟基丙基和1-(羟基甲基)2-羟基乙基。 

如本文使用的术语“烷氧基”指基团-OR_x，其中R_x为C₁至C₆烷基。在一个实施方案中，R_x为C₁至C₄烷基。示例性的烷氧基包括，但不限于甲氧基、乙氧基和丙氧基。. 

在某些实施方案中，本发明涉及由分离的或基本上纯的式I至VIII代表的化合物。如本文使用的术语“基本上纯的”指高于99%纯。 

如本文使用的“分离的”指已经从其天然存在的任何环境得到的提取物或化合物。例如，分离的化合物或提取物不会指存在于植物中可以被分离的化合物或提取物。在优选的实施方案中，本发明的化合物和提取物为至少75%纯，优选地至少90%纯，更优选地超过95%纯，并且最优选地超过99%纯(基本上纯的)。 

本发明进一步包括化合物的立体异构体。术语“立体异构体”涵盖所有对映异构体/立体异构体纯的和对映异构体/立体异构体富集的本文公开的化合物。. 

在一个实施方案中，本发明涉及化合物的对映异构体形式。本发明的化合物的对映异构体形式基本上不含彼此(即，对映异构体过量)。换句话说，化合物的“R”形式基本上 不含化合物的“S”形式，因此，呈对映异构体过量的“S”形式。同样的，化合物的“S”形式基本上不含化合物的“R”形式，因此，呈对映异构体过量的“R”形式。在本发明的一个实施方案中，对映异构体化合物为至少约80%对映异构体过量。在优选的实施方案中，化合物为至少约90%对映异构体过量。在一个更优选的实施方案中，化合物为至少约95%对映异构体过量。在一个甚至更优选的实施方案中，化合物为至少约97.5%对映异构体过量。在一个更优选的实施方案中，化合物为至少约99%对映异构体过量。. 

本发明还涵盖式I至VIII的化合物的盐、溶剂化物、水合物和多晶型物，及其用途。 

在一个实施方案中，本发明不涵盖在PCT/CN2010/001982中公开的没食子酸、6-O-没食子酰基熊果苷和6-O-没食子酰基络缌的治疗用途。 

玫瑰红景天提取物 

本发明的一个方面是提供用于制备玫瑰红景天提取物的方法。本发明的方法也可以用于从玫瑰红景天中分离生物活性化学成分。本发明还提供制备玫瑰红景天提取物的根据。 

在一个实施方案中，本发明提供从玫瑰红景天制备红景天提取物和/或分离生物活性化学成分的方法，其中所述方法包括下述步骤、基本上由下述步骤组成、或由下述步骤组成： 

a)提供足量的玫瑰红景天原料； 

b)用包括醇的第一溶剂提取玫瑰红景天原料，得到玫瑰红景天醇提取物； 

c)回收所述玫瑰红景天醇提取物；和任选地， 

d)浓缩物该玫瑰红景天醇提取物。 

优选地，将玫瑰红景天原料干燥并研磨成粉末。优选地，所述原料为玫瑰红景天根。 

在某些实施方案中，用于制备玫瑰红景天提取物的溶剂可以包括，但不限于醇(例如，C₁-C₄醇，比如甲醇、乙醇、丙醇)；C1-C3酮(例如，丙酮)；乙酸；乙酸盐、乙酸乙酯和水。 

在一个实施方案中，第一溶剂包括一种或多种醇，选自C₁-C₃醇，比如甲醇、乙醇和丙醇。 

在一个实施方案中，第一溶剂包括或者为水-醇混合物。醇-水(例如，乙醇-水、甲醇-水)混合物可以包括约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的醇(例如，乙醇、甲醇)。 

在一个实施方案中，提取方法进一步包括∶ 

混合玫瑰红景天醇提取物与水；和 

用一种或多种有机溶剂分配该水-玫瑰红景天醇提取物，得到一种或多种有机溶剂组分和水组分。 

在某些实施方案中，有机溶剂可以选自乙腈、THF、氯仿、甲苯、氯化乙烯、氯苯、二氯苯、醇(例如，C₁-C₂₀醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、正丙醇、正丁醇)、C₁-C₂₀酮(例如丙酮、甲基乙基酮)、C₁-C₂₀烷基(例如，丁烷、异丁烷、戊烷、异戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷)、乙酸、乙酸盐、石油醚、乙酸乙酯、亚甲基氯、四氯甲烷或其任意组合。. 

在一个实施方案中，提取方法包括∶ 

提供足量的玫瑰红景天原料； 

用包括醇(比如乙醇)的第一溶剂提取玫瑰红景天原料，得到玫瑰红景天醇提取物； 

回收该玫瑰红景天醇提取物；和任选地，浓缩该玫瑰红景天醇提取物； 

混合该玫瑰红景天醇提取物与水；和 

用一种或多种选自石油醚、乙酸乙酯和正丁醇的溶剂连续地分配该水-玫瑰红景天醇提取物，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水组分。 

在一个实施方案中，所述方法进一步包括从本发明的玫瑰红景天提取物(比如玫瑰红景天醇(例如乙醇、正丁醇)提取物)分离络塞维和/或红景天苷，和本发明的玫瑰红景天醇(例如乙醇、正丁醇)提取物的水组分。 

在一个实施方案中，在室温下进行提取方法。在另一个实施方案中，在10℃-100℃的温度下，或者其中任何温度，包括但不限于15℃-90℃、20℃-80℃和60℃-90℃的任一温度下进行提取方法。 

在一个实施方案中，玫瑰红景天的原料与溶剂混合至少约15分钟，以萃取生物学活性化学组分。优选地，提取时间为至少约20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、4小时或5小时。 

可以通过例如过滤除去残余物来收集玫瑰红景天提取物。在一个实施方案中，可以进一步蒸发玫瑰红景天提取物，得到固体或半固体组合物，在另一个实施方案中，可以浓缩和/或纯化玫瑰红景天提取物。 

在一个进一步的实施方案中，本发明的方法包括通过使用技术比如NMR分析和色谱分析，例如硅胶柱色谱，形成玫瑰红景天提取物的化学特性。 

本发明进一步提供通过本发明的提取方法得到的玫瑰红景天提取物。在一个特定实施方案中，玫瑰红景天提取物具有如图10A-H所示的化学特性。 

如本文使用的术语“基本上由...组成”将本发明的范围限定为指定步骤，并且其实质上不会影响本发明的基础的和新的特性，即，由玫瑰红景天制备玫瑰红景天提取物和/或分离生物活性化学成分的方法。例如，通过使用“基本上由...组成”，制备玫瑰红景天提取物的方法不包括提取或接触玫瑰红景天的任何未指定步骤，例如，用未指定的溶剂萃取或接触玫瑰红景天、或者在不同于指定条件的条件(例如，不同温度)下萃取玫瑰红景天的另外的步骤。同时，通过使用术语“基本上由...组成”，所述方法可以包括实质上不会影响从玫瑰红景天萃取生物学活性化学组分的步骤，包括收集或回收玫瑰红景天提取物；浓缩该玫瑰红景天提取物；将多种玫瑰红景天提取物合并为单一组合物；将该玫瑰红景天提取物冻干或干燥成固体或半固体组合物；将该玫瑰红景天提取物配制成药物组合物，比如溶液、 悬浮液、片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、煎剂、和酊剂；缓和该玫瑰红景天提取物与可药用载体、赋形剂、矫味剂、缓冲剂和/或乳化剂；及包装该玫瑰红景天提取物。 

神经病学和神经变性疾病的治疗 

本发明的另一个方面提供玫瑰红景天(RR)提取物和组分(例如，水和/或醇，比如丁醇组分)、和/或式I(例如络塞维)至式VIII的化合物及其盐的治疗用途，以及包括一种或多种前述成分的治疗组合物，用于治疗神经变性疾病和神经病理性病症，包括帕金森病和突触核蛋白病。 

有利地，发现在6-OHDA诱导的PD动物模型中，RR的总提取物、及玫瑰红景天(RR)总提取物的后续丁醇和水组分具有神经保护活性、抑制α-突触核蛋白的聚集、及减少酪氨酸羟化酶蛋白质表达。另外，络塞维，一种从玫瑰红景天分离的化合物，抑制α-突触核蛋白聚集。本发明的玫瑰红景天(RR)提取物和分离的化合物抑制具有聚集倾向的α-突触核蛋白，从其低聚体形式。可溶性α-突触核蛋白低聚物有毒性，可最终导致神经变性疾病的神经元细胞死亡。 

在一个实施方案中，本发明提供一种用于预防、治疗或改善疾病或病症的方法，其中抑制α-突触核蛋白蛋白质的聚集、抑制淀粉样-β-肽的聚集、和/或抑制半胱天冬酶-3的活化将是有益的。在一个实施方案中，所述方法包括向需要这样的治疗的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包括本发明的玫瑰红景天提取物、从玫瑰红景天分离的生物活性替代物(例如，络塞维)、和/或式I至式VIII的化合物。 

在一个实施方案中，玫瑰红景天提取物为醇提取物(提取溶剂为醇，比如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇或醇-水混合物)的水组分和/或醇组分(分配溶剂为醇，比如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇，或醇-水混合物)。 

在某些实施方案中，本发明预防、治疗或改善神经变性疾病，包括，但不限于帕金森病、突触核蛋白病、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、具有路易体的痴呆(DLB)、单纯性自主神经衰竭(PAF)、多系统萎缩(MSA)和亨廷顿氏疾病。在某些实施方案中，本发明预防、治疗或改善急性和慢性CNS病症，包括神经病理性病症比如神经性疼痛、中 风、脑外伤和癫痫。在某些实施方案中，本发明预防、治疗或改善路易体疾病(LBD)，包括，但不限于帕金森病、弥漫性路易体病(DLBD)、阿尔茨海默病的路易体变体、多系统萎缩(MSA)及混合型PD和阿尔茨海默病。 

突触核蛋白病代表一组神经变性疾病，其包含在神经元和神经胶质的选择性易感人群中不溶性α-突触核蛋白蛋白质的聚集体。蛋白质α-突触核蛋白为PD患者中发现的路易体，其对于PD的发病机制起重要作用。突触核蛋白病包括帕金森症(PD)、具有路易体的痴呆(DLB)、单纯性自主神经衰竭(PAF)和多系统萎缩(MSA)。临床上，突触核蛋白病的特征在于运动、认知、行为和植物神经功能的长期和渐进性降低，取决于损害的分布。神经元和神经胶质中突触核蛋白的聚集体的沉积表明这些病症可存在共同发病机制。人类患者中的α-突触核蛋白和神经变性表型之间的组合表明α-突触核蛋白的表达水平增加和异常聚集在PD的发病机制中起作用。 

本发明发现了RR的总提取物、RR总提取物的后续丁醇组分和水组分、及化合物RR-C36(络塞维)抑制α-突触核蛋白的聚集，因此，用于治疗PD以及其它突触核蛋白病。. 

在一个实施方案中，所述方法包括施用有效量的药物组合物，其包括作为活性成分的本发明的玫瑰红景天提取物、从玫瑰红景天分离的生物活性替代物(例如，络塞维)和/或选自式I-VIII的化合物。 

在某些实施方案中，药物组合物包括作为活性成分的至少75%重量，或高于75%(包括但不限于，高于80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)的任意重量百分数的本发明的玫瑰红景天提取物、从玫瑰红景天分离的生物活性替代物(例如络塞维)和/或选自式I-VIII的化合物。 

如本文使用的术语“受试者”描述可以提供用本发明的组合物治疗的生物体，包括哺乳动物比如灵长类。可以受益于所公开治疗方法的哺乳动物种类包括，但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人类、猴子；驯养动物，比如犬、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡；及其它动物比如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。 

在一个特定实施方案中，术语“治疗”包括(i)改善诊断患有PD或PD-相关病症的患者中与PD或PD-相关病症有关的症状；和/或(ii)缓解(比如减缓其发展)或补救诊断患有PD或PD-相关病症的患者中PD或PD-相关病症。 

在一个实施方案中，根据本发明需要治疗的受试者患有或诊断患有神经变性疾病，比如帕金森病、突触核蛋白病、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、具有路易体的痴呆(DLB)、单纯性自主神经衰竭(PAF)、多系统萎缩(MSA)、亨廷顿氏疾病和路易体疾病(LBD)。 

在一个实施方案中，本发明提供一种抑制α-突触核蛋白蛋白质的聚集、抑制淀粉样-β肽的聚集、和/或抑制半胱天冬酶-3的活化的方法，其中所述方法包括向需要这样的处理的细胞施用有效量的组合物，所述组合物包括本发明的玫瑰红景天提取物、从玫瑰红景天分离的生物活性替代物(例如络塞维)、和/或选自式I-VIII的化合物。在一个实施方案中，细胞为哺乳动物受试者(优选人类受试者)的细胞。 

α-突触核蛋白是人类中由SNCA基因编码的蛋白质。α-突触核蛋白片段，称为阿尔茨海默病淀粉样蛋白的非-Abeta成分(NAC)，最初在淀粉样富集组分中发现，通过克隆全长的cDNA显示是其前体蛋白NACP的片段。后来，确定NACP是TORPEDO突触核蛋白的人同系物。因此，现在，NACP被称为人α-突触核蛋白。多种种类的α-突触核蛋白蛋白质的氨基酸序列是公共可获得的，可以由本领域技术人员经由数据库比如GenBank容易地获得。在一个实施方案中，α-突触核蛋白蛋白质是人源的。 

淀粉样蛋白β(Aβ)是从淀粉样前体蛋白加工的36-43-氨基酸的肽。Aβ是患有阿尔茨海默病的患者脑内发现的沉积物的主要成分。多种种类的淀粉样β蛋白质的氨基酸序列是公共可获得的，可以由本领域技术人员经由数据库比如GenBank容易地获得。在一个实施方案中，淀粉样β蛋白质是人源的。 

半胱天冬酶-3，也称为CPP32/Yama/凋亡酶(apopain)是由CASP3基因编码的，并且是半胱氨酸-天门冬氨酸蛋白酶(半胱天冬酶)家族的成员。半胱天冬酶-3由裂解成17kDa和12kDa亚基的32kDa酶原形成。当酶原以特定残基裂解时，则可以通过疏水性相互作用形成活性异四聚体，使来自p17的四个和来自p12的两个反向平行β片结合在一起形成异二聚 体，其反过来又与另一个异二聚体相互作用形成被α-螺旋（独特的半胱氨酸蛋白酶）包围的完整12-链β-片结构。当所述异二聚体从头至尾彼此排列时，活性位点位于由来自两个参与亚基的残基形成的分子的各个末端，但是必需的Cys-285和His-237残基是基于p17(较大)亚基。半胱天冬酶-3参与淀粉样-β4A前体蛋白的裂解，该淀粉样-β4A前体蛋白与阿尔茨海默病中神经元死亡有关。 

多种种类的半胱天冬酶-3蛋白质的氨基酸序列是公共可获得的，可以由本领域技术人员经由数据库比如GenBank容易地获得。在一个实施方案中，半胱天冬酶-3蛋白质是人源的。 

如本文使用的术语“治疗(treatment)”或其任意语法变化(例如，treat、treating和treatment等)包括但不限于改善或减缓疾病或病症的症状，降低、遏制、抑制、减轻或影响病症的进展、严重程度和/或范围。 

如本文使用的术语“预防(prevention)”或其任意语法变化(例如，prevent、preventing和prevention等)包括但不限于延迟症状发作、防止疾病复发、增加症状发作之间的潜伏时间、或其组合。如本文使用的预防不要求症状完全不存在。 

如本文使用的术语“有效量”指能够治疗或改善疾病或病症或者以其它方式能够产生预期治疗效果的量。在某些实施方案中，有效量能够减少α-突触核蛋白蛋白质的聚集至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。. 

治疗组合物和剂型 

在另一个方面，本发明提供用于治疗受试者中神经变性疾病或神经病理性病症的药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物包括有效量的玫瑰红景天提取物或玫瑰红景天的分离的化合物和可药用载体或赋形剂。 

本发明提供治疗或药物组合物，其包括治疗有效量的本发明的玫瑰红景天提取物和任选的可药用载体。本发明还提供包括根据本发明从玫瑰红景天分离的化合物(比如络塞 维)的治疗或药物组合物。本发明还涵盖包括本发明的玫瑰红景天提取物的食品补充剂和健康食品或饮料制品。 

在一个实施方案中，治疗或药物组合物包括治疗有效量的本发明的玫瑰红景天提取物的水组分、和/或醇(例如，溶剂包含醇比如甲醇、乙醇、丙醇、和丁醇，及任选的水)组分、及任选的可药用载体。 

在一个实施方案中，本发明还提供治疗组合物，包括分离的或基本上纯的选自式I至式VIII的化合物或其盐、和任选的可药用载体。 

术语“载体”指与化合物一起施用的稀释剂、助剂、赋形剂或溶媒。这样的药物载体可以为无菌液体，比如水和油，包括石油比如矿物油；植物油比如花生油、大豆油和芝麻油；动物油；或合成来源的油。盐溶液和含水葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是对于可注射溶液而言。 

合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果想要，治疗组合物也可以包含微量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、胶囊、颗粒剂、粉末、缓释剂型等形式。组合物可以用常用结合剂和载体比如甘油三酯配制。合适的药物载体的实例描述在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。这样的组合物包含治疗有效量的治疗组合物与合适量的载体，以便提供用于向患者合适地施用的形式。剂型应当适合给药方式。 

本发明的治疗或药物组合物可以配制为中性或盐形式。可药用盐包括但不限于与盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸、钠、钾、铵、钙、氢氧化铁等形成的盐。 

本发明还提供药物包装或试剂盒，其包括被一种或多种成分，例如本发明的药物组合物的化合物、载体填充的一个或多个容器。 

本发明的组合物也可以按照传统中医药实践来配制。在治疗特定疾病、病症或紊乱中有效的组合物和剂型的剂量将取决于通过标准临床技术确定的疾病、病症或紊乱的性质。 

处方量传统中医药可以容易地制成适用于向人类或动物施用的药物的任何形式。合适的形式包括，例如酊剂、煎剂和干提取物。这些可以口服服用，通过静脉注射或粘膜施用。活性成分也可以配制成胶囊、粉剂末、丸剂、锭剂、栓剂、口服溶液、巴氏消毒的胃肠道悬浮液注射剂、小量或大量注射剂、冷冻粉末注射剂、巴氏消毒的粉末注射剂等。所有上述方法都是本领域技术人员已知的，描述在书籍中，且通常由中草药执业医师使用。. 

酊剂是通过将原始药材(例如草药和菌类)悬浮在醇溶液比如例如酒剂或酒中。在悬浮一段时期之后，液体(醇溶液)可以施用例如每天两次或三次，每次一茶匙。 

提取物是原药材的必需组分的浓缩制品。典型地，通过将原药材悬浮在合适选择的溶剂从原药材(例如草药和菌类)提取必需组分，所述溶剂通常为水、乙醇/水混合物、甲醇、丁醇、异丁醇、丙酮、己烷、石油醚或其它有机溶剂中。提取方法可以利用浸渍、渗滤、再渗滤、对流提取、涡流提取或通过二氧化碳超临界(温度/压力)提取来进一步促进所述提取过程。在过滤除去草药残渣之后，可以将提取液进一步蒸发并由此弄多，得到软提取物(浸膏)和/或利用喷雾干燥、真空烘箱干燥、流化床干燥或冷冻干燥得到干提取物(干浸膏粉)。所述软提取物或干提取物可以进一步被溶于合适的液体中至所需使用浓度，或者加工成比如丸剂、胶囊、注射剂等形式。 

施用途径 

本发明的化合物和组合物可以通过标准途径施用给被治疗的受试者，所述途径包括口服、吸入、或肠胃外施用包括静脉内、皮下、局部、透皮、真皮内、经粘膜、腹膜内、肌内、囊内、眶内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射、输注和电穿孔，以及作为插入(暂时或永久)到受试者中的任何医疗装置或物体的组分共同施用。在优选的实施方案中，本发明的化合物和组合物通过口服给药施用给受试者。 

可有效地治疗特定疾病、病症或紊乱的本发明的治疗或药物组合物的量将取决于施用途径以及疾病、病症或紊乱的严重性，并应当根据执业医师的判断和每个患者的情况来决定。通常，剂量范围为约0.001mg/kg到约3g/kg。 

例如，合适的单位剂量可以为约0.01至约500mg、约0.01至约400mg、约0.01至约300mg、约0.01至约200mg、约0.01至约100mg、约0.01至约50mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.01至约3mg、约0.01至约1mg、或约0.01至约0.5mg。这样的单位剂量可以施用超过一天一次，例如一天2或3次。 

可以与所述载体物质结合产生单一剂型的活性成分的量将可变化。取决于病症的类型和待治疗的受试者。通常，治疗组合物包含约5%到约95%的活性成分(w/w)。更具体地，治疗组合物包含约20%(w/w)至约80%或约30%至约70%的活性成分(w/w)。 

一旦患者的病症出现改善，则如有必要，可以施用维持剂量。随后，可以根据症状，降低施用剂量或频率或两者至改善的状态得到维持的水平。当所述症状已经缓解至期望水平时，治疗应当停止。然而，一旦疾病症状出现任何复发，患者可能需要长期的间歇性治疗。 

另外，可以任选地使用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。在所述制剂中使用的精确剂量还将取决于施用途径及疾病、病症或紊乱的严重性，并应当根据执业医师的判断和每个患者的情况来确定。有效剂量可以由体外或动物模型测试系统得到的剂量反应曲线推断得到。 

材料和方法 

玫瑰红景天总提取物的制备 

在中国新疆伊梨采集的玫瑰红景天干燥根购自中国四川省成都市医药公司。将玫瑰红景天的干燥根(300g)浸泡在1.5L的70%乙醇(材料与溶剂的比例为1：5)中30分钟。然后，将该草药-溶剂混合物回流提取3次，每次2小时(1.5L、1.5L、1.5L，2小时/次)。过滤该提取物，并在真空中蒸干滤液，得到44.0g的总提取物(TE)。 

RRBU和RRWA组分的制备 

将玫瑰红景天总提取物(TE)(50.0g)悬浮在300ml的水中，然后用300ml的石油醚(60-90℃)、300ml的乙酸乙酯和300ml的正-BuOH连续地分配萃取。每种溶剂萃取3次，分别合并萃取液。蒸发这些组分得到总共4.8g的石油醚提取物(PE)、13.8g的乙酸乙酯提取物(EA)、19.2g的n-BuOH提取物(BU)和10.6g的水提取物(WA)。 

用于测定α-突触核蛋白聚集的Filter trap assay测定 

重组α-突触核蛋白购自Genway(#10-663-45667)。在使用之前，将该蛋白质稀释至1μg/μl的浓度，并在-80℃下以等分试样贮存。 

将等分试样在冰上解冻，并以12000×g旋转，以破坏预形成的聚集体。然后，在室温下，用在1x Tris-缓冲盐水(1x TBS:20mM Tris、pH7.5；500mM NaCl，用HCl调节pH7.5)中的玫瑰红景天样品或DMSO(0.2%)或刚果红(5μM)孵育蛋白质(0.07μg)。在孵育之后，根据制造商的说明，将样品负载在Bio-Dot SF Microfiltration Apparatus(Bio Rad)上。在真空过滤后，α-突触核蛋白聚集体截留在0.45μm硝基纤维素膜(S&S)上。通过蛋白质印迹分析，使用抗α-突触核蛋白抗体(BD transduction laboratories,#610787)、1:5000(1hr RT)和辣根过氧化酶(HRP)-结合的马抗小鼠IgG二级抗体(Cell Signaling Technology)1:5000(1hr RT)测定截留的蛋白质的量。然后，经由增强化学发光检测试剂盒(ECL；Amersham)使蛋白质表达显影。 

注射6-OHDA的小鼠PD模型和酪氨酸羟化酶表达的检测 

将6-羟基多巴胺(6-OHDA,50μg,Sigma)或相同量的溶媒(L-抗坏血酸，0.02%；Sigma)注射到香港科技大学动物中心提供的雄性C57BL/6小鼠(10-12周龄)的侧脑室中。在注射6-OHDA之前1小时，腹膜内施用地昔帕明(25mg/kg)阻断去甲肾上腺素重吸收，以便保护非多巴胺能神经元的神经元。 

使用水合氯醛(400mg/kg，i.p.)麻醉小鼠，并将小鼠置于用于小鼠立体定位的框架适配器(Koft)中。将6-OHDA以10μg/μl的浓度溶于包含0.02%抗坏血酸的生理盐水中，并按照0.5μl/min的速率注射。在注射之后，将注射针(Hamilton)留在原位7分钟，之后抽出。 

使用下述坐标进行注射：距前囟前后方向0.5mm和中侧1.0mm，距头盖骨背腹侧2.0mm。立体定位注射之后3天，解剖纹状体组织，称重并以1:10比例用裂解缓冲液(20mM的Tris[pH7.6]、150mM的NaCl、1mM的EDTA、1mM的NaF、0.5%NP-40和蛋白酶抑制剂)匀浆化。在4℃下，孵育该匀浆液20分钟，接着在4℃下，以20,000×g离心10min。收集上清液，并通过DC蛋白质测定试剂盒(Bio-rad)测定蛋白质浓度。 

将蛋白质样品与SDS样品缓冲液混合，并在100℃煮沸5分钟。在10%SDS-PAGE凝胶上分离等量的蛋白质，转移至硝基纤维素膜。用酪氨酸羟化酶(TH，1:4000,Millipore)的抗体和β-肌动蛋白(1:2000，Sigma)孵育该膜。然后，用HRP-结合的二级抗体(1:4000，Cell Signaling Technology)培养印迹，接着进行化学发光检测(ECL；Amsersham)。 

组分RRBU和RRWA中化合物成分的测定 

HPLC条件： 

采用HPLC-DAD方法进行RRTE、RRCF、RRBU、RRWA和标准化合物的分析和质量控制。所有的分析都使用由600泵、717自动进样器和UV/VIS光电二极管阵列2996检测器组成的Waters HPLC系统。 

在室温下，在SunFire C18柱(粒径4.6mm×150.0mm，5μm)上进行色谱分离，流动相为乙腈(溶剂A)和水(溶剂B)，流速1.0ml/分钟。采用梯度洗脱，从0至45min使用2%至70%的溶剂A(对于图10A-D，0-33分钟，2%～50%ACN；33-40分钟，50%～70%ACN；40-43分钟，70%ACN；43-45分钟，70%～2%ACN，并且对于图11A-D，0～40分钟，10%至85%ACN；40～42分钟，85%至10%CAN)。用于检测化合物的波长为220nm。将样品溶于比例2:1的MeOH和水中，0.45μm Millipore针筒式过滤器滤过。注入20微升样品进行HPLC分析。 

腹膜内注射后小鼠脑和血浆中RR-C36水平的测定 

将化合物RR-C36(络塞维)溶于生理盐水中，并以300mg/kg(10ml/kg)腹膜内注射到8周龄C57Bl/6小鼠中。在施用后15、30和60分钟，将小鼠麻醉，眼窝取血到EDTA 收集管中。然后，给小鼠灌注生理盐水30分钟，并解剖大脑。然后，将大脑在300μl水中匀浆化。在离心之后收集血浆。接着，将1ml的三氟醋酸盐加入到血浆和脑匀浆液中，并涡旋至充分混合。离心，将上清液转移并在真空下蒸发。接着，将0.1ml的乙腈(ACN)加入到各管中，涡旋和超声处理5分钟。通过13800rpm离心5分钟，沉淀任何不溶物。小心地转移75μl上清液到另外的小瓶中进行LC-MS/MS分析，进样体积为10μl。 

HPLC条件： 

使用Agilent1200系列HPLC装置，配备有G-1312二元泵、G-1313自动进样器、和G-1316柱温箱。通过HP Chemstation软件(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)操作该系统。于40℃的柱温下，在Agilent Zorbax C18柱(50×3.0mm,1.8μm)上进行液相层析。流动相由(A)0.1%甲酸水溶液和(B)甲醇组成。进样10微升的各样品溶液，并按照下述程序以0.5mL/分钟的流速洗脱：0–5分钟，30～100%B；5–6分钟，100%B；6–6.1分钟，100～30%B；6.1–10分钟，30%B。 

MS/MS检测：API4000+MS 

在装有具备电喷雾电离探针的Turbo V源的AB SCIEX4000+三重四极杆系统上进行MS分析。以阳离子方式进行的ESI多反应监测(MRM)模式用于检测。 

在MRM模式中，四极杆1设定为一组母离子，四极杆2用作诱导裂解的碰撞室，四极杆3设定为一组子离子。ESI条件如下：去簇电压60V，入口电压10V，碰撞室出口电压12V，碰撞能量60V，气帘气20(任意单位)，碰撞气体5(任意单位)，离子喷雾电压5500kV，离子源温400℃，离子源气体1∶40(任意单位)，离子源气体2∶20(任意单位)。使用的母/子离子对为451>117。 

PD小鼠的自主活动试验 

Rotorod试验 

Rotorod试验评价啮齿类动物的运动协调、平衡和均衡能力，是由试验化合物引起的啮齿类动物运动协调的微小缺失的一种灵敏指示。在该试验中，将啮齿类动物放置于小 发动机驱动的旋转柱体上，记录动物在该转筒上行走的方式。在加速旋转棒(Panlab)上试验小鼠的自发活动。在训练前，使小鼠适应机器一天。将小鼠放置于以4rpm的初始速度旋转的水平塑料杆上，杆的转动速度在10分钟之内从4rpm直线增加至40rpm。测定当行走在杆的顶端时每只小鼠保持其平衡的等待时间。在治疗或手术前一天，试验受试者预训练3次。在手术之后，记录受试者下落的等待时间。 

旷场试验（Open Field Test） 

旷场试验测量试验化合物对受试者自主活动的影响。通过将每只小鼠放置在旷场(正方形场地(50×50cm)，被40cm高的黑壁包围)中30分钟来测量自发活动。在每次试验之前，用70%乙醇清洁场地，然后用湿棉花擦拭以防止由于之前小鼠遗留下的气味线索引起的可能偏差。将每只小鼠分别放置于场地中心，并通过固定在2m高的摄像机记录其在场地中的活动。使用Noldus EthoVision XT软件进行每只小鼠的评分。排除在场地的角或外周或中心区域和行走的全部路程所花费的时间与平均值的差高于2SD的小鼠。 

原子力显微镜检查（Atomic force microscopy） 

重组α-突触核蛋白购自GenWay Biotech,Inc.(San Diego CA)，并贮存在-20℃下。将蛋白质溶液解冻，并以20,000×g离心10分钟，以除去任何预形成的聚集体或污染粒子。 

通过将溶于TBS缓冲液中的2μl的TCM药物或DMSO加入到40μl的α-突触核蛋白等分试样(1mg/mL)中进行聚集试验。在第0、3、7和14天的时间点，将10μl的药物和α-突触核蛋白混合物进一步等分到硅化处理的微量离心管(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中。第0天，将样品立即固定到新切割的白云母基片上，如下所述。在第3、7和14天，在37℃下，在温度调节搅拌器(C25Incubator Shaker,New Brunswick Scientific,Edison,NJ)中孵育样品，同时以250rpm振摇。在每个时间点，将2.1μl的各种等分试样应用于新切割的白云母基片(3mm圆片，SPI Supplies,West Chester,PA)上，并孵育20分钟。用过滤水(7×100μl)冲洗云母表面，以除去盐和释放结合的蛋白质。将样品风干过夜，第二天进 行AFM成像。使用Veeco MultiMode Scanning Probe Microscope(Santa Barbara,CA)与Bruker Scanasyst-Air探针(Camarillo,CA)对样品成像。 

所有的测量都是在适宜的环境条件下，使用空气构型的ScanAsist以轻敲模式进行。以0.977Hz的扫描频率进行成像，每个线512个数据点。在四个预先设定的位置获取2μm图像，以证实那些各个云母片的面材结构是一致的。使用Nanoscope Analysis1.4(Bruker)分析图像。 

SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白和细胞死亡的检测 

将人神经瘤细胞系SH-SY5Y保持在37℃下5%CO₂中的MEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，该MEM补充有10%FBS、100U/ml青霉素和1mg/mL链霉素。 

对于裂解的半胱天冬酶-3和α-突触核蛋白聚集的蛋白质印迹分析，将1×10⁵细胞/ml的SH-SY5Y细胞接种在100-mm组织培养板中。在孵育24小时之后，用在含有2%FBS的MEM中的RRBU和RRWA预处理细胞2小时。然后，用1mM的MPP+(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)处理细胞20小时。使细胞在改性的RIPA裂解缓冲液(在50mMTris缓冲液，pH7.4中的150mM NaCl、1%Nonidet P-40,1mM EDTA、0.5%脱氧胆酸、2μg/ml抑肽酶、1mM PMSF、5mM苯甲脒、1mM原钒酸钠和10μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂)中裂解。 

蛋白质定量试剂购自BioRad laboratories(Hercules,CA)。在通过SDS-PAGE凝胶电泳分离之后，将蛋白质转移到硝基纤维素膜上。在室温下，用在Tris-缓冲的生理盐水中的0.1%吐温-20和5%脱脂奶粉阻断小时之后，在4℃下，用一级抗体(1:1000)孵育该膜过夜，并用辣根过氧化酶(HRP)结合的二级抗体(1:2000)孵育1小时。裂解半胱天冬酶-3的抗体和第二抗体(HRP结合的山羊抗小鼠、抗兔子抗体)购自Cell Signaling Technology(Beverly,MA)。α-突触核蛋白的抗体来自BD Transduction Laboratories(San Jose,CA)。GAPDH的抗体得自Ambion(Invitrogen)。 

使用增强化学发光(ECL)蛋白质印迹系统(GE Healthcare Buckinghamshire,UK)进行检测。使用ImageJ进行蛋白质印迹的定量。 

人A53T转基因小鼠PD模型 

使用在小鼠朊病毒启动子的控制下过表达人A53Tα-突触核蛋白的转基因小鼠(本文也称为人A53T转基因小鼠)进行行为和生物化学研究(Giasson,2002,Neuron34:521-233)。如Jackson Laboratory描述的进行基因分型。简而言之，通过蛋白酶K消化从小鼠耳朵提取基因组DNA。通过DNA样品的定量PCR鉴别纯合的转基因小鼠(A53T)和年龄配对的非转基因小鼠(野生型，WT)。将A53T(n=4-6)和WT(n=2-3)小鼠随机分配到不同实验组中。 

转基因小鼠PD模型中α-突触核蛋白的检测 

通过生物化学组分检测转基因小鼠中α-突触核蛋白的表达，如所描述(Ihara,2007,Neuron53:519-33)。解剖来自每只小鼠的脊髓，称重，并通过在3mL/g的氚核X-100可溶性缓冲液(10mM Tris-HCl[pH7.6]、150mM NaCl、1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂)中超声处理来匀浆化，4℃下孵育20分钟。将该匀浆液在4℃以15,000×g离心30分钟。在离心之后，将上清液保存为“Triton可溶组分”，并用1mL/g的0.1%SDS缓冲液(10mMTris-HCl[pH8.0]、150mM NaCl、1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS和蛋白酶抑制剂)进一步超声处理和提取沉淀物。在4℃以15,000×g离心30分钟之后，将上清液保存为“SDS-可溶性组分”。将剩余沉淀物溶解，并且在1ml/g的3%SDS缓冲液(3%SDS和5%β-巯基乙醇)中超声处理。将溶解产物煮沸5分钟，保存为“SDS-不溶性组分”。在负载和在15%SDS-PAGE凝胶中蛋白质分离之前，马上将样品与SDS样品缓冲液混合，并在100℃下煮沸5分钟。然后，将该蛋白质转移到硝基纤维素膜，并用α-突触核蛋白(1:1000，BD Transduction Laboratories)的抗体、LB509(1:500,Invitorgen)和GAPDH(1:10,000，Ambion)孵育该膜。然后，用HRP结合的二级抗体(1:4000，Cell signaling technology)培养印迹，接着进行化学发光检测(ECL；GE Healthcare)。 

通过硫代黄素T测定来检测aβ(1-42)聚集体 

通过特异性结合原纤维结构的硫代黄素T(ThT)测定淀粉样-β-聚集相对度。Aβ(1-42)肽购自rPeptide(Bogart,GA)。根据制造商的试验设计进行Aβ(1-42)聚集体的制备。 

总而言之，将Aβ(1-42)肽首先以6mg/mL溶于水中，接着在PBS中稀释至1mg/ml。在37℃下，用RR组分或分离的化合物孵育30μl的Aβ(1-42)溶液3天。然后，将ThT(Sigma-Aldrich)加入到每个样品中至20μM的最终浓度。使用FLEX Station(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量每个样品的荧光强度。用430nm的激发波长和485nm的发射波长与455nm的截止波长测量荧光任意单位。 

实施例

如下是用于阐述实施本发明的实施方案的实施例。这些实施例不应当被看作是限制。除非另有说明，所有溶剂混合物比例都以体积计。 

实施例1-玫瑰红景天提取物抑制α-突触核蛋白蛋白质的聚集 

制备玫瑰红景天(RR)的总提取物(TE)。在37℃下，用该提取物(0.07μg)在TBS中的重组-α-突触核蛋白孵育7天。在培养之后，根据制造商的说明用Bio-Dot SF微量过滤装置(Bio Rad)过滤样品。在过滤之后，通过蛋白质印迹分析测定截留的α-突触核蛋白的量。 

如图1所示，在未处理的对照样品中，与第0天相比，在第7天，α-突触核蛋白蛋白质的聚集形式的量显著增加。当与未处理的对照相比，用DMSO处理7天的样品中发现了类似量的α-突触核蛋白蛋白质的聚集形式。使用刚果红(一种已知的抗α-突触核蛋白聚集的抑制剂)处理的样品用作阳性对照。用1μg至100μg的RR的TE(RRTE)孵育α-突触核蛋白蛋白质，抑制α-突触核蛋白聚集，其抑制作用与刚果红相当(图1)。 

实施例2-玫瑰红景天提取物的水和乙醇组分抑制α-突触核蛋白蛋白质的聚集 

制备玫瑰红景天(RR)的总提取物(TE)和组分。然后，在37℃下，用该提取物(μg/ml)孵育在TBS中的重组-α-突触核蛋白7天。在孵育之后，根据制造商的说明，用Bio-Dot SF微量过滤装置(Bio Rad)过滤样品。在过滤之后，通过蛋白质印迹分析测定截留的α-突触核蛋白的量。 

用RR总提取物(RRTE)和RR组分(RRPE(玫瑰红景天石油醚组分)、RREA(玫瑰红景天乙酸乙酯组分)、RRBU(玫瑰红景天丁醇组分)和RRWA(玫瑰红景天水组分))孵育重组α-突触核蛋白7天。如实施例1描述的进行过滤器截留测定。未处理的样品为阴性对照，刚果红处理的样品为阳性对照。 

结果表明RRTE、RREA、RRBU和RRWA在低至1μg/ml的浓度抑制α突触核蛋白的聚集，而RRPE甚至在10μg/ml也不会抑制α突触核蛋白聚集。3μg/ml的RRTE抑制α-突触核蛋白的聚集，该抑制作用与刚果红(阳性对照)相当。由总提取物制备丁醇(BU)、EA(乙酸乙酯)和水(WA)组分。结果表明BU、EA和WA组分(1μg/ml)有效地抑制α-突触核蛋白聚集，这样的抑制作用大于TE的作用(图2).。 

实施例3-α-突触核蛋白蛋白质聚集的抑制 

从RRWA分离化合物RR-C20(红景天苷)和RR-C36(络塞维)。然后，在37℃下，分别用化合物RR-C20和RR-36孵育在TBS中的重组α-突触核蛋白7天。在孵育之后，根据制造商的说明，用Bio-Dot SF微量过滤装置(Bio Rad)过滤样品。在过滤之后，通过蛋白质印迹分析测定截留的α-突触核蛋白的量。 

如图3A所示，在孵育7天之后，α-突触核蛋白聚集体增加，刚果红抑制α-突触核蛋白聚集的增加。从RRBU或RRWA分离的RR-C36(络塞维)以剂量依赖性方式抑制α-突触核蛋白聚集。 

图3B显示RR-C36(络塞维)以剂量依赖性方式抑制体外α-突触核蛋白的聚集。如通过PRISM GraphPad(版本5.03)测定，RR-C36抗-聚集作用的IC50为～0.36μM。 

通过用RR-C36孵育预聚集的α-突触核蛋白(孵育α-突触核蛋白5天)检查RR-C36的解集作用。10μM的RR-C36诱导预聚集的α-突触核蛋白解聚。 

图3C显示在7天孵育之后，α-突触核蛋白聚集增加，刚果红抑制α-突触核蛋白聚集的增加。从RR分离的RR-C22(6-O-没食子酰基络缌)和RR-C49(络塞琳)以剂量依赖性方式抑制α-突触核蛋白聚集。 

图3D显示在7天孵育之后，α-突触核蛋白聚集增加，刚果红抑制α-突触核蛋白聚集的增加。从RR分离的RR-C31(淫羊藿次苷D2)和RR-C47(mongrhoside)以剂量依赖性方式抑制α-突触核蛋白聚集。 

图3E显示在7天孵育之后，α-突触核蛋白聚集增加，刚果红抑制α-突触核蛋白聚集的增加。从RR分离的RR-C04(没食子酸)和RR-C34(6-O-没食子酰基熊果苷)以剂量依赖性方式抑制α-突触核蛋白聚集。 

实施例4-玫瑰红景天组分，RR-C36和RR-C41抑制α-突触核蛋白的低聚物形成 

如在原子力显微镜检查中观察的，形成的α-突触核蛋白在体外具有不同的形态学(Aperti et al.,2006)。基于高度差检测较小、较大的球形低聚物和原纤维种类。非原纤维低聚物比如球体的高度为2-6纳米，纤丝(filaments)的高度为5纳米，原纤维的高度为8-10纳米。在37℃下，用在TBS中的重组α-突触核蛋白孵育玫瑰红景天(RR)的组分，RR-C36和RR-C41达到7天和14天。在孵育之后，将样品点样在云母上，使用原子力显微镜检查进行分析。如图4A&4B所示，在DMSO-处理的样品中观察到α-突触核蛋白的低聚物或短的原纤维；相反，组分RRBU、RRWA、化合物RR-C36(络塞维)和RR-C41(rhodiocyanoside A)抑制较大α-突触核蛋白聚集体的形成。 

实施例5-RR组分显示出对AΒ1-42的抗-聚集活性 

为了检查RR的总提取物、各种RR组分和络塞维(RR-C36)是否抑制淀粉样-β肽(Aβ1-42)的聚集，在37℃分别用RRTE、各种RR组分和络塞维孵育重组人Aβ1-423天。在孵育之后，样品进行硫代黄素T(ThT)结合测定。组分RRBU和RRWA显示对Aβ1-42聚集的抗-聚集活性，如通过ThT荧光单位的减少所显示的。RR-C36没有降低Aβ1-42聚集体的量。 

实施例6-RRBU和RRWA防止MPP+诱导的神经元细胞死亡且RRWA抑制MPP+诱导的α-突触核蛋白聚集 

SH-SY5Y细胞的MPP+处理诱导细胞的凋亡、α-突触核蛋白的聚集、以及高分子量聚集体的形成(Kalivendi et al.,Alpha-synuclein up-regulation and aggregation during MPP+-induced apoptosis in neuroblastoma cells:intermediacy of transferrin receptor iron and hydrogen peroxide.J.Biol.Chem.(2004)279:15240-15247)。 

在该实施例中，首先用RRBU(50μg/ml)、RRWA(50μg/ml)或DMSO(0.1%)预处理SH-SY5Y细胞2小时，然后用MPP+(1mM)孵育20小时。收集全部细胞溶解产物进行针对裂解的半胱天冬酶-3和α突触核蛋白的蛋白质印迹。 

如图6所示，在MPP+的存在下，RRBU和RRWA降低半胱天冬酶-3的裂解形式或活化形式的表达水平。GAPDH的探查充当负载对照。另外，RRBU和RRWA都降低高分子量α-突触核蛋白的形成，并增加细胞溶解产物中单体的含量。 

实施例7-玫瑰红景天的WA组分减少注射6-OHDA的小鼠中酪氨酸羟化酶的损失 

经由侧脑室内途径，将6-羟基多巴胺(6-OHDA)，一种天然的多巴胺能毒素，注射到用RRWA预处理5天的小鼠中。然后，在立体定位手术之后，每日用RRWA处理所述小鼠额外3天。解剖小鼠的纹状体，并提取蛋白质。使用蛋白质印迹分析纹状体中酪氨酸羟化酶(TH)的表达。图7A图解试验设计。 

酪氨酸羟化酶是一种催化催化氨基酸L-酪氨酸转化成二羟基苯丙氨酸-多巴胺前体的酶。酪氨酸羟化酶的表达降低表明多巴胺能神经元损失。 

如图7B所示，当与注射抗坏血酸的小鼠(充当假对照)时，注射6-OHDA的小鼠显示纹状体中酪氨酸羟化酶的蛋白质表达显著减少。在6-OHDA-处理的小鼠中，10mg/kg或100mg/kg的玫瑰红景天的水组分(RRWA)处理恢复了TH水平，如通过蛋白质印迹分析显示的(图7B)。 

在Rotorod试验中评价注射6-OHDA小鼠的自主活动。在立体定位手术之前1天(试验前)和之后3天，使用标准rotorod装置以4rpm至40rpm的加速度进行该试验超过600s。测量三个试验中每只小鼠的平均下落持续时间。在注射6-OHDA之后三天，下落持续时间降低约67%。在6-OHDA损伤之后，用RRWA处理的小鼠显示运动行为改善。 如图7C所示,在RRWA-处理的老鼠中运动缺乏得到缓解。结果表明RRWA减少了6-OHDA诱导的TH损失，并且缓解了6-OHDA损伤之后的运动缺陷。 

实施例8-RRWA、RRBU和络塞维改善人A53TΑ-突触核蛋白转基因小鼠中的运动缺陷 

检查人A53Tα-突触核蛋白转基因(A53T)小鼠中RRBU、RRWA和RR-C36的作用。与非转基因(WT)小鼠相比，五至六月龄A53T小鼠显示运动活动受损，如通过旷场实验测定所示(图8，左图)。将A53T小鼠随机分组，并且每日口服RRBU(150mg/kg)、RRWA(150mg/kg)或RR-C36(络塞维)(20mg/kg)处理4周。在用RR-C36、RRWA或RRBU处理4周之后，在旷场试验中检查处理小鼠的运动功能。RR-C36、RRWA和RRBU改善A53T小鼠的运动功能，结果表明处理的小鼠在旷场中行进的距离更大(图8，右图)。 

实施例9-腹腔注射后小鼠血浆和脑中络塞维的检测 

经由腹腔注射向小鼠施用络塞维(RR-C36)。在腹膜内注射15、30和60分钟，用LCMS/MS检测在小鼠脑和血浆中的RR-C36。使用与脑匀浆液和血浆混合的已知浓度的RR-C36半定量RR-C36的水平。由标准值计算脑和血浆中RR-C36的实际浓度。 

如图9所示，在施用之后15分钟后再小鼠的脑和血浆中检测到了RR-C36。 

实施例10-从玫瑰红景天分离的化合物的提取、分离和结构解析 

在中国新疆伊梨采集的玫瑰红景天的干燥根根购自中国四川省成都成都医药公司。将玫瑰红景天的干燥根(7.5kg)用70%的EtOH水溶液(35L、35L、35L，2小时/次)回流提取三次。在真空下浓缩70%的乙醇提取物，得到残余物(900g)。将该残余物悬浮在1.5L H₂O中，然后用石油醚(60-90℃，1.5L×3)、乙酸乙酯(1.5L×3)和正丁醇(1.5L×3)连续地萃取。分别合并蒸发这些组分，得到总共90g的石油醚提取物、250g的EtOAc提取物、360g的正丁醇提取物和190g的水提取物。 

一部分正丁醇提取物(200g)进行硅胶柱色谱，用比例为20:2:1、16:2:110:2:1、6:2:1、4:2:1的EtOAc/EtOH/H₂O洗脱，得到66个流份。基于TLC特性，合并这些流份， 得到10个次组分(sub-fractions)(Fr.A～Fr.J)。使用反复柱色谱(硅胶柱，用比例为50:1～5:1的CHCl₃和甲醇洗脱；或Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱)，从Fr.A分离得到化合物RR-C04(没食子酸，15mg)，从Fr.B分离得到RR-C20(红景天苷，1.8g)，从Fr.C分离得到RR-C47(mongrhoside,5mg)，从Fr.D分离得到RR-C31(淫羊藿次苷D2,12mg)、RR-C34(6-O-没食子酰基熊果苷，16mg)、RR-C36(络塞维,800mg)和RR-C49(络塞琳，8mg)，从Fr.F分离得到RR-C22(6-O-没食子酰基络缌，6mg)和RR-C41(rhodiocyanoside A,360mg)， 

基于¹H NMR和¹³C NMR解析化合物RR-C04、RR-C20、RR-C22、RR-C31、RR-C34、RR-C36、RR-C41、RR-C47和RR-C49的结构。这些化合物的NMR数据显示在表1、表2和表3中。 

表1.化合物RR-C20、RR-C36和RR-C41的¹H和¹³C NMR数据(CD₃OD,400MHz) 

表2.化合物RR-C4、RR-C22和RR-C34的¹H和¹³C NMR数据(CD₃OD,400MHz) 

表3.T化合物RR-C31、RR-C47和RR-C49的¹H和¹³C NMR数据(CD₃OD,400MHz) 

在此，将本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都以如同每个参考文献分别或特别地指出并入本文，并且在本文中列出全部内容一样并入作为参考。 

在描述本发明的上下文中（(特别是在下述权利要求书的内容中）的使用的术语"一个"和"所述的"及类似指示词将被解释为包括单数和复数，除非本文中另有说明或与上下文有明显的矛盾。 

除非本文另有说明，本文中数值范围的列举仅仅意味着充当分别指出属于所述范围的各个单独值的简写方法，并且将各个单独值如同其分别在本文中列举一样并入说明书中，除非另有说明，本文提供的所有的精确值代表相应的近似值(例如，对于特定的因素或测定提供的所有精确示例性的值可被认为也提供相应的近似测定，当适当时，用"约"修饰)。 

除非另有说明，本文提供的任何或所有的实例、或示例性术语(例如"比如"）的使用意味着仅仅为了更好地阐述本发明，而不造成对本发明范围的限制。在说明书中没有术语应当看作是指示任何作为实施本发明必不可少的部分，除非同样明确地说明。 

对于成分使用术语"包括"、"具有"或"包含"的本发明的任何方面或实施方案的本文说明意味着提供用于本发明的类似方面或实施方案"由其组成"、"基本上由其组成"或"基本上包括"那些特定成分的支持，除非另有说明或与上下文明显矛盾(例如，本文描述的组合物如包括一种特定成分应当理解为也描述了由所述成分组成的组合物，除非另有说明或与上下文明显矛盾)。 

应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅仅用于示例说明的目的，根据其的各种改良或变化将可由本领域技术人员提议，并包括在本申请的精神和权限范围之内。 

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Claims (20)

1.一种抑制α-突触核蛋白聚集的方法，其中所述方法包括向α-突触核蛋白聚集体施用有效量的分离的或基本纯的式I、或式III至式VIII的化合物、或其盐，

其中式I的化合物具有下述结构∶

其中式I的R₁-R₃独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；式I的R₄-R₉独立地为氢、烷基或酰基；

其中式III的化合物具有下述结构∶

其中式III的R₁-R₃和R₇-R₉独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；式III的R₄-R₆独立地为氢、烷基或酰基；

其中式IV的化合物具有下述结构∶

其中式IV的R₁-R₆独立地为氢、烷基或酰基；式IV的R₇-R₉独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；

其中式V的化合物具有下述结构∶

其中式V的R₁-R₄独立地为氢、烷基或酰基；式V的R₅为羟基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、烷氧基、硫醇、氰基或–COOH；

其中式VI的化合物具有下述结构∶

其中式VI的R₁-R₃独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；式VI的R₄-R₁₀独立地为氢、烷基或酰基；

其中式VII的化合物具有下述结构∶

其中式VII的R₁-R₄独立地为氢、烷基或酰基；

其中式VIII的化合物具有下述结构∶

其中式VIII的R₁-R₃和R₇-R₉独立地为氢、羟基、酰基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、烷基、羟基烷基、烷氧基、硫醇；式VIII的R₄-R₆独立地为氢、烷基或酰基。

2.根据权利要求1的方法，其中所述化合物选自络塞维(rosavin)、6-O-没食子酰基络缌(6-O-galloyl rosin)、络塞琳(rosarin)、淫羊藿次苷D2、mongrhoside、6-O-没食子酰基熊果苷（6-O-galloyl arbutin）或rhodiocyanoside A。

3.根据权利要求1的方法，其中α-突触核蛋白聚集体位于受试者中，并且向受试者施用所述化合物或其盐。

4.根据权利要求3的方法，其中所述受试者患有神经变性疾病。

5.根据权利要求4的方法，其中所述神经变性疾病选自帕金森病、突触核蛋白病、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、具有路易体的痴呆、单纯性自主神经衰竭(PAF)、多系统萎缩(MSA)、亨廷顿氏疾病或路易体疾病。

6.一种治疗神经变性疾病或神经病理性疾病的方法，其中所述方法包括向需要这样的治疗的受试者施用有效量的分离的或基本上纯的式I、或式IV至式VII的化合物、或其盐，

其中式I的化合物具有下述结构∶

其中式I的R₁-R₃独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；式I的R₄-R₉独立地为氢、烷基或酰基；

其中式IV的化合物具有下述结构∶

其中式IV的R₁-R₆独立地为氢、烷基或酰基；式IV的R₇-R₉独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；

其中式V的化合物具有下述结构：

其中式V的R₁-R₄独立地为氢、烷基或酰基；式V的R₅为羟基、卤素、卤代烷基、氨基、烷基氨基、烷氧基、硫醇、氰基或–COOH；

其中式VI的化合物具有下述结构∶

其中式VI的R₁-R₃独立地为氢、羟基、甲氧基或乙氧基、卤素、氨基、酰基或硫醇；式VI的R₄-R₁₀独立地为氢、烷基或酰基；和

其中式VII的化合物具有下述结构∶

其中式VII的R₁-R₄独立地为氢、烷基或酰基。

7.根据权利要求6的方法，其中所述化合物选自络塞维、络塞琳、淫羊藿次苷D2、mongrhoside、或rhodiocyanoside A。

8.根据权利要求6的方法，其中所述神经变性疾病选自帕金森病、突触核蛋白病、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、具有路易体的痴呆、单纯性自主神经衰竭(PAF)、多系统萎缩(MSA)、亨廷顿氏疾病或路易体疾病。

9.根据权利要求6的方法，其中所述神经变性疾病为突触核蛋白病。

10.根据权利要求6的方法，其中所述神经变性疾病为帕金森病。

11.根据权利要求6的方法，其中所述神经病理性病症选自神经性疼痛、中风、脑外伤或癫痫。

12.一种减少α-突触核蛋白聚集的方法，其中所述方法包括向α-突触核蛋白聚集体施用有效量的包括分离的玫瑰红景天提取物和任选地可药用载体的组合物。

13.根据权利要求12的方法，其中所述α-突触核蛋白聚集体位于受试者中，并且向受试者施用所述组合物。

14.权利要求12的方法，其中所述组合物包括至少90%重量的玫瑰红景天提取物。

15.权利要求12的方法，其中所述玫瑰红景天提取物为水提取物或醇提取物。

16.权利要求12的方法，其中所述玫瑰红景天提取物为水、乙醇或丁醇提取物。

17.根据权利要求12的方法，其中所述玫瑰红景天提取物是使用包括下述的方法制备的：

提供足量的玫瑰红景天原料；

用包括醇的第一溶剂提取该玫瑰红景天原料，得到玫瑰红景天醇提取物；

回收该玫瑰红景天醇提取物；

混合该玫瑰红景天醇提取物与水；和

用一种或多种有机溶剂分配该水-玫瑰红景天醇提取物，得到一种或多种有机溶剂组分和水组分，

其中所述第一溶剂包括选自甲醇、乙醇或丙醇的醇，和

其中所述有机溶剂选自石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。

18.根据权利要求12的方法，其中所述原料为玫瑰红景天根。

19.一种减少淀粉样β肽聚集的方法，其中所述方法包括向淀粉样β肽聚集体施用有效量的包括分离的玫瑰红景天提取物和任选的可药用载体的组合物。

20.根据权利要求19的方法，其中所述淀粉样β肽聚集体位于受试者中，并且向受试者施用所述组合物。

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