CN109771468A - 杜仲雄花有效部位及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杜仲雄花有效部位的制备方法，其包括如下步骤：将粉碎后的杜仲雄花用30－60%乙醇闪式提取，提取液浓缩后用大孔吸附树脂吸附并用水冲洗，然后用30－60%乙醇梯度洗脱，合并梯度洗脱获得的洗脱液，经浓缩、干燥后即得到杜仲雄花有效部位。本发明经试验发现：杜仲雄花有效部位对酒精诱导的小鼠脑神经DNA损伤具有显著保护作用，其保护机制与增强小鼠脑组织的抗氧化功能，保护脑组织免受自由基的进一步伤害有关，可用于制备保护脑神经保健品、食品或药物等。

Description

杜仲雄花有效部位及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种杜仲雄花有效部位、制备方法及其在制备预防和治疗由酒精引起的脑神经损伤、或者是保护与增强脑组织抗氧化功能药物、食品或保健品中的新应用。

背景技术

乙醇滥用是世界范围内严重危害人类健康的问题，引起脑损害、认知缺陷、运动协调功能丧失及相应的心理功能改变。中枢神经系统是乙醇的主要作用靶点，其基因毒性是乙醇中毒性疾病的重要机制之一。目前，已经证明乙醇急性及长期服用对小鼠不同脑区DNA造成不同程度的氧化性损伤, 进而造成脑神经细胞坏死和凋亡、炎症等病理变化，最终导致各种脑部疾病，其中对小脑和大脑皮层基因毒性最强。而脑组织对于基因毒性引起的DNA损伤修复能力低，所以，DNA修复系统缺陷导致DNA损伤的积累，最终导致神经变性即神经毒性。因此，寻找新型、有效预防和治疗酒精引起脑损伤的功能性食品、保健品或药物具有重要意义。

杜仲雄花为杜仲科杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）雄树开的花。杜仲是我国特产的名贵滋补中药材，为补益肝脏和肾脏的佳品，能够预防习惯性流产、抗衰老，调节血压等。杜仲雄花与其叶、皮所含有效成分相似，如富含黄酮、绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷等，以及微量元素、粗蛋白、多种维他命和氨基酸等，具备极高医疗保健价值，如降血脂、延缓衰老、增强免疫力、改善糖代谢、镇静镇痛、抗菌等。杜仲为雌雄异体，其中雄株大约占总数的40～60%，而且雄株雄花产量颇高，但是目前对于杜仲雄花的药用价值却关注度不够，相关研究报道甚少，也没有关于杜仲雄花保护酒精引起脑损伤的相关报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，更好地提供一种杜仲雄花有效部位，其可以用于制备预防和保护由酒精引起脑神经损伤的食品、保健品以及药物中，从而充分利用杜仲雄花资源，开辟综合利用的新途径。

本发明还提供了上述杜仲雄花有效部位的制备方法，及其在制备预防和治疗由酒精引起的脑神经损伤、或者是保护与增强脑组织抗氧化功能药物、食品或保健品中的新应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种杜仲雄花有效部位的制备方法，其包括如下步骤：将粉碎后的杜仲雄花用30－60%乙醇闪式提取，提取液浓缩后用大孔吸附树脂吸附并用水冲洗（水冲洗液弃掉），然后用30－60%乙醇梯度洗脱，合并梯度洗脱获得的洗脱液，经浓缩、干燥后即得到杜仲雄花有效部位。

具体的，闪式提取时每1 g 杜仲雄花添加30－60%乙醇10－15mL，闪式提取2－3次，以充分提取到较多的有效成分。

进一步优选的，闪式提取时每次提取时间为3－8min。

具体的，所述大孔吸附树脂采用常规型号，具体为HPD100，HPD600，HPD400，D101，AB-8，ADS-17或DM130等。

本发明提供了采用上述制备方法制备得到的杜仲雄花有效部位。

本发明提供了上述杜仲雄花有效部位在制备保护与增强脑组织抗氧化功能药物、食品或保健品中的应用。

进一步的，本发明还提供了上述杜仲雄花有效部位在制备预防和治疗由酒精引起的脑神经损伤药物、食品或保健品中的应用。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明从杜仲雄花中提取得到杜仲雄花有效部位，并采用腹腔注射酒精诱导急性酒精脑神经DNA损伤小鼠模型，首次研究杜仲雄花对酒精诱导急性脑神经DNA损伤小鼠的影响。彗星实验和脑组织病理切片实验证实了杜仲雄花有效部位可以拮抗酒精引起的小鼠小脑、大脑皮层的DNA损伤，并且对酒精引起的小鼠脑神经损伤具有一定的保护作用；它可以降低小鼠小脑、大脑皮层的MDA、NO、8-OHdG的含量；能不同程度地提高小鼠小脑、大脑皮层部位的T-SOD、GSH-PX酶活力，上调了NQO1蛋白表达水平、下调Keap1蛋白表达水平，说明杜仲雄花可能通过激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路减轻酒精引起的小鼠脑神经DNA损伤，且此通路与神经保护和抗氧化应激作用密切相关。以上说明杜仲雄花有效部位能拮抗急性酒精诱导的脑神经损伤，并提高小鼠机体的抗氧化功能，保护机体免受自由基进一步伤害。

附图说明

图1杜仲雄花有效部位对乙醇引起小鼠小脑和大脑皮层DNA损伤的保护作用。尾矩显示为平均值±标准差。模型组与空白组对比，#P<0.001，模型组与给药组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图2 杜仲雄花有效部位对乙醇引起的小鼠小脑和大脑皮层组织学变化的作用（HE，×400）。

图3为杜仲雄花有效部位对小鼠小脑和大脑皮层中SOD、GSH-PX酶活性含量的影响。与空白对照组相比，&P<0.001，#P<0.05；与模型组相比，**P<0.01，***P<0.001。

图4为杜仲雄花有效部位对小鼠小脑和大脑皮层中NO、MDA含量的影响。与空白对照组相比，&P<0.001，Δ P<0.01；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图5 为杜仲雄花有效部位对小鼠小脑和大脑皮层中8-OHdG含量的影响。与空白对照组相比，&P<0.001；与模型组相比，***P<0.001。

图6 杜仲雄花有效部位对乙醇引起小鼠小脑和大脑皮层的 NQO1（a）、Keapl（b）蛋白表达水平的影响；与空白组相比，#P< 0.05，与模型组相比，*P< 0.05，**P< 0.01；（A代表空白组，B代表模型组，C代表阳性组，D代表低剂量给药组，E代表高剂量给药组）。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

下述实施例中，如无特殊说明，乙醇均指的是体积百分比。

实施例1

一种杜仲雄花有效部位的制备方法，其包括如下步骤：将0.2kg干燥的杜仲雄花粉碎后，分别用2L浓度50%（v/v，下同）乙醇闪式提取2次（第一次提取5min，第二次提取6 min），合并提取液，抽滤，旋转蒸发仪减压蒸发浓缩以回收乙醇，经HPD100大孔吸附树脂吸附，然后用水冲洗至流出液无颜色（弃掉），再依次用6倍柱体积30%乙醇、6倍柱体积60%乙醇梯度洗脱，合并梯度洗脱获得的洗脱液，经减压蒸发浓缩（以回收溶剂）、70℃干燥得19.52g提取物，即为杜仲雄花有效部位。

实施例2

一种杜仲雄花有效部位的制备方法，其包括如下步骤：将1kg干燥的杜仲雄花粉碎后，分别用10L 浓度60%乙醇闪式提取3次（第一次闪式提取3 min，第二次散式提取4 min，第三次闪式提取6 min），合并提取液，抽滤，旋转蒸发仪减压蒸发浓缩以回收乙醇。经HPD400大孔吸附树脂吸附，然后用水冲洗至流出液无颜色（弃掉），再依次用6倍柱体积35%乙醇、6倍柱体积55%乙醇梯度洗脱，合并梯度洗脱获得的洗脱液，经减压蒸发浓缩（以回收溶剂）、70℃干燥得98.91g提取物，即为杜仲雄花有效部位。

实施例3

一种杜仲雄花有效部位的制备方法，其包括如下步骤：将3 kg干燥的杜仲雄花粉碎后，分别用36L浓度40%乙醇闪式提取3次（第一次闪式提取7 min，第二次散式提取5 min，第三次闪式提取5min抽滤），合并提取液，抽滤，旋转蒸发仪减压蒸发浓缩以回收乙醇。经D101大孔吸附树脂吸附，然后用水冲洗至流出液无颜色（弃掉），再依次用6倍柱体积40%乙醇、6倍柱体积60%乙醇梯度洗脱，合并梯度洗脱获得的洗脱液，经减压蒸发浓缩（以回收溶剂）、70℃干燥得296.38g提取物，即为杜仲雄花有效部位。

效果实验一：杜仲雄花有效部位对酒精诱导的小鼠急性脑神经DNA损伤的影响

实验原料：实施例3制得的杜仲雄花有效部位作为实验原料。

实验动物：昆明种小鼠，体重 20±2 g，SPF级，由河南省实验动物中心提供，生产批号：SCXK（豫）2015-0004；合格证编号：No.41003100003652。

实验试剂：氯化钠，天津市德恩化学试剂有限公司；

氯化钾，天津市德恩化学试剂有限公司；

低熔点琼脂糖，郑州博远泰隆科贸有限公司进口分装；

正常熔点琼脂糖，郑州博远泰隆科贸有限公司美国原装进口；

乙二胺四乙酸二钠，天津欧博凯化工有限公司；

氢氧化钠，天津市光复科技发展有限公司；

磷酸氢二钠，天津市致远化学试剂有限公司；

盐酸，开封东大化工有限公司；

溴化乙锭，郑州博远泰隆科贸有限公司进口分装；

Triton X-100，AMRESCO solarbio；二甲基亚砜，Amresco solarbio公司；

磷酸二氢钾，天津市光复科技发展有限公司；TRIS，Sigma solarbio；

硫酸二甲酯，成都格雷西亚化学技术有限公司；

无水乙醇，安徽安特食品股份有限公司。

实验仪器：多功能水浴锅，郑州长城科技工贸有限公司；

JY200C型电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；

AB135-S型梅特勒-托利多B-S系列天平；

JY-SP7型水平电泳槽，北京君意东方电泳设备有限公司；

FV10型OLYMPUS荧光显微镜，日本；

载玻片与盖玻片，江苏海门帆一实验器材厂；

Multiskan Go1510酶标仪，Thermo Scientific；

LRH-150恒温孵育箱，上海一恒科学仪器有限公司；

TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂；涡流混合器，Thermolyne。

实验动物：雄性小鼠20只，分为5组，每组4只。即：空白组、模型组（乙醇6.0g/kg）、阳性组（维生素E 50mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲雄花低剂量组（100mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲雄花高剂量组（400mg/kg+乙醇6.0g/kg）。杜仲雄花有效部位用0.5%CMC-Na（羧甲基纤维素钠）双蒸水溶解。阳性组灌胃给予维生素E 50mg/kg，杜仲雄花低和高剂量组分别灌胃给予杜仲雄花有效部位100mg/kg和400mg/kg，连续灌胃三天，空白组及模型组灌胃给予等体积0.5%CMC-Na双蒸水，连续灌胃三天；最后一次给药后半小时，模型组、阳性组、杜仲雄花低和高剂量组以6.0g/kg剂量腹腔注射30%（v/v）乙醇（0.2ml/10g），空白组腹腔注射等容积生理盐水。

实验方法：给予乙醇四小时后断头取脑分离小脑和大脑皮层，迅速移至冰冷的器皿中，制备细胞混合液，凝胶制片，细胞裂解，DNA碱解旋，电泳，中和，固定，染色，阅片，CASP彗星分析软件分析，以尾矩为测量指标进行评价，用SPSS 17.0版本软件分析给药组与对照组之间的差异性水平，采用单因素方差分析来判断总体显著性差异，结果如图1所示。

图1给出了不同组别小鼠对乙醇引起小脑和大脑皮层DNA损伤的结果。图1结果表明：杜仲雄花有效部位高、低剂量组均具有显著拮抗酒精引起的小鼠小脑和大脑皮层的神经元DNA损伤。

效果实验二：杜仲雄花有效部位对酒精诱导的小鼠急性脑组织损伤的保护作用

实验动物：同上。

实验方法：给予乙醇四小时后，迅速剥离出小鼠整只脑，将其保存在配制好的4%多聚甲醛溶液中备用，采用石蜡包埋切片技术，制备脑组织切片。通过取材、脱水、包埋、切片、HE染色，最后显微镜观察。结果如图2所示。

图2 给出了杜仲雄花有效部位对乙醇引起的小鼠小脑和大脑皮层组织学变化的作用。从图2可以清晰看出：空白组小脑和大脑皮层细胞均呈较规则的圆形，细胞核大小、形状和排列也呈正常形态。模型组与之相比较，细胞数目出现缺失，结构不明晰，且大多数细胞固缩变形，部分呈空泡变性，细胞核深染，排列层次混乱。杜仲雄花有效部位低、高剂量组中，细胞极少数出现变形，呈空泡状的现象也有所减少。

效果实验三：杜仲雄花有效部位的抗氧化试验

实验动物：成年昆明小鼠，雄性，体重20 ± 2 g，SPF级，100只，分为5组，每组20只。即：空白组、模型组（乙醇6.0g/kg）、阳性组（维生素E 50mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲雄花低剂量组（100mg/kg+乙醇6.0g/kg）、杜仲雄花高剂量组（400mg/kg+乙醇6.0g/kg）。给药方法同上。

主要试剂盒：一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)，以上试剂均为南京建成生物工程研究所生产；8-羟基-2-脱氧鸟嘌呤核苷(8-OHdG)试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。

主要仪器：Multiskan Go1510 酶标仪 (Thermo Scientific)；TGL- 16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

实验方法：给药方法同上所述。实验操作按照试剂盒说明书进行，测定小鼠小脑和大脑皮层中NO、MDA、8-OHdG的含量，以及SOD、GSH-PX活力，结果如图3至5所示。

图3至5分别给出了杜仲雄花有效部位对小鼠小脑和大脑皮层中SOD、GSH-PX酶活性及NO、MDA、8-OHdG含量的影响。图3至5的结果显示：给药组与模型组比较，杜仲雄花有效部位高、低剂量组均能显著降低酒精急性给药后小鼠小脑和大脑皮层NO、MDA含量，显著提高神经DNA损伤小鼠小脑和大脑皮层的SOD酶和GSH-PX酶活性，并且高、低剂量组小脑和大脑皮层区域DNA的氧化损伤标记物8-OHdG含量也显著降低。表明杜仲雄花有效部位对小鼠脑组织氧化性DNA损伤均有保护作用，通过增强小鼠脑组织的抗氧化功能，避免脑组织被自由基进一步伤害。

效果实验四：杜仲雄花有效部位对酒精诱导小鼠脑组织损伤的NQO1（醌氧化还原酶1）、Keap1（Kelch样ECH联合蛋白1）蛋白表达的影响

实验动物：同上。

实验试剂：如下所示。

实验仪器： 如下所示。

实验方法：采用Western-blot方法进行组织总蛋白提取，BCA法测蛋白浓度，灌胶，上样，电泳，转膜，免疫反应，化学发光，凝胶图像分析，实验结果如图6所示。

图6的结果显示：与模型组相比较，杜仲雄花有效部位低、高剂量组的NQO1蛋白表达水平明显上升（*P< 0.05，**P< 0.01），而Keap1蛋白表达水平明显下降（*P< 0.05，**P<0.01）。

Keap1-Nrf2/ARE信号通路在机体抗氧化方面起到至关重要的作用。它调控的许多下游因子，如醌氧化还原酶1(NQO1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等，具备了抗氧化应激、抗细胞凋亡等诸多作用。NQO1属于Ⅱ相解毒酶，而且是机体中一种非常重要的可以抵抗氧化应激反应的酶。据报道，通过激活Keap1-Nrf2/ARE 氧化应激信号通路可能会对一些神经系统疾病表现出很强的神经保护功能，例如脑出血、脑梗死、创伤性脑损伤、帕金森等^[63]。说明杜仲雄花有效部位对酒精引起的小鼠小脑和大脑皮层DNA损伤保护的作用机制，可能通过激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路，上调NQO1蛋白表达水平，下调Keap1蛋白表达水平，发挥抗氧化作用。

Claims (7)

1.一种杜仲雄花有效部位的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将粉碎后的杜仲雄花用30－60%乙醇闪式提取，提取液浓缩后用大孔吸附树脂吸附并用水冲洗，然后用30－60%乙醇梯度洗脱，合并梯度洗脱获得的洗脱液，经浓缩、干燥后即得到杜仲雄花有效部位。

2.如权利要求1 所述杜仲雄花有效部位的制备方法，其特征在于，闪式提取时每1 g杜仲雄花添加30－60%乙醇10－15mL，闪式提取2－3次。

3.如权利要求2 所述杜仲雄花有效部位的制备方法，其特征在于，闪式提取时每次3－8min。

4.如权利要求1所述杜仲雄花有效部位的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的型号为HPD100，HPD600，HPD400，D101，AB-8，ADS-17或DM130。

5.采用权利要求1 至4任一所述制备方法制备得到的杜仲雄花有效部位。

6.权利要求5 所述杜仲雄花有效部位在制备保护与增强脑组织抗氧化功能药物、食品或保健品中的应用。

7.权利要求5 所述杜仲雄花有效部位在制备预防和治疗由酒精引起的脑神经损伤药物、食品或保健品中的应用。