TW201904597A

TW201904597A - 馬齒莧加工品、馬齒莧加工品的製造方法、補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑

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Publication number: TW201904597A
Application number: TW107118705A
Authority: TW
Inventors: 平山洋佑; 後藤一法; 髙野翔; 髙橋諾都咖
Original assignee: 日商日本阿明諾化學有限公司
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2019-02-01
Also published as: JPWO2018221627A1; EP3632455A4; CN110740741A; EP3632455A1; WO2018221627A1; US20200155633A1

Abstract

本發明之馬齒莧加工品係藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。

Description

馬齒莧加工品、馬齒莧加工品的製造方法、補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑

本發明係關於一種馬齒莧加工品、馬齒莧加工品的製造方法、補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑。

腸管的表面由保護黏膜覆蓋，藉此防禦腸管免受來自外界之刺激或細菌感染。有助於該腸管之物理障壁之保護黏膜的主成分係黏蛋白。黏蛋白基因存在20種，分類為分泌型及膜型之2種。於腸管中表現之黏蛋白主要係分泌型之MUC2。

另外，作為腸管之障壁功能，保護黏液中之IgA之存在亦受到關注。IgA於免疫學上阻止腸內細菌或腸內細菌所產生之毒素侵入活體內。

馬齒莧(Portulaca oleracea.L)係馬齒莧科馬齒莧屬之多年生植物。馬齒莧自古以來一直被用作對傷病、腳氣、便秘、牙疼等各種疾患發揮效果之藥草。

非專利文獻1中，記載有藉由源自馬齒莧之多糖類而使腸炎模型大鼠之黏蛋白分泌增強。

非專利文獻2中，記載有以防止由運動引起之肌肉痛為目的而使人攝取馬齒莧(Purslane)萃取物，且記載有藉由投予馬齒莧(Purslane)萃取物而血清中IgA減少。

[先前技術文獻] [非專利文獻]

非專利文獻1：Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine on Digestion，2009年，第2卷，第96-99頁，Effect of portulaca oleracea polysaccharide on treating ulcerative colitis induced by TNBs in rats, ZHANG Tao、WANG Xiao-ping、CHCN Jian-yong、PAN Feng。

非專利文獻2：Isokinetics and Exercise Science 2011 3 199-206, Preventive effects of purslane extract on delayed onset muscle soreness induced by one session bench-stepping exercise。

然而，關於具有優異的腸管黏膜保護效果之馬齒莧萃取物或馬齒莧加工品，至今並無報告。

本發明者等人發現利用使用酵母之預定之製造方法獲得之馬齒莧加工品具有優異的腸管黏膜效果，從而完成本發明。本發明之目的在於提供一種具有優異的腸管黏膜效果之馬齒莧加工品、補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑及整腸劑、以及馬齒莧加工品的製造方法。

為了達成上述目的，本發明之第1觀點之馬齒莧加工品係藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。

例如，進而於前述熱水萃取物中添加果膠酶及纖維素酶中的至少一者。

本發明之第2觀點之馬齒莧加工品的製造方法包括：熱水加工步驟，將馬齒莧藉由熱水進行加工；以及培養步驟，添加酵母進行培養。

例如，進而於前述培養步驟中，添加果膠酶及纖維素酶中的至少一者。

本發明之第3觀點之補充劑係以馬齒莧加工品作為有效成分，前述馬齒莧加工品係藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。

本發明之第4觀點之醫藥品係以馬齒莧加工品作為有效成分，前述馬齒莧加工品係藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。

本發明之第5觀點之腸管黏膜保護劑係以馬齒莧加工品作為有效成分，前述馬齒莧加工品係藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。

本發明之第6觀點之整腸劑係以馬齒莧加工品作為有效成分，前述馬齒莧加工品係藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。

根據本發明，可提供一種具有優異的腸管黏膜效果之馬齒莧加工品、補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑及整腸劑、以及馬齒莧加工品的製造方法。

圖1中的(a)係馬齒莧+酵母加工品之濃度依存MUC2基因表現解析之圖，圖1中的(b)係測定單獨之馬齒莧熱水萃取物、馬齒莧+酵母加工品及單獨之酵母熱水萃取物中的MUC2基因表現量所得之圖表。

圖2係測定未經果膠酶加工之樣品、及經果膠酶及纖維素酶之至少一者加工之馬齒莧+酵母加工品中的MUC2基因表現量所得之圖表。

圖3係研究馬齒莧+酵母加工品中的酵母添加量與MUC2基因表現量之關係性之圖表。

圖4係研究馬齒莧+酵母加工品中的培養時間與MUC2基因表現量之關係性之圖表。

圖5中的(a)係表示動物實驗中之試驗開始14天後之糞便中黏蛋白量之測定結果之圖，圖5中的(b)係表示試驗開始14天後之糞便中sIgA量之測定結果之圖。

圖6係表示動物實驗中之使用定量PCR(Polymerase chain reaction；聚合酶連鎖反應)之簡易菌叢解析之結果之圖，圖6中的(a)係表示擬桿菌門之解析結果之圖，圖6中的(b)係表示厚壁菌門之解析結果之圖。

圖7中的(a)係表示社內監測試驗(3名)中之試驗開始3週後之糞便中黏蛋白量之測定結果之圖，圖7中的(b)係表示試驗開始3週後之糞便中sIgA量之測定結果之圖。

圖8中的(a)係說明VAS評分法之圖，圖8中的(b)係表示VAS問卷調查之結果之圖表。

圖9中的(a)係表示社內監測試驗(3名)中之全面菌叢解析(屬級別)之結果之圖，圖9中的(b)係菌叢主成分分析之結果之圖。

圖10係表示糞便中黏蛋白量之測定結果之圖表。

圖11係表示PAC-QOL分數之結果之圖表。

圖12中的(a)係表示PAC-QOL中之心理痛苦分數之結果之圖表，圖12中的(b)係表示PAC-QOL中之不安分數之結果之圖表。

首先，對本實施形態之馬齒莧加工品的製造方法進行詳細說明。

本實施形態之馬齒莧加工品的製造方法包括：熱水加工步驟，將馬齒莧藉由熱水進行加工；以及培養步驟，添加酵母進行培養。再者，於本說明書中，有時將經過熱水加工步驟獲得之源自馬齒莧之萃取物稱為「熱水萃取物」、「馬齒莧熱水萃取物」。另外，於本說明書中，有時將經過培養步驟獲得之源自馬齒莧之加工品稱為「馬齒莧加工品」、「馬齒莧+酵母加工品」。

馬齒莧(Portulaca oleracea.L)係與仙人掌科近緣之馬齒莧科馬齒莧屬之多年生植物。由葉、莖及種籽構成，葉及莖以稍厚之壁厚含有黏性物質，有時用作食用及生藥。於世界上之熱帶至溫帶中範圍廣泛地生長，對高溫、乾燥具有較強之耐性。再者，馬齒莧的任一部位均可利用，但較佳為地上部，尤佳為莖及葉。將這些直接使用或進行乾燥而使用。本實施形態中，可較佳地使用經乾燥之馬齒莧(乾燥馬齒莧：例如水分含量為0重量%至10重量%之狀態)，亦可將乾燥馬齒莧進而進行粉碎而使用。

馬齒莧之熱水加工中所使用之水之量為馬齒莧(例如乾燥馬齒莧)之1倍量至30倍量，較佳為10倍量至30倍量。再者，於熱水加工時，以提高酵母之反應速度為目的，亦可添加糖類，糖類較佳為蔗糖等二糖(例如，相對於水將蔗糖設為15重量%以下)。另外，添加馬齒莧、水及糖類之順序並無限定。

熱水加工步驟係藉由下述方式而進行，亦即，於馬齒莧中添加上述量之水，例如於100℃至130℃之熱水中加熱15分鐘至30分鐘(例如，121℃、20分鐘)。於熱水加工步驟中，較佳為進行滅菌或殺菌。熱水加工步驟後，於60℃以下、較佳為25℃至40℃，將熱水萃取物冷卻後，添加酵母。再者，冷卻方法除放置冷卻以外，水浴冷卻等積極冷卻等方法並無限定。

於經過熱水加工步驟獲得之熱水萃取物中，添加酵母後，進行培養。培養係於25℃至40℃下進行16小時以上。較佳為振盪培養或者一面攪拌一面進行培養。培養溫度為25℃至40℃，較佳為30℃至37℃。培養時間為16小時以上，就製造成本之方面而言，較佳為16小時至72小時，更佳為16小時至24小時。

所使用之酵母只要為發揮本發明之效果之酵母，則可無特別限制地使用，亦可使用可簡便地使用之乾酵母。作為乾酵母，例如可使用日清超級山茶乾酵母(Nisshin Super Camellia dry yeast)(東方酵母工業股份有限公司)或Saf即發乾酵母(Saf Instant dry yeast)(LESAFFRE公司)。所添加之酵母之量為馬齒莧(例如，乾燥馬齒莧)之7.5重量%以上，就製造效率之觀點而言，較佳為65重量%至260重量%，更佳為70重量%至90重量%。

再者，於培養步驟中，亦可添加果膠酶及纖維素酶中的至少一者。果膠酶及/或纖維素酶係分解高等植物之細胞壁之酵素，藉由添加果膠酶及/或纖維素酶，可將馬齒莧有效率地進行加工。只要為發揮本發明之效果之果膠酶及/或纖維素酶，則可無特別限制地使用，例如可使用果膠酶PL Amano(Amano Enzyme股份有限公司)、纖維素酶A Amano 3(Amano Enzyme股份有限公司)。所添加之果膠酶及/或纖維素酶之量例如為馬齒莧(例如，乾燥馬齒莧)之5重量%至20重量%，就製造成本之方面而言，較佳為5重量%至15重量%。可於添加酵母之前後或同時添加果膠酶及/或纖維素酶，尤其是添加果膠酶時之馬齒莧熱水萃取物或馬齒莧加工品之溫度較佳為60℃以下，添加纖維素酶時之馬齒莧熱水萃取物或馬齒莧加工品之溫度較佳為70℃以下，添加酵母時之馬齒莧熱水萃取物之溫度較佳為60℃以下。例如，將馬齒莧熱水萃取物或馬齒莧加工品之溫度冷卻為45℃至50℃後，添加果膠酶，進而冷卻為25℃至40℃後，添加酵母。

培養步驟後之培養液亦可再次進行加熱加工(例如，100℃至130℃、15分鐘至30分鐘)。藉由於培養後進行加熱加工，可將酵母進行殺菌，並且於添加果膠酶及/或纖維素酶之情形時，可進行果膠酶及/或纖維素酶之失活。

培養步驟後，可將固形物成分去除，例如可藉由離心分離機或傾析器等去除殘渣後，利用抽吸過濾或澄清器等進行固液分離而澄清化。另外，然後，例如濃縮2倍至15倍，添加賦形劑，進行滅菌(例如，121℃、15分鐘至30分鐘)。作為賦形劑，可列舉：糊精、澱粉、麥芽糖、山梨糖醇等。進而，然後，例如於噴霧乾燥或冷凍乾燥等乾燥加工後，亦可進行篩分加工。

以下表示馬齒莧加工品的製造方法的一實施態樣。

1.於乾燥馬齒莧及蔗糖(水之15重量%量以下)中，添加乾燥馬齒莧之10倍量至30倍量之水。

2.加熱加工(100℃至130℃、15分鐘至30分鐘)。

3.放置冷卻為45℃至50℃，添加乾燥馬齒莧之5重量%至20重量%量之果膠酶(製品名：果膠酶PL Amano，Amano Enzyme股份有限公司)。

4.放置冷卻為25℃至40℃，添加乾燥馬齒莧之7.5重量%至260重量%量之乾酵母(製品名：Saf即發乾酵母(金)，LESAFFRE公司)。

5.培養及反應(25℃至40℃、16小時至72小時、振盪培養)。

6.加熱加工(100℃至130℃、15分鐘至30分鐘)。

7.利用傾析器分離後，利用澄清器澄清化。

8.濃縮2倍至15倍後，添加糊精(製品名：Pinedex，松穀化學工業股份有限公司)。

9.滅菌(121℃、15分鐘至30分鐘)。

10.噴霧乾燥後，進行篩分。

以下表示馬齒莧加工品的製造方法的一例。

1.於乾燥馬齒莧及蔗糖(水之2重量%量)中，添加乾燥馬齒莧之15倍量之水。

2.加熱加工(121℃、20分鐘)。

3.放置冷卻至50℃，添加乾燥馬齒莧之10重量%量之果膠酶(製品名：果膠酶PL Amano，Amano Enzyme股份有限公司)。

4.放置冷卻至37℃，添加乾燥馬齒莧之80重量%量之乾酵母(製品名：Saf即發乾酵母(金)，LESAFFRE公司)。

5.培養及反應(37℃、20小時、振盪培養)。

6.加熱加工(121℃、20分鐘)。

7.利用傾析器分離後，利用澄清器澄清化。

8.濃縮10倍後，添加糊精(製品名：Pinedex，松穀化學工業股份有限公司)。

9.滅菌(121℃、20分鐘)。

10.噴霧乾燥後，進行篩分。

其次，對本實施形態之馬齒莧加工品進行說明。

本實施形態之馬齒莧加工品係藉由上述製造方法以馬齒莧作為原料而製造，藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物(馬齒莧熱水萃取物)中，添加酵母進行培養。再者，於本說明書中，有時將馬齒莧加工品稱為「馬齒莧+酵母加工品」，於培養步驟中添加果膠酶之情形時，有時稱為「果膠酶加工馬齒莧+酵母加工品」。

本實施形態之馬齒莧加工品由於具有黏蛋白基因表現增加效果、IgA上升效果以及腸內菌叢改善效果，故而如下所述，可用作補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑。

其次，對本實施形態之補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑進行說明。

本實施形態之補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑含有本實施形態之馬齒莧加工品作為有效成分。

本實施形態之補充劑及醫藥品可以整腸、排便促進、腸內菌叢改善、糞便量之增加、糞中黏蛋白量之增加、糞中IgA量之增加、腸內有用細菌之增加、腸內環境改善、腸管免疫活化等為目的而使用。另外，可期待下痢、排便障礙等腸功能缺陷之改善；腸管免疫缺陷；腸內之有害微生物代謝產物、有害酵素之產生；生活習慣疾病；過敏等與腸組織異常相關之各種疾病及異常之改善、緩和、治療以及預防。另外，預想對黏蛋白基因表現降低之狀態(例如，克隆氏病)發揮效果。

本實施形態之腸管黏膜保護劑起因於作為有效成分之馬齒莧加工品之優異的黏蛋白基因表現增加效果、IgA上升效果以及腸內菌叢改善效果而具有保護腸管黏膜之作用，進而發揮整腸、排便促進、腸內菌叢改善、糞便量之增加、糞中黏蛋白量之增加、糞中IgA量之增加、腸內有用細菌之增加、腸內環境改善、腸管免疫活化等效果。另外，可期待下痢、排便障礙等腸功能缺陷之改善；腸管免疫缺陷；腸內之有害微生物代謝產物、有害酵素之產生；生活習慣疾病；過敏等與腸組織異常有關之各種疾病及異常之改善、緩和、治療以及預防。另外，預想對黏蛋白基因表現降低之狀態(例如，克隆氏病)發揮效果。

本實施形態之整腸劑起因於作為有效成分之馬齒莧加工品之優異的黏蛋白基因表現增加效果、IgA上升效果以及腸內菌叢改善效果而發揮整腸、排便促進、腸內菌叢改善、糞便量之增加、糞中黏蛋白量之增加、糞中IgA量之增加、腸內有用細菌之增加、腸內環境改善、腸管免疫活化等效果。另外，可期待下痢、排便障礙等腸功能缺陷之改善；腸管免疫缺陷；腸內之有害微生物代謝產物、有害酵素之產生；生活習慣疾病；過敏等與腸組織異常相關之各種疾病及異常之改善、緩和、治療以及預防。另外，對黏蛋白基因表現降低之狀態(例如，克隆氏病)發揮效果。

本實施形態之補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑可藉由常規方法，例如加工成顆粒狀、粒狀、錠劑、膠囊、凝膠狀、乳霜狀、膏狀、懸浮液狀、水溶液狀、乳液狀、粉末狀等適於飲食用之形態。另外，可添加通常所使用之賦形劑、結合劑、潤滑劑、著色劑、崩解劑、增黏劑、保存劑、穩定劑、pH值調整劑等。進而，為了改善味質，於無損本發明之效果之範圍內，可添加糖類、糖醇類、鹽類、油脂類、胺基酸類、有機酸類、甘油等。另外，於醫藥品之情形時，可藉由常規方法，例如製備成錠劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、糖漿劑、注射劑等劑型。另外，可添加醫藥品中通常所使用之賦形劑、結合劑、潤滑劑、著色劑、崩解劑、增黏劑、保存劑、穩定劑、pH值調整劑等。關於投予方法，有經口投予、靜脈內投予、腹腔內投予、皮內投予、舌下投予等，可於發揮本發明之效果之範圍內適宜選擇。

本實施形態之補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑例如可以馬齒莧加工品之固形物成分換算以50mg/天至2000mg/天、較佳為100mg/天至1000mg/天、更佳為300mg/天至500mg/天進行投予。關於投予量，可基於投予之目的、劑型、患者之年齡、體重等而適宜選擇。

如以上所說明，本實施形態之馬齒莧加工品具有優異的黏蛋白基因表現增加效果、IgA上升效果以及腸內菌叢改善效果，提供含有本實施形態之馬齒莧加工品作為有效成分之補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑。另外，本實施形態之馬齒莧加工品的製造方法可簡便且以低成本製造具有優異的黏蛋白基因表現增加效果、IgA上升效果以及腸內菌叢改善效果之馬齒莧加工品。

[實施例]

以下，列舉實施例對本發明進行具體說明。但是，本發明並不限定於這些實施例。

(實施例1)

使用各種樣品，進行體外(in vitro)篩選，進行黏蛋白基因表現量之解析。

作為樣品，對約50種食品樣品進行評價。以下，表示使用人結腸腺癌(DLD-1細胞)之黏蛋白基因(MUC2)mRNA表現水準之評價法。使DLD-1(提供者：東北大學老年醫學研究所)懸浮於添加有10%之胎牛血清(FBS；fetal bovine serum)之RPMI1640培養基(製品名：RPMI1640培養基「NISSUI」2粉末，日水製藥股份有限公司製造)，移至24孔微量盤內(2.5萬個/孔)，於37℃、5%CO₂存在下培養一晚。去除上清液，添加新鮮的RPMI1640培養基，將各樣品以終濃度成為100μg/mL之方式添加至孔中。於未經加工之對照組中，添加RPMI1640培養基。於37℃、5%CO₂存在下培養4小時後，去除孔之上清液，回收細胞而供於mRNA檢測。然後，使用TRIzol reagent(Life Technologies公司製造)提取全部量之RNA，利用Nanodrop(Thermo Scientific公司製造)測定濃度。使用cDNA合成套組(製品名：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover，東洋紡生命科學(TOYOBO Life Science)公司製造)，合成cDNA。將反轉錄後之反應液以成為3ng/μL之方式利用無核酸酶(Nuclease-free)水進行稀釋，製成即時PCR(real-time polymerase chain reaction；即時聚合酶鏈反應)之模板。

於PCR反應中，作為引子，使用MUC2正向引子(forward primer)(序列編號1)、及MUC2反向引子(reverse primer)(序列編號2)。作為修正MUC2基因之表現之內部標準基因，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH；Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase)基因，作為該基因之引子，使用GAPDH正向引子(序列編號3)、及GAPDH反向引子(序列編號4)。即時PCR反應係利用即時反應套組(製品名：SsoAdvanced SYBR Green Supermix，Bio-Rad Laboratories公司製造)藉由即時PCR解析系統(製品名：CFX Connect，Bio-Rad Laboratories公司製造)進行。將總量10μL之PCR反應液於95℃下進行3分鐘之培育(初期改性)，然後於95℃下進行10秒之改性、於60℃下進行30秒之退火，將該操作反復進行40個循環。

序列編號1：5’-CACCTGTGCCCTGGAAGGC-3’

序列編號2：5’-CGGTCACGTGGGGCAGGTTC-3’

序列編號3：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’

序列編號4：5’-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’

使用藉由即時PCR解析系統CFX Connect所獲得之Cq值，基於以下之計算式，算出MUC2基因之表現量比(△△Ct法)。

對照組之MUC2之Cq值：A

對照組之GAPDHCq值：B

樣品之MUC2之Cq值：C

樣品之GAPDH之Cq值：D

△Cq(對照組)=A-B

△Cq(樣品)=C-D

△(△Cq)=△Cq(樣品)-△Cq(對照組)

表現量比=2^-△(△Cq)

表1係表示各樣品之MUC2基因表現之表。

表1、圖1、2中之「馬齒莧+酵母加工品」係以如下方式製備。

2.加熱加工(121℃、20分鐘)。

3.放置冷卻至37℃，添加乾燥馬齒莧之80重量%量之乾酵母(製品名：日清超級山茶乾酵母，東方酵母工業股份有限公司)。

4.培養及反應(37℃、20小時、振盪培養)。

5.加熱加工(121℃、20分鐘)。

6.利用傾析器分離後，利用澄清器澄清化。

7.10倍濃縮後，添加糊精(製品名：Pinedex，松穀化學工業股份有限公司)。

8.滅菌(121℃、20分鐘)。

9.噴霧乾燥後，進行篩分。

表1、圖1中之「馬齒莧熱水萃取物」係藉由上述之「馬齒莧+酵母加工品」的製備方法中的未進行「1.」之蔗糖添加、「3.」、「4.」、「5.」的步驟而製備。

結果示於表1。確認到馬齒莧+酵母加工品中，與馬齒莧熱水萃取物相比，MUC2基因之表現量非常高。確認到即使在甜瓜+酵母加工品中，與甜瓜熱水萃取物相比，MUC2基因之表現量亦較高，從而可知由添加酵母所帶來之MUC2基因之表現量之增加於馬齒莧中非常大。

對MUC2基因表現量之增加顯著之馬齒莧+酵母加工品，進行濃度依存試驗。利用與前述相同之方法測定馬齒莧+酵母加工品濃度0μg/mL、66.6μg/mL、200μg/mL、600μg/mL下之MUC2基因表現量。將馬齒莧+酵母加工品濃度0μg/mL之情形設為對照組(Control)時之結果示於圖1中的(a)。可觀察到馬齒莧+酵母加工品中的MUC2基因表現量濃度依存地增加。

另外，利用與前述相同之方法測定馬齒莧熱水萃取物、馬齒莧+酵母加工品及酵母熱水萃取物中的MUC2基因表現量並加以比較。再者，酵母熱水萃取物係藉由下述方式而製備，亦即，於乾酵母中添加水，121℃、20分鐘之加熱加工後，將固形物成分分離，進行乾燥加工。將未添加任何成分之情形設為對照組時之結果示於圖1中的(b)。顯示出馬齒莧+酵母加工品中MUC2基因表現量最高，且相較於馬齒莧熱水萃取物與酵母熱水萃取物之MUC2基因表現量之合計值而言，馬齒莧+酵母加工品中MUC2基因表現量亦最高，故而藉由與酵母之共培養而活性提升。

另外，利用與前述相同之方法測定馬齒莧+酵母加工品中未經果膠酶加工之樣品(依據上述「馬齒莧+酵母加工品」的製備方法)、及經酵素加工之樣品(於上述「馬齒莧+酵母加工品」之「2.」「3.」之間，不進行放置冷卻至50℃並添加乾燥馬齒莧之10重量%量之果膠酶(製品名：果膠酶PL Amano，Amano Enzyme股份有限公司)及纖維素酶(製品名：纖維素酶A Amano 3，Amano Enzyme股份有限公司)中的至少一者之步驟，且於「3.」之步驟中進行培養及反應)中MUC2基因表現量並加以比較。將未添加任何成分之情形設為對照組時之結果示於圖2。顯示出與酵素非加工品相比，果膠酶加工品中MUC2基因表現量非常高，藉由果膠酶加工而活性大幅提升。另外，顯示出於纖維素酶加工、果膠酶及纖維素酶之共加工中，與酵素非加工相比，活性亦提升。

另外，對馬齒莧+酵母加工品中之酵母之添加量進行研究。利用與前述相同之方法測定添加馬齒莧乾燥物之0%、65%、260%量之乾酵母之情形之MUC2基因表現量並加以比較。將未添加馬齒莧+酵母加工品之情形設為對照組時之結果示於圖3。顯示出依存於酵母之添加量，MUC2基因表現量變高。

另外，對馬齒莧+酵母加工品中之培養時間進行研究。利用與前述相同之方法測定添加乾酵母後之培養時間16小時、64小時、112小時之MUC2基因表現量並加以比較。將未添加馬齒莧+酵母加工品之情形設為對照組時之結果示於圖4。顯示出依存於培養時間變長，MUC2基因表現量變高。

(實施例2)

使用利用與實施例1相同之方法製備之馬齒莧+酵母加工品，以如下方式進行動物試驗。

對BALB/c小鼠(雄，6週齡)投予葡聚糖硫酸鈉(DSS；Dextran Sulfate Sodium)，誘導中等程度之炎症狀態而製作使腸管之障壁功能降低之模型小鼠。

將小鼠以如下方式進行分組。

‧對照組：n=10

‧DSS投予組：n=10

‧DSS+「馬齒莧+酵母加工品」(500mg/kg)投予組：n=10

以下表示試驗排程。各組均於試驗開始第0天、第7天、第14天回收糞便。

‧對照組：於試驗開始14天後進行屠殺並解剖、腸管回收。

‧DSS投予組：自試驗開始7天後開始投予1.5%DSS，於試驗開始14天後進行屠殺並解剖、腸管回收。

‧DSS+「馬齒莧+酵母加工品」投予組：自試驗開始日開始投予「馬齒莧+酵母加工品」，自試驗開始7天後開始投予1.5%DSS，於試驗開始14天後進行屠殺並解剖、回收腸管及糞便。

以下表示評價項目。

‧大腸之長度

將小鼠於異氟烷麻醉下放血屠殺後，摘出十二指腸至直腸之消化管。自摘出之消化管切取大腸，利用量尺測定長度。

‧糞便中黏蛋白量

糞便中之黏蛋白量係使用糞便黏蛋白測定套組(製品名：Fecal Mucin Assay Kit，Cosmo Bio股份有限公司)而測定。

‧糞便中sIgA

為了免疫指標評價而測定糞便中sIgA。於所回收之糞便中添加500μL之生理鹽水並利用刮勺破碎後，進行離心分離(20,100×g、4℃、10分鐘)。將所獲得之上清液供於IgA 測定套組(製品名：Mouse IgA ELISA Ready-SET-Go！，eBioScience)。

‧簡易菌叢解析

進行使用擬桿菌門(Phylum Bacteroidetes)及厚壁菌門(Phylum Firmicutes)之種特異引子之即時PCR而進行解析。使用糞便DNA提取套組(製品名：PowerFecal DNA Isolation Kit，MO BIO Laboratories)自所回收之糞便中提取DNA，利用無核酸酶(Nuclease-free)水稀釋成50pg/μL而製成PCR之模板。PCR反應係使用平等人所報告之引子(Taira 2015 J Clin Biochem Nutr 56：149-54)。作為擬桿菌門特異引子，使用Bact934F(序列編號5)及Bact1060R(序列編號6)。作為厚壁菌門特異引子，使用Firm934F(序列編號7)及Firm1060R(序列編號8)。總菌數測定使用16SrRNA區域之通用引子(總菌正向引子：序列編號9、總菌反向引子：序列編號10)。即時PCR反應係利用即時反應套組(製品名：SsoAdvanced SYBR Green Supermix，Bio-Rad Laboratories公司製造)藉由即時PCR解析系統(製品名：CFX Connect，Bio-Rad Laboratories公司製造)進行。將總量10μL之PCR反應液於95℃下進行3分鐘之培育(初期改性)，然後於95℃下進行5秒之改性，於60℃下進行15秒之退火，將該操作反復進行40個循環。

序列編號5：5’-GGARCATGTGGTTTAATTCGATGAT-3’

序列編號6：5’-AGCTGACGACAACCATGCAG-3’

序列編號7：5’-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-3’

序列編號8：5’-AGCTGACGACAACCATGCAC-3’

序列編號9：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’

序列編號10：5’-AGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’

擬桿菌門或厚壁菌門Cq值：A

總菌數Cq值：B

△Cq(總菌數)=B-B

△Cq(擬桿菌門或厚壁菌門)=A-B

△(△Cq)=△Cq(擬桿菌門或厚壁菌門)-△Cq(總菌數)

表現量比=2^-△(△Cq)

試驗開始14天後之糞便中黏蛋白量之測定結果示於圖5中的(a)。DSS+「馬齒莧+酵母加工品」組中，與對照組相比，黏蛋白量顯著增加。另外，試驗開始14天後之糞便中sIgA量之測定結果示於圖5中的(b)。DSS組中，與對照組相比，可觀察到sIgA量顯著降低，但DSS+「馬齒莧+酵母加工品」組中，與對照組相比，未觀察到顯著降低(顯著性概率1%)，與DSS組相比，sIgA量增加。

簡易菌叢解析之結果示於圖6。圖6中的(a)之擬桿菌門係構成腸內細菌叢之主要構成菌之一，屬於該門之細菌多顯示厭氧性。有於DSS腸炎小鼠中擬桿菌增殖之報告。圖6中的(b)之厚壁菌門係包含乳酸菌、枯草菌、葡萄球菌、梭孢桿菌(clostridium)等之革蘭氏陽性細菌之群，與腸內細菌、皮膚常駐菌、病原菌、發酵食品生存於各種場所。

於試驗開始14天後所回收之糞便中之擬桿菌門相對於總菌數之比率示於圖6中的(a)。於DSS組中，可觀察到與對照組相比，擬桿菌門之比率增加之傾向，但於DSS+「馬齒莧+酵母加工品」組中，可觀察到與DSS組相比，擬桿菌門之比率減少之傾向。

於試驗開始14天後所回收之糞便中之厚壁菌門相對於總菌數之比率示於圖6中的(b)。於DSS組中，相對於對照組，擬桿菌門之比率顯著減少，但於DSS+「馬齒莧+酵母加工品」組中，可觀察到與DSS組相比，擬桿菌門之比率增加之傾向。

根據以上內容，藉由投予馬齒莧+酵母加工品，因DSS投予所致之黏蛋白量減少及sIgA量減少得到改善，另外，腸內菌叢之惡化得到抑制。提示藉由黏蛋白量上升而使腸內細菌叢穩定化。

(實施例3)

按照以下方式進行社內監測試驗。

作為人監測預試驗，對受驗者3名進行社內監測試驗。本試驗之目的在於研究是否藉由攝取馬齒莧+酵母加工品而人之腸內黏蛋白量增加。

試驗方法係開放標籤試驗，對社內之受驗者3名歷時3週投予利用實施例1之方法所製備之含有馬齒莧+酵母加工品之膠囊(以馬齒莧+酵母加工品固形物成分計為400mg/天)，於受驗食攝取前後採集糞便及血液。

評價項目示於以下。

‧全面腸內菌叢解析(下一代定序儀)

將使用採便套組(製品名：採便套組，Techno Suruga Laboratory股份有限公司)所採集之糞便冷凍保存。所保存之糞便供於Cosmo Bio股份有限公司之腸內菌群委託解析(基於下一代序列之宏基因組解析)。主成分分析係使用Illumina股份有限公司之BaseSpace Sequence Hub進行。

‧糞便中黏蛋白量

測定係使用糞便黏蛋白測定套組(製品名：Fecal Mucin Assay Kit，Cosmo Bio股份有限公司)進行。

‧糞便中sIgA量

將使用採便套組(製品名：採便套組，Techno Suruga Laboratory股份有限公司)採集之糞便冷凍保存。所保存之糞便供於Cosmo Bio股份有限公司之糞便中sIgA測定解析。

‧問卷調查(腹部狀態、排便狀況)

糞便中黏蛋白量及sIgA量之測定結果示於圖7。藉由攝取含有馬齒莧+酵母加工品之膠囊，糞便中黏蛋白量於3名中有2名上升(圖7中的(a))，sIgA量亦於3名中有2名上升(圖7中的(b))。

針對腹部狀態，使用作為將問卷調查數值化之方法之視覺模擬評分法(VAS；Visual Analogue Scale)進行評價(圖8中的(a))。如圖8中的(b)所示，關於排便容易性、腹部狀態、食欲及下腹脹痛，確認到與攝取前相比，於攝取後，整體上分數上升之傾向。

關於排便狀況，對以下所示之項目於攝取前及攝取後進行問卷調查。

‧便形之狀態(布裡斯托大便分類法(Bristol Stool Scale))

7：球粒便(較硬而為球粒之兔糞狀之便)。

6：硬便(為香腸狀且較硬之便)。

5：稍硬之便(表面存在裂紋之香腸狀之便)。

4：普通便(表面光滑且柔軟之香腸狀或如蛇盤繞之便)。

3：稍軟之便(存在清晰之褶皺且柔軟之半固形之便)。

2：泥狀便(境界模糊、軟乎乎之不定形之小片便、泥狀之便)。

1：水樣便(為水樣且不含固形物之液體狀之便)。

‧便之顏色

自「差」至「良」，以「1」至「5」之5個等級進行評價。

‧便之尺寸

記錄視作直徑25mm×長度57mm之圓柱根數之數量。

‧便之臭味

1：非常強烈、2：強烈、3：普通、2：較弱、1：非常弱。

‧排便時間

記錄進入廁所後至排便為止之時間。

‧排便之困難度

1：相當費力、2：稍微費力、3：幾乎不費力。

‧排便後之感覺

1：不暢快、2：普通、3：暢快。

表2係表示排便狀況之結果之表。

結果為，如表2所示，尤其是，便之顏色之平均值由 2.4變化為3.0，接近顯示良好狀態之5，排便後之感覺之平均值由2.2變化為2.4，接近顯示暢快之感覺之4。

對腸內細菌叢進行全面解析所得之結果示於圖9中的(a)。圖7中的(a)中，可觀察到黏蛋白增加之受驗者1、2中，與受驗者3相比，顯示同樣之腸內細菌叢，且攝取前後之變化舉動亦類似。另外，於全部受驗者中可觀察到對腸管免疫系統具有有益效果之擬桿菌屬細菌增加。此外，進行腸內細菌叢之主成分分析(PCA(Principal Components Analysis)解析)所得之結果示於圖9中的(b)。受驗者1、2與受驗者3相比位於附近，故而可確認腸內細菌叢類似。另外，受驗者1、2與受驗者3相比攝取前後之變化較大，故而可確認藉由攝取而使腸內細菌叢相較於受驗者3大幅變化。

表3中的(a)係表示社內監測試驗(3名)中之腸內細菌之多樣性指數之表，表3中的(b)係表示FB比之表。

腸內細菌之多樣性、菌叢之擴增容易性指數及菌叢變化之方向之解析結果示於表3。Shannon指數係α多樣性之指標，Shannon指數之值越大，表示腸內細菌越富有多樣性。根據表3中的(a)，顯示出於攝取後，腸內細菌之多樣性得到改善。FB(Firmicutes/Bacteroidetes，厚壁菌門/擬桿菌門)比係相對於擬桿菌門之細菌數之厚壁菌門之細菌數，FB比越小，越不易擴增。根據表3中的(b)，顯示出菌叢傾向於不易擴增之方向。

根據以上內容，社內監測試驗之結果為，糞便中黏蛋白量及sIgA量於受驗者3名中有2名上升。另外，作為體感性，可觀察到腹部狀態之改善，另外，可觀察到便性之改善。進而，與腸管免疫關係深遠之擬桿菌細菌之數量上升，腸內細菌之多樣性得到改善。

(實施例4)

進而，以如下方式進行大規模之社內監測試驗。

對自主地希望攝取之受驗者37名，進行社內監測試驗。本試驗之目的在於探索馬齒莧+酵母加工品之體感性。

受驗食係與實施例3相同之含有馬齒莧+酵母加工品之膠囊(以馬齒莧+酵母加工品固形物成分計為400mg/天)。攝取該膠囊14天。再者，攝取之時間段自由，但每天於同一時間攝取。

評價項目如下所述。受驗者記錄於2種詢問票(僅攝取後)。

‧詢問票1→關於體感性之有無、攝取時間、飲食生活等

‧詢問票2→關於攝取後之身體狀態之改善(胃腸、眼、鼻、耳、口、皮膚、腰腿、關節、腦、免疫等)

對投予排程進行說明。於2016年12月12日開始攝取，於同年12月26日結束攝取，於同日記錄於詢問票。再者，未設置飲食、飲酒等之限制，受驗者過著日常生活，服藥者亦可參加試驗。

表4中的(a)係表示社內監測試驗(37名)中之體感性之回答結果之表，表4中的(b)係表示飲食生活之回答結果之表，表4中的(c)係表示有關攝取時間與體感性之關係性之表。

詢問表1之結果示於表4。根據表4中的(a)，回答有體感性之受驗者為67.6%。根據表4中的(b)，顯示出於以肉及蔬菜為中心之受驗者中反應性良好。根據表4(c)，顯示出於午飯後至晚飯後之時間段攝取時反應性良好。

表5係表示有關社內監測試驗(37名)中改善之項目之表。

詢問表2之結果示於表5。於「排便容易性」方面「稍微改善以上」為45.9%，於「便之硬度」方面「稍微改善以上」為37.8%，於「腸之蠕動」方面「稍微改善以上」為37.8%。再者，作為自由意見中所獲得之改善項目，有集中力提升、白天之想睡改善、食欲增進、手腳之寒冷改善、體重減少。根據以上內容，感受到腸內環境關係之體感性之受驗者較多，於腸以外之項目中於「皮膚之乾裂」方面感受到改善效果之受驗者較多。

根據以上內容，藉由攝取馬齒莧+酵母加工品14天，約68%之受驗者確認到體感性，獲得了排便改善等針對腸內環境之較多之體感性。另外，亦提示有對皮膚之乾裂等之改善效果。

(實施例5)

在受驗者80名中，選出糞便中黏蛋白量較低之60名，以如下方式進行試驗。

於攝取開始日之14天前，實施受驗者80名之糞便中黏蛋白量測定，選出糞便中黏蛋白量較低之60名(男性38名、女性22名、平均年齡21.6±2.4歲)。然後，分配為安慰劑組20名、服用實施例1中所製備之含有馬齒莧+酵母加工品固形物成分200mg之膠囊之低用量組(以馬齒莧+酵母加工品固形物成分計為200mg/天)20名以及服用含有相同之馬齒莧+酵母加工品固形物成分400mg之膠囊之高用量組(以馬齒莧+酵母加工品固形物成分計為400mg/天)20名而進行試驗。受驗食之攝取期間為28天，於攝取開始第0天、第14天及第28天進行採便及詢問票之記錄、回收。糞便中黏蛋白量之測定係利用與實施例3相同之方法進行。

於詢問票中，藉由便秘患者生活質量評估(PAC-QOL；Patient Assessment of Constipation Quality of Life)，評價身體痛苦、心理痛苦、不安感以及滿足感。

詢問項目如下所述，將各項目以「完全沒有」至「極度」之「0」至「4」之5個等級進行評價。

Physical discomfort(身體痛苦)

1.感覺到腹部像要撐破那樣的脹痛嗎？

2.感覺到因便秘而導致體重增加嗎？

3.身體感覺到不舒服嗎？

4.想要排便但排不出嗎？

Psychosocial discomfort(心理痛苦)

5.與他人一起，感覺到不好意思嗎？

6.因無法排便而導致食量逐漸減少嗎？

7.必須要注意食物嗎？

8.食欲下降嗎？

9.(例如在朋友家等)無法自己選擇食物而感覺到擔心嗎？

10.外出中，會因長時間在廁所而感覺到不好意思嗎？

11.外出中，會因多次去廁所而感覺到不好意思嗎？

12.旅行中或外出中，會因生活節奏變化而感覺到擔心嗎？

Worries/concerns(不安)

13.因便秘而坐立不安嗎？

14.因便秘而情緒不穩定嗎？

15.滿腦子都在想便秘這件事嗎？

16.因便秘而感覺到緊張嗎？

17.因便秘而自己失去自信嗎？

18.感覺到可控制自己所處之狀況嗎？

19.因不知道何時有便意而擔心嗎？

20.有必要排便時擔心可能會排不出嗎？

21.因無法排便而越發擔心嗎？

22.認為或許症狀惡化而變得不安嗎？

23.感覺到身體不正常發揮功能嗎？

Satisfaction(滿足感)

24.感覺到排便次數比自己所期待的少嗎？

25.對排便次數滿意嗎？

26.對自己之排便週期滿意嗎？

27.對腸之蠕動滿意嗎？

28.對所接受之治療滿意嗎？

糞便中黏蛋白量之測定結果示於圖10。與安慰劑組相比，於低用量組及高用量組中，確認到糞便中黏蛋白量增加。

PAC-QOL(心理痛苦、身體痛苦、不安感及滿足感之綜合分數)之結果示於圖11。PAC-QOL分數之值越低，表示受便秘影響之QOL越得到改善。於高用量組中，顯示出與安慰劑組相比，QOL顯著改善。

PAC-QOL中，心理痛苦分數之結果示於圖12中的(a)，不安分數之結果示於圖12中的(b)。關於心理痛苦分數及不安分數之兩者，於高用量組中，顯示出與安慰劑組相比，顯著改善。如此證明了藉由本實施例之馬齒莧加工品可改善受便秘影響之QOL。

如以上所說明，顯示出本實施例之馬齒莧加工品(馬齒莧+酵母加工品、果膠酶加工馬齒莧+酵母加工品)具有優異的黏蛋白基因表現增加效果、IgA上升效果及腸內菌叢改善效果，作為補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑有用。

本發明在不脫離本發明之廣義之精神與範圍之情況下，可實施各種實施形態及變形。另外，上述之實施形態係用以說明本發明，並不限定本發明之範圍。亦即，本發明之範圍由申請專利範圍所示，而並非由實施形態所示。而且，申請專利範圍內及與申請專利範圍同等之發明之意義之範圍內所實施之各種變形均視為本發明之範圍內。

本申請案係基於2017年5月31日提出申請之日本特許申請案2017-108131號。將日本特許申請案2017-108131號之說明書、申請專利範圍、圖式整體作為參照而併入至本說明書中。

<110> 日本阿明諾化學有限公司

<120> 馬齒莧加工品、馬齒莧加工品的製造方法、補充劑、醫藥品、腸管黏膜保護劑以及整腸劑

<130> 107P000816TW

<150> JP2017-108131

<151> 2017-05-31

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MUC2 forward primer

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MUC2 reverse primer

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH forward primer

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH reverse primer

<400> 4

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bact934F

<400> 5

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Bact1060R

<400> 6

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Firm934F

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Firm1060R

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> All bacteria foward

<400> 9

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> All bacteria reverse

<400> 10

Claims

一種馬齒莧加工品，藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。
如請求項1所記載之馬齒莧加工品，其中進而於前述熱水萃取物中添加果膠酶及纖維素酶中的至少一者。
一種馬齒莧加工品的製造方法，包括：熱水加工步驟，將馬齒莧藉由熱水進行加工；以及培養步驟，添加酵母進行培養。
如請求項3所記載之馬齒莧加工品的製造方法，其中進而於前述培養步驟中，添加果膠酶及纖維素酶中的至少一者。
一種補充劑，以馬齒莧加工品作為有效成分，前述馬齒莧加工品係藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。
如請求項5所記載之補充劑，其中進而於前述熱水萃取物中添加果膠酶及纖維素酶中的至少一者。
一種醫藥品，以馬齒莧加工品作為有效成分，前述馬齒莧加工品係藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。
如請求項7所記載之醫藥品，其中進而於前述熱水萃取物中添加果膠酶及纖維素酶中的至少一者。
一種腸管黏膜保護劑，以馬齒莧加工品作為有效成分，前述馬齒莧加工品係藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。
如請求項9所記載之腸管黏膜保護劑，其中進而於前述熱水萃取物中添加果膠酶及纖維素酶中的至少一者。
一種整腸劑，以馬齒莧加工品作為有效成分，前述馬齒莧加工品係藉由下述方式而獲得：於將馬齒莧藉由熱水進行加工所得之熱水萃取物中，添加酵母進行培養。
如請求項11所記載之整腸劑，其中進而於前述熱水萃取物中添加果膠酶及纖維素酶中的至少一者。