FI71948B - Foerfarande foer odling av kaernhaltiga celler med ytodlingsteknik och foer tillvaratagande av av cellodlingen beroende aenen ur de sao haer erhaollna cellerna - Google Patents

Description

£35^1 ΓΒ1 m,KUULUTUSJULKAISU 71948 Β 11 UTLÄGGNINGSSKRIFT f \ Ο • C (45) Patentti :.:/Sr r. city _ ^ (51) Kv.lk.*/lnt.CI.* C 12 N 5/00, C 12 M 3/00, C 12 P 21/00 SUOMI FINLAND (21) Patenttihakemus — Patcntansökning 8 02 04 0 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag 26.06.80 (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 26.06.80 (41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig 29.12.80

Patentti· ja rekisterihallitus Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm.— 28 11.86

Patent· och registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 28.06.79 17.04.80 Saksan 1iittotasavalta-Förbunds-republiken Tyskland(DE) P 2926091-1, P 3014814.2 (71) Dr. Karl Thomae Gesellschaft mit beschränkter Haftung,

Biberach an der Riss, Saksan 1iittotasava1ta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Walter Merk, Biberaeh, Saksan 1iittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (74) Lei tz inger Oy (54) Menetelmä tumallisten solujen viljelemiseksi pintavi1jelytekniikalla ja soluviljelmästä riippuvien aineiden taiteennottamiseksi näin saaduista soluista - Förfarande för odling av kärnhaltiga celler med ytodlingsteknik och för ti11varatagande av av cellodlingen beroende ämnen ur de sä här erhal1na cel 1erna

Tiedetään, että muuttumattomien tumallisten solujen (eukoryoottien) viljely onnistuu vain pintaviljelymenetelmällä. Tämä merkitsee sitä, että suspensiossa olevat solut eivät kasva. Niillä on pikemminkin oltava tilaisuus laskeutua sopivalle pinnalle, jotta ne voisivat lisääntyä siinä kosketusinhibiitiöön asti.

Pintaviljelmämenetelmä suoritetaan yksinkertaisimmalla tavalla tasaisella pohjalla varustetussa astiassa, jolloin on tarkattava, että astian pohja on mahdollisimman tarkkaan vaakasuorassa. Tällainen astia muodostuu parhaiten lasista tai sopivasta muovista, jolloin säiliön suuruutta rajoittaa lopulta vain sen käsittelytarve. Jotta tällöin päästäisiin mahdollisimman suuriin pintoihin, on olemassa myös säiliöitä, joissa on useampia vaakasuoria päällekkäisiä tasaisia pintoja, jotka on yhdistetty toisiinsa vastaavilla aukoilla. Saman periaatteen mukaisesti on esitetty myös pinoamme, jossa on kymmenen päällekkäistä tasaista kasvatuspintaa, joiden kunkin pinta-ala on 600 cm2. säiliöt voidaan tällöin myös kytkeä neljän kappaleen ryhmiks i.

2 71948

Solujen kasvattamiseen käytetään lisäksi toisissa soluviljelymenetel-missär esimerkiksi nk. pyörivissä pulloissa, koko sisäpintaa pyörittämällä säiliötä. Tällainen pyörivä pullo voi olla varustettu levyillä tai muilla kappaleilla niin, että pinta tulee suuremmaksi ja että lisäksi voidaan varmistaa ravintoaineiden saanti alustan avulla sekä tarvittava hapensyöttö.

Näille menetelmille asettaa kuitenkin rajansa se, että säiliön ympärysmitan vuoksi niitä ei voida enää käsitellä tai käsittely on vaikeaa. Lisäksi käytön aikana on vaikea toteuttaa liikkeen vuoksi letkuyhteydet, jotka ovat välttämättömiä kasvatusmuutosten vuoksi.

Kuitenkin on olemassa myös laitteita, jotka muodostuvat useammalla solukasvatuspinnalla varustetusta säiliöstä ja pumpusta. Kierrättämällä elatusainetta pumpun avulla mahdollistetaan tarpeellinen ravinnon ja hapen syöttö. Siten on esimerkiksi esitetty tilavuudeltaan 2 litran laite, jossa tasaiset kasvatuspinnat on korvattu pienillä lasisylintereillä ja pumppaamalla kierrätetyn alustan pH:ta säädetään kaasulla. Samalla tavalla tehdään tunnetussa elinperfuusiotekniikassa.

Kuvatussa pintaviljelymenetelmässä, jossa säiliössä käytetään pieniä lasisylintereitä, joiden pituus on noin 6 mm, ulkohalkaisija noin 4 mm ja sisähalkaisija noin 2 mm, ei ole kuitenkaan mahdollista peittää kaikkia kasvatuspinoja kierrättämällä pumpun avulla samanaikaisesti alustaa. Tämä johtuu fysikaalisista syistä, kuten kostu-misesta, kapillaarivaikutuksesta ja muista rajapinta-ilmiöistä, erityisesti ilmakuplien muodostumisesta.

Samoista syistä ei voida riittävästi huuhdella solujen peittämiä kasvatuspintoja. Täydellistä takaisinvirtausta ei tapahdu, koska osa alkuperäisestä alustasta tarttuu kiinni itsepintaisesti. Tähän mennessä pintakasvatuksessa käytettyjen lasisylintereiden tai kuulien fysikaaliset voimat estävät kuitenkin esimerkiksi fibro-plasti-interferonin valmistuksessa tarvitun, induktioaineen tai vierasproteiinin täydellisen poistamisen huuhtelemalla. Sitä paitsi interferonin valmistuksessa tavallisesti käytetyt pumput, joissa 3 71948 esiintyy leikkausvoimia, tuhoavat suurimman osan jo valmistetusta interferonista.

Nk. Microcarrier-tekniikassa suspendoidaan sopivia kuulia, jotka esimerkiksi on tehty dekstraanista ja joiden halkaisija on noin 0,15 - 0,25 mm, alustaan ja pidetään suspensiossa liikuttamalla. Näiden kuulien pinnoilla voidaan sopivalla tekniikalla, (kts. Biotechnology and Bioengineering, Voi. XXI, 433-442 (1979)), viljellä soluja. Käytettävissä oleva pinta, annettuna alusta/tilavuus-suhteena on tällöin erityisen suuri. Se on 3000 cm2, kun 100 ml:ssa alustaa on 0,5 g dekstraani-kantajaa. Solulliset kuulat ovat kuitenkin erittäin herkkiä mekaanisille vaikutuksille. Alusta poistetaan antamalla kantajan laskeutua ja suodattamalla päälle jäänyt neste imun avulla. Myöskään tällöin ei täydellinen huuhtelu ole mahdollista.

Nyttemmin on yllättäen havaittu, että pintakasvatuksen ja siten soluviljelmästä riippuvien aineiden, kuten interferonin, virusten, fermenttien, immuuni-suoja-aineiden, kuten immunoglobuliinien, edellä kuvatuista haitoista voidaan päästä, kun käytetään kasvatus-pintoina kappaleita, jotka muotonsa vuoksi eivät tuota häiritseviä rajapintavaikutuksia ja jotka siten mahdollistavat kasvatuspintojen täydellisen peittymisen ja riittävän huuhtelun. Tällöin käytetään tarkoituksenmukaisesti täytekappaleita, joilla on soluviljelmälle sopiva pinta ja jotka tarjoavat sille riittävän kiinnittymismah-dollisuuden, ja jotka pidättävät alustan valuttamisen jälkeen alle 8 % alustasta laskettuna vapaasta tilavuudesta ja joiden pinta-alan suhde vapaaseen tilavuuteen samalla on 20:1 - 5:1 cm~l.

Tämän laatuisina täytekappaleina tulevat kysymykseen kierukat, satulakappaleet, spiraalit, lankaspiraalit tai lankakudosspiraalit.

Erityisen suositeltuja täytekappaleita ovat kuitenkin spiraalit, kierukat ja satulakappaleet, erityisesti V2A- tai V4Ä-teräksestä tehdyt, venytetyssä muodossa olevat kierukat ja lankaspiraalit, joissa yksittäiset kierteet eivät kosketa molemminpuolisesti, tai satulat, koska samanaikaisesti kun niillä on suuri pinta, niillä on vain vähäinen, kiertävään alustaan kohdistuva virtausvastus 4 71948 ja huuhdottaessa vain vähäinen alustan pidätyskyky. Lankaspiraalina ovat tällöin erityisen sopivia ne, joiden kokonaispituus on 4 - 8 mm, parhaiten kuitenkin 5-7 mm, kokonaisleveys 4-8 mm, parhaiten kuitenkin 5-7 mm, ja langanhalkaisija 0,4 - 0,8 mm, parhaiten kuitenkin 0,5 - 0,7 mm, jolloin yksittäisten kierteiden väli on 0. 1 - 0,5 mm, parhaiten kuitenkin 0,2 - 0,4 mm.

Esimerkiksi seuraavien täytekappaleiden: A = V4Ä-spiraalit (ulkohalkaisija: 6 mm, langan ulkohalkaisija: 0,6 mm, pituus: 6 mm), B = Satula (halkaisija: 6 mm, pituus: 6 mm), C = V4Ä-lankakudos-sylinterit (halkaisija: 3 mm, pituus: 5 mm) ja D = Lasisylinterit (ulkohalkaisija: 4 mm, sisähalkaisija 2 mm, pituus: 6 mm) sopivuus keksinnön mukaiseen menetelmään tutkittiin verrattuna lasisylintereihin D:

Metodiikka: 1. Lasiputken (sisähalkaisija: 3-5 cm) alaosaa kavennetaan suppiloksi, sen päähän liitetään putki, jonka sisähalkaisija on noin 0,5 cm, ja varustetaan hanalla. Kohtaan, jossa suppilo muuttuu 0,5 cm putkeksi, tehdään merkki. Hanan ollessa suljettu täytetään sen jälkeen lasiputki vedellä tähän merkkiin asti ja tilavuus määritetään punnitsemalla ulosvalutettu määrä. Sen jälkeen täytetään uudelleen vedellä tähän merkkiin asti ja lisätään punnittu määrä vettä (esimerkiksi 200 ml). Yläpinta varustetaan merkillä. Sen jälkeen vesi lasketaan alamerkkiin asti. Samanaikaisesti lasketaan jäljelle jäänyt vesimäärä, joka jää lasiseinään, punnitsemalla ulosvalutettu määrä ja vähentämällä asetetusta nimellistilavuudesta. Koko toimenpide toistetaan useita kertoja ja keskiarvo sovitaan tyhjöarvoksi.

5 71948

Koeputken on oltava ennen jokaista koetta täysin kuiva (esimerkiksi pestään asetonilla ja sen jälkeen puhalletaan ilmaa). Samoin tutkittavat täytekappaleet on kuivattava kuivauskaapissa. Tutkimusta varten lasiputki täytetään täytekappaleilla ylämerkkiin asti. Tällöin ilmoitetaan sisäänlaitettujen täytekappaleiden paino ja määrä. Hanan ollessa suljettu lisätään sen jälkeen punnittu määrä vettä ylämerkkiin asti, lasketaan täyttömäärä punnitsemalla ylijäänyt määrä ja sovitaan tämä "vapaaksi tilavuudeksi". Sen jälkeen hana avataan, valutetaan vettä alamerkkiin asti vaa'an päälle asetettuun taarattuun astiaan. Täytekappaleisiin jäänyt veden "jäännösmäärä" lasketaan vähentämällä valutettu määrä "vapaasta tilavuudesta". Täytekappaleiden pinta joko lasketaan tai otetaan siitä selvää valmistajalta. Tuloksena lasketaan seuraavat; kokeellisesti saadut arvot: Vapaa tilavuus litraa kohti cm^jnä; täytekappaleiden tilavuuden suhde vapaaseen tilavuuteen ja jäännösmäärä valuttamisen jälkeen prosentteina vapaasta tilavuudesta.

2. Samaan lasiputkeen (kuiva) täytetään sama määrä täytekappaleita, minkä jälkeen täytetään värjätyllä vedellä (esimerkiksi 1 % neut-raalipunaa = 100 %). Sen jälkeen ylempi reikä suljetaan ilmatiiviisti putkella, joka on täytetty vedellä ja irrotettu puristuksesta letkupumpun avulla. Hanan avaamisen jälkeen lisätään letkupumpun kautta vettä mitattu määrä 100 ml minuutissa ja määritetään huuhte-luvaikutus minuuttia kohti mittaamalla fotometrillä värin intensiteetti. Mitattua arvoa pidetään lähtöarvona ja huuhteluvaikutus lasketaan jäännösvärinä prosenteissa sen jälkeen, kun on huuhdeltu x-kertaa vapaalla tilavuudella. 5 minuutin kuluttua huuhtelun aloittamisesta veden syöttö keskeytetään, pylvästä ravistellaan hetken ja arvo mitataan 30 sekunnin pumppauksen jälkeen. Arvo annetaan jäännösvärinä prosenteissa, kun on huuhdeltu x-kertaa vapaalla tilavuudella ja sen jälkeen ravisteltu.

Saadut arvot on esitetty seuraavassa taulukossa.

6 3 * 71948

(0 P

Ό a> JC (0 (0 Ό •H 3 (0 Ρ 3 Ρ 3 Ρ Ρ 3 VO m Ρ 30 -C Ρ (0 > ^ > <0 (0 (0 ro ro CN O'

(/1 C Λ Οι H

:0 3 I (0 -h

C .X X > P

c__ 30 “~ :t0 m

>3 (N

v

O O O M

(f (0 00

P P

P

* <0 O O O O

C (0 .X

3 iH

•X Ρ (0__

- m 0 ST

tn (0 3 ns 3 P 3 P CN r-~ p p > ρ cnj m 3 <0 (0 φ - - •X -x p x o o o o

•H | -H

<0 X p m > 3 3 (0 (S' rH iH rH (0

φ Φ rH 4J

P P (0 P VO P CN CT

C -C (0 (0 m σν o σν 3 3a jk!*·*·*·.

3 3 (0 O O O O

I £ > # (N

«0 C (0

P <0 (0 P

30 (0 PO) :<0 ·η en <0 ε ε (0 ό C0<0C(03u"toooom :0 p 0) Q. 3 O VO VO (Tl

CP(0(0> V ^ ^ V

e 3 .x > (0 ro vo oo

:(0 rH rH rH

:(0 (0 ;(0 r* Ή (3 > -ro <#> p e I <0 •H (1) (0 en

I-H (0 C

(0 C (0 <0

Or (0 a d) iP rH ip ip a e (0 p (0 e > 3 ........

-X -H 3 (0 a 0) > ct tt P Ό (0 w *. * w C JC I—I O UI rH Ip

30 <0 3 -H P P (N (N

H Ό en p I Ό (0 (0 ro p p ε

•H P O

P -H

i—I *

(0 -p VO (N O CN

(0 en p m cn τΐ< ro a 3 XI oo vo er en (0 3 0

> > X

(0

I P

(0 (0 p a >ι a < en u q 30 (0

H -X

7 71948

Edellisen metodiikkaan nojautuen keksinnön mukaiseen menetelmään sopivat siten kaikki täytekappaleet, jotka 1. alustan valuttamisen jälkeen pidättävät alle 8 % alustaa laskettuna vapaasta tilavuudesta (pidätystilavuus) ja 2. joiden värimäärä on enintään 0,15 % sen jälkeen, kun on huuhdeltu 4 kertaa vapaalla tilavuudella, tai joiden jäännösväri on enintään 0,5 % sen jälkeen, kun on huuhdeltu 4 kertaa vapaalla tilavuudella ja tämän jälkeen ravistelu.

Tällaiset täytekappaleet mahdollistavat suspensioon vietyjen tumallisten solujen, esimerkiksi fibroblasti-solujen, epiteettisolujen, tarttumisen lyhyen ajan sisällä, esimerkiksi 1-3 tunnin aikana. Sitä paitsi kiertävän alustan ravintoaineet tulevat hyvin käytetyiksi niin, että taataan solujen nopea kasvu. Erityisen edullista on kuitenkin, että tiiviisti kasvaneet viljelmät voidaan saattaa induktioaineiden kanssa yhteyteen halutun aikavälin kuluessa, ja että tämän jälkeen tarpeellinen induktioaineiden poistaminen ei tuota mitään vaikeuksia yksinkertaisesti huuhtelemalla. Huuhtelu voi tällöin tapahtua jatkuvatoimisesti tai epäjatkuvasti, so. korvaamalla kiertävä alusta huuhteluaineella tai mahdollisesti antamalla alustan valua useaan kertaan pois ja sen jälkeen täyttämällä huuhteluaineella. Jälkimmäisessä tapauksessa huuhteluaine syötetään parhaiten alhaalta käsin.

Käytetyt täytekappaleet voidaan lisäksi puhdistaa vaikeuksitta ja käyttää sen jälkeen uudelleen. Tämä tarkoittaa kuitenkin sitä, että solut tarttuvat niin hyvin tällaisten täytekappaleiden pinnalle, että taataan häiriötön solujen kasvu, mutta toisaalta eivät tartu niin kovaa, että solut eivät enää irtoa myöhemmässä puhdistuksessa.

Oheisen keksinnön kohteena on siten uusi tumallisten solujen (eukaryoottien) pintaviljelymenetelmä ja soluviljelmästä riippuvien aineiden talteenottomenetelmä käyttämällä täytekappaleita, jotka alustan valuttamisen jälkeen pidättävät alle 8 % alustasta laskettuna vapaasta tilavuudesta, so. joiden pidätystilavuus on alle 8 % 71948 ja joiden pinta-alan suhde vapaaseen tilavuuteen on 20:1 - 5:1 cm-1. Näillä täytekappaleilla ei ole siten häiritseviä fysikaalisia ominaisuuksia, esimerkiksi niillä ei ole häiritseviä rajapintavaikutuksia (kostumista, kapillaarivaikutusta), jolloin alustan pumpaamisen käytetään tarkoituksenmukaisesti pumppuja, joissa ei esiinny leikkausvoimia, esimerkiksi letkupumppuja.

Erityisen suositeltuja täytekappaleita ovat tällöin kuitenkin ne täytekappaleet, joissa samanaikaisesti on täytekappaleiden pinnan suhde vapaaseen tilavuuteen 20:1 - 5:1, parhaiten kuitenkin 15:1 - 5:1.

Keksinnön mukainen menetelmä on osoittautunut erityisen edulliseksi valmistettaessa fibroblasti-interferoneja. Reaktioastia, parhaiten paineenkestävä reaktioastia, esimerkiksi Duran-lasista tehty 25 litran kaksivaippainen reaktioastia, joka on tavalliseen tapaan varustettu syöttö- ja poistoaukolla, pH-elektrodilla ja fermeaatto-rilla, täytetään tätä varten huolellisesti pestyillä täytekappaleilla, parhaiten venytetyssä muodossa olevilla V4A-lankaspiraa-leilla (pituus: 6 mm, leveys: 6 mm, langan halkaisija: 0,6 mm, kierteen korkeus: 0,3 mm) noin 3/4 ja steriloidaan parhaiten paine-höyryllä. Täytekappaleiden pinnan suhde vapaaseen tilavuuteen on tällöin noin 11/1 cm-1. Sen jälkeen solut, jotka on saatu parhaiten trypsiinikäsittelemällä pintasoluviljelmät, suspendoidaan solu-tiheydellä tarkoituksenmukaisesti 20.000 solua/cm^, minimialustaan, johon on tarkoituksenmukaisesti lisätty 10 % vasikkasikiön seerumia ja antibioottia, kuten kanamysiiniä konsentraatiossa 200 ^jg/ml. Käytettyä soluviljelmäsuspensiota pidetään pumppaamatta 2-4 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen alustaa kierrätetään pumppaamalla parhaiten letkupurapulla, jonka kierrosluku on 30 kierrosta minuutissa, ja pH säädetään välille 7,3 ja 7.5. 24 - 48 tunnin kuluttua soluviljelmä-suspension lisäämisestä poistetaan alustaa säännöllisin välein ja lisätään koostumukseltaan samanlaista tuoretta kasvatusalustaa. Seuraavina 3-4 päivänä alustaa lisätään ja poistetaan yhteensä 80 litraa. Menetelmän jatko riippuu aineesta, joka on tarkoitus ottaa talteen soluviljelmästä. Kun esimerkiksi on kysymys interferonista, koko alusta poistetaan 8-10 päivän jälkeen soluvil- 9 71948 jelmän lisäämisestä ja sen jälkeen suoritetaan indusointi tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi Poly I:C:lla, mitomysiini C:llä, viruksilla tai muilla sopivilla aineilla. Sen jälkeen poistetaan koko induktioalusta ja solut pestään useita kertoja minimialustalla (Minimum Essential Medium). Sen jälkeen lisätään uudelleen alustaa, johon on lisätty interferonille sopivaa stabilisaattoria, esimerkiksi seerumi-albumiinia. Tätä nestettä kierrätetään uudelleen edellä kuvatulla tavalla. 12 - 24 tunnin lisäajan jälkeen poistetaan alusta ja saatu raaka-interferoni väkevöidään ja puhdistetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

Keksinnön mukaisesti käytetään parhaiten letkupumppua, jonka teho on 50 - 400 % kokonaistilavuudesta tuntia kohti kierrosluvulla 25 - 60 kierrosta minuutissa. Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan siten käyttää huomattavasti suurempia tilavuusmääriä kuin tähän mennessä tunnetuissa menetelmissä, ja sen rajoituksena on ainoastaan riittävä ravinnon ja hapen syöttö sekä pH-arvon pitäminen vakiona soluille sopivalla alueella.

Keksinnön mukaisella menetelmällä on lisäetuna, että tuotantovaiheen aikana muodostuneet, soluviljelmästä riippuvat aineet, kuten esimerkiksi interferoni voidaan poistaa kierrosta epäjatkuvasti tai jatku-vatoimisesti, korvata uudella alustalla ja esimerkiksi näin poistettu interferoni voidaan viedä puhdistus- ja väkevöintipylvääseen.

Sitä paitsi ei tuota mitään vaikeuksia lisätä nk. stimulointiainetta tai tällaisten aineiden seosta minä tahansa haluttuna menetelmän ajankohtana, millä on tarkoitus nostaa soluviljelmästä riippuvan aineen saantoa, tai poistaa sitä (ks. saman hakijan eurooppalainen patenttijulkaisu EP-A3-5476).

Seuraava esimerkki selventää keksintöä lähemmin:

Esimerkki 15 litran kaksivaippainen, Duran-lasista tehty reaktioastia täytetään 17 litralla huolellisesti valittuja täytekappaleita: V4A-lankaspi- . 10 71 948 raalit, venytetty muoto, pituus 6 mm, leveys 6 mm, langan halkaisija 0,6 mm, kierteen korkeus: 0,3 mm, umpinaisia (täytekappaleiden pinnan suhde vapaaseen tilavuuteen (= noin 11/1 cm"l). Syöttöä ja poistoa varten reaktori varustetaan sisähalkaisijaltaan 8-10 mm silikonikumiletkuilla, yhdistetään pH-elektrodeilla pH-mittariin ja permeaattoriin ja kytketään kiertoon. Laitteisto steriloidaan painehöyryllä. Soluja, jotka on saatu trypsinoimalla pintaviljemä-kasvatus, suspendoidaan 20.000 solua/cm^ 17 litraan minimialustaa, joka sisältää 10 % vasikansikiöseerumia ja 200 pg/ml kanamysiiniä, ja laitetaan reaktoriastiaan. Reaktoriastia lämmitetään kaksois-vaipan ja vesihaudetermostaatin avulla 37°C:een ja pidetään säädettynä tässä lämpötilassa. Lisätty soluviljelmäsuspensio pidetään pumppaamatta reaktioastiässä 2-4 tuntia. Sen jälkeen silikoniletku laitetaan letkupumppuun ja pumpataan 40 - 80 litra/tunti teholla kierrosluvulla 30 kierrosta per minuutti. pH pidetään säätämällä välillä 7,3 ja 7,5. 24 - 48 tuntia panoksen lisäämisen jälkeen poistetaan alustaa säännöllisin välein ja lisätään koostumukseltaan samanlaista tuoretta kasvualustaa. Seuraavina 3-4 päivänä lisätään ja poistetaan yhteensä 80 litraa alustaa. 8-20 päivän kuluttua soluviljelmän lisäämisestä alusta lasketaan pois kokonaan, solut pestään lisäämällä minimialustaa ilman seerumia ja sen jälkeen lisätään induktioalustaa, joka sisältää 100 pg/ml Poly I:C ja 2,5 pg/ml sykloheksimidiä. Alusta pidetään 3 tuntia reaktioastiässä. Sen jälkeen lisätään 2 )jg/ml aktinomysiiniä D. Tunnin kuluttua aktino-mysiini D:n lisäämisestä poistetaan kaikki induktioalusta ja solut pestään vähintään neljä kertaa seerumia sisältämättömällä minimi-alustalla. Sen jälkeen lisätään minimialustaa, jossa on 1000 /jg/ml seerumia-albumia, ja pumpataan edellä kuvatulla tavalla. pH pidetään säätämällä 7,5 - 7,6. Alusta poistetaan 19 - 20 tunnin kuluttua ja väkevöidään ja puhdistetaan tunnetuilla menetelmillä.

Interferonin saanto puhdistamattomassa liuoksessa on 900 - 2000 yksikköä/viljelypinnan cm^, kun vertailuna on National Institutes of Healt'in (USA) kansainvälinen referenssivalmista G 023-902-527.

Fibrobalsti-interferonia valmistettiin analogisesti käyttämällä eri täytekappaleita eri määriä seuraavin tuloksin: 7194 8

Panoksen määrä Interferoni-referenssiyksik-Täytekappale+ litroissa köjä/viljelypinnan cm^ A 2,2 1.580 A 17,0 1.374 A 108,0 1.103 B 0,2 470

Vertailu (L)++ 0,2 23 __0_j_2_ 19_ + Määritelmä sivulla 5 ++ ks. sivu 2, rivit 18 - 24.

Claims (8)

12 71 948

1. Menetelmä tumallisten solujen viljelemiseksi pintaviljelyteknii-kalla ja soluviljelmästä riippuvien aineiden taiteenottamiseksi näin saaduista soluista, tunnettu siitä, että kasvatus-pintana käytetään metallisia kierukoiden, satulakappaleiden, spiraalien, lankaspiraalien tai lankakudosspiraalien muotoisia täytekappaleita, jotka vesipitoisen viljelyvällaineen valuttamisen jälkeen pidättävät alle 8 % väliaineesta laskettuna vapaasta tilavuudesta, jolloin samanaikaisesti kasvatuspinnan pinta-alan suhde vapaan tilan tilavuuteen on 5 : 1 - 20 : 1 cm“l.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että täytekappaleina käytetään venytetyssä muodossa olevaa spiraalia, jonka kokonaispituus on 4 - 8 mm, kokonaisleveys on 4- 8 mm, halkaisija on 0,4 - 0,8 mm ja kierteen korkeus on 0,1 - 0,5 mm tai satuloita.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että täytekappaleina käytetään venytetyssä muodossa olevaa spiraalia, jonka kokonaispituus on 5 - 7 mm, kokonaisleveys on 5- 7 mm, halkaisija on 0,5 - 0,7 mm ja kierteen korkeus on 0,2 - 0,4 mm tai satuloita.

4. Patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että täytekappaleet on valmistettu V2A- tai V4Ä-teräksestä.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että täytekappaleina käytetään V^A-teräksistä lankaspiraalia tai lankakudosspiraalia.

6. Patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että täytekappaleen pinnan suhde vapaaseen tilavuuteen on 15 : 1 - 5 : 1 cm-1.

7. Patenttivaatimusten 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluviljelmästä riippuvana aineena valmistetaan interferonia. 13 71 948

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solujen indusoinnin jälkeen muodostunut interferoni erotetaan jatkuvatoimisesti tai epäjatkuvasti, jolloin väliaineen kierrättämiseen käytetään pumppua, jossa ei esiinny lainkaan leikkausvoimia.