KR20210125031A

KR20210125031A - 단백질 하이드로겔, 이의 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20210125031A
Application number: KR1020217027865A
Authority: KR
Inventors: 마르신 프체미슬라프 크르지카프스키; 레나타 크르지카우스카
Original assignee: 리얼 리서치 에스피. 제트 오. 오.
Priority date: 2019-02-04
Filing date: 2020-02-04
Publication date: 2021-10-15
Also published as: EP3921372B1; EP3689971A1; PL3921372T3; JP2022520025A; IL285368A; WO2020161613A1; AU2020218941A1; CN113614177A; EP3921372A1; CA3127555A1; US20220135749A1

Abstract

본 발명은 저-농축된 성분들, 즉, 시약 A 및 시약 B를 기반으로 하여 생성된 새로운 단백질 하이드로겔, 하이드로겔 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

단백질 하이드로겔, 이의 제조 방법 및 용도

본 발명은 단백질 하이드로겔(protein hydrogel), 이의 제조 방법 및 건강한 세포와 종양성 세포(neoplastic cell) 둘 모두, 둘 모두의 세포주 및 일차 세포의, 2D 및 3D 세포 배양을 포함한, 세포 배양을 위한 이의 용도; 3D 조건에서의 하이드로겔 내의 이동 및 침윤 분석(invasion assay), 혈관형성 분석의 수행, 및 대동맥 발아 분석(aortic sprouting assay)의 수행을 위한 용도에 관한 것이다.

현재, 3-차원 환경에서의 세포 배양을 위한 많은 상이한 유형의 배지가 있다. 이들은 일반적으로는 몇 가지 유형으로 구분될 수 있다: 단백질 하이드로겔, 합성 하이드로겔, 스캐폴드(scaffold), 현적법(hanging drop method) 등.

단백질 하이드로겔의 이점은 이들이 세포 성장을 위한 생리학적 환경과 가장 가깝다는 것이다. 현재, 3-차원 조건에서의 세포 배양을 위해서 가장 흔히 사용되는 재료는 하이드로겔이며, 이의 조성은 세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 단백질로 이루어져 있다. 그중에서도, 합성된 펩티드로부터 생산되는 다른 하이드로겔이 또한 이용 가능하지만, 이들은 훨씬 덜 일반적으로 사용된다. 다른 한편으로, 콜라겐 및 젤라틴이 2-차원 세포 배양에서 배양물 표면을 코팅하기 위해서 사용된다.

콜라겐이 또한 3-차원 배양을 위해서 사용된다. 전형적으로는 pH 변화에 의해서 가교된 하이드로겔이 사용된다. 낮은 pH에서, 콜라겐, 예를 들어, 래트 꼬리 콜라겐(rat tail collagen)은 용해되고, 더 중성의 pH의 배양 배지가 그것에 첨가된 후에, 콜라겐은 겔화되고 배양물이 그것 상에서 성장할 수 있다. 젤라틴은 콜라겐 섬유의 부분적 가수분해 생성물이다. 이용 가능한 젤라틴 종류 중에, 두 가지 기본적인 유형, 즉, 산성 유형, 즉, 가수분해가 산성 환경에서 수행되는 것, 및 알칼리성 유형, 즉, 가수분해가 알칼리성 환경에서 수행되는 것이 확인될 수 있다. 겔화 강도를 결정하는 값에 따라서, 상이한 블룸값(Bloom value)의 젤라틴이 확인된다. 블룸값이 더 높을수록 겔화 강도가 더 크다.

현재, 3D 세포 배양 및 혈관형성 분석을 가능하게 하는 하이드로겔이 상업적으로 이용 가능하다. 혈관형성 분석을 수행하는 것을 가능하게 하는 제품의 몇 가지 예 중 하나는 Matrigel^®(및 이의 유도체)이다. Matrigel의 주요 성분은 라미닌(laminin), 타입 IV 콜라겐(type IV collagen), 프로테오글리칸, 엔탁틴(entactin) 및 Engelbreth-Holm-Swarm(EHS) 육종인 뮤린 신생물(murine neoplasm)으로부터 추출되는 성장 인자이다. 미국특허 US4829000호는 세포 배양을 위한 조성물 및 생물학적 활성 추출물의 생산을 위한 방법을 개시하고 있다. 문헌[Orci et al., Vascular outgrowths from tissue explants embedded in fibrin or collagen gels: a simple in vitro model of angiogenesis, Cell Biology International Reports, Vol. 9, No. 10, October 1985]로부터 혈관형성 분석을 수행하기 위해서 콜라겐을 사용하는 것이 또한 공지되어 있지만, 콜라겐의 사용은 종래 기술에서 노동 집약적이고, 불량한 재현 가능한 결과를 주는 것으로 기재되어 있다. 기본적인 형성 재료가 젤라틴인 하이드로겔, 및 구체적으로는 메타크릴화된 젤라틴(FastLink GelMA)이 또한 상업적으로 구입 가능하고, 그러한 하이드로겔의 예시적인 생산자는 Stemorgan Inc.이다. 그러나, 이들 하이드로겔은 약 10%의 농도의 젤라틴을 사용하며, 이는 본 발명에서 제안되는 젤라틴 농도 범위를 현저하게 초과한다. 추가로, GelMA 내의 젤라틴은 UV 방사선의 영향 하에 자유 라디칼을 생성시키는 개시제에 의해서 가교된다.

본 발명의 목적은, 종래 기술로부터 공지된 기존의 문제들을 해결하고 덜 독성이지만, 생산 비용을 감소시키고 생산 효율을 증가시키는, 저-농축 혼합물(low-concentrated mixture)을 기반으로 하는 하이드로겔을 제공하는 것이다. 사용된 성분 때문에, 새로운 하이드로겔은 종래 기술로부터 공지된 하이드로겔에 비해서 현저하게 더 큰 재현성(reproducibility)을 부여한다. 이러한 재현성은 새로운 하이드로겔의 두 가지의 근본적인 특징으로부터 생성된다. 우선, 종래 기술로부터 공지된 하이드로겔에 비해서, 새로운 하이드로겔은 성장 인자를 실질적으로 함유하지 않는데, 이는, 첫 번째로, 젤라틴 생산 기술이 성장 인자의 생존 잠재성을 극적으로 저하시키고, 두 번째로, 글루타르알데하이드(GTA)와의 겔라틴 가교 반응 동안에, 가능한 잔류량의 성장 인자가 불활성화된다는 두 가지 원인으로부터 유래된다. 새로운 하이드로겔의 재현성에 대한 두 번째 근거는 이의 성분들의 농도의 재현성이다.

종래 기술에서, 문헌[DOILLON et al. Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity, Anticancer Research 24: 2169-2178 (2004)]로부터, 종양성 세포 배양의 3D 모델을 위한 성분으로서 피브린 첨가와 함께 콜라겐을 사용하는 것이 공지되어 있다. 또한, 문헌[Yamada & Even-Ram: Cell migration in 3D matrix 2005]으로부터, 3D 세포 배양의 이용이 공지되어 있으며, 그러한 이용은 하이드로겔 내부에서 침윤 및 이동하는 종양성 세포의 잠재성을 시험하기 위해서 콜라겐과 피브린을 기반으로 한다.

종래 기술에서, 문헌[MONTESANO et al., Vascular outgrowths from tissue explants embedded in fibrin or collagen gels: a simple in vitro model of angiogenesis, Cell Biology International Reports, Vol. 9, No. 10, October 1985]으로부터, 3D 내피 세포 배양의 이용이 또한 공지되어 있으며, 그러한 이용은 콜라겐과 피브린을 기반으로 하고 혈관형성 분석을 수행하는 것을 가능하게 한다. 그러나, 이들 하이드로겔은 GTA를 함유하지 않는다.

GTA(글루타르알데하이드)는, 특히, 알데하이드 기와의 폴리펩티드 사슬의 하이드록시-리신의 리신 또는 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 반응에 의한, 콜라겐 재료의 매우 효과적인 안정화 때문에, 가장 흔히 사용되는 화학적 가교제 중 하나 이다. 그러나, 세포 배양의 상황에서, 이의 단점은, 매우 낮은 농도에서도, 독성이 있다는 것이다. 문헌[Ou&Yang The micro patterning of glutaraldehyde (GA)-crosslinked gelatin and its application to cell-culture, Lab on a Chip, 2005]에서 개시된 바와 같이, 45% GTA에서의 습화 후의 잔류물을 제거하기 위해서 하이드로겔을 물로 세척함으로써 이러한 문제를 해소시키려는 시도가 있었지만, 추가의 세정 단계 후에도, 사용된 GTA 농도는, 개시된 방법에 따라서 생산된 하이드로겔이 본 발명의 하이드로겔과 상이한 품질을 가질 많큼 높았다.

반면에, 문헌[Bigi et al., Mechanical and thermal properties of gelatin films at different degrees of glutaraldehyde crosslinking, Biomaterials 22 (2001) 763-768]은 GTA-가교된 젤라틴을 함유하는 하이드로겔 조성물이 우수한 안정성을 특징으로 함을 나타내고 있다. 0.1% 내지 1% GTA의 범위로 존재하는 결과에 따르면, 가교의 범위는 60%로부터 100%까지 증가하고, 그에 따라서, 열적 및 기계적 특성이 다른데, 그 이유는 상이한 GTA 농도를 이용하여 필름의 물리화학적 특성을 조절하는 것이 가능하기 때문이다. 그러나, GTA 농도는 여전히 이러한 방식으로 제조된 하이드로겔 상에서의 세포 배양을 불가능하게 할 만큼 충분히 높다.

문헌 CN105316285호는 3D 세포 배양을 위한 배지의 생산을 위한 방법으로서, 콜라겐을 아세트산에 용해시키고, 키토산을 아세트산에 용해시키고, 이들을 혼합하고, 건조시키고, 이어서, GTA를 첨가하고, 가교를 위해서 8 내지 16 시간 동안 정치시키고, 얻은 하이드로겔을 정제함을 포함하는 방법을 개시하고 있다.

현재, 종래 기술에서는, 낮은 농도의 GTA에 의한 단백질의 가교에 의해서 생성되는 하이드로겔이 없다. 농도를 감소시킴으로써, 그리고 동시에, GTA의 비율을 결합될 수 있는 리신의 양으로 감소시킴으로써, 우수한 물리화학적 품질 뿐만 아니라 더 낮은 독성의 하이드로겔이 얻어졌으며, 이는 건강한 세포와 종양성 세포 둘 모두의 2D 및 3D 세포 배양을 위한 본 발명의 하이드로겔의 사용, 3D 조건에서의 하이드로겔 중의 이동 및 침윤 분석, 혈관형성 분석의 수행 또는 대동맥 발아 분석의 수행을 가능하게 한다.

그러나, 이러한 방식으로, 시험에서, 예를 들어, 혈관형성 분석을 수행하기 위해서 광범위하게 사용될 수 있게 하는, 정밀하게 선택된 품질, 예컨대, 밀도, 경도 및 탄성의 하이드로겔을 개발할 필요가 여전히 존재한다. 본 발명에서, 밀도 및 경도 파라미터의 정밀한 선택은 젤라틴 또는 콜라겐 및 GTA 농도의 변화에 의해서 적합하게 수행된다. 탄성은 변화되는 상기 두 파라미터 및 하이드로겔 생산 방법의 결과이다. 가교의 수준은 최종 제품의 파라미터를 결정하고, 단지 발명자들에 의해서 기재된 기술이 본 발명의 하이드로겔의 파라미터를 얻을 수 있기에 충분히 낮은 수준으로 농도를 저하시키는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈관형성 분석(혈관형성 분석, 시험관내 혈관형성 튜브 형성 분석, 내피 세포 튜브 형성 분석)을 수행하는데 사용하기 위한 하이드로겔을 제공하는 것이다. 새로운 하이드로겔은 또한 다른 세포 배양, 예컨대, 종양성 세포 배양에서, 랩온어칩(lab-on-a-chip) 배양, 식물 및 박테리아 세포 배양 및 유출 배양(flow culture)에서 사용된다.

본 발명에 의해서 해결되는 추가의 기술적 문제는 젤라틴과의 GTA의 반응 후에 유지되는 독성의 제거이다. 이미 잔류하는 본원에서 사용된 GTA의 양을 제거하면, 생성되는 하이드로겔은 가장 민감한 세포라도 성장할 수 있게 한다.

추가로, 본 발명의 매우 중요한 특성은 경제적인 양태이다. 첫 번째로, 그러한 낮은 농도로 하이드로겔을 생성시킬 수 있도록 GTA를 젤라틴과 반응시키는 것이 가능하다. 추가로, 본원발명에서 사용되는 비교적 저렴한 시약은 생산의 효율 및 비용-효과를 증가시키면서 비용을 유의하게 감소시키며, 청구된 제품이 훨씬 더 큰 규모로 기능하는 것이 가능하다.

매우 중요한 양태는 그러한 방식으로 생성되는 단백질 하이드로겔이 오늘날 상업적으로 이용 가능한 유사한 적용 범위를 갖는 제품보다 세포 배양을 위한 훨씬 더 재현 가능한 제품이라는 사실이다. 본 발명의 단백질 하이드로겔은 성장 인자가 없고 또한 유의하게 증가된 제품 재현성을 갖는 이러한 부류의 유일한 제품이다. 그것은 성장 인자를 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는데, 그 이유는 상업적으로 구입 가능한 성분들의 각각의 제조가 그들에 존재할 수 있는 잔류 성장 인자를 불활성화시키고, 추가로, 성장 인자가 GTA와의 반응 동안에 불활성화되기 때문이다. 본 발명의 단백질 하이드로겔 단독의 높은 재형성은 그것이 상업적으로 구입 가능한 성분으로부터 합성되고, 그에 의해서 이들의 농도가 최종 제품에서 매우 정밀하게 선택되고 제어될 수 있다는 사실로부터 유래된다.

본 발명의 주제는 젤라틴 또는 콜라겐인 시약 A, 가교제이며 GTA(글루타르알데하이드)인 시약 B, 및 용매를 포함하는 단백질 하이드로겔로서, 시약 A가 0.15 중량% 내지 1.5 중량%의 최종 농도로 존재하며, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하드로겔의 한 분획에서 0.375-4.5 mg 대 0.01-0.15 mg인 것을 특징으로 하는 단백질 하이드로겔이다.

바람직하게는, 시약 A의 최종 농도는 0.25 중량% 내지 1 중량%이고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하드로겔의 한 분획에서 0.625-3 mg 대 0.0135-0.075 mg이다.

특히 바람직하게는, 시약 A의 최종 농도는 0.3 중량% 내지 0.8 중량%이고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하드로겔의 한 분획에서 0.75-2.4 mg 대 0.021-0.045 mg이다.

본 발명의 단백질 하이드로겔은 젤라틴이 적어도 225의 블룸값, 바람직하게는 300의 블룸값의 젤라틴인 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명의 단백질 하이드로겔은 용매가 수용액이고, 더욱 바람직하게는 dH₂O, PBS, HBSS의 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 PBS인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 주제는,

a) 수용액, 바람직하게는 dH₂O, PBS, HBSS의 군으로부터 선택된 수용액, 가장 바람직하게는 PBS에 적합한 양의 젤라틴 또는 콜라겐인 시약 A를 첨가하는 단계;

b) 단계 a)의 혼합물을 가열하여 겔을 용해시키는 단계;

c) 임의로, 겔을 초기 안정화시키는 단계;

d) 가교제이며 GTA인 시약 B를 수용액에 용해시키고 이를 냉각시킴으로써 이를 제조하는 단계;

e) 단계 d)에서 제조된 시약 B를 단계 c)에서 제조된 겔에 첨가하는 단계;

f) 임의로, 얻은 혼합물을 혼합하는 단계;

g) 가교시키는 단계;

h) 임의로, 과량의 시약 B의 하이드로겔을 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 단백질 하이드로겔을 생산하는 방법으로서,

시약 A가 0.15 중량% 내지 1.5 중량%의 최종 농도로 존재하고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 0.375-4.5 mg 대 0.01-0.15 mg이고, 겔이 온도 0-12℃에 도달하는 때에 겔의 초기 안정화가 수행되고 그 기간이 적어도 약 5분이고; 단계 d)-g)가 약 0℃ 내지 약 12℃의 감소된 온도에서 수행되고, 단계 g)에서, 가교의 기간이 적어도 12 시간인 것을 특징으로 하는, 방법이다.

단계 c)에서 제조된 겔에의 단계 d)에서 제조된 시약 B의 첨가는 시약 B를 겔에 첨가하거나 시약 B를 이미 겔화된 겔 상으로 첨가함으로써 수행될 수 있다.

바람직하게는, 시약 A의 최종 농도가 0.25 중량% 내지 1 중량%이고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 0.625-3 mg 대 0.0135-0.075 mg이다.

특히 바람직하게는, 시약 A의 최종 농도가 0.3 중량% 내지 0.8 중량%이고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 0.75-2.4 mg 대 0.021-0.045 mg이다.

바람직하게는, 초기 안정화의 기간이 30 분 내지 48 시간, 가장 바람직하게는 45 분 내지 24 시간이다.

바람직하게는, 가교의 기간이 48 시간 초과, 가장 바람직하게는 72 시간 초과이다.

단계 h)에서의 하이드로겔의 정제가 수행되면, 그것은 바람직하게는 수용액, 바람직하게는 세포 배양을 위한 수용액, 바람직하게는 PBS에 의해서 세정함으로써 또는 중화 시약 B에 의해서, 바람직하게는 L-리신을 첨가함으로써 수행된다.

방법의 상기 기재된 단계 h)에서 과량의 시약 B의 하이드로겔의 임의의 정제는 -CHO 기와 반응하여 이를 불활성화시킬 수 있는 모든 물질에 의해서 수행된다. 그러한 물질의 예는 L-리신, 그러나 또한, 리신의 미결합 측쇄 -NH₂를 포함하는 단백질이다. 이러한 물질은, 예를 들어, 두 개의 -CHO 기를 포함하는 GTA인 독성 가교 물질을 중화시키기 위해서 사용된다. 이러한 물질은 하이드로겔이 생성되는 때에 첨가되는 -CHO 기의 몰농도의 배수인 농도로 사용된다. 예를 들어, 30 μl의 0.1% GTA가 사용되는 때에, 약 0.6*10^-3 몰의 -CHO 기가 그러한 부피에 존재한다. 10x (10 배) 농도의 L-리신은 -CHO 기보다 10배 더 많은 몰의 L-리신이 하이드로겔을 생성시키기 위해서 첨가됨을 의미한다. L-리신은 측쇄에 단지 하나의 -NH₂ 기를 포함하며, 상기 기는 -CHO 기에 결합할 수 있고, 전형적으로는 하이드로겔의 초기 부피와 동일한 부피로 첨가된다.

본 발명의 또 다른 주제는 세포 배양을 위한, 바람직하게는 3D 세포 배양을 위한 본 발명의 단백질 하이드로겔의 용도이다.

본 발명의 또 다른 주제는 혈관형성 분석을 수행하기 위한 본 발명의 발명에 의해서 생산된 단백질 하이드로겔의 용도로서, 단계 c)에서의 초기 안정화의 기간이 10 내지 90 분, 바람직하게는 15 내지 60 분, 가장 바람직하게는 40 내지 55 분이고, 가교의 기간이 60 시간 초과이고, 시약 A의 최종 농도가 0.35-0.55%이고, 그러한 비율은, 0.875 mg 내지 1.375 mg의 범위의 시약 A의 질량의 경우에, 0.024 mg 내지 0.036 mg의 시약 B에 해당되게 하이드로겔의 한 분획에서 유지되는, 용도이다.

바람직하게는, 그러한 비율은. 1 mg 내지 1.25 mg의 범위의 시약 A의 질량의 경우에, 0.027 mg 내지 0.033 mg의 시약 B에 해당되게 하이드로겔의 한 분획에서 유지된다.

특히 바람직하게는, 그러한 비율은. 1 mg의 양의 시약 A의 질량의 경우에, 0.03 mg의 양의 시약 B에 해당되게 하이드로겔의 한 분획에서 유지된다.

GTA가 0.15%-1.5%의 농도의 젤라틴에(즉, 각각 250 μl에 또는 300 μl에) 참가되는, 0.15 mg(즉, 30 μl 중의 0.5% 또는 300 μl 중의 0.05%) 미만의 값으로의 GTA의 농도의 저하는, 이의 독성을 감소시킬 뿐만 아니라 (이는 제거하기에 더 용이함), 가장 중요하게는, 하이드로겔의 탄성 및 점도를 변화시키는 것을 가능하게 하고, 그에 따라서, 세포 성장의 파라미터에 영향을 주고, 완전히 새로운 기회를 부여한다.

본원에서 사용된 용어는 본 기술분야에서 일반적으로 허용되는 의미를 갖는다.

용어 "감소된 온도"는 약 0℃ 내지 약 12℃, 바람직하게는 약 0℃ 내지 약 8℃, 특히 바람직하게는 얼음 상의 범위 내의 온도를 의미하고, 상기 표현은 표현 "냉장 온도"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

용어 "약"은 주어진 수치 값이 정의된 값을 갖지만 10%의 오차가 있을 수 있음을 나타내기 위해서 의도된다.

용어 "수용액"은 바람직하게는 세포 배양을 위한 수용액, 바람직하게 dH₂O, PBS, HBSS의 군으로부터부터 선택되는 수용액, 특히 바람직하게는 PBS를 의미한다.

용어 "가교제", "시약 B"는 둘 이상의 단백질 사슬을 연결시키는 기능을 수행하는 화합물을 의미한다. 단백질 사슬은 단백질의 말단에서의 아미노산 측쇄 또는 아미노산에 의해서 연결된다. 단백질의 연결은, 단백질 사슬이 연결된 결과로 단백질의 네트워크가 생성되는 때에는, 가교라고 일컬어지며, 또한 하이드로겔이라고 일컬어진다. 예시적인 단백질 가교 메커니즘이 열거되어 있는, 문헌[Sung et al. Evaluation of gelatin hydrogel crosslinked with various crosslinking agents as bioadhesives: In vitro study, Journal of biomedical materials Research, 1999]에 의한 작업에서 실시예에 나타낸 바와 같이, 단백질 가교는, 예를 들어, -NH₂ 또는 -COOH 작용기에 의해서 발생한다. Bigi 등의 문헌에 개시된 바와 같이, 가교제는 바람직하게는 펜탄-1,5-디알(글루타르알데하이드, GTA)이다. GTA는 단백질들 사이에 -NH₂ 기를 공유 결합시킴으로써, 그리고 추가로, 한 단백질의 내부의 그 기들을 결합시켜 그것들을 안정화시킴으로써 젤라틴 또는 콜라겐을 가교시킨다.

용어 "단백질 하이드로겔 분획/웰(protein hydrogel portion/well)"은 생성 동안에 청구범위에 주어진 비율이 지지되는 예시적인 분획을 의미한다. "분획"의 두 예가 사용되었고, 250 μl의 겔의 경우에, 그에 30μl GTA가 첨가된다(겔의 내부에, 그 결과, 표적 부피는 280 μl의 하이드로겔이다). 분획의 또 다른 예는 300 μl 겔 분획이고, 그 표면 상에, 300 μl GTA가 첨가되고 - 여기에서, 분획은 300 μl의 하이드로겔로 제한되는데, 그 이유는 겔의 표면 상에 첨가된 GTA가 그 자체로 겔과 혼합되지 않고, 그에 따라서, 최종적으로 생성되는 하이드로겔의 부피를 증가시키지 않기 때문이다. 적용되는 시약 B는 그러한 방식으로 겔 내로 확산되며, 그곳에서 가교 반응이 수행되고, 나머지 과량은 하이드로겔의 표면으로부터 흡인에 의해서 제거된다. 본 발명의 목적상, 상기 주어지고 구체예에서 개시된 하이드로겔 분획 부피가 제시되었다. 그러나, 보호범위는 더 적거나 더 많은 양의 시약 A 및 B를 포함하고, 상세한 설명에 기재된 바와 같은 시약 A 대 시약 B의 비율이 지지된다.

"시약 A"는 젤라틴 또는 콜라겐, 그러나 또한, 살아있는 유기체로부터 얻은 젤라틴 또는 콜라겐 중 하나와 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 갖는 어떠한 다른 단백질 뿐만 아니라, 재조합 단백질, 즉, 유전적으로 변형된 유기체에서의 생산에 의해서 얻은 재조합 단백질을 의미한다.

본 발명의 주제는 구체예에 그리고 도면에 나타내어져 있으며, 여기에서,
도 1은 하이드로겔 상의 튜브-형성 HUVEC 내피 세포를 나타내고 있다. 본 시험은 혈관의 형성을 예시하는 모델 분석이다. 그것은 프로-혈관형성 시험(pro-angiogenic test) 및 항-혈관형성 시험을 가능하게 한다.
도 2는 하이드로겔 상에서 배양된 4T1 세포를 나타내며, 세포는 3 차원 구조제, 회전 타원체를 형성시킨다. 장기간 배양 후에, 이웃하는 회전 타원체 사이를 이동하는 세포가 관찰된다. 도 2의 A는 씨딩 14일 후의 4T1 세포를 나타내며, 도 2의 B는 씨딩 17일 후를 나타낸다.
도 3은 하이드로겔로 절반이 충전되고 배양 배지를 그에 부은 배양 웰을 나타내고 있다. 하이드로겔에 따라 다양한 종류의 세포 성장 및 거동이 예시되어 있다. 도 3의 A 및 C는 경질 및 걸쭉한 하이드로겔 상의 성장 및 이동을 나타내며, 도 3의 B 및 D는 연질 및 묽은 하이드로겔 상의 성장 및 이동을 나타낸다. 도 3의 A는 하이드로겔의 표면 상의 세포 성장을 나타내고 있으며, 이는 3D 성장이지만 하이드로겔의 표면 상의 성장이다. 도 3의 B는 하이드로겔의 내부로의 세포 성장을 나타낸다. 도 3의 C는 하이드로겔의 표면 상에서의 이동을 나타내고 있다. 도 3의 D는 하이드로겔 내로 성장한 두 덩어리를 나타내고 있으며, 세포가 하이드로겔 내부에서 그들 사이에 이동한다.

구체예를 이하 나타내는데, 이들은 단지 본 발명의 예시이며 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 I - 단백질 하이드로겔의 생산

0.4%의 농도의 60개의 하이드로겔 분획을 생성시키기 위해서, 0.06 g의 타입 A 블룸 300 젤라틴을 칭량하고 14.94 ml의 PBS 용액에 용해시켰다. 각각의 하이드로겔 분획은 0.001 g의 젤라틴을 함유하였다. 용액을 37℃로 가열하여 겔을 용해시키고, 이어서, 여과에 의해서 살균하였다. 이러한 방식으로 제조된 겔을 웰당 250 μl로 48-웰 플레이트 내로 피펫팅하고, 냉장고에 넣어 냉각시키고, 이어서, 냉장고에서 45 분 동안 안정화시켰다. 나머지 12개의 겔 분획은 사용하지 않고 남겨두었다. 0.03 mg의 GTA를 취하고 30 μl의 dH₂O에 보충함으로써, dH₂O 중의 0.1% GTA 용액을 미리 제조하고 냉장고에서 30 분 동안 냉각시켰다. 냉각되고 안정화되었지만 겔화되지 않은 겔에, 30 μl의 GTA 용액을 첨가하였다. GTA 첨가는 얼음 상에서 수행되었다. 각각의 하이드로겔 분획에서, 약 0.03 mg의 GTA가 존재하였다. 이어서, GTA가 첨가된 겔을 함유하는 플레이트를 72 시간 동안 냉장고에 넣었다. 그 시간 후에, 생성된 하이드로겔은 L-라이신을 첨가함으로써 하이드로겔 중화에 의해 과량의 GTA를 정제하였다. PBS에 용해된 농도 10x의 L-리신이 사용되었다. 리신을 하이드로겔과 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 이러한 방식으로 제조된 하이드로겔은 추가의 사용을 위해서 준비된다.

실시예 II - 단백질 하이드로겔의 생산

0.7%의 농도의 50개의 하이드로겔 분획을 생성시키기 위해서, 0.105 g의 타입 A 블룸 300 젤라틴을 칭량하고 14.895 ml의 PBS 용액에 용해시켰다. 각각의 하이드로겔 분획은 0.0021 g의 젤라틴을 함유하였다. 용액을 37℃로 가열하여 겔을 용해시키고, 이어서, 여과에 의해서 살균하였다. 겔을 웰당 300 μl로 48-웰 플레이트 내로 피펫팅하였다. 나머지 2 개의 겔 분획은 사용하지 않고 남겨두었다. 이러한 방식으로 제조된 플레이트를 2 시간 동안 냉장고에 넣었다. 0.06 mg의 GTA를 채취하고 300 μl의 dH₂O에 보충함으로써, dH₂O 중의 0.02% GTA 용액을 미리 제조하고, 냉장고에서 최소 30 분 동안 냉각시켰다. 겔화된 겔의 표면 상에, 300 μl의 GTA 용액을 부드럽게 붓고, 24 시간 동안 냉장고에 넣었다. GTA 첨가는 얼음 상에서 수행된다. 각각의 하이드로겔 분획에서, 약 0.06 mg의 GTA가 존재하였다. 그 시간 후에, 생성된 하이드로겔은 PBS로 3회 하이드로겔을 세정함으로써 과량의 GTA를 정제하였다. 이러한 방식으로 제조된 하이드로겔은 추가의 사용을 위해서 준비된다.

실시예 III

실시예 I에서 제조된 하이드로겔 상에, 내피(HUVEC) 세포를 48-웰 플레이트에 15,000 세포/웰의 밀도로 씨딩하였다(특정의 세포주 배치(cell line batch) 및 세포 분할의 수에 따라서, 씨딩된 세포의 밀도는 48-웰 플레이트의 5,000 내지 50,000 세포/웰로 다양할 수 있다). 내피 세포를 EGM™-2 BulletKit™ Lonza 배지에서 배양하였다. 경험의 결과는 내피 세포에 의해서 하이드로겔의 표면 상에서 튜브가 형성되었다(도 1).

실시예 IV

실시예 II에서 제조된 하이드로겔 상에, 종양성 4T1(뮤린 유선 암종(murine mammary carcinoma)) 세포를 48-웰 플레이트에 10,000 세포/웰의 밀도로 씨딩하였다. 세포를 RPMI + 10% FBS 배지에서 배양하였다. 경험의 결과는 종양성 세포에 의해서 회전 타원체가 형성되었다(도 2).

실시예 V(종래 기술 농도를 사용한 비교예)

하이드로겔이 종래 기술에서 개시된 방법(Bigi et al.)에 따라서 생산되는 분석을 수행하였다. 그러기 위해서, 조성 5% 타입 A 블룸 300 젤라틴(질량) 및 표 1 내지 표 8에 기재된 질량 농도의 GTA의 하이드로겔을 제조하였다. 표 1, 2, 3 및 4에 나타낸 실험에서, 단백질 하이드로겔을 24 시간 동안 건조시키는 반면에(건조는 Bigi 등의 공보에서의 설명에 따랐다), 표 5, 6, 7 및 8에서는, 제조된 단백질 하이드로겔을 24 시간 가교시켰으며, 여기에서, A는 하이드로겔이 세정되지 않음을 의미하고, B는 그것이 dH₂O로 5x 세정됨을 의미하고, C는 그것이 PBS로 5x 세정됨을 의미한다. 세정 단계는 인용된 공보에서 기재되지 않았다. 실험 후에, 생성되는 세포를 계산하였다: 0 - 평평해진 세포 없음; 가장 가능하게는 모든 세포가 사망함; 1 - 소수의 평평해진 세포가 존재함; 2 - 많은 수의 평평해진 세포가 존재함. 이하 표는 얻은 결과를 나타낸다.

씨딩된 세포주: Panc_02

표 1

표 2

표 5

표 6

씨딩된 세포주: HUVEC

표 3

표 4

표 7

표 8

상기 데이터는, 종래 기술로부터의 더 높은 농도 하이드로겔 상에서는, 세포가 성장하거나 평평하게 성장하지 않음을 나타낸다. HUVEC 세포주의 경우에, 그것은 혈관의 형성, 혈관형성 분석의 수행을 억제하였다. Panc_02 세포주의 경우에, 이것은, 가교제가 적절히 제거/중화되면, 세포가 성장할 수 있지만, 표준 2D 배양에 전형적인 것과 같이, 성장이 세포가 평평해지도록 경질 배지 상에서 이루어짐을 의미한다.

실시예 VI - dH₂O 용매에 의한 단백질 하이드로겔의 생산

0.3%의 농도의 50개의 하이드로겔 분획(각각 300 μl)을 생성시키기 위해서, 0.045 g의 타입 A 블룸 300 젤라틴을 칭량하고 14.955 ml의 dH₂O에 용해시켰다. 각각의 하이드로겔 분획은 0.0009 g의 젤라틴을 함유하였다. 용액을 37℃로 30 분 동안 가열하여 겔을 용해시키고, 이어서, 여과에 의해서 살균하였다. 이러한 방식으로 제조된 겔을 웰당 300 μl로 48-웰 플레이트 내로 피펫팅하였다. 2 개의 겔 분획은 처분을 위해서 피펫팅하지 않고 남겨두었다. 48 개의 겔 분획을 함유한 48-웰 플레이트를 냉장고에 넣어 냉각시키고, 이어서, 냉장 온도에서 23 시간 동안 안정화시켰다. 0.0105 mg의 GTA를 채취하고 300 μl의 dH₂O에 보충함으로써, dH₂O 중의 0.0035%(질량) GTA 용액을 미리 제조하고, 이의 온도를 이를 냉장고에서 최소 30 분 동안 정치시켜 냉장 온도로 저하시켰다. 냉각되고 안정화되고 겔화된 겔의 표면 상에, 300 μl의 냉각된 GTA 용액을 첨가하였다. GTA 첨가는 얼음 상에서 수행되었다. 이어서, 부은 GTA를 함유하는 겔을 함유한 플레이트를 72 시간 동안 냉장고에 넣었다. 이어서, 각각의 하이드로겔 분획에서, 약 0.0105 mg의 GTA가 존재하였다. 그 시간 후에, 생성된 하이드로겔은 PBS로 3회 하이드로겔을 세정함으로써 과량의 GTA를 정제하였다. 이러한 방식으로 제조된 하이드로겔은 추가의 사용을 위해서 준비된다.

실시예 VII - 독성 GTA의 잔류물을 제거하는 단계를 수행할 필요가 없는 세포 배양을 위한 하이드로겔 생산

0.6%의 농도의 50 개의 하이드로겔 분획(각각 250 μl)을 생성시키기 위해서, 0.075 g의 타입 A 블룸 300 젤라틴을 칭량하고 12.425 ml의 PBS에 용해시켰다. 각각의 하이드로겔 분획은 0.0015 g의 젤라틴을 함유하였다. 용액을 37℃로 30 분 동안 가열하여 겔을 용해시키고, 이어서, 여과에 의해서 살균하였다. 이러한 방식으로 제조된 겔을 웰당 250 μl로 48-웰 플레이트 내로 피펫팅하였다. 2 개의 겔 분획은 처분을 위해서 피펫팅하지 않고 남겨두었다. 48 개의 겔 분획을 함유한 48-웰 플레이트를 냉장고에 넣어 냉각시키고, 이어서, 냉장 온도에서 60 분 동안 안정화시켰다. 0.018 mg의 GTA를 채취하고 30 μl의 dH₂O에 보충함으로써, dH₂O 중의 0.06%(질량) GTA 용액을 미리 제조하고, 이의 온도를 이를 냉장고에서 최소 30 분 동안 정치시켜 냉장 온도로 저하시켰다. 냉각되고 안정화되었지만 겔화되지 않은 겔에, 30 μl의 각각의 냉각된 GTA 용액을 첨가하였다. GTA 첨가는 얼음 상에서 수행되었다. 이어서, 첨가된 GTA를 함유하는 겔을 함유한 플레이트를 72 시간 동안 냉장고에 넣었다. 각각의 하이드로겔 분획에서, 약 0.018 mg의 GTA가 존재하였다. 이러한 방식으로 제조된 하이드로겔은 추가의 사용을 위해서 준비된다.

실시예 VIII - 타입 B 젤라틴에 의한 단백질 하이드로겔의 생산

0.4%의 농도의 60 개의 하이드로겔 분획(각각 250 μl)을 생성시키기 위해서, 0.06 g의 타입 B 젤라틴을 칭량하고 14.940 ml의 PBS에 용해시켰다. 각각의 하이드로겔 분획은 0.001 g의 젤라틴을 함유하였다. 용액을 37℃로 30 분 동안 가열하여 겔을 용해시키고, 이어서, 여과에 의해서 살균하였다. 이러한 방식으로 제조된 겔을 웰당 250 μl로 48-웰 플레이트 내로 피펫팅하였다. 12 개의 겔 분획은 처분을 위해서 피펫팅하지 않고 남겨두었다. 48 개의 겔 분획을 함유한 48-웰 플레이트를 냉장고에 넣어 냉각시키고, 이어서, 냉장 온도에서 50 분 동안 안정화시켰다. 0.045 mg의 GTA를 채취하고 30 μl의 dH₂O에 보충함으로써, dH₂O 중의 0.15%(질량) GTA 용액을 미리 제조하고, 이의 온도를 냉장 온도로 저하시켰다. 냉각되고 부분적으로 안정화되었지만 겔화되지 않은 겔에, 30 μl의 냉각된 GTA 용액을 첨가하였다. GTA 첨가는 얼음 상에서 수행되었다. 각각의 하이드로겔 분획에서, 약 0.045 mg의 GTA가 존재하였다. 이어서, GTA를 부은 겔을 함유하는 플레이트를 72 시간 동안 냉장고에 넣었다. 그 시간 후에, 생성되는 단백질 하이드로겔은 PBS로 3회 하이드로겔을 세정함으로써 과량의 GTA를 정제하였다. 이러한 방식으로 제조된 하이드로겔은 추가의 사용을 위해서 준비된다.

실시예 IX - 혈관형성의 재현성

0.4%의 농도의 50 개의 하이드로겔 분획(각각 250 μl)을 생성시키기 위해서, 0.05 g의 타입 A 블룸 300 젤라틴을 칭량하고 12.45 ml의 PBS에 용해시켰다. 각각의 하이드로겔 분획은 0.001 g의 젤라틴을 함유하였다. 용액을 37℃로 30 분 동안 가열하여 겔을 용해시키고, 이어서, 여과에 의해서 살균하였다. 이러한 방식으로 제조된 겔을 웰당 250 μl로 48-웰 플레이트 내로 피펫팅하였다. 2 개의 겔 분획은 처분을 위해서 피펫팅하지 않고 남겨두었다. 48 개의 겔 분획을 함유한 48-웰 플레이트를 냉장고에 넣어 냉각시키고, 이어서, 냉장 온도에서 40 분 동안 안정화시켰다. 0.03 mg의 GTA를 채취하고 30 μl의 dH₂O에 보충함으로써, dH₂O 중의 0.1%(질량) GTA 용액을 미리 제조하고, 이의 온도를 이를 냉장고에서 최소 30 분 동안 정치시켜 냉장 온도로 저하시켰다. 냉각되고 안정화되었지만 겔화되지 않은 겔에, 30 μl의 각각의 냉각된 GTA 용액을 첨가하였다. GTA 첨가는 얼음 상에서 수행되었다. 이어서, GTA가 첨가된 겔을 함유한 플레이트를 72 시간 동안 냉장고에 넣었다. 각각의 하이드로겔 분획에서, 약 0.03 mg의 GTA가 존재하였다. 이러한 방식으로 제조된 하이드로겔을 PBS로 3x 세정하였다. 단백질 하이드로겔을 매번 4 회반복으로 10개의 별도의 생산 배치에서 제조하였다.

이러한 방식으로 제조된 단백질 하이드로겔 상에, 세포를 씨딩하고 10 시간 인큐베이션 후에, 세포를 현미경 하에 관찰하였다. 이하 표 9는 분석 결과를 나타내며, 여기에서,

A - 세포가 웰-모양 튜브를 형성시킴

B - 세포가 튜브를 형성시키기 시작함

표 9

실험은 본 개시내용의 주제인 방법의 특성 중 하나가 결과의 높은 재현성임을 나타내고 있다. 모두 40 번의 시도에서, 혈관형성 분석은 긍정적인 결과를 나타냈으며, 단지 2회가 약간 시간이 지연되었으며, 이는 통계적 오차에 기인될 수 있다. 상기 결과는, 경쟁 제품에 비한, 혈관형성 분석의 유효성에서의 유의한 개선을 나타낸다.

본 발명의 주제인 단백질 하이드로겔은 하이드로겔의 정밀하게 선택된 파라미터, 예를 들어, 밀도 또는 경도를 갖는 배지를 얻는 것을 가능하게 한다. 이들 파라미터는 세포가 자연적으로 성장하는 생리학적 조건의 재현에 영향을 주며, 이는 차례로 이들의 거동, 예컨대, 하이드로겔 내에서의 이동, 회전 타원체를 형성시키는 능력 등에 영향을 준다.

Claims

젤라틴 또는 콜라겐인 시약 A, 가교제이고 GTA인 시약 B, 및 용매를 포함하는 단백질 하이드로겔(protein hydrogel)로서, 시약 A가 0.15 중량% 내지 1.5 중량%의 최종 농도로 존재하고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 0.375-4.5 mg 대 0.01-0.15 mg인 것을 특징으로 하는, 단백질 하이드로겔.
청구항 1에 있어서,
시약 A의 최종 농도가 0.25 중량% 내지 1 중량%이고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 0.625-3 mg 대 0.0135-0.075 mg인 것을 특징으로 하는, 단백질 하이드로겔.
청구항 2에 있어서,
시약 A의 최종 농도가 0.3 중량% 내지 0.8 중량%이고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 0.75-2.4 mg 대 0.021-0.045 mg인 것을 특징으로 하는, 단백질 하이드로겔.
청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
젤라틴이 적어도 225의 블룸값(Bloom value), 바람직하게는 300의 블룸값의 젤라틴인 것을 특징으로 하는, 단백질 하이드로겔.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
용매가 수용액, 바람직하게는 dH₂O, PBS, HBSS의 군으로부터 선택된 수용액, 가장 바람직하게는 PBS인 것을 특징으로 하는, 단백질 하이드로겔.
a) 수용액, 바람직하게는 dH₂O, PBS, HBSS의 군으로부터 선택된 수용액, 가장 바람직하게는 PBS에 적합한 양의 젤라틴 또는 콜라겐인 시약 A를 첨가하는 단계;
b) 단계 a)의 혼합물을 가열하여 겔을 용해시키는 단계;
c) 임의로, 겔을 초기 안정화시키는 단계;
d) 가교제이며 GTA인 시약 B를 수용액에 용해시키고 이를 냉각시킴으로써 이를 제조하는 단계;
e) 단계 d)에서 제조된 시약 B를 단계 c)에서 제조된 겔에 첨가하는 단계;
f) 임의로, 상기 얻은 혼합물을 혼합하는 단계;
g) 가교시키는 단계;
h) 임의로, 과량의 시약 B의 하이드로겔을 정제하는 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 5에 정의된 바와 같은 단백질 하이드로겔을 생산하는 방법으로서,
시약 A가 0.15 중량% 내지 1.5 중량%의 최종 농도로 존재하고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 0.375-4.5 mg 대 0.01-0.15 mg이고, 겔이 온도 0℃-12℃에 도달하는 때에 겔의 초기 안정화가 수행되고, 그 기간이 적어도 약 5분이고; 단계 d)-g)가 약 0℃ 내지 약 12℃의 감소된 온도에서 수행되고, 단계 g)에서, 가교의 기간이 적어도 12 시간인 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 6에 있어서,
시약 A의 최종 농도가 0.25 중량% 내지 1 중량%이고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 0.625-3 mg 대 0.0135-0.075 mg인 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 7에 있어서,
시약 A의 최종 농도가 0.3 중량% 내지 0.8 중량%이고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 0.75-2.4 mg 대 0.021-0.045 mg인 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 6에 있어서,
초기 안정화의 기간이 30 분 내지 48 시간, 가장 바람직하게는 45 분 내지 24 시간인 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 6에 있어서,
가교의 기간이 48 시간 초과, 가장 바람직하게는 72 시간 초과인 것을 특징으로 하는, 방법.
청구항 6 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
단계 h)에서의 하이드로겔의 정제가 수행되면, 그것은 수용액, 바람직하게는 세포 배양을 위한 수용액, 바람직하게는 PBS에 의해서 세정함으로써 또는 중화 시약 B에 의해서, 바람직하게는 L-리신을 첨가함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
세포 배양을 위한 청구항 1 내지 청구항 5에서 정의된 단백질 하이드로겔의 용도.
청구항 12에 있어서,
3D 세포 배양을 위한 용도.
혈관형성 분석을 수행하기 위한 청구항 6에 정의된 방법에 의해서 생산된 단백질 하이드로겔에 따른 용도로서, 단계 c)에서의 초기 안정화의 기간이 10 내지 90 분, 바람직하게는 15 내지 60 분, 가장 바람직하게는 40 내지 55 분이고, 감소된 온도에서의 가교 반응의 기간이 60 시간 초과이고, 시약 A의 최종 농도 0.35-0.55%이고, 시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 0.875-1.375 mg 대 0.024-0.036 mg인, 용도.
청구항 14에 있어서,
시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 1-1.25 mg 대 0.027-0.033 mg인, 용도.
청구항 15에 있어서,
시약 A 대 시약 B의 비율이 하이드로겔의 한 분획에서 1-0.03 mg 내지 0.01-0.15 mg이고, 그러한 비율이, 1 mg의 양의 시약 A의 질량에 대해서, 0.03 mg의 시약 B에 해당되게 하이드로겔의 한 분획에서 유지되는, 용도.