CN105363063B - 具有温敏性能的胶原蛋白敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有温敏性能的胶原蛋白敷料及其制备方法，胶原蛋白敷料的原料按重量份数比计包括1份的胶原蛋白酶解液、16～25份的N‑异丙基丙烯酰胺和70～90份的纯化水。该方法将胶原蛋白酶解液和N‑异丙基丙烯酰胺溶解于水中，搅拌均匀，得到混合液；向混合液中加入N,N‑亚甲基双丙烯酰胺，机械搅拌使各组分混合均匀；继续搅拌同时加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，并在水浴中充氮反应，得到反应液；冻干即制得。该胶原蛋白敷料增加了胶原蛋白的温敏性能，使其在人体体温的作用下较短时间内转相为凝胶状，从而在一定时间范围内稳定存在；同时改善了胶原蛋白敷料的交联度，使其在体内自然降解的时间延长，可作为缓释载体使用。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白领域，具体地指一种具有温敏性能的胶原蛋白敷料及其制备方法。
背景技术
温敏凝胶也称为热敏凝胶，是一类在某一特定温度下发生溶胀或强烈收缩的凝胶,这一特定温度称为凝胶的最低临界溶解温度(LCST)，可分为热胀型温敏凝胶和热缩型温敏凝胶。首先观察到凝胶温敏性能的是Tanaka，发现N,N-次甲基双丙烯酰胺交联的聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性能在某一临界温度附近,随着温度的微小变化,其体积变化可达几十至几百倍。
目前普遍使用的N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)类温敏凝胶，其LCST在32～33℃左右，在相变温度LCST下体积会发生突变从而实现对药物释放的控制，常常通过向N-异丙基丙烯酰胺的高分子链中添加亲水或疏水基团来调解凝胶的LCST，使其具有与人体体温相适应的相变温度，因此N-异丙基丙烯酰胺在医药、生物工程领域具有广泛的应用前景。胶原蛋白是一组由多种糖蛋白分子组成的大家族,广泛分布于人体各组织器官中，它是人体最主要的结构蛋白，以结缔组织中含量最高，约占机体总蛋白的25％，目前已发现并确认了25种类型的胶原蛋白。胶原蛋白基于其结构及特性，作为生物材料在组织创伤后的止血、修复、缺损性填充，以及用于组织工程支架而发展起来的再生医学中发挥着巨大作用。
虽然已经存在各种以胶原蛋白为基材，添加壳聚糖、羧甲基纤维素等其它材料制作而成的胶原蛋白敷料，但是具有人体体温感应的智能胶原蛋白敷料并未发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有温敏性能的胶原蛋白敷料及其制备方法，该胶原蛋白敷料一方面增加了胶原蛋白的温敏性能，使其在人体体温的作用下较短时间内转相为凝胶状，从而在一定时间范围内稳定存在；另一方面，改善了胶原蛋白敷料的交联度，使其在体内自然降解的时间延长，可作为缓释载体使用。
为实现上述目的，本发明提供的一种具有温敏性能的胶原蛋白敷料，所述胶原蛋白敷料的原料按重量份数比计包括1份的胶原蛋白酶解液、16～25份的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和70～90份的纯化水。
进一步地，所述胶原蛋白敷料的原料还包括辅料，所述辅料按重量份数比计由0.05～0.1份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、0.002～0.01份的过硫酸铵(APS)和0.002～0.01份的四甲基乙二胺(TEMED)组成。
再进一步地，所述胶原蛋白敷料的原料按重量份数比计包括1份的胶原蛋白酶解液、16～22份的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、0.06～0.08份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、0.004～0.01份的过硫酸铵(APS)、0.004～0.008份的四甲基乙二胺(TEMED)和75～95份的纯化水。
再进一步地，所述胶原蛋白敷料的原料按重量份数比计包括1份的胶原蛋白酶解液、18份的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、0.07份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、0.005份的过硫酸铵(APS)、0.005份的四甲基乙二胺(TEMED)和80份的纯化水。
再进一步地，所述胶原蛋白酶解液的浓度为7～8mg/mL。
再进一步地，所述胶原蛋白酶解液的制备方法，包括以下步骤：
1)去除牛跟腱上的粗皮毛和皮下脂肪，将牛跟腱置于脱脂剂中进行脱脂处理，水洗，其中，所述脱脂剂是丙酮和乙醇按重量比3～1︰1混合而成；
2)将洗净的牛跟腱倒入组织捣碎机中在8000～14000rpm/min条件下搅拌10～30min成糊状，再将糊状的牛跟腱和质量分数为5％的NaCl溶液按重量比1︰10～20混合均匀，然后置于搅拌机上搅拌12～24h，过滤，用蒸馏水重复冲洗3～5次，沥干，得到处理料；
3)向处理料按质量比加入1份0.5～0.8moL/L的冰醋酸和3份600～700mg/L的胃蛋白酶的混合物；室温持续搅拌20～30h得到反应液，再利用0.5～0.8moL/L的冰醋酸调节反应液的pH至5；
4)向反应液中加入NaCl饱和溶液，搅拌20～30h，离心弃上清，得到沉淀物；再向沉淀物中滴加摩尔浓度为0.5～0.8moL的冰醋酸使一级沉淀物完全溶解，离心，取上清液并用0.5～0.8moL/L的冰醋酸调节pH至7.5；
5)向上清液中加入NaCl饱和溶液，搅拌20～30h，离心弃上清，得到沉淀物，再向沉淀物中滴加摩尔浓度为0.5～0.8moL的冰醋酸使沉淀物完全溶解，得到溶解液；
6)以蒸馏水为透析外液对溶解液透析24～30h，即得胶原蛋白酶解液。
本发明还提供了一种具有温敏性能的胶原蛋白敷料的制备方法，包括以下步骤：
1)按重量份数比计称取1份的胶原蛋白酶解液、16～25份的N-异丙基丙烯酰胺、0.05～0.1份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、0.002～0.01份的过硫酸铵、0.002～0.01份的四甲基乙二胺和70～90份的纯化水，备用；
2)将胶原蛋白酶解液和N-异丙基丙烯酰胺溶解于纯化水中，搅拌均匀，得到混合液；
3)向混合液中加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺，在氮气保护下机械搅拌10～30min使各组分混合均匀；继续搅拌同时加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，并在30～38℃水浴中充氮反应6～8h，得到反应液；
4)将反应液平铺于不锈钢托盘中，于-40℃条件下冻干，即制得胶原蛋白敷料。
作为优选方案，所述步骤1)中，胶原蛋白酶解液的浓度为7～8mg/mL。
作为优选方案，所述步骤1)中，胶原蛋白酶解液的制备方法，包括以下步骤：
1)去除牛跟腱上的粗皮毛和皮下脂肪，将牛跟腱置于脱脂剂中进行脱脂处理，水洗，其中，所述脱脂剂是丙酮和乙醇按重量比3～1︰1混合而成；
2)将洗净的牛跟腱倒入组织捣碎机中在8000～14000rpm/min条件下搅拌10～30min成糊状，再将糊状的牛跟腱和质量分数为5％NaCl溶液按重量比1︰10～20混合均匀，然后置于搅拌机上搅拌12～24h，过滤，用蒸馏水冲洗感觉，重复冲洗3～5次，沥干，得到处理料；
3)向处理料按质量比加入1份0.5～0.8moL/L的冰醋酸和3份600～700mg/L的胃蛋白酶的混合物；室温持续搅拌20～30h得到反应液，再利用0.5～0.8moL/L的冰醋酸调节反应液的pH至5；
4)向反应液中加入NaCl饱和溶液，搅拌20～30h，离心弃上清，得到沉淀物；再向沉淀物中滴加摩尔浓度为0.5～0.8moL的冰醋酸使一级沉淀物完全溶解，离心，取上清液并用0.5～0.8moL/L的冰醋酸调节pH至7.5；
5)向上清液中加入NaCl饱和溶液，搅拌20～30h，离心弃上清，得到沉淀物，再向沉淀物中滴加摩尔浓度为0.5～0.8moL的冰醋酸使沉淀物完全溶解，得到溶解液；
6)以蒸馏水为透析外液对溶解液透析24～30h，即得胶原蛋白酶解液。
本发明中原料选择的理论基础
N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)类温敏凝胶的LCST在32～33℃左右，在相变温度LCST下体积会发生突变从而实现对药物释放的控制，常常通过向N-异丙基丙烯酰胺的高分子链中添加亲水或疏水基团来调解凝胶的LCST，使其具有与人体体温相适应的相变温度，因此N-异丙基丙烯酰胺在医药、生物工程领域具有广泛的应用前景。
本发明的有益效果在于：
胶原蛋白本身具有良好的生物相容性的材料被广泛运用，一般的胶原制品在体内的酶解速度较快，这样就导致胶原本身作为骨架使用或者作为止血材料并提供伤口愈合所需营养时并不能发挥长效稳定的功效。这样需要发明一种新型的具有恒定并且更加缓和释放的胶原蛋白载体。一方面作为缓释骨架，改性后的胶原蛋白可以为更多药品提供缓释支架，增加药物在药剂上的突破；另一方面，改性后的胶原蛋白拥有与人体37°更为接近的温敏性能，在机体的体温调节下能够智能响应，调节载体支架的三维构型，从而控制其作为药物支架时药物的释放速率。另外，作为机体本身在不同病理条件下，不同部位的体温会有差异，这种温敏响应胶原骨架可以更好的通过体温调节不同药物的最适释放速率。
本发明在寻找具有温敏性能的材料上做了大量工作，最后通过验证发现NIPAAm与胶原蛋白的组合所制作成型的敷料具有与人体更为接近的突变温度。通过一系列的实施案例，寻找到胶原与NIPAAm的最佳比例，并且在辅料的选择上及比重上做了大量研究工作，制作出具有良好的吸水性能的敷料，在电镜扫描中可以发现骨架的密度和孔径大小最为合适。
在胶原蛋白敷料的制作工艺中，催化剂、引发剂所使用的量进行了大量的探究，寻找到合适的比例，一方面能促进胶原蛋白和NIPAAm的交联，另一方面尽量降低辅料的使用来满足敷料最终良好的生物相容性。
附图说明
图1为胶原蛋白敷料1～4的样品与空白的纯胶原蛋白敷料的SEM扫描电镜下观察图；
其中，图1A为胶原蛋白敷料1样品的SEM扫描电镜下观察图；
图1B为胶原蛋白敷料2样品的SEM扫描电镜下观察图；
图1C为胶原蛋白敷料3样品的SEM扫描电镜下观察图；
图1D为胶原蛋白敷料4样品的SEM扫描电镜下观察图；
图1E为空白的纯胶原蛋白敷料的SEM扫描电镜下观察图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
一种具有温敏性能的胶原蛋白敷料，所述胶原蛋白敷料的原料按重量份数比计包括1份的胶原蛋白酶解液、16～25份的N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)和70～90份的纯化水。
所述胶原蛋白敷料的原料还包括辅料，所述辅料按重量份数比计由0.05～0.1份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、0.002～0.01份的过硫酸铵(APS)和0.002～0.01份的四甲基乙二胺(TEMED)组成。
具有温敏性能的胶原蛋白敷料的制备方法，包括以下步骤：
1)按重量份数比计称取1份的胶原蛋白酶解液、16～25份的N-异丙基丙烯酰胺、0.05～0.1份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、0.002～0.01份的过硫酸铵、0.002～0.01份的四甲基乙二胺和70～90份的纯化水，备用；
2)将胶原蛋白酶解液和N-异丙基丙烯酰胺溶解于纯化水中，搅拌均匀，得到混合液；
3)向混合液中加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺，在氮气保护下机械搅拌10～30min使各组分混合均匀；继续搅拌同时加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，并在30～38℃水浴中充氮反应6～8h，得到反应液；
4)将反应液平铺于不锈钢托盘中，于-40℃条件下冻干，即制得胶原蛋白敷料。
上述使用的原料大部分购于市面，其中，
胶原蛋白酶解液的制备方法，包括以下步骤：
1)去除牛跟腱上的粗皮毛和皮下脂肪，将牛跟腱置于脱脂剂中进行脱脂处理，水洗，其中，所述脱脂剂是丙酮和乙醇按重量比3～1︰1混合而成；
2)将洗净的牛跟腱倒入组织捣碎机中在8000～14000rpm/min条件下搅拌10～30min成糊状，再将糊状的牛跟腱和质量分数为5％的NaCl溶液按重量比1︰10～20混合均匀，然后置于搅拌机上搅拌12～24h，过滤，用蒸馏水重复冲洗3～5次，沥干，得到处理料；
3)向处理料按质量比加入1份0.5～0.8moL/L的冰醋酸和3份600～700mg/L的胃蛋白酶的混合物；室温持续搅拌20～30h得到反应液，再利用0.5～0.8moL/L的冰醋酸调节反应液的pH至5；
4)向反应液中加入NaCl饱和溶液，搅拌20～30h，离心弃上清，得到沉淀物；再向沉淀物中滴加摩尔浓度为0.5～0.8moL的冰醋酸使一级沉淀物完全溶解，离心，取上清液并用0.5～0.8moL/L的冰醋酸调节pH至7.5；
5)向上清液中加入NaCl饱和溶液，搅拌20～30h，离心弃上清，得到沉淀物，再向沉淀物中滴加摩尔浓度为0.5～0.8moL的冰醋酸使沉淀物完全溶解，得到溶解液；
6)以蒸馏水为透析外液对溶解液透析24～30h，即得胶原蛋白酶解液，其中，胶原蛋白酶解液的浓度为7～8mg/mL。
根据上述原料和胶原蛋白敷料的制备方法，制备胶原蛋白敷料，其组份配方如下表1所示：
表1
上述配方制备得到胶原蛋白敷料1～8，将胶原蛋白敷料1～8与一般的胶原蛋白敷料进行性能测试，
1、吸水率测试：
取胶原蛋白敷料1～8的样品与空白的纯胶原蛋白敷料各180mg，分别量取敷料厚度，然后将其分别浸入到蒸馏水中,浸泡30min后取出称重。计算公式为：
吸水率＝(Wt-Wo)/Wo，式中Wt-润湿敷料质量，Wo-干敷料重量。
经过实际测量计算胶原蛋白敷料的吸水率如下表2所示。
表2
2)敷料微观结构观察
按照0.2cm×0.2cm大小取胶原蛋白敷料1～4的样品本实施示例中四个样品与空白的纯胶原蛋白敷料后，喷金，SEM扫描电镜下观察。
如图1所示，图1A-E其中图B中电镜扫描显示该温敏胶原蛋白敷料的骨架密度高，说明其具有更长效的降解速率，并且图B中敷料的孔隙率较高，孔径较大，故在吸水率上具有良好的性能，与实验一致。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.一种具有温敏性能的胶原蛋白敷料，其特征在于：所述胶原蛋白敷料的原料按重量份数比计包括1份的胶原蛋白酶解液、16～25份的N-异丙基丙烯酰胺、70～90份的纯化水；0.05～0.1份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、0.002～0.01份的过硫酸铵和0.002～0.01份的四甲基乙二胺；其中，所述胶原蛋白酶解液的浓度为7～8mg/mL；其中，所述胶原蛋白酶解液的制备方法，包括以下步骤：
1)去除牛跟腱上的粗皮毛和皮下脂肪，将牛跟腱置于脱脂剂中进行脱脂处理，水洗，其中，所述脱脂剂是丙酮和乙醇按重量比3～1︰1混合而成；
2)将洗净的牛跟腱倒入组织捣碎机中在8000～14000rpm/min条件下搅拌10～30min成糊状，再将糊状的牛跟腱和5％NaCl溶液按重量比1︰10～20混合均匀，然后置于搅拌机上搅拌12～24h，过滤，用蒸馏水重复冲洗3～5次，沥干，得到处理料；
3)向处理料按质量比加入1份0.5～0.8mol/L的冰醋酸和3份600～700mg/L的胃蛋白酶的混合物；室温持续搅拌20～30h得到反应液，再利用0.5～0.8mol/L的冰醋酸调节反应液的pH至5；
4)向反应液中加入NaCl饱和溶液，搅拌20～30h，离心弃上清，得到沉淀物；再向沉淀物中滴加摩尔浓度为0.5～0.8mol的冰醋酸使一级沉淀物完全溶解，离心，取上清液并用0.5～0.8mol/L的冰醋酸调节pH至7.5；
5)向上清液中加入NaCl饱和溶液，搅拌20～30h，离心弃上清，得到沉淀物，再向沉淀物中滴加摩尔浓度为0.5～0.8mol/L的冰醋酸使沉淀物完全溶解，得到溶解液；
6)以蒸馏水为透析外液对溶解液透析24～30h，即得胶原蛋白酶解液。
2.根据权利要求1所述具有温敏性能的胶原蛋白敷料，其特征在于：所述胶原蛋白敷料的原料按重量份数比计包括1份的胶原蛋白酶解液、16～22份的N-异丙基丙烯酰胺、0.06～0.08份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、0.004～0.01份的过硫酸铵、0.004～0.008份的四甲基乙二胺和75～95份的纯化水。
3.根据权利要求2所述具有温敏性能的胶原蛋白敷料，其特征在于：所述胶原蛋白敷料的原料按重量份数比计包括1份的胶原蛋白酶解液、18份的N-异丙基丙烯酰胺、0.07份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、0.005份的过硫酸铵、0.005份的四甲基乙二胺和80份的纯化水。
4.一种具有温敏性能的胶原蛋白敷料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)胶原蛋白酶解液的制备方法，包括以下步骤：
a.去除牛跟腱上的粗皮毛和皮下脂肪，将牛跟腱置于脱脂剂中进行脱脂处理，水洗，其中，所述脱脂剂是丙酮和乙醇按重量比3～1︰1混合而成；
b.将洗净的牛跟腱倒入组织捣碎机中在8000～14000rpm/min条件下搅拌10～30min成糊状，再将糊状的牛跟腱和5％NaCl溶液按重量比1︰10～20混合均匀，然后置于搅拌机上搅拌12～24h，过滤，用蒸馏水重复冲洗3～5次，沥干，得到处理料；
c.向处理料按质量比加入1份0.5～0.8mol/L的冰醋酸和3份600～700mg/L的胃蛋白酶的混合物；室温持续搅拌20-30h得到反应液，再利用0.5～0.8moL/L的冰醋酸调节反应液的pH至5；
d.向反应液中加入NaCl饱和溶液，搅拌20～30h，离心弃上清，得到沉淀物；再向沉淀物中滴加摩尔浓度为0.5～0.8mol的冰醋酸使一级沉淀物完全溶解，离心，取上清液并用0.5～0.8mol/L的冰醋酸调节pH至7.5；
e.向上清液中加入NaCl饱和
溶液，搅拌20～30h，离心弃上清，得到沉淀物，再向沉淀物中滴加摩尔浓度为0.5～0.8mol/L的冰醋酸使沉淀物完全溶解，得到溶解液；
f.以蒸馏水为透析外液对溶解液透析24～30h，即得胶原蛋白酶解液；
2)按重量份数比计称取1份的胶原蛋白酶解液、16～25份的N-异丙基丙烯酰胺、0.05～0.1份的N,N-亚甲基双丙烯酰胺、0.002～0.01份的过硫酸铵、0.002～0.01份的四甲基乙二胺和70～90份的纯化水，备用；其中，胶原蛋白酶解液的浓度为7～8mg/mL；
3)将胶原蛋白酶解液和N-异丙基丙烯酰胺溶解于纯化水中，搅拌均匀，得到混合液；
4)向混合液中加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺，在氮气保护下机械搅拌10～30min使各组分混合均匀；继续搅拌同时加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，并在30～38℃水浴中充氮反应6～8h，得到反应液；
5)将反应液平铺于不锈钢托盘中，于-40℃条件下冻干，即制得胶原蛋白敷料。
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| CN105363063A (zh) | 2016-03-02 |
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| C06 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |